CN112575123B - 引物组合、探针组合以及人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
引物组合、探针组合以及人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒。本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种用于诊断高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染的PCR荧光探针检测方法，利用本方法制备的试剂盒采用磁珠法提取宫颈脱落细胞中的人乳头瘤病毒核酸，并进行实时荧光聚合酶链反应，对样本中的14种HPV DNA型别进行检测并分型HPV16/18型。同时联合细胞学检查进行女性宫颈癌筛查。本试剂盒可用于患者宫颈细胞样本中高危型人乳头瘤病毒的定性检测，在检测HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68的同时分型鉴定HPV16和HPV18型。本试剂盒定性检测患者宫颈细胞中的高危型HPV DNA，确定患者是否需要行阴道镜检查。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及引物组合、探针组合以及人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一类分子量较小的无包膜的双链环状DNA病毒，专性侵染和寄生人体生殖器官及其它组织器官的上皮细胞。目前已经鉴定出的HPV约有150种亚型，根据其致病性大小分为低危型和高危型。低危型HPV主要引起肛门皮肤及男性外生殖器、女性大小阴唇、尿道口、阴道下段的外生性疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤。高危型HPV除可引起外生殖器疣外，更重要的是引起外生殖器癌、宫颈癌及高度子宫颈上皮内瘤变，其病毒亚型主要有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68型。
HPV在人群中极易传播扩散，可通过直接或间接接触交叉传染，其感染部位隐蔽，发病隐匿，不易早期发现，可致多种增生性病变，在女性生殖系统所引起的最常见的恶性肿瘤为宫颈癌。宫颈癌是妇女中最常见的恶性肿瘤，主要发生于多产妇女的早期绝经期。每年全世界有约19万人死于宫颈癌，而其中超过3/4的死亡发生在发展中国家。宫颈癌的发生率在所有癌症中排名第七，而在妇女中排名第三，仅次于乳腺癌和大肠癌。在发展中国家，少于50％的患宫颈癌的妇女能存活5年以上，而在发达国家，5年存活率是66％左右。在过去的10年中，估计全世界每年有将近371000例新的侵入性宫颈癌，占到整个妇女癌症的10％。宫颈癌高发病区主要位于中南美洲、南非、东非和加勒比地区，这些地区每年的平均发病率达到万分之四。东欧和北美的发病率低于每年万分之三，但在巴西东北部，发病率要比北美高10倍，一生中累积风险性可高达10％。
由于感染HPV是引起宫颈癌的一大原因，所以现在这一研究已成为宫颈癌预防的前沿学科。在西方工业化国家，对于所有的恶性肿瘤疾病，宫颈癌也许是公共预防措施做得最好的例子。对宫颈癌的病因学研究可知，高危HPV持续感染是子宫颈癌的主要致病因素，99.7％宫颈癌患者存在HPV感染。临床研究显示，从HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变并最终发展为宫颈癌大约需要8-10年。因此筛查是目前预防和早期诊断宫颈癌的主要手段。在检出的所有型别中主要有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68型。其中HPV16和HPV 18这两种高危型别与70％的宫颈癌病例相关。早期宫颈病变的治疗效果远比宫颈癌的治疗效果要好得多，因此，快速、准确的检测出HPV高危型的感染，且能够对16型和18型准确分型，对于早期治疗和降低宫颈癌的发病率和死亡率等具有重要的意义。
现有宫颈癌的筛查技术可分两类，基于形态学的方法是在细胞或组织水平检查以识别不正常，基于分子生物学的方法是检查子宫颈上皮瘤的宫颈癌的标志物。进一步区分这些方法可根据他们释放借助于显微镜或物理和电光学的特性。本文总结了当前各种宫颈癌筛查的方法，而其中最关联或最有先兆的方法总结在如下几节。
宫颈巴氏(Pap)细胞学：Pap检测是最早的癌症检测方法之一，毫无疑问，它同时也是现代医学中最有成效的一种方法。Pap检测主要是检查宫颈癌先兆，通过重复检测，可以密切监测可疑的或低度异常，或提议病人立即进行阴道镜、细胞切片检查，并对高度或严重的损害进行治疗。通过Pap检测预防侵入性宫颈癌，可在它还只是上皮组织时就阻止其恶性发展。
薄层液相为基础的细胞学：ThinPrepTM和Autocyte Prep系统是两种基于液体的用于代替传统Pap涂片的制片方法。从子宫颈取得的样本被溶于细胞保存液而不是直接涂在玻璃片上。通过这种方法几乎所有的细胞都可给予检测。在传统Pap涂片法中，约20％从子宫颈收集的细胞会被置于玻璃片上，而在薄层样本中，多余的血细胞和炎症细胞会被裂解，而含有约50000细胞的随机样本会由自动细胞处理机转移到玻璃片，并形成一薄层涂片，这涂片经染色后由细胞技术员进行检查。这种自动的薄层技术可以使涂片更清晰、均一，并且没有血细胞、炎症细胞碎片和细胞集落这些影响显微镜检测的因子，从而提高对非典型细胞、癌症先兆和癌症的检出率。
自动化细胞学：自动化的系统正处于测试和市场推广的阶段。这些系统包括一种能自动把宫颈癌细胞悬浮液制成标准薄层玻璃片的装置，及通过计算机辅助扫描来首先发现不正常细胞，并把这些涂片分离处理以便作进一步的人工细胞学检测。这些方法最关键的优点是可减轻因缺乏合格的细胞学家而引起的人员紧张。现在在北美和欧洲，有许多私人公司赞助的比较性实验正在验证这些自动化机器的筛查效率和经济效益。
醋酸法目视筛查(VIA)：在低收入国家，目查法已成为一种技术要求低、能代替细胞学筛查的方法。这些目查法包括直接检查子宫颈，借助醋酸的目查法(也称为直接目查DVI,子宫镜和辅助目查)，低倍镜醋酸目查(VIAM)，Lugol’s碘酒目查法(VILI)和子宫颈图像。
