CN104561349A - 一种广谱灵活的检测人乳头瘤病毒基因型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种广谱灵活的检测人乳头瘤病毒基因型的方法，检测型别涵盖国际肿瘤研究机构IARC所述致癌和致病的45个HPV基因型(亚型)和1个中国CDC新鉴定报道的引起巨大疣型,覆盖面超越了目前各种同类试剂盒涉及型别的总和。发明以质谱扫描多重PCR为平台,将临床需求频率最高的21个致癌型和2个高发致疣型作为一个独立反应进行检测，总共仅需两个反应，最大程度地满足了临床重点检测和疑难病症广谱筛查的需求；检测组合灵活，性价比高；一天可以检测几个乃至几千个样；自动实时报告结果,不受人为因素影响；能够一次同时准确检出数十种HPV型别。体现了高通量、高灵活性、高自动化和宽线性范围宽的独特优势,为致病HPV感染的全面普及筛查提供了不可或缺的检测工具。
Description
技术领域
本发明涉及检测和鉴定病原微生物制剂领域，特别涉及一种广谱灵活的检测人乳头瘤病毒基因型的方法。
背景技术
1983年德国病毒学家哈拉尔德·楚尔·豪森(Harald zur Hausen)首先发现人乳头瘤病毒(HPV)的一些型别与宫颈癌有关。该研究成果使宫颈癌成为目前唯一可以预防并早期发现,可以治愈的人类癌症。2003年世界卫生组织国际肿瘤研究机构(WHO_IARC)公布了由9个国家11个研究机构得出的分析报告，根据HPV不同型别与宫颈癌的关系，将被检出的30个HPV基因型分为三大类，其中15种致癌高危型：16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73，82(W13B/MM4亚型和IS39亚型)；3种可能致癌高危型：26，53，66；及12种低危型：6，11，40，42，43，44，54，61，70，72，81(CP8304)和CP6108。2009年WHO_IARC召集了16个国家的36位科学家对生物致癌物质进行了重新评估，并对引起宫颈癌的HPV基因型进行了相关性排序：第一位为HPV-16型，它的致癌危险性较其它任何一种高危型都更为严重，已知可在人体的某些部位引起癌症；第二位包括：18，31，33，35，39，45，51，52，56，58和59型，有充分证据引起宫颈癌；第三位为HPV-68型，为有限证据对人致癌和强机理证据致癌；第四位包括：26，53，66，67，70，73和82型，为有限证据导致宫颈癌；此外，根据系统发生树分类，对人类具有充分或有限证据致癌的型别还有：30,34,69,85和97型；最后，HPV-6和HPV-11型基于流行病学证据不足和无潜在致癌机理的基础上归类为不属于对人类致癌型。工作组专家亦同时提出：除了对上述引起宫颈癌的alpha属HPV高度关注外，还应对beta和gamma属的HPV作进一步研究。这些广泛传播的HPV基因型可能引起皮肤癌，特别是Beta属中HPV-5和HPV-8型为可能致癌型，有限证据表明对疣状表皮发育不良症患者可引起皮肤癌。
HPV属于乳头多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)乳头瘤病毒属，是一类可感染表皮和粘膜鳞状上皮的小DNA病毒。其基因组为双链环状DNA，长约7900对碱基(bp)，含8个开放阅读框(open reading frames，ORFs)，依功能不同分3个区:(1)早期区(early region，E区):分别编码E1、E2、E4、E5、E6、E7等6个早期蛋白，参与病毒DNA的复制、转录、翻译调控和转化等功能。(2)晚期区(late region，L区):编码主要外壳蛋白L1和次要外壳蛋白L2。(3)非编码区(uncoding region，UCR)或上游调控区(URR):含有HPV基因组DNA的复制起点和HPV表达所必需的调控元件。
美国食品和药品管理局(FDA)目前批准的检测方法有：Qiagen HC II高危HPV检测和HC II低危HPV检测；Cervista HPV 16/18检测和Cervista高危HPV检测(Hologics)。HC II是第二代杂交捕获法(Hybrid Capture II)，1999年上市，可定性区分13种高危型(16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68)与5种低危型(6/11/42/43/44)，但不能分型。Cervista应用恒温酶DNA扩增和荧光发光判读法，2009年上市，可定性检测14种高危型(与HC II相比增加了66型)，除16/18可以另外检测，也不能具体分型。