CN109402298A - 一种用于定性检测人宫颈脱落细胞中hpv感染的试剂盒 - Google Patents
一种用于定性检测人宫颈脱落细胞中hpv感染的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于检测人宫颈脱落细胞中人乳头瘤病毒核酸的试剂盒，包括用于检测HPV6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、61、66、68、70、72、73、81、82、89、83、67、55、84、34型等35个型别的一个或多个型别的检测试剂。使用本发明的试剂盒可在同一个反应条件下同时对35个与HPV病毒相关基因的型别进行高通量检测。检测的特异性强，灵敏度高，最低检测限为1ng/μL，用时短，从标本送检到得出结果可在2小时以内完成。
Description
技术领域
本发明涉及人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)核酸检测领域，更特别地，涉及一种用于定性检测人宫颈脱落细胞中HPV感染的试剂盒。
背景技术
人类乳头瘤病毒(human papillomaviruses，HPV)感染与人类多种肿瘤特别是宫颈癌的发生、发展密切有关。而宫颈癌为女性最常见的癌症之一，其发病率仅次于乳腺癌。全球每年新发病例约40万且有超过20万妇女死于该病。在发展中国家，由于宫颈癌筛查工作的不完善，其发生率是发达国家的6倍。近年，年轻宫颈癌患者有明显上升趋势，发病以每年2％～3％速度增长，对妇女的身心健康造成极大的危害。因此，对宫颈癌进行早期筛查的一项重要内容就是对HPV的检测。
HPV是一种具有种属特异性的嗜上皮病毒，属双链闭环的小DNA病毒。人类是HPV的唯一宿主，它定向感染人体皮肤及粘膜的复层鳞状上皮内，具有高度的宿主特异亲和力。
国际癌症研究中心(IARC)专题讨论会(1995年)明确提出，HPV感染是宫颈癌的主要病因。目前鉴定出HPV亚型100余种，其中30余种与宫颈感染和病变有关，根据其致病力的大小分为高危型和低危型两种：将HPV6、11、40、42等归为低危型，主要引起生殖道、肛周皮肤和阴道下部的外生殖性湿疣类病变、扁平湿疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤变(CINI)；高危型主要为HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82等，主要导致高度子宫颈上皮内瘤变(CINII、CINIII)和宫颈癌的发生在，，尤其是HPV16和18型。全球范围的研究结果显示，在99.7％的宫颈癌患者体内检测到高危型人乳头瘤病毒DNA的存其中HPV16、18、31、45型的感染占80％。因此，检测出样本中的具体HPV亚型对于宫颈癌的防治具有重要的指导意义。
长期以来，细胞学筛查是宫颈癌筛查的唯一或主要方式，近年来，HPV感染的检查方法也由组织细胞水平发展到分子水平。
目前国内临床主要的HPV检测的常见方法包括测序法、杂交捕获法、基因芯片法及荧光PCR法。测序法的结果相对准确，但操作繁琐。杂交捕获法如Digene公司的HybridCaptureII已在临床上应用，但检测时间长，一次实验一般要5-6小时、灵敏度低、操作复杂、检测基因型少且需要特定昂贵的仪器，成本高，也不适用于临床。
荧光定量PCR(FQ-PCR)在常规PCR的基础上把基因扩增、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程在单管封闭条件下进行，实现了实时动态检测和结果自动化分析，从根本上解决了扩增产物污染和不能定量的问题。该方法通过探针杂交进一步提高了HPV DNA检测的特异性，具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点，成本适中，几乎不会造成污染，适用于临床工作和大规模筛查。然而，目前该方法主要针对HPV6、11、16和18感染，易漏诊其他HPV亚型，也不能明确区分多种型别。
因此，临床上需要一种能一次性快速、准确检测多种常见型别的HPV试剂盒。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种用于定性检测HPV感染的试剂盒，包括用于检测HPV6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、61、66、68、70、72、73、81、82、89、83、67、55、84、34型中的一个或多个型别的检测试剂。
在一个优选实施方案中，所述检测试剂包括用于扩增覆盖所述基因的突变位点的引物对，以及检测所述型别的探针。
在一个优选实施方案中，用于检测HPV6型的引物对如SEQ ID NO 01和02所示，探针如SEQ ID NO 071所示；
用于检测HPV11型的引物对如SEQ ID NO 03和04所示，探针如SEQ ID NO 072所示；