筛查中检查HPV：目前研究人员正在比较HPV检测与Pap检测作为宫颈癌筛查方法的优缺点。由于HPV难以进行体外培养，而且不是所有的感染者都有可检测的抗体反应。因此，HPV DNA的检测是非介入式检测HPV感染最好方法。目前HPV检测的方法主要有三类：第一类是直接探针结合，如southern印迹和点印迹，原位杂交过滤法等。这些方法普遍存在灵敏度低，操作繁琐等缺点。
第二类是信号放大法，大多数的研究所采用的是唯一经FDA批准的Digene的第一和第二代Hybrid Capture(HC)系统。另一些用不同的PCR方法来检测HPV。相比于HC法，PCR的检测灵敏度更高，但第二代HC2的检测灵敏度已大大提高，接近于PCR的水平。HC2检查是通过微孔板化学发光信号扩增的核酸杂交技术，定性检查子宫颈样本中高危HPV病毒，这些病毒通常与宫颈癌有联系，它们是：16、18、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。
第三类是基于PCR的把序列片段扩增，PCR方法是用型别特异或通用引物扩增目标片段并与特异性探针杂交。实时定量PCR(real-time quantitative PCR)技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术，所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。实时PCR技术较之与以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。另外，它还可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增，即多重扩增。
定量PCR技术所使用的探针有多种，包括：水解探针或Taqman探针、分子信标、scorpions等。相比较于Taqman探针，后期发明的Taqman-MGB探针、分子信标、scorpions等具有分析灵敏度高等优点，缺点在于价格昂贵。
目前使用荧光定量PCR进行HPV基因检测的技术包括：
1.GenoID公司的GenoID Real-Time HPV Assay(GenoID)试剂盒，有两个试剂盒构成，分别检测14高危(16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68)和5个低危(6,11,42,43,44(Lightcycler only))。
2.Abbott公司的RealTime High Risk HPV test试剂盒，能检测14高危(16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68)。
3.港龙公司的人乳头瘤病毒(HPV)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒，由两个试剂盒构成，分别检测13个高危(16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68)和5个低危(6,11,42,43,44)。
4.湖南圣湘生物科技有限公司的一种HPV高危型分型荧光PCR检测试剂盒，由6个部分组成，需要8管检测，分别检测15个高危16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68型的DNA核酸片段。
但是上述技术存在很多问题：
1)成本高。本试剂盒1个测试可以完成14个型别的覆盖，而湖南圣湘需要8个测试完成所消耗的酶量为本试剂盒8倍。
2)储存温度要求高。目前市面同类试剂盒一般储存在-20℃1年，本试剂盒可以实现2～8℃保存1年。
3)操作复杂。湖南圣湘需要8个测试完成一个样本测试，而本试剂盒1个测试就能完成，操作简单。
4)灵敏度低。临界浓度样本对比结果，本试剂盒检测灵敏度高于同类试剂盒。
因此，提供一种能检测14种高危型人乳头状瘤病毒并能对16、18型准确分型的检测试剂盒，具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种高危型人乳头瘤病毒核酸检测与16/18分型试剂盒。本发明在Taqman探针的基础上，通过优化探针序列和PCR反应体系，使用Taqman探针同样达到准确检测的目的。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了引物探针组合，包括：
引物或其组合；和/或
探针或其组合；
(1)所述引物或其组合，具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
Ⅰ、具有SEQ ID No.1～30任意所示的核苷酸序列；或
Ⅱ、具有SEQ ID No.1～30任意所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列或具有SEQ ID No.1～30任意所示的核苷酸序列功能相近的核苷酸序列；或
III、与SEQ ID No.1～30任意所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或具有SEQ ID No.1～30任意所示的核苷酸序列功能相近的核苷酸序列；或
IV、如Ⅰ、Ⅱ或III所示序列的互补序列；
(2)所述探针或其组合，具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
V、具有SEQ ID No.31～37任意所示的核苷酸序列；或
VI、具有SEQ ID No.31～37任意所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列或具有SEQ ID No.31～37任意所示的核苷酸序列功能相近的核苷酸序列；或
VII、与SEQ ID No.31～37任意所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或具有SEQ ID No.31～37任意所示的核苷酸序列功能相近的核苷酸序列；或
VIII、如V、VI或VII所示序列的互补序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述探针或其组合包括：