2011年FDA首次批准cobas HPV 16/18分型检测，2014年罗氏公司补充申报31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66和68型，其方法总共可分型检测14个高危型，FDA批准用于宫颈癌一线初级筛查。此外，罗氏Linear Array HPV基因分型法，采用PCR扩增靶向DNA和核酸杂交检测37个HPV基因型[6,11,16,18,26,31,33,35,39,40,42,45,51,52,53,54,55,56,58,59,61,62,64,66,67,68,69,70,71,72,73(MM9),81,82(MM4),83(MM7),84(MM8),IS39 and CP6108，可以用于美国以外的国家。
中国食品药品监督管理总局(CFDA)批准上市的检测HPV的国产试剂，主要基于两种方法：1、杂交法，包括达安19型、凯普21型、亚能23型、透景26型等方法，第二代杂交捕获法(HC2)等；2、实时荧光PCR法，包括之江13种高危分型，港龙、凯普、亚能等公司13种高危不分型、达安8个型定量等。
此外，采用PCR-质谱联用技术检测HPV申报专利的方法有密执安州立大学和深圳华大基因。前者针对E6基因区进行13种高危型作分型和定量检测，后者采用通用GP5+/GP6+引物针对L1基因区分析17个型。中国医学科学院采用EL双基因探针检测2003年IARC公布的30个HPV基因型。
上述方法存在的问题是：
1.检测的HPV型别少，均未能达到国际肿瘤研究机构IARC在2003和2009年提出的对人类致癌或致病的总共46个HPV基因型，特别是均没有包括根据系统发生树分类，对人类具有充分或有限证据致癌的5个型别中的4个型(30,34,85,97)；也没有包括Beta属的2个致癌型(5,8)和中国CDC新鉴定出的引起巨大疣的型别(2)。无法满足当前临床对广谱筛查HPV的需求，其检测结果将使＞1％的人检测漏诊。
2.采用杂交方法检测的灵敏度低，约为5000copies/ml，且需要目测，检测线性范围窄。经对比实验发现，目前一次可以检测20多个型的试剂盒，在实际检测中往往一次最多只能检出约3种高载量的基因型，而遗漏了高危低载量的型别，如HPV16型病毒在整合到人体基因组后，易产生强致癌性,但因L1基因丢失而易产生漏检。
3.采用实时荧光PCR法的检测型别数量受限，型别数量最高的分型试剂盒仅为13个型别，且需要用5个反应完成检测。
4.目前的PCR-质谱法采用多重PCR探针混合识别在同一个通用引物扩增区中的相似序列，易产生交叉错配的假阳性问题，导致结果难以重复。采用双基因探针法，检测30个基因型，需要同时用3个反应检测，且型别涵盖面亦不够全面。此外，因成本较高，超出常规临床检测收费标准的承受能力，主要适用于其它方法难以准确检测的石蜡样本。
发明内容
本发明提供了一种广谱灵活的检测人乳头瘤病毒基因型(亚型)分型的方法，旨在最大限度覆盖IARC提出的所有致癌和致病HPV基因型，以及中国CDC鉴定出的罕见型别；对确切高危致癌型HPV16采用E/L双基因探针，以使该病毒的漏检率降至最低；将所有21个高危致癌型和占85％以上的2个高发致疣型作为一个独立反应进行检测，总共46型仅需两个反应。最大程度地满足了临床重点检测和疑难病症广谱筛查的需求；检测组合灵活，性价比高；一天可以检测几个乃至几千个样本；自动实时报告结果,不受人为因素影响；能够一次同时准确检出数十种HPV型别。体现了高通量、高灵活性、高自动化和宽线性范围宽的独特优势,为致病HPV感染的全面普及筛查提供了不可或缺的检测工具。
本发明实施例是这样实现的，一种广谱灵活的检测人类乳头状瘤病毒基因型的方法，待检测人类乳头状瘤病毒基因型为46种HPV基因型，包括：HPV2、5、6、8、11、16、18、26、30、31、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、61、62、64、66、67、68、69、70、71、72、73、81/CP8304、82(W13B/MM4亚型)、IS39(82亚型)、83、84、85、CP6108/89和97型。
包括以下步骤：
