CN103276105B

CN103276105B - 16&18型人乳头瘤病毒的pcr-荧光检测用引物、探针、检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN103276105B
Application number: CN201310156152.6A
Authority: CN
Inventors: 郑隆泗; 王鹏飞
Original assignee: Ailikang Medical Science & Technology Co Ltd Hangzhou
Current assignee: Ailikang Medical Science & Technology Co Ltd Hangzhou
Priority date: 2013-04-27
Filing date: 2013-04-27
Publication date: 2015-02-04
Anticipated expiration: 2033-04-27
Also published as: CN103276105A

Abstract

本发明公开了一种16&18型人乳头瘤病毒的PCR-荧光检测用引物、探针、检测方法及试剂盒，该方法涉及一种能检测最常见的能引起宫颈病变的高危16&18型人乳头瘤病毒(HPV)的核酸检测技术。本试剂盒包括PCR核酸反应混合液，其中包括灭菌水、dNTP Mixture、10×PCR Buffer、含有Mg²⁺离子的溶液、dUTP、16&18型人乳头瘤病毒基因正向引物、16&18型人乳头瘤病毒基因反向引物、16&18型人乳头瘤病毒基因探针。本发明采用锁核苷酸（LNA）探针PCR-荧光并管检测16&18型人乳头瘤病毒(HPV)，本发明具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。

Description

16&18型人乳头瘤病毒的PCR-荧光检测用引物、探针、检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，涉及一种16&18型人乳头瘤病毒的PCR-荧光检测用引物、探针、检测方法及试剂盒，适用于生殖泌尿道、宫颈脱落细胞、组织及其它体液的16&18型人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测。

背景技术

HPV(人乳头瘤病毒)在近20年内已鉴定出100余种基因，至少有85种基因已完全测序。HPV属乳多空病毒科乳头瘤病毒属，是一个7200～8000bp左右的双链环状的DNA病毒，基因组编码3个功能区，即早期转录区、晚期转录区和上游调控区(URR)。早期区约占4kb，编码5～8个开放阅读框架，依次为E6、E7、E1(E8)、E2、E4(E3)、E5，具有参与病毒DNA的复制、转录、翻译、调控和细胞转化等功能。E1涉及病毒DNA复制，在病毒开始复制中起关键作用。E2是一种反式激活蛋白，涉及病毒DNA转录的反式激活。E3功能不清。E4与病毒成熟胞浆蛋白有关。E5正好位于E2的下游，编码一种小蛋白，与细胞转化有关。E6称为多功能蛋白，E6蛋白能与细胞内E6相关蛋白(E6AP)形成复合物，特异性地结合抑癌基因P53的产物，使P53降解失活，导致细胞周期失控；作为一种多功能蛋白，它还可通过激活端粒酶使正常细胞永生化；E7能与成视网膜细胞瘤(Rb)抑制蛋白结合，与HPV致癌的关系极为密切。晚期区也称L区，约3kb，两个主要ORF分别称为L1、L2。其功能是编码病毒的衣壳蛋白，L1区编码主要衣壳蛋白，是主要的种特异性抗原；它在真核细胞内具有自身组装成病毒样颗粒的特性，大量实验证明它具有较强的免疫原性，能刺激机体产生中和抗体IgG、IgA，可使机体免受相应病毒的攻击。

HPV是一种部位特异的DNA病毒，在上皮及粘膜的表面复制繁殖。子宫颈的鳞状上皮细胞与柱状上皮细胞的连接处是HPV的易感部位。HPV感染宿主细胞后，可以游离状态存在于宿主细胞中，也可与细胞染色体整合以整合状态存在于宿主细胞中。文献报道，宫颈上皮内瘤变细胞中HPV16、HPV18的DNA绝大多数呈整合形式，在浸润型宫颈癌中则以游离和整合形式共存。在高危型HPV中，E6、E7是主要的转化蛋白，它们可以通过和p53及视网膜母细胞瘤蛋白(p Rb)的相互作用使正常细胞发生恶性转化。HPV能和宿主基因组发生整合，使E2开放读码框失活并失去其阻遏E6、E7转录的功能，多种基因改变的积累作用导致了癌症的发生。大部分免疫系统正常的人感染HPV后可以自行清除病毒并且不会发病，但是病毒的持续感染却容易诱发宫颈疾病。