12个型别探针，具有SEQ ID No.31～34任意所示的核苷酸序列；所述12个型别包括HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68；
16型探针，具有如SEQ ID No.35所示的核苷酸序列；
18型探针，具有如SEQ ID No.36所示的核苷酸序列；
内标探针，具有如SEQ ID No.37所示的核苷酸序列。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的引物探针组合在制备检测人乳头瘤病毒或对人乳头瘤病毒分型的试剂或试剂盒中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述人乳头瘤病毒包括高危型人乳头瘤病毒HPV16型、HPV18型、HPV31型、HPV33型、HPV35型、HPV39型、HPV45型、HPV51型、HPV52型、HPV56型、HPV58型、HPV59型、HPV66型、HPV68型中的一种或多种。
本发明还提供了检测试剂，包括所述的引物探针组合以及可接受的助剂。
在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂包括PCR第一反应液和PCR第二反应液；
以体系总量为20μL计，所述PCR第一反应液包括：如所述的引物探针组合中的引物或探针的含量分别为0.1～0.5μM；Trinice 30～100mM，KOAc 100～150mM，Tween200.005％～0.1％(v/v)，甘油0.1％～1％(v/v)，NaN30.1％～5％(w/v)，UDG酶1～10μL，rTth 1～5μL，dNTPs 0.11～0.6mM，DMSO 5～50μL，余量为超纯水；
以体系总量为10μL计，所述PCR第二反应液包括：醋酸锰1～6mM，醋酸镁2～10mM，NaN30.01％～0.1％(w/v)，余量为超纯水。
本发明还提供了所述的试剂在制备检测人乳头瘤病毒或对人乳头瘤病毒分型的试剂盒中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述人乳头瘤病毒包括高危型人乳头瘤病毒HPV16型、HPV18型、HPV31型、HPV33型、HPV35型、HPV39型、HPV45型、HPV51型、HPV52型、HPV56型、HPV58型、HPV59型、HPV66型、HPV68型中的一种或多种。
更重要的是，本发明还提供了试剂盒，包括所述的引物探针组合或所述的试剂。
本发明提供一种能检测14种高危型人乳头状瘤病毒并能对16、18型准确分型的检测试剂盒，它至少由以下组分组成：①PCR反应液1：各型别探针及合并探针0.1～0.5μM，各型别引物0.1～0.5μM，Trinice 30～100mM，KOAc 100～150mM，Tween200.005％～0.1％，甘油0.1％～1％，NaN30.1％～5％，UDG酶1～10μL，rTth 1～5μL，dNTPs 0.11～0.6mM，DMSO 5～50μL，超纯水；②PCR反应液2：醋酸锰1～6mM，醋酸镁2～10mM，NaN3 0.01％～0.1％，超纯水。本发明在Taqman探针的基础上，通过优化探针序列和PCR反应体系，使用Taqman探针同样达到准确检测的目的。
本试剂盒1个测试可以完成14个型别的覆盖，操作简单，检测灵敏度高于同类试剂盒，可以实现2～8℃保存1年。本发明试剂盒具有很好的特异性，检测灵敏度不高于1.0E+04copies/反应。
本发明的有益效果包括但不限于：
1)成本低。本试剂盒1个测试可以完成14个型别的覆盖，而湖南圣湘需要8个测试完成所消耗的酶量为本试剂盒8倍。
2)储存温度要求低。目前市面同类试剂盒一般储存在-20℃1年，本试剂盒可以实现2～8℃保存1年。
3)操作简单。湖南圣湘需要8个测试完成一个样本测试，而本试剂盒1个测试就能完成，操作简单。
4)灵敏度高。临界浓度样本对比结果，本试剂盒检测灵敏度高于同类试剂盒
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示FAM通道(12个型别)扩增曲线；
图2示ROX通道(18型)扩增曲线；
图3示CY5通道(16型)扩增曲线；
图4示分别使用两对HPV16型引物探针进行扩增的结果；其中，组合1为本发明的引物序列；组合2为对照序列；
图5示分别使用两对HPV33型引物探针进行扩增的结果；其中，组合1为对照序列；组合2为本发明的引物序列；
图6示分别使用两对HPV35型引物探针进行扩增的结果；其中，组合1为本发明的引物序列；组合2为对照序列；
图7示分别使用两对HPV39型引物探针进行扩增的结果；其中，组合1为对照序列；组合2为本发明的引物序列；
图8示分别使用两对HPV45型引物探针进行扩增的结果；其中，组合1为对照序列1；组合2为本发明的引物序列；组合3为对照序列2；
图9示分别使用两对HPV56型引物探针进行扩增的结果；其中，组合1为对照序列；组合2为本发明的引物序列；
图10示分别使用两对HPV58型引物探针进行扩增的结果；其中，组合1为对照序列1；组合2为对照序列2；组合3为本发明的引物序列；
图11示分别使用两对HPV68型引物探针进行扩增的结果；其中，组合1为对照序列；组合2为本发明的引物序列。
具体实施方式
本发明公开了一种高危型人乳头瘤病毒核酸检测与16/18分型试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本实施例提供一种能检测14种高危型人乳头状瘤病毒并能对16、18型准确分型的检测试剂盒，它至少由以下组分组成：
①PCR反应液1：各型别探针及合并探针0.1～0.5μM，各型别引物0.1～0.5μM，Trinice 30～100mM，KOAc 100～150mM，Tween200.005％～0.1％，甘油0.1％～1％，NaN30.1％～5％，UDG酶1～10μL，rTth 1～5μL，dNTPs 0.11～0.6mM，DMSO 5～50μL，超纯水。
所述引物探针的碱基序列如实施例1中表1所示。
②PCR反应液2：醋酸锰1～6mM，醋酸镁2～10mM，NaN30.01％～0.1％，超纯水。
高危型人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒用于检测疣体表面脱落细胞、妇女宫颈上皮细胞、生殖道分泌物等未知样本中的高危HPV-DNA的操作步骤是：