1、引物设计：涵盖国际肿瘤研究机构IARC在2003和2009年提出的全部46种致癌和致病HPV类型，全部检测分为两部分，第一部分包括对于高危致癌型HPV16，其它致癌型：18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66，67、68、70、73、82(含W13B/MM4亚型和IS39亚型)，及高发治疣型6和11型，总共23种型，对于高危致癌型HPV16特别采用了E和L双基因探针检测，其他基因采用单基因检测。第二部分包括：2、5、8、30、34、40、42、43、44、54、55、61、62、64、69、71、72、81/CP8304、83、84、85、89(含CP6108)和97型，总共23种型。根据待测HPV基因型全序列，获取E6、E7基因区或L1基因区，选择每个型别的特异性保守序列，设计一对PCR引物，在引物的5’端带有10个碱基(ACGTTGGATG)任意组合的标签序列，使总长度达到30个碱基以上，用以从分子量上将引物与探针区别开，避免干扰。在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针的长度为14-28个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过29个碱基，每个探针的延伸产物之间分子量相差至少16Da。各种HPV扩增引物序列见表1，其对应的碱基延伸探针见表2。
2、PCR反应：在PCR过程中引入尿嘧啶N糖基化酶(UNG酶)技术，在首次PCR反应体系中，以dUTP替代常规PCR的dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，用UNG酶处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG酶在PCR循环中一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR反应及产物，彻底排除了PCR扩增产物污染引起的假阳性问题。通过第一轮PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物。
3、虾碱性磷酸酶(SAP)处理：SAP可使未结合的剩余核酸(dNTPs)脱磷酸失活，避免干扰下一步碱基延伸反应。
4、碱基延伸反应：在第二轮扩增中进行单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，得到的延伸产物与所述延伸探针及各型别延伸产物之间的分子量差异不小于16Da，
5、树脂脱盐：采用树脂对延伸产物进行纯化。
6、质谱检测：将纯化后的产物采用微量点样仪点于芯片上，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)系统进行分子量检测，根据分子量标记确定待测HPV基因型别，软件自动处理报告每个基因型的检测结果和可信程度。
本发明的检测方法，优选的包括以下步骤：
(1)用一对PCR引物，在引物的5’端带有ACGTTGGATG碱基的任意组合的标签序列，使总长度达到30个碱基以上，以区别于探针；在扩增区中的保守序列设计一条单碱基延伸探针，探针的长度为14-28个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过29个碱基；
(2)第一次PCR扩增反应，将dUTP/dNTP混合物、UNG酶、Taq酶和多重PCR引物、水、待检样本一同加入PCR反应体系中，先进行dUTP的消化，降解PCR扩增产物，然后灭活UNG酶，随后作45个循环PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物；
(3)用虾碱性磷酸酶处理，使第一轮反应中剩余dNTP脱磷酸失活；
(4)第二次单碱基延伸扩增，将ddNTPs加入反应体系中，使之在单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，扩增200个循环，每个探针的延伸产物之间分子量相差至少26Da；
(5)采用阳离子交换树脂吸附盐离子，纯化延伸反应产物；
(6)纯化后产物采用质谱技术进行分子量检测，根据分子量标记确定待测HPV基因的类型。
其中所述步骤(1)引物设计中每一种待测HPV基因型采用1个或2个基因区检测，其中一种致癌性早期转录区E6或E7基因区和一种衣壳蛋白晚期转录区L1基因区。
所述步骤(1)中，优选的采用β球蛋白基因作为样品质量控制参照，引物序列为SEQIDNO.93和SEQ ID NO.94，探针序列为SEQ ID NO.148。
优选的在每次反应中加入阴性对照，所述阴性对照为去离子双蒸水。
本发明的方法，检测浓度低至1拷贝/ul。
本发明还包括，一种检测生物样品中微生物DNA的试剂盒，所述试剂盒中包含一种或多种如表1，表2的合成的多核苷酸试剂。
表1
| 序列编号 | 引物序列 | HPV基因型别 |
| SEQ ID NO.1 | ACGTTGGATGAGGGATGTCTGAGGAGAATC | HPV 2E正向引物 |
| SEQ ID NO.2 | ACGTTGGAGTACCATACACAGAGCYATCGC | HPV 2E反向引物 |