临床上有些学者根据HPV致癌危险性大小不同将HPV分为低危型和高危型。低危型HPV主要引起肛门皮肤和外生殖器疣类病变，其亚型主要包括HPV6，11，30，39，42，43和44型；高危型HPV主要包括HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56和58型，主要引起宫颈癌、外阴癌、肛门癌等恶性肿瘤。新近研究资料证实，宫颈癌病因是多因素的，但与HPV感染关系较密切。尤其是高危型HPV感染是宫颈癌和癌前病变发生的必要条件，而高危型HPV中又以16/18型常见，其中超过2/3的宫颈癌与其感染相关。HPV分型还与宫颈癌病理类型有关，HPV16与宫颈鳞癌关系最密切，HPV18最易导致宫颈腺癌。Berlin Grace研究显示，高危型HPV16是致宫颈癌常见病毒，但HPV18的致癌作用比HPV16潜力更大。HPV16/18感染是宫颈癌高危因素，能客观反映宫颈癌的恶性程度，HPV型别也可反映癌组织的病理学类型，可能作为评估患者预后的新指标。

现有技术中人乳头瘤病毒的快速检测方法如下：

目前临床上用于人乳头瘤病毒(HPV)的提前诊断和治疗以及预后判断的方法主要有病理学检查，细胞学检查，免疫组化检查等。

细胞学检查包括传统巴氏涂片（CV）、液基薄层细胞学技术(TCT)、自动细胞学检测系统（LCT）等。该方法优点：操作简单，价格低廉，适宜作初步筛查；缺点：凹空细胞是HPV感染的主要形态学改变，但由于其他病毒感染及人为因素均有可能造成细胞内出现空泡或凹空样变，而且细胞学检查易受取材、染色及细胞病理医生的主观判断等因素的影响，因此应用细胞病理学检测HPV存在灵敏度低、特异性差、假阴性率和假阳性率高、不能对HPV进行分型。组织学检查包括肉眼观察；阴道镜观察；组织检查。该方法优点：操作简单，价格低廉，适宜作初步筛查；缺点：准确率低，人员素质要求高，病人痛苦程度大。免疫组化检查包括ELISA，免疫沉淀法等。该方法优点：原理明确，操作相对简单；缺点：血清学检测的对象是抗原和抗体，由于人体对HPV产生免疫应答有一定的迟滞性，所以血清学检测对无免疫应答者和HPV潜伏期感染者会产生漏检。

实时荧光PCR技术在常规PCR基础上加入荧光标记探针，从PCR扩增到得出结果是在完全封闭的系统中运行，无需PCR后处理，从而避免了扩增产物污染和交叉污染的可能性。同时在扩增时结合了特异探针的杂交，进一步提高了实验的敏感性和特异性，而且可以实时荧光监测扩增过程，结果准确可靠，非常适合用于临床的大面积筛查。荧光PCR法检测为阳性即可对HPV阳性感染进行确诊，目前实时荧光PCR技术已越来越广泛的应用于HPV的临床检测。对于HPV高危型阳性检测结果，需要进行严格的跟踪检查，协助临床诊断。由于此法检测宫颈HPV感染具有快速、简便、准确的优点，且适用于多种样本类型，成本相对较低，在严格进行实验实质量控制的情况下，该法为临床上HPV检测的一种理想方法。

在本发明之前，传统检测16、18型人乳头瘤病毒荧光探针技术是运用TaqMan探针技术而达到检测的目的。TaqMan探针技术被普遍使用，但是在运用过程存在探针Tm值偏低，热稳定性弱，杂交特异性低等问题，从而引起荧光PCR最终检测结果出现假阳性的情况。特别是运用在人乳头瘤病毒病毒检测，因为该病毒分型多，各个分型之间序列差异小，而引起相关病变的病毒型别具有针对性，因此特异性非常关键。而传统的16、18型人乳头瘤病毒荧光探针的检测试剂盒对16和18型人乳头瘤病毒分别设计引物、探针，从而分管检测，方法繁琐，缺乏临床快速、简便的检测意义。

发明内容

本发明的目的正是要克服上述技术的不足，而提供快速、简便、特异性高的16&18型人乳头瘤病毒的PCR-荧光检测用引物、探针、检测方法及试剂盒。该技术在TaqMan探针的基础上引入锁核酸（LNA）,提高探针的Tm值、增加热稳定性、提高杂交的特异性，从而提高PCR荧光检测结果的特异性。且检测试剂盒具有操作简便、自动化程度高的特点。该试剂盒并引入内标系统，可有效的避免假阴性结果的出现。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：这种16&18型人乳头瘤病毒的PCR荧光检测的引物，包括16、18型人乳头瘤病毒的引物，其序列如下：

16型正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示：5-TCATTTTATAATCCAGATACACAGCG-3，