试剂准备
取出试剂盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温，混匀后备用；取2种HPVPCR反应液各n份，每份为20μL×n PCR反应液1与10μL×n份PCR反应液2，每份为30μL混匀为PCR-mix，瞬时离心后备用。其中，n＝待检样本数+质控品2个，所述质控品即为阴性对照和阳性对照。
阳性对照包含16、18、58型假病毒以及β-globin内标，浓度约为1E6copies/ml；阴性对照包含β-globin假病毒。
在样本处理区进行样本、质控品预处理：
①样本处理：待测样本使用安图生物公司核酸提取纯化试剂盒提取纯化后得到100μL纯化样本。
②加样：每个PCR反应管中分别加入上述处理后的待测样本、阴性对照、阳性对照，即每个样本分别取50μL样本和30μL PCR-mix加入一个八连管的PCR反应管中。
荧光PCR反应与结果分析(在荧光定量PCR扩增仪上进行)
①将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称。
②荧光检测通道选择：选择FAM通道(Reportere:FAM,Quencher:None)检测HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68-DNA；选择HEX(Reporter:HEX,Quencher:None)检测β-globin(内标)；选择ROX通道(Reporter:ROX,Quencher:None)检测HPV18-DNA；选择CY5通道(Reporter:CY5,Quencher:None)检测HPV16-DNA。
③荧光定量PCR反应如下。
④结果分析
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；仪器软件根据各样本Ct值大小，并按以下情况进行结果判定：1)FAM、ROX、CY5通道CT值≤33，且β-globin检测为阳性(HEX通道Ct值≤35)的样本判断为阳性。
2)FAM、ROX、CY5通道CT值≤33，且β-globin检测为阴性(HEX通道Ct值＞35)的样本，表明标本内没有宫颈上皮细胞，但该患者近期接触过HPV病毒，病人是否感染HPV不能确定。建议对此样本进行重新取样再进行实验。
3)FAM、ROX、CY5通道CT值＞35，且β-globin检测为阳性(HEX通道Ct值≤35)的样本判断为阴性。
4)FAM、ROX、CY5通道CT值＞35，且β-globin检测为阴性(HEX通道Ct值＞35)的样本，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重新取样再进行实验。
5)FAM、ROX、CY5通道CT值在33～35范围，且β-globin检测为阳性(HEX通道Ct值≤35)的样本，则表明该样本处于临界浓度，建议对此样本进行重新取样再进行实验，若结果相同则为阳性，否则为阴性。
6)FAM、ROX、CY5通道CT值在33～35范围，且β-globin检测为阴性(HEX通道Ct值＞35)的样本，表明标本内没有宫颈上皮细胞，病人是否感染HPV不能确定。建议对此样本进行重新取样再进行实验。
本发明仅能检测出相应型别HPV DNA，不能检测出其他型别HPV DNA及非HPV病原体DNA，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。本发明检测灵敏度不高于1.0E+04copies/反应。另外，对PCR反应体系进行了优化组合，利用UNG酶可以降解含dU的DNA链的特点，在PCR体系中添加了UNG酶和dUTP，可以预防前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性；利用内标监控DNA提取和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止样本检测假阴性。荧光定量PCR扩增结束后，通过曲线形状及Ct值判断HPV高危型-DNA阴阳性，检测结果可用于HPV高危型感染及分型的诊断和宫颈癌的早期筛查。
使用本发明中的试剂盒检测中国食品药品检定研究院的人乳头瘤病毒全基因组分型参考品、企业工作参考品，阴阳性参考品符合率为100％。且精密度试验表明：批内和批间重复性好，检测结果Ct值的变异系数<10％。另外，特异性试验表明：与常见性病病原体(CT、CMV、HSV、UU等)和低危型HPV(6、11、26、61、67、69等)无交叉反应。
本发明提供的高危型人乳头瘤病毒核酸检测与16/18分型试剂盒中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1)引物探针序列
表1
2)试剂盒组成成分：①PCR反应液1：各型别探针及合并探针，各型别引物，Trinice，KOAc，Tween20，甘油，NaN3，UDG酶，rTth，dNTPs，DMSO，超纯水。②PCR反应液2：醋酸锰，醋酸镁，NaN3，超纯水。
3)试剂盒成分浓度：①PCR反应液1：各型别探针及合并探针0.1～0.5μM，各型别引物0.1～0.5μM，Trinice 30～100mM，KOAc 100～150mM，Tween200.005％～0.1％，甘油0.1％～1％，NaN30.1％～5％，UDG酶1～10μL，rTth 1～5μL，dNTPs 0.11～0.6mM，DMSO5～50μL/L，超纯水。②PCR反应液2：醋酸锰1～6mM，醋酸镁2～10mM，NaN30.01％～0.1％，超纯水。
表2为具体实施过程中，各型别引物探针用量：
表2
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表3、表4为具体实施过程中，PCR反应液1与2各成分用量：
表3
表4
试验操作步骤如专利内容所写，具体反应条件如下：
表5
实施例2特异性实验：
使用TE溶液将人乳头瘤病毒全基因组分型参考品中不在检测范围内的HPV型别稀释至1×104-1×105copies/反应，进行检测，结果如下：
表6
结果分析：本试剂盒与不在检测范围内的HPV型别无交叉。
实施例3灵敏度实验：