用于检测HPV16型的引物对如SEQ ID NO 05和06所示，探针如SEQ ID NO 73所示；
用于检测HPV18型的引物对如SEQ ID NO 07和08所示，探针如SEQ ID NO 74所示；
用于检测HPV26型的引物对如SEQ ID NO 09和10所示，探针如SEQ ID NO 75所示；
用于检测HPV31型的引物对如SEQ ID NO 11和12所示，探针如SEQ ID NO 76所示；
用于检测HPV33型的引物对如SEQ ID NO 13和14所示，探针如SEQ ID NO 77所示；
用于检测HPV35型的引物对如SEQ ID NO 15和16所示，探针如SEQ ID NO 78所示；
用于检测HPV39型的引物对如SEQ ID NO 17和18所示，探针如SEQ ID NO 79所示；
用于检测HPV40型的引物对如SEQ ID NO 19和20所示，探针如SEQ ID NO 80所示；
用于检测HPV42型的引物对如SEQ ID NO 21和22所示，探针如SEQ ID NO 81所示；
用于检测HPV43型的引物对如SEQ ID NO 23和24所示，探针如SEQ ID NO 82所示；
用于检测HPV44型的引物对如SEQ ID NO 25和26所示，探针如SEQ ID NO 83所示；
用于检测HPV45型的引物对如SEQ ID NO 27和28所示，探针如SEQ ID NO 84所示；
用于检测HPV51型的引物对如SEQ ID NO 29和30所示，探针如SEQ ID NO 85所示；
用于检测HPV52型的引物对如SEQ ID NO 31和32所示，探针如SEQ ID NO 86所示；
用于检测HPV53型的引物对如SEQ ID NO 33和34所示，探针如SEQ ID NO 87所示；
用于检测HPV54型的引物对如SEQ ID NO 35和36所示，探针如SEQ ID NO 88所示；
用于检测HPV56型的引物对如SEQ ID NO 37和38所示，探针如SEQ ID NO 89所示；
用于检测HPV58型的引物对如SEQ ID NO 39和40所示，探针如SEQ ID NO 90所示；
用于检测HPV59型的引物对如SEQ ID NO 41和42所示，探针如SEQ ID NO 91所示；
用于检测HPV61型的引物对如SEQ ID NO 43和44所示，探针如SEQ ID NO 92所示；
用于检测HPV66型的引物对如SEQ ID NO 45和46所示，探针如SEQ ID NO 93所示；
用于检测HPV68型的引物对如SEQ ID NO 47和48所示，探针如SEQ ID NO 94所示；
用于检测HPV70型的引物对如SEQ ID NO 49和50所示，探针如SEQ ID NO 95所示；
用于检测HPV72型的引物对如SEQ ID NO 51和52所示，探针如SEQ ID NO 96所示；
用于检测HPV73型的引物对如SEQ ID NO 53和54所示，探针如SEQ ID NO 97所示；
用于检测HPV81型的引物对如SEQ ID NO 55和56所示，探针如SEQ ID NO 98所示；
用于检测HPV82型的引物对如SEQ ID NO 57和58所示，探针如SEQ ID NO 99所示；
用于检测HPV89型的引物对如SEQ ID NO 59和60所示，探针如SEQ ID NO 100所示；
用于检测HPV83型的引物对如SEQ ID NO 61和62所示，探针如SEQ ID NO 101所示；
用于检测HPV67型的引物对如SEQ ID NO 63和64所示，探针如SEQ ID NO 102所示；
用于检测HPV55型的引物对如SEQ ID NO 65和66所示，探针如SEQ ID NO 103所示；
用于检测HPV84型的引物对如SEQ ID NO 67和68所示，探针如SEQ ID NO 104所示；
用于检测HPV34型的引物对如SEQ ID NO 69和70所示，探针如SEQ ID NO 105所示。
本试剂盒使用TaqMan探针实时荧光PCR技术，并结合微流控芯片及微流控核酸检测仪，能一次检测35种常见型别的HPV，大大提高了HPV的检测效率，实现对宫颈癌HPV病毒的早期检测，操作简单，具有高通量、高精度的优点。
使用本发明的试剂盒可在同一个反应条件下同时对35个人乳头瘤病毒(HPV)的型别进行高通量检测。检测的特异性强，灵敏度高，最低检测限为1ng/μL，用时短，从标本送检到得出结果可在2小时以内完成。适用于对人乳头瘤病毒的检测及筛查。
附图说明
图1为使用实施例中的试剂盒检测得到的HPV病毒核酸分析结果的散点图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.与人乳头瘤病毒(HPV)相关病毒核酸型别的确定