| SEQ ID NO.3 | ACGTTGGATGTATCTTCCACCATCGACACC | HPV 5L正向引物 |
| SEQ ID NO.4 | ACGTTGGATGCCTACAGTTAACAATCTGTC | HPV 5L反向引物 |
| SEQ ID NO.5 | ACGTTGGATGATRAACCGRGCCTTGGTTAG | HPV 6E正向引物 |
| SEQ ID NO.6 | ACGTTGGATGACAAGACATRTTAGACGTGC | HPV 6E反向引物 |
| SEQ ID NO.7 | ACGTTGGATGCCACAACATCTACAGATGAC | HPV 8L正向引物 |
| SEQ ID NO.8 | ACGTTGGATGACATGGAATGGCTTTTTCCC | HPV 8L反向引物 |
| SEQ ID NO.9 | ACGTTGGATGACCAACGCCTAAAGGTTGAC | HPV 11L正向引物 |
| SEQ ID NO.10 | ACGTTGGATGTCATCRCTGTTTGACCCCAC | HPV 11L反向引物 |
| SEQ ID NO.11 | ACGTTGGATGACTGCAATGTTRCAGGACCC | HPV 16E正向引物 |
| SEQ ID NO.12 | ACGTTGGATGTAGTTGTTRGCAGCTCTGTG | HPV 16E反向引物 |
| SEQ ID NO.13 | ACGTTGGATGCTGTTGTTGATACTACACGC | HPV 16L正向引物 |
| SEQ ID NO.14 | ACGTTGGATGTGAAGTSGATATGGCAGCAC | HPV 16L反向引物 |
| SEQ ID NO.15 | ACGTTGGATGCACTTCAWTGCAAGYCATAG | HPV 18E正向引物 |
| SEQ ID NO.16 | ACGTTGGATGCTGTCTCTATACACCYCAAI | HPV 18E反向引物 |
| SEQ ID NO.17 | ACGTTGGATGTACACATCTTTTGCATGCAG | HPV 26E正向引物 |
| SEQ ID NO.18 | ACGTTGGATGGGAAACCTTACAATGGGCTG | HPV 26E反向引物 |
| SEQ ID NO.19 | ACGTTGGATGAACTGAGCCTCAGYGGTTAC | HPV 30L正向引物 |
| SEQ ID NO.20 | ACGTTGGATGAAATAACAGGGATCCCCCGC | HPV 30L反向引物 |
| SEQ ID NO.21 | ACGTTGGATGCGATTCCACAACATAGGAGG | HPV 31E正向引物 |
| SEQ ID NO.22 | ACGTTGGATGCACTTGYGTTTCAGTACGAG | HPV 31E反向引物 |
| SEQ ID NO.23 | ACGTTGGATGTGGATGTAAGCCTCRAACAG | HPV 33L正向引物 |
| SEQ ID NO.24 | ACGTTGGATGAGGTGGYCAATCATTGWCAG | HPV 33L反向引物 |
| SEQ ID NO.25 | ACGTTGGATGGCGGTGGTGTAAGYCCAAAA | HPV 34L正向引物 |
| SEQ ID NO.26 | ACGTTGGATGRCATGCAGAAGAGTATGACC | HPV 34L反向引物 |
| SEQ ID NO.27 | ACGTTGGATGTAGGRCTCCTATAGGTGAAC | HPV 35L正向引物 |
| SEQ ID NO.28 | ACGTTGGATGCAAAGGAGGACATTCWCCTG | HPV 35L反向引物 |
| SEQ ID NO.29 | ACGTTGGATGTCCACGTGCCTGGTATATTC | HPV 39L正向引物 |
| SEQ ID NO.30 | ACGTTGGATGACCCYTAGTACCAACTTTAC | HPV 39L反向引物 |
| SEQ ID NO.31 | ACGTTGGATGAGAGGTAACCAAGGYTCCAC | HPV 40L正向引物 |
| SEQ ID NO.32 | ACGTTGGATGTAACAGGTACATCTGGTCGG | HPV 40L反向引物 |
| SEQ ID NO.33 | ACGTTGGATGTTGACATACCAACGTYTGAG | HPV 42E正向引物 |