使用TE溶液将人乳头瘤病毒全基因组分型参考品中在检测范围内的HPV型别稀释至1×103-1×104copies/反应，进行检测，其中缺乏型别使用人乳头瘤病毒L1分型参考品进行检测，结果如下：
表7
结果分析：在检测范围内的HPV型别均检出，且Ct值较高，检出能力较强。
对比例1其它引物探针组合补充材料
各反应液中各成分使用量与专利中实施案例中描述一致。
1、16型引物探针
HPV16型引物探针组合1为所用序列；
HPV16型引物探针组合2为对照序列：
HPV 16-F：5'-TGTCTCTTTGGCTGCCTAGTGA-3'(如SEQ ID No.38所示)
HPV 16-R：5'-GTGCAACATATTCATCCGTGCT-3'(如SEQ ID No.39所示)
使用上述引物与探针组合配制单重试剂，其上下游引物均为0.25μM，探针为0.5μM，PCR反应液中将HPV16型质粒稀释3个梯度(1E7、1E6、1E5copies/ml)，样本提取后分别使用上述两对HPV16型引物探针进行扩增，观察Ct值和扩增曲线的差异，扩增结果如图4所示：
从以上数据可看出，HPV16型引物探针组合2的在较高浓度水平扩增Ct值较组合1提前，但在较低浓度水平扩增高度明显比组合1低很多，综合考虑确定HPV16型的引物探针为组合1。
2、33型引物探针
HPV33型引物探针组合1为对照序列：
HPV33-F：5'-TTGGCTACAACGTGCACAAG-3'(如SEQ ID No.40所示)
HPV33-R：5'-GTCATATTAGTACTGCGAGTGGT-3'(如SEQ ID No.41所示)
HPV33型引物探针组合2为所用序列。
将HPV33型质粒稀释至1E5copies/mL，样本提取后分别使用上述两对HPV33型引物探针进行扩增，其上下游引物均为0.375μM，探针为1.375μM(4种探针均加入，Probe1、2、3、4分别为0.25μM、0.μM、0.375μM、0.25μM)，观察Ct值和扩增曲线的差异，扩增结果如图5所示：
从以上数据可以看出，HPV33型两种引物探针组合中组合2扩增高度明显高于组合1，综合考虑确定HPV33型的引物探针为组合2。
3、35型引物探针
HPV35型引物探针组合1为所用序列；
HPV35型引物探针组合2为对照序列：
HPV35-F：5'-CATATTGGTTGCAACGTGCACA-3'(如SEQ ID No.42所示)
HPV35-R：5'-ACACAGACATATTTGTACTACGGGT-3'(如SEQ ID No.43所示)
将HPV35型质粒稀释至1E7copies/mL，样本提取后分别使用上述两对HPV35型引物探针进行扩增，其上下游引物均为0.25μM，探针为1.375μM(4种探针均加入，Probe1、2、3、4分别为0.25μM、0.5μM、0.375μM、0.25μM)，观察Ct值和扩增线型的差异，扩增结果如图6所示：
从以上数据可以看出，HPV35型引物探针组合1的扩增高度明显高于组合2，且两者Ct值无明显差异，综合考虑确定HPV35型的引物探针为组合1。
4、39型引物探针
HPV39型引物探针组合1为对照序列；
HPV39-F：5'-ATTGGCTACATAAGGCCCAGG-3'(如SEQ ID No.44所示)
HPV39-R：5'-AATGTAAAGTTGGTACTACGGGT-3'(如SEQ ID No.45所示)
HPV39型引物探针组合2为所用序列。
将HPV39型质粒稀释至1E7copies/mL，提取三个复孔，提取后分别使用上述两对HPV39型引物探针进行扩增，其上下游引物均为0.375μM，探针为1.375μM(4种探针均加入，Probe1、2、3、4分别为0.25μM、0.5μM、0.375μM、0.25μM)，观察Ct值和扩增曲线的差异，扩增结果如图7所示：
从以上数据可以看出，HPV39型引物探针组合2的扩增高度明显高于组合1，且Ct值要提前，综合考虑确定HPV39型的引物探针为组合2。
5、45型引物探针
HPV45型引物探针组合1为对照序列1：
HPV45-F：5'-TTGGTTACATAAGGCCCAGG-3'(如SEQ ID No.46所示)
HPV45-R：5'-TAGTACTGCGGGTAGTGTCCA-3'(如SEQ ID No.47所示)
HPV45型引物探针组合2为所用序列；
HPV45型引物探针组合3为对照序列2：
HPV45-F：5'-GCCATATTGGTTACATAAGGCCC-3'(如SEQ ID No.48所示)
HPV45-R：5'-TTAGTACTGCGGGTAGTGTCC-3'(如SEQ ID No.49所示)
将HPV45型质粒稀释至1E7copies/mL，提取三个复孔，提取后分别使用上述两对HPV45型引物探针进行扩增，其上下游引物均为0.25μM，探针为1.375μM(4种探针均加入，Probe1、2、3、4分别为0.25μM、0.5μM、0.375μM、0.25μM)，观察Ct值和扩增曲线的差异，扩增结果如图8所示：
从以上数据可以看出，HPV45型3种引物探针组合的Ct值差异不大，但组合2和组合3的高度要明显高于组合1，综合考虑确定HPV45型的引物探针为组合2。
6、56型引物探针
HPV56型引物探针组合1为对照序列：
HPV56-F：5'-CCTTATTGGTTGCAACGTG-3'(如SEQ ID No.50所示)
HPV56-R：5'-AATAGTCATGTTAGTACTCCTAGT-3'(如SEQ ID No.51所示)
HPV56型引物探针组合2为所用序列。
将HPV56型质粒稀释至1E5copies/mL，提取三个复孔，提取后分别使用上述两对HPV56型引物探针进行扩增，其上下游引物均为0.375μM，探针为1.375μM(4种探针均加入，Probe1、2、3、4分别为0.25μM、0.5μM、0.375μM、0.25μM)，观察Ct值和扩增曲线的差异，扩增结果如图9所示：
从以上数据可以看出，HPV56型引物探针组合2的扩增高度明显高于组合1，两种引物探针组合的Ct值差异均较小，综合考虑确定HPV56型的引物探针为组合2。
7、58型引物探针
HPV58型引物探针组合1为对照序列1：
HPV58-R：5'-AAGCCTTATTGGCTACAGCGT-3'(如SEQ ID No.52所示)
P5244：5'-GTACTGCGAGTGGTATCCACC-3'(如SEQ ID No.53所示)