我们在研究过程中发现人乳头瘤病毒(HPV)分型有100多个，本试剂盒主要检测HPV6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、61、66、68、70、72、73、81、82、89、83、67、55、84、34型等35个型别的一个或多个型别。
2.突变位点的检测
2.1检测技术和仪器
为了能够快速高通量地检测这些突变，我们采用微流控技术，包括微流控芯片和微流控平台两个部分。
微流控芯片是将微流控通道、阀门和反应仓集成在一张芯片上，通过气压、温度控制系统及荧光分析系统自动完成反应体系混合，实现多达9216个PCR反应。大大降低了手工加样的步骤和时间，完成整个过程约2小时。
微流控芯片上都精密设置了许多微通道(样本、试剂、控制液通道)和微反应仓，预先在进样口分别加入试剂、样本和控制液，通过气压控制可实现芯片上的不同阀门开关，精准控制溶液在芯片通道内流动，在反应仓中混合，最多可以实现9216个nL级的PCR反应仓，进行实时荧光定量PCR反应。
我们采用的微流控平台由Ascend MF600型微流控核酸扩增仪(对应Fluidigm的Juno)和Ascend MF800型微流控核酸检测仪(对应Fluidigm的Biomark)组成。
Ascend MF600型微流控核酸扩增仪(Juno)PCR与普通扩增仪的区别主要在于微流控技术，原理如下：
微流控核酸扩增仪所使用芯片将微流控通道、阀门和反应仓集成在一张芯片上，通过微流控核酸扩增仪气压控制系统和温度控制系统自动完成反应体系混合和PCR反应。
微流控核酸扩增仪嵌入式PC控制系统可校准和监测仪器的性能，识别和记录芯片条码。利用触摸LCD显示屏，自定义和选择需要的试验程序。仪器采用的芯片将微流控通道、阀门和反应仓集成在一张芯片上，通过气压控制系统控制样本及试剂在微流控芯片每一个微小的反应室内的精准流动和混合，温控模块实现PCR过程中快速、精确、均匀的升温/降温，在芯片上实现微流控PCR反应。完全取代人工操作，实现反应体系混合和PCR反应的全自动化。微流控核酸扩增仪包括气压控制系统及温控控制模块，气压控制系统通过真空泵的气压控制液体在微流控芯片中的精准流动，可作为芯片样本及试剂预处理控制器，嵌入式PC可校准和监测仪器的性能；温控模块控制PCR过程中快速、精确、均匀的升温/降温。用户可利用触摸LCD显示屏，自定义和选择需要的试验程序。
微流控核酸检测仪原理类似于实时荧光定量PCR仪。原理如下：微流控核酸检测仪所使用芯片将微流控通道、阀门和反应仓集成在一张芯片上，可自动完成PCR反应及结果分析。在PCR反应刚开始时，试剂量充足，模板和产物的浓度都足够低，产物不与引物竞争，扩增以恒定的指数速率增长。后期反应速率不再呈指数增长，扩增呈可变线性增长，进入线性增长期。在平台期，扩增速率趋近于零。
2.2检测引物和探针设计
微流控芯片与平台的结合可实现高通量快速的检测。但是，在一张芯片上，所有反应体系的反应条件是一致的，需要在引物和探针方面进行综合考虑，实现所有24种检测反应能在同一个反应条件下得到有效并且精确的检测结果。这给一次性检测不同的位点带来了很大难度。
我们花了大量时间进行研究和实验验证，设计了以下引物和探针以实现一次性对上述35个行呗进行有效而精确的检测。引物和探针的如表1所示。
表1检测引物和探针
2.3反应体系组成和反应条件。
所述模板可以为宫颈脱落细胞。
反应条件如表2所示。
表2反应条件
3具体检测示例
35对引物及35个探针由英潍捷基合成；192.24芯片购自Fluidigm公司；ROX参比染料购自Life公司；特异性PCR反应液购自Applied Biosystems公司。
仪器：微流控核酸扩增仪(Juno)、微流控核酸检测仪(Biomark)、2720型PCR扩增仪，涡旋振荡器，离心机。
采用本试剂盒以临床已确认型别的共计200例质粒样本，建立微流控荧光PCR检测35种HPV核酸型别，最终以循环结束后散点图作为结果判断的标准。
配制引物探针mixX，其中X表示数字1-35，分别代表第一至第三十五个型别的位点。按照表3分别配制35个位点的引物探针mix。将引物探针mixX按照表4所示配制10×试剂，分别标记为Assay 1-35。按表5配制样本预混液，然后将样本预混液与模板配制成最终反应体系(表6)。
表3引物探针mix的配制
表4 10×试剂的配制
表5样本预混液的配制
表6最终反应体系的配制
| 组分 | 反应体积(μL) |
| DNA | 1.6 |
| 样本预混液 | 2.4 |
| 总体积 | 4.0 |
将反应体系上载至微流控芯片上，于微流控平台中进行进行荧光PCR检测反应，反应条件如表2所示。
图1为HPV16型分析结果的实时荧光图。统计后如表7。结果显示，本发明的试剂盒检测结果与实际相符。
表7 200例质粒样本检测结果统计
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东腾飞基因科技股份有限公司
<120> 一种用于检测HPV病毒核酸的试剂盒
<160> 105
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgcagccaaa accagtatca at 22