| SEQ ID NO.34 | ACGTTGGATGATGTCCTGTTTGGCTTGGTC | HPV 42E反向引物 |
| SEQ ID NO.35 | ACGTTGGATGTCATAACCTCTGGGRTTAGC | HPV 43L正向引物 |
| SEQ ID NO.36 | ACGTTGGATGAGGAATACRTGCGGCATGTG | HPV 43L反向引物 |
| SEQ ID NO.37 | ACGTTGGATGTCCCGCGTAGTTAAAYTGCC | HPV 44E正向引物 |
| SEQ ID NO.38 | ACGTTGGATGCAGTTATATGTAGTGTACCG | HPV 44E反向引物 |
| SEQ ID NO.39 | ACGTTGGATGGCTACCAGATTTGTYCACAG | HPV 45E正向引物 |
| SEQ ID NO.40 | ACGTTGGATGTACCTCTYTGCGTRCCAAMG | HPV 45E反向引物 |
| SEQ ID NO.41 | ACGTTGGATGTGGGTTTCGTTACGTTGTCG | HPV 51E正向引物 |
| SEQ ID NO.42 | ACGTTGGATGCATGAAATAGCYGGACGSTG | HPV 51E反向引物 |
| SEQ ID NO.43 | ACGTTGGATGGTAGGACATCCCTATTTTTC | HPV 52L正向引物 |
| SEQ ID NO.44 | ACGTTGGATGATTGCAGYCCAGACACCTTG | HPV 52L反向引物 |
| SEQ ID NO.45 | ACGTTGGATGGACCTGCAWTGCRATGAGC | HPV 53E正向引物 |
| SEQ ID NO.46 | ACGTTGGATGGTCTAGCTTGCTGTYGCTG | HPV 53E反向引物 |
| SEQ ID NO.47 | ACGTTGGATGACTAAGCGTTGTGRCTCAGG | HPV 54L正向引物 |
| SEQ ID NO.48 | ACGTTGGATGGGTGTTTAGGGTGCYACTAC | HPV 54L反向引物 |
| SEQ ID NO.49 | ACGTTGGATGGTCACAGGCCATTACATGTC | HPV 55L正向引物 |
| SEQ ID NO.50 | ACGTTGGATGTTCTCTGAGATCTARCTCCC | HPV 55L反向引物 |
| SEQ ID NO.51 | ACGTTGGATGTTTGACCTAGTWCCCAGTTI | HPV 56L正向引物 |
| SEQ ID NO.52 | ACGTTGGATGGGACAGTTTTTCTARAGACC | HPV 56L反向引物 |
| SEQ ID NO.53 | ACGTTGGATGCTGMTATCTTGTGGAACCGC | HPV 57E正向引物 |
| SEQ ID NO.54 | ACGTTGGATGGCTATATYTGCCATAYGCCC | HPV 57E反向引物 |
| SEQ ID NO.55 | ACGTTGGATGATTTGTGTCYGGCGTTWGAG | HPV 58E正向引物 |
| SEQ ID NO.56 | ACGTTGGATGTACCTCAGASCGCTGCAIAG | HPV 58E反向引物 |
| SEQ ID NO.57 | ACGTTGGATGCACGTGATAATGRATCTGTGG | HPV 59L正向引物 |
| SEQ ID NO.58 | ACGTTGGATGTACAAGCAGTGCCCTTTGTC | HPV 59L反向引物 |
| SEQ ID NO.59 | ACGTTGGATGTACAGGAAAAGGAGCYTCAG | HPV 61E正向引物 |
| SEQ ID NO.60 | ACGTTGGATGTCTACACTGGCAACRCCTTC | HPV 61E反向引物 |
| SEQ ID NO.61 | ACGTTGGATGGGGAGGTAAAACCCCAAAG | HPV 62L正向引物 |
| SEQ ID NO.62 | ACGTTGGATGTTRACCCCCGAAATYATGGC | HPV 62L反向引物 |
| SEQ ID NO.63 | ACGTTGGATGGCGGTGGTGTAAGYCCAAAA | HPV 64L正向引物 |
| SEQ ID NO.64 | ACGTTGGATGRCATGCAGAAGAGTATGACC | HPV 64L反向引物 |
| SEQ ID NO.65 | ACGTTGGATGCAGGCAARCGTACCCTAAAC | HPV 66L正向引物 |