HPV58型引物探针组合2为对照序列2；
DP5926：5'-AAGCCTTATTGGCTACAGCGT-3'(如SEQ ID No.54所示)
P5938：5'-GTGCTACGAGTGGTATCAACC-3'(如SEQ ID No.55所示)
HPV58型引物探针组合3为所用序列。
将HPV58型质粒稀释至1E5copies/mL，提取三个复孔，提取后分别使用上述三对HPV58型引物探针进行扩增，其上下游引物均为0.375μM，探针为1.375μM(4种探针均加入，Probe1、2、3、4分别为0.25μM、0.5μM、0.375μM、0.25μM)，观察Ct值和扩增曲线的差异，扩增结果如图10所示：
从以上数据可以看出，HPV58型3种引物探针组合中组合3扩增高度明显高于组合1和组合2，Ct值也更提前，综合考虑确定HPV58型的引物探针为组合3。
8、68型引物探针
HPV68型引物探针组合1：
P5239：5'-CCTATTGGCTGCACAAGGCA-3'(如SEQ ID No.56所示)
P5240：5'-GTACTGCGAGTGGTATCCACAA-3'(如SEQ ID No.57所示)
HPV68型引物探针组合2为所用序列。
将HPV68型质粒稀释至1E5copies/mL，提取三个复孔，提取后分别使用上述两对HPV58型引物探针进行扩增，其上下游引物均为0.5μM，探针为1.375μM(4种探针均加入，Probe1、2、3、4分别为0.25μM、0.5μM、0.375μM、0.25μM)，观察Ct值和扩增曲线的差异，扩增结果如图11所示：
从以上数据可以看出，HPV68型引物探针组合2的扩增高度略优于组合1，且Ct值差异较小，综合考虑确定HPV68型的引物探针为组合2。
对比例2与其它试剂盒对比
与潮州凯普高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)国械注准20163401763进行对比。使用潮州凯普一次性使用宫颈细胞采集器粤械注准20162660713中细胞保存液分别梯度稀释16、18型临床样本，分别使用安图本试剂盒与凯普试剂盒进行平行检测，结果如下：
表8
| 16型 | 凯普 | 安图 |
| 靶标 | 靶标 | |
| 原液 | 29.82 | 22.58 |
| 10倍稀释 | 33.49 | 25.99 |
| 100倍稀释 | 36.96 | 28.56 |
| 1000倍稀释 | 阴性 | 32.07 |
表9
| 18型 | 凯普 | 安图 |
| 靶标 | 靶标 | |
| 原液 | 28.94 | 22.78 |
| 10倍稀释 | 32.17 | 26.07 |
| 100倍稀释 | 35.49 | 29.02 |
| 1000倍稀释 | 阴性 | 32.56 |
结果分析：样本经过梯度稀释后，分别使用安图与凯普试剂盒进行提取扩增，结果显示：低值样本安图检测阳性但凯普检测为阴性，表明安图试剂盒检出能力要比凯普较强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 郑州安图生物工程股份有限公司
<120> 引物组合、探针组合以及人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒
<130> MP2019803
<160> 58
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccacaataat ggcatttgtt ggggtaacca 30
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtctgcagt taaggttatt ttgcacagtt g 31
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcataacaat ggtgtttgct ggcataatca 30
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catctgcagt taaagtaata gtacacaact g 31
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggacacaat aatggtattt gttggggcaa tca 33
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgtctgcaga taatgttatt ttgcataact g 31
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aggtcataat aatggtattt gttggggcaa tca 33
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cttctgcagt taaggtaact ttgcatagtt g 31
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggccataata atggtatttg ttggagtaac ca 32
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
catctgctgt tagtgttatt ttacataact g 31
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agggccacaa caatggtata tgttggcata atca 34
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
catcagttgt taatgttaca gtacacagtt g 31
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agggccataa caatggtatt tgttggcata atca 34
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cctctgcagt taaagtaata gtgcacaact g 31