16型反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示：5-ATAAAGGATGGCCACTAATGCC-3，

18型正向引物如序列表中SEQ ID NO.3所示：5-AGCATTTATAATCCTGAAACACAACG-3，

18型反向引物如序列表中SEQ ID NO.4所示：5-AAAATGGATGCCCACTAAGGC-3。

或者在上述序列的5’端和/或3’端有延长的核苷酸片段的一组序列；

或者与上述序列的同源性大于85%的一组序列；

或者与上述序列的碱基互补的一组序列。

这种16&18型人乳头瘤病毒的PCR荧光检测的探针，包括16、18型人乳头瘤病毒的探针，荧光探针如序列表中SEQ ID NO.5所示：5-acaCctAawGgcTgacc-3；或者在上述序列的5’端和/或3’端有延长的核苷酸片段的一组序列，或者与上述序列的同源性大于85%的一组序列；或者与上述序列的碱基互补的一组序列；其中，所述荧光探针的5’端修饰的荧光染料选自：FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3或Cy5；3’端修饰的荧光染料选自：TAMRA、Eclipse，BHQ1，BHQ2，BHQ3或DABCYL。

所述荧光探针的5’端和3’端分别用FAM、BHQ荧光基团修饰，在中间碱基上嵌入4个锁核酸基团（大写字母碱基为锁核酸基团结合部位）。

在该序列的四个碱基上进行锁核酸（LNA）修饰，修饰碱基位置如以下序列中大写碱基位置处：5-acaCctAawGgcTgacc-3。

这种内标系统荧光探针检测技术引物，包括如下的序列组：

包括下述正向引物，反向引物的两组序列：

T7噬菌体正向引物如序列表中SEQ ID NO.6所示：

5-GAAGTGAAAGCTAAGCGCGG-3，

T7噬菌体反向引物如序列表中SEQ ID NO.7所示：

5-GTATTGTCAGCACTGGTTAGGCA-3

或者与上述序列的同源性大于85%的一组序列；

或者与上述序列的碱基互补的一组序列。

本发明所述的这种内标系统荧光探针检测技术探针，为以下序列：

荧光探针如序列表中SEQ ID NO.8所示：5-CGCCCGACAGCCTTCCAGTTCC-3；

或者与上述序列的同源性大于85%的一组序列；

或者与上述序列的碱基互补的一组序列；

其中，所述荧光探针的5’端和3’端分别用HEX、BHQ荧光基团修饰。

作为优选，其中荧光探针的5’端修饰的荧光染料选自：FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3或Cy5；3’端修饰的荧光染料选自：TAMRA、Eclipse，BHQ1，BHQ2，BHQ3或DABCYL。

本发明所述的16&18型人乳头瘤病毒荧光探针检测试剂盒，该试剂盒含有：

（1）PCR核酸反应混合液，其中包括灭菌水、dNTP Mixture、10×PCR Buffer、含有Mg²⁺离子的溶液、dUTP、16&18型人乳头瘤病毒基因正向引物、16&18型人乳头瘤病毒基因反向引物、16&18型人乳头瘤病毒基因探针、内标T7噬菌体基因正向引物、内标T7噬菌体基因反向引物、内标T7噬菌体基因探针；

18型反向引物如序列表中SEQ ID NO.4所示：5-AAAATGGATGCCCACTAAGGC-3，

16&18型基因探针如序列表中SEQ ID NO.5所示：5-acaCctAawGgcTgacc-3；

T7噬菌体正向引物如序列表中SEQ ID NO.6所示：5-GAAGTGAAAGCTAAGCGCGG-3，

T7噬菌体反向引物如序列表中SEQ ID NO.7所示：5-GTATTGTCAGCACTGGTTAGGCA-3

内标荧光探针如序列表中SEQ ID NO.8所示：5-CGCCCGACAGCCTTCCAGTTCC-3

其中，探针5'端标记FAM/HEX荧光报告基团，3'端标记BHQ荧光淬灭基团；

（2）酶混合液，其中包括Taq酶和UDG酶；其中Taq酶为具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶；