| SEQ ID NO.66 | ACGTTGGATGTGGCCATCCTTATTACTCTG | HPV 66L反向引物 |
| SEQ ID NO.67 | ACGTTGGATGGGGTGTTGGTATTAGTYGAC | HPV 67L正向引物 |
| SEQ ID NO.68 | ACGTTGGATGATCCATAGACAAGCATTCCC | HPV 67L反向引物 |
| SEQ ID NO.69 | ACGTTGGATGATCATATRCCTCAACATGCC | HPV 68L正向引物 |
| SEQ ID NO.70 | ACGTTGGATGACTGTTGTGGATACCACTCG | HPV 68L反向引物 |
| SEQ ID NO.71 | ACGTTGGATGTAGATACTACCCGRAGTACC | HPV 69L正向引物 |
| SEQ ID NO.72 | ACGTTGGATGCACCATGCCTTATAAACTGC | HPV 69L反向引物 |
| SEQ ID NO.73 | ACGTTGGATGTTCCTCTGCTGTTAGTACAC | HPV 70L正向引物 |
| SEQ ID NO.74 | ACGTTGGATGTGCTTATYGTCCACAGACAC | HPV 70L反向引物 |
| SEQ ID NO.75 | ACGTTGGATGCGCCAATGGCCTGRTATTTT | HPV 71E正向引物 |
| SEQ ID NO.76 | ACGTTGGATGACAAGCCATTGTGTAGTGTG | HPV 71E反向引物 |
| SEQ ID NO.77 | ACGTTGGATGGTCCGCTTATCTTWTGGAAG | HPV 72E正向引物 |
| SEQ ID NO.78 | ACGTTGGATGCTATATATAAGGTGCKATGC | HPV 72E反向引物 |
| SEQ ID NO.79 | ACGTTGGATGGAGAGTATAGGCGATYTAGAC | HPV 73E正向引物 |
| SEQ ID NO.80 | ACGTTGGATGGGCATTTTCCGWACCTTATI | HPV 73E反向引物 |
| SEQ ID NO.81 | ACGTTGGATGTTTGGGCGTAGGTACTAGTG | HPV 81/CP8304L正向引物 |
| SEQ ID NO.82 | ACGTTGGATGACTGGCAGCAGCCAAYTAAG | HPV 81/CP8304L反向引物 |
| SEQ ID NO.83 | ACGTTGGATGCCCAACAAATTTGWTCTTCC | HPV 82L正向引物 |
| SEQ ID NO.84 | ACGTTGGATGCCACTAAGGCCAACARCTAI | HPV 82L反向引物 |
| SEQ ID NO.85 | ACGTTGGATGAGGTGCTGCCTACRTCTTAT | HPV 83L正向引物 |
| SEQ ID NO.86 | ACGTTGGATGAGGAGCATAGATGTAGCTGG | HPV 83L反向引物 |
| SEQ ID NO.87 | ACGTTGGATGATACAATCGCCATACYGCTC | HPV 84L正向引物 |
| SEQ ID NO.88 | ACGTTGGAGTGGAAAGTAAGTCAGAGGTGC | HPV 84L反向引物 |
| SEQ ID NO.89 | ACGTTGGATGCCTTTAGGTGTTAGCCTTAG | HPV 85L正向引物 |
| SEQ ID NO.90 | ACGTTGGATGTACAGAAGTAGCAACYTGGG | HPV 85L反向引物 |
| SEQ ID NO.91 | ACGTTGGATGCAACCTTACCATTTGTGCTG | HPV 89/CP6108L正向引物 |
| SEQ ID NO.92 | ACGTTGGATGGTCATATTCCTCAGRGTGTC | HPV 89/CP6108L反向引物 |
| SEQ ID NO.93 | ACGTTGGATGTTTGGGTTACCTGACTCTAC | HPV 97L反向引物 |
| SEQ ID NO.94 | ACGTTGGATGTCCACGGCCTATTRCAACAC | HPV 97L正向引物 |
| SEQ ID NO.95 | ACGTTGGATGAAAGCAGCACTTGACTAGAG | HBB_W1 |
| SEQ ID NO.96 | ACGTTGGATGACTGTGCTTGACCTAGGAAC | HBB_W1 |
表2.