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agggtcacaa taatggcatt tgctggaaca atca 34
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cattctgtag ttaaagtaat tttacataac tg 32
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gggccacaat aatggcatat gttggggcaa tca 33
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
catcagctgt taatgtaatt ttgcacaatt g 31
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aggccataat aatggcattt gctggggtaa tca 33
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cctctgcaga caaagtaatt ttgcataatt g 31
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aggtcataac aatggcattt gctggggcaa tca 33
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tctctgcagt tagtgtaatt ttgcaaagct g 31
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggtttaaaca atggtatatg ttggcacaat ca 32
<210> 24
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cctctgtagt taatgttatt ttacacagtt g 31
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cacaccataa taatggcata tgctggggta atca 34
<210> 26
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cttctgcagt taaggttatt ttacaaagtt g 31
<210> 27
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agggacacaa caatggtatt tgttggcata atca 34
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
catcagttga caatgttata gtacacaact g 31
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gactctctct gcctattggt ctatt 25
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cccataacag catcaggagt g 21
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n（5）=y
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n（15）=w
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n（23）=i
<400> 31
taaantgtaa atcanattct tcnccatg 28
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n（5）=y
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n（15）=w
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n（23）=i
<400> 32
taaantgtaa atcanattct tcnacatg 28
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n（5）=y
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
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<400> 33
taaantgtaa atcanattcc tcnacatg 28
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n（5）=y
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n（15）=w
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n（23）=i
<400> 34
taaantgtaa atcanattcc tcnccatg 28
<210> 35
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
taaactgtaa atcatattcc tccccatg 28
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
taaactgcaa atcatattcc tcaacatg 28
<210> 37
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cagatcccca aaggactcaa agaacc 26
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tgtctctttg gctgcctagt ga 22