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ctcccgcccc agtatccaaa gtaat 25
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cgccgccaag cctaaggacg a 21
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gccaagccta aggacgagct 20
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ataacaatgg catttgctgg cat 23
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ctgcatgtct gaggtattcc tta 23
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cctcccccaa atggtacatt ag 22
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atggcctata tacacacaat gaatcc 26
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aggcaattgc ttgtcaaaaa ca 22
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gcgtactagt gacagcaagg tatatctt 28
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acatcacagg ctgtaacttg tcaaa 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttgctggaa caatcagctt ttt 23
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gactggcaat ttggccttac c 21
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tgaccttaag gaacggtttt catc 24
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<212> DNA
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ttacgcaggg aacaaatgtt tg 22
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<212> DNA
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ccattaggac gcaaatttct gtt 23
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ggctcgcaga cgtcctacta tag 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctgcctccc aatcctgttt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 21
<212> DNA
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<212> DNA
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cctccaccag ccttgatga 19
<210> 102
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<400> 102
ccccgtgtag tggtaacagt aatg 24
<210> 103
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<212> DNA
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caggcaatac tgcatcgcca tcca 24
<210> 105
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
tgatactact agaagcacaa act 23
Claims (3)
1.一种用于定性检测人宫颈脱落细胞中HPV感染的试剂盒，其特征在于，包括用于检测HPV6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、61、66、68、70、72、73、81、82、89、83、67、55、84、34型中的一个或多个型别的检测试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括用于扩增覆盖所述基因的突变位点的引物对，以及检测所述型别的探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，用于检测HPV6型的引物对如SEQ ID NO01和02所示，探针如SEQ ID NO 071所示；
用于检测HPV11型的引物对如SEQ ID NO 03和04所示，探针如SEQ ID NO 072所示；
用于检测HPV16型的引物对如SEQ ID NO 05和06所示，探针如SEQ ID NO 73所示；
用于检测HPV18型的引物对如SEQ ID NO 07和08所示，探针如SEQ ID NO 74所示；
用于检测HPV26型的引物对如SEQ ID NO 09和10所示，探针如SEQ ID NO 75所示；
用于检测HPV31型的引物对如SEQ ID NO 11和12所示，探针如SEQ ID NO 76所示；
用于检测HPV33型的引物对如SEQ ID NO 13和14所示，探针如SEQ ID NO 77所示；
用于检测HPV35型的引物对如SEQ ID NO 15和16所示，探针如SEQ ID NO 78所示；
用于检测HPV39型的引物对如SEQ ID NO 17和18所示，探针如SEQ ID NO 79所示；
用于检测HPV40型的引物对如SEQ ID NO 19和20所示，探针如SEQ ID NO 80所示；
用于检测HPV42型的引物对如SEQ ID NO 21和22所示，探针如SEQ ID NO 81所示；
用于检测HPV43型的引物对如SEQ ID NO 23和24所示，探针如SEQ ID NO 82所示；
用于检测HPV44型的引物对如SEQ ID NO 25和26所示，探针如SEQ ID NO 83所示；
用于检测HPV45型的引物对如SEQ ID NO 27和28所示，探针如SEQ ID NO 84所示；
用于检测HPV51型的引物对如SEQ ID NO 29和30所示，探针如SEQ ID NO 85所示；
用于检测HPV52型的引物对如SEQ ID NO 31和32所示，探针如SEQ ID NO 86所示；
用于检测HPV53型的引物对如SEQ ID NO 33和34所示，探针如SEQ ID NO 87所示；
用于检测HPV54型的引物对如SEQ ID NO 35和36所示，探针如SEQ ID NO 88所示；
用于检测HPV56型的引物对如SEQ ID NO 37和38所示，探针如SEQ ID NO 89所示；
用于检测HPV58型的引物对如SEQ ID NO 39和40所示，探针如SEQ ID NO 90所示；
用于检测HPV59型的引物对如SEQ ID NO 41和42所示，探针如SEQ ID NO 91所示；
用于检测HPV61型的引物对如SEQ ID NO 43和44所示，探针如SEQ ID NO 92所示；
用于检测HPV66型的引物对如SEQ ID NO 45和46所示，探针如SEQ ID NO 93所示；
用于检测HPV68型的引物对如SEQ ID NO 47和48所示，探针如SEQ ID NO 94所示；
用于检测HPV70型的引物对如SEQ ID NO 49和50所示，探针如SEQ ID NO 95所示；
用于检测HPV72型的引物对如SEQ ID NO 51和52所示，探针如SEQ ID NO 96所示；
用于检测HPV73型的引物对如SEQ ID NO 53和54所示，探针如SEQ ID NO 97所示；
用于检测HPV81型的引物对如SEQ ID NO 55和56所示，探针如SEQ ID NO 98所示；
用于检测HPV82型的引物对如SEQ ID NO 57和58所示，探针如SEQ ID NO 99所示；
用于检测HPV89型的引物对如SEQ ID NO 59和60所示，探针如SEQ ID NO 100所示；
用于检测HPV83型的引物对如SEQ ID NO 61和62所示，探针如SEQ ID NO 101所示；
用于检测HPV67型的引物对如SEQ ID NO 63和64所示，探针如SEQ ID NO 102所示；
用于检测HPV55型的引物对如SEQ ID NO 65和66所示，探针如SEQ ID NO 103所示；
用于检测HPV84型的引物对如SEQ ID NO 67和68所示，探针如SEQ ID NO 104所示；
或者，用于检测HPV34型的引物对如SEQ ID NO 69和70所示，探针如SEQ ID NO 105所示。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190301 |