| 序列编号 | 基因型别 | 碱基延伸探针序列 | 延伸碱基 |
| SEQ ID NO.97 | HPV 2E | ggattTGCCCAGGAGAATCCA | T |
| SEQ ID NO.98 | HPV 5L | CAAAGGGCCAGAGTC | C |
| SEQ ID NO.99 | HPV 6E | gggACAGGGCGGTTTGTGAC | A |
| SEQ ID NO.100 | HPV 8L | GCATTGCACACCCT | G |
| SEQ ID NO.101 | HPV 11L | CGCACGCCCATACTAAA | C |
| SEQ ID NO.102 | HPV 16E | CAGGAGAGGACCCA | C |
| SEQ ID NO.103 | HPV 16L | cGCTACACGCAGTACAAATAT | T |
| SEQ ID NO.104 | HPV 18E | ggaaAGTTGTGTATATTGCAAGAC | A |
| SEQ ID NO.105 | HPV 26E | GACATGCAGCATACG | C |
| SEQ ID NO.106 | HPV 30L | cccatTAGACCCCCTCAGAGGTTACCA | T |
| SEQ ID NO.107 | HPV 31E | ggGTTAGGTGGACAGGAC | G |
| SEQ ID NO.108 | HPV 33L | ccggtGTACTAATGTAAAGGTGTTGCTT | G |
| SEQ ID NO.109 | HPV 34L | gaatGTTCACCAAAATTCCACT | G |
| SEQ ID NO.110 | HPV 35L | acGCCTTGTAATGCTAACCA | G |
| SEQ ID NO.111 | HPV 39L | ACTCTAAGAAGGTATGGAAG | A |
| SEQ ID NO.112 | HPV 40L | GTAATAAATACACTTGGTGTGGA | G |
| SEQ ID NO.113 | HPV 42E | ACCCCGTGTGAGAC | A |
| SEQ ID NO.114 | HPV 43L | GAAATATAAACGTTATTATGCATAATT | G |
| SEQ ID NO.115 | HPV 44E | gggagTGACCTTTGCCTAAATTGAT | T |
| SEQ ID NO.116 | HPV 45E | gtaaGTATCTATTATCACTACAAGAC | G |
| SEQ ID NO.117 | HPV 51E | ggtgGTTTCGTTACGTTGTCGTGTAC | G |
| SEQ ID NO.118 | HPV 52L | gaacTAATGACACCAGTAGTGG | G |
| SEQ ID NO.119 | HPV 53E | gggcaCAATTGAATGCAATGCCATGAG | C |
| SEQ ID NO.120 | HPV 54L | TAAACTGTGTCTCAGGATTATA | T |
| SEQ ID NO.121 | HPV 55L | TCAAAAGCCCCATTACATG | |
| SEQ ID NO.122 | HPV 56L | ccctTACCCTTGCATTAAAAATTTTC | A |
| SEQ ID NO.123 | HPV 57E | TCCCCCTCCTTCTCC | T |
| SEQ ID NO.124 | HPV 58E | gaagACGAATTGAAATGCGTTG | A |
| SEQ ID NO.125 | HPV 59L | TGGCACTCAGCTGTGTATTAT | T |
| SEQ ID NO.126 | HPV 61E | GTACAGAAGGAGCATCAG | G |
| SEQ ID NO.127 | HPV 62L | tAGACCCCAAAGTTCC | A |
| SEQ ID NO.128 | HPV 64L | gaatGTTCACCAAAATTCCACT | A |
| SEQ ID NO.129 | HPV 66L | TATCGTACCCTAAACACTC | T |
| SEQ ID NO.130 | HPV 67L | CCTAACTGAAACAAATAATAAATAC | G |
| SEQ ID NO.131 | HPV 68L | TCAGTGGTACAGCTGAT | T |
| SEQ ID NO.132 | HPV 69L | cTCATCTGCACAATCTGCA | T |
| SEQ ID NO.133 | HPV 70L | AGTTGTTAGTACACAGGAC | T |
| SEQ ID NO.134 | HPV 71E | ggcaATCGCCTGCTATTTTATGAA | A |
| SEQ ID NO.135 | HPV 72E | ccctGATATTGATTCCTGTCTGCACCT | G |
| SEQ ID NO.136 | HPV 73E | GTATATAGGCGATATAGACAATCA | G |
| SEQ ID NO.137 | HPV 81/CP8304L | ACCCGGTACTAGTGGTC | A |
| SEQ ID NO.138 | HPV 82L | ACATCCTAATTTGTTTAATCCAG | A |
| SEQ ID NO.139 | HPV 83L | ATTCCGCCTACCTCTTATTAT | A |