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gtgcaacata ttcatccgtg ct 22
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ttggctacaa cgtgcacaag 20
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gtcatattag tactgcgagt ggt 23
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
catattggtt gcaacgtgca ca 22
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
acacagacat atttgtacta cgggt 25
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
attggctaca taaggcccag g 21
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
aatgtaaagt tggtactacg ggt 23
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ttggttacat aaggcccagg 20
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tagtactgcg ggtagtgtcc a 21
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gccatattgg ttacataagg ccc 23
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ttagtactgc gggtagtgtc c 21
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ccttattggt tgcaacgtg 19
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
aatagtcatg ttagtactcc tagt 24
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
aagccttatt ggctacagcg t 21
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gtactgcgag tggtatccac c 21
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
aagccttatt ggctacagcg t 21
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gtgctacgag tggtatcaac c 21
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
cctattggct gcacaaggca 20
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
gtactgcgag tggtatccac aa 22
<210> 58
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
taaantgtaa atcanattct tcnccatg 28
Claims (4)
1.试剂，其特征在于，包括引物探针组合、PCR第一反应液和PCR第二反应液；
以体系总量为20μL计，所述PCR第一反应液包括：所述引物探针组合中的引物或探针的含量分别为0.1~0.5 μM，Trinice 30~100 mM，KOAc 100~150 mM，Tween20 0.005%~0.1%（v/v），甘油 0.1%~1%（v/v），NaN3 0.1%~5%（w/v），UDG酶 1~10μL，rTth 1~5μL ，dNTPs 0.11~0.6mM和DMSO 5~50μL，余量为超纯水；
以体系总量为10μL计，所述PCR第二反应液包括：醋酸锰 1~6mM，醋酸镁 2~10mM和NaN30.01%~0.1%（w/v），余量为超纯水；
所述引物探针组合包括：引物或其组合；和
探针或其组合；
（1）所述引物或其组合，具有SEQ ID No.1~30所示的核苷酸序列；
（2）所述探针或其组合，具有SEQ ID No.31~37所示的核苷酸序列；
所述探针或其组合包括：
12个型别探针，具有SEQ ID No.31~34所示的核苷酸序列；所述12个型别包括HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68；
16型探针，具有如SEQ ID No.35所示的核苷酸序列；
18型探针，具有如SEQ ID No.36所示的核苷酸序列；
内标探针，具有如SEQ ID No.37所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的试剂在制备检测人乳头瘤病毒或对人乳头瘤病毒分型的试剂盒中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述人乳头瘤病毒包括高危型人乳头瘤病毒HPV16型、HPV18型、HPV31型、HPV33型、HPV35型、HPV39型、HPV45型、HPV51型、HPV52型、HPV56型、HPV58型、HPV59型、HPV66型、HPV68型中的一种或多种。
4.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的试剂。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
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