| SEQ ID NO.140 | HPV 84L | AGAGGTAGTGGTGCAG | A |
| SEQ ID NO.141 | HPV 85L | ctttcCATCGGTGTTAGCCTTAGTGGT | C |
| SEQ ID NO.142 | HPV 89E | gggttgttCTGTGCTCGTTCTGCCA | G |
| SEQ ID NO.143 | HPV 89/CP6108L | acctgACCATTTGTGCTGCTTCCC | A |
| SEQ ID NO.144 | HPV 97L | taccgGACTCTACTATTTACAATCCC | G |
| SEQ ID NO.145 | HBB | tctacCATTTTAAATTCCCCAAGTGAGA | C |
与现有HPV检测的其它技术和同类技术相比，本发明技术方案最大限度地发挥了PCR-质谱联用平台检测病毒基因型的优势，将国际肿瘤研究机构IARC所述致癌和致病的46个HPV基因型(亚型)全部囊括其中，特别是包括了目前所有商用检测试剂盒均不具备的根据系统发生树分类属于高危致癌型的5个罕见型别以及Beta属的2个致癌型和中国CDC新鉴定出的引起巨大疣的型别。对于最高危致癌型HPV-16采用了E/L双基因探针，确保在基因整合缺失或突变时，仍能够有效检出该基因型。本发明将所有21个致癌型和占85％以上的2个高发致疣型作为一个独立反应进行检测，总共46型仅需两个反应。临床可根据需求分别使用或组合使用，最大程度地降低了使用成本。检测通量灵活一天可以检测几个至几千个样本。为致病HPV感染的全面普及筛查提供了不可或缺的检测工具。
采用大于20重以上PCR反应产物，作一次性质谱检测，不需要荧光染料标记、不需要洗涤、反应在微量体系中进行，使试剂耗材成本大大降低。首轮PCR扩增区域为60-140bp的基因型特异性片段，第二轮PCR采用特异性探针末端单点法扩增，可以允许使用更多循环，最大限度地提高了检测灵敏度和特异性，使检测灵敏度达到1aM级单个拷贝水平，避免了检测漏诊造成的假阴性问题。同时采用UNG酶技术和基因型特异性片段扩增设计技术，彻底排除了PCR产物污染和同源序列探针错配引起的假阳性问题。为多种肿瘤病因学研究和HPV疫苗的研制和应用提供了可靠的临床实验依据。
附图说明
图1、48Plex HPV基因型碱基延伸探针质谱峰图(1-2)
具体实施方式
本发明包括同时检测46种已知致病HPV类型中的一种或多种，每种基因型同时采用特异性基因作检测。此处所描述的具体实施方式仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施方式提供的高精确度检测和/或鉴定人类乳头状瘤病毒基因型的方法，待检测HPV基因型包括：HPV2、5、6、8、11、16、18、26、30、31、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、61、62、64、66、67、68、69、70、71、72、73、81/CP8304、82、IS39(82亚型)、83、84、85、CP6108/89和97型。
每种基因型采用基因型特异片段检测。包括如下步骤：
(1)根据待测HPV基因型全序列，获取E6、E7基因区，或L1基因区，选择每个型别的特异性保守序列，设计一对PCR引物，在引物的5’端带有10个碱基(ACGTTGGATG)任意组合的标签序列，使总长度达到30个碱基以上，用以从分子量上将引物与探针区别开。各种HPV基因型的扩增引物序列见表1。在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针的长度为14-28个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过29个碱基，每个探针的延伸产物之间分子量相差至少16Da。各种HPV扩增引物序列见表1，其对应的碱基延伸探针见表2。
(2)通过PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物。
PCR反应体系配制见表3.
表3
先用37℃-50℃2分钟，进行dUTP的消化，然后94℃4分钟灭活，(同时这一步也达到预变性的效果)，随后作PCR扩增。反应条件为95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共45个循环；最终72℃延伸5分钟，完成后恒温于4℃。
(3)通过虾碱性磷酸酶(SAP)处理，使未结合的剩余核酸(dNTPs)脱磷酸失活，预防干扰下一步碱基延伸反应。SAP消化酶反应体系见表4。
表4
反应条件为37℃孵育40分钟，去除剩余dNTPs；然后用85℃5分钟使SAP酶失活。
(4)通过碱基延伸反应，在单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，得到的延伸产物与所述延伸探针及各型别延伸产物之间的分子量差异不小于16Da，延伸反应体系见表5。
表5
*延伸反应探针mix的浓度，按照各型分子量大小进行线性关系调节，总浓度约为8-15M，最终浓度约为0.84-1.57M。
Claims (1)
1.一种检测生物样品中病原体DNA的试剂盒，所述试剂盒中包含合成的多核苷酸试剂，所述多核苷酸为HPV基因型的特异基因序列的正向和反向引物序列SEQID NO.1-SEQ ID NO.94；碱基延伸探针SEQ ID NO.97-SEQ ID NO.144；以及DNA质控引物序列为SEQ IDNO.95和SEQ ID NO.96，探针序列SEQ ID NO.145。
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