（3）核酸提取液，主要成分为TE溶液，其中包括EDTA、Tris.HCl成分；

（4）内标溶液，含T7噬菌体溶液；

（4）阴性质控品，为不含目的基因的无菌纯化水；

（5）阳性质控品，为1.0×10⁶copy/mL含16&18型人乳头瘤病毒基因的阳性质粒标准品；

（6）临界阳性质控品，为1.0×10³copy/mL含16&18型人乳头瘤病毒基因的阳性质粒标准品；

阳性质控品质粒序列如序列表中SEQ ID NO.9：5-GTTCCTAAAGTATCAGGATTACAATACAGGGTATTTAGAATACATTTACCTGACCCCAATAAGTTTGGTTTTCCTGACACCTCATTTTATAATCCAGATACACAGCGGCTGGTTTGGGCCTGTGTAGGTGTTGAGGTAGGTCGTGGTCAGCCATTAGGTGTGGGCATTAGTGGCCATCCTTTATTAAATAAATTGGATGACACAGAAAATGCTAGTGCTTATGCAGCAAATGCAGGTGTGGATAATAGAGAATGTATATCTATGGA-3。

作为优选，所述核酸扩增反应液各组分含量的配比为：10×PCR Buffer用量Buffer5μl；浓度为10mmol/L的dNTP Mixture用量1μL；浓度为25mmol/L的MgCl₂溶液用量10μL；浓度为10μmol/L的正向引物用量均为1.5μL；浓度为10μmol/L的反向引物用量1.5μL；浓度为10μmol/L的探针用量1μL；浓度为5U/μL的热启动Taq酶用量0.5μL；UDG的用量为0.1μl；Dutp的用量为0.1μl。

本发明所述的这种16&18型人乳头瘤病毒(HPV)的试剂盒的检测方法，包括下列步骤：

（1）标本采集：

a)生殖泌尿道分泌物

男性：用细小棉拭子伸入尿道约2-4厘米，略捻动棉拭子收集分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检。

女性：生殖道-用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内，停留5秒钟，捻动棉拭子收集分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检。

尿道-用无菌生理盐水清洗尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2厘米，捻动棉拭子收集分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检。

b)子宫颈上脱落的上皮细胞

用宫颈取样器刷取宫颈处脱落的细胞，并把取样器置取样管中，密闭送检。

（2）标本保存和运输：标本应立即送检使用，如不能马上送检样本，可在2-8℃条件下保存7天，在-20℃条件下可长期保存。标本长途运输时应采用0℃冰壶或泡沫加冰密封运输。

（3）标本处理

a)在样品取样管中加入1mlPBS缓冲液(或生理盐水)，充分震荡混匀，吸取液体转至1.5ml离心管中，12000r/min离心10min。

b)弃上清加入100μl核酸提取液和10ul内标溶液，混旋器上充分混匀，100℃水浴10min（误差小于1min）。

c)室温静置10min使其充分裂解，12000r/min离心5min，上清液中即含有DNA模板。如果样本裂解产物当天不使用，建议-20℃保存。

（4）试剂配制

从试剂盒中取出PCR反应混合液和酶混合液置室温解冻后，2000rpm离心10秒。

按所需检测样品数，取PCR反应管（样品数+3）。每人份PCR反应体系配制如下：

计算上述试剂的使用量，加入一适当体积的离心管中，充分混匀后，2000rpm离

心10秒。按30ul/管分装至各PCR反应管中，然后将反应管转移至样本处理区。（5）加样

分别加入20ul处理后的样品上清液、阴性质控品、临界阳性质控品、阳性质控品，盖紧反应管，5000rpm离心数秒，转移至PCR检测区。

（6）荧光定量PCR扩增

a)定义样品孔及设置反应条件

37℃5分钟；

94℃5分钟；

94℃30秒、58℃45秒，5个循环；

94℃30秒、58℃45秒，5个循环（58℃收集荧光信号）。

反应体系50ul,荧光反应通道选择FAM和CY5.

b)完成设置反应条件后，运行反应程序

（7）结果分析

a)反应结束后保存反应结果；

b)基线和阈值设定：基线调整取6-15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品检测荧光曲线的最高点。

（8）质量控制：

a)阴性质控品：FAM检测通道扩增曲线不成S型或CT值为空白；

b)临界阳性质控品和阳性质控品：临界阳性质控品CT值＞阳性质控品CT值，且FAM检测通道有扩增曲线；

c)内标质控：所有检测样品CY5通道CT＜38；

以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需从新进行。

【检测结果的解释】

1.阴性结果判定：ABI7000，ABI7300，Bio-rad iCycler iQ等其他仪器：如果样品Ct值＞32，则为阴性。

Stratagene Mx3000，Stratagene Mx3005p仪器：如果样品Ct值＞35，则为阴性。

2.阳性结果判定：ABI7000，ABI7300，Bio-rad iCycler iQ等其他仪器：如果样品Ct值≤32，则为阳性。

Stratagene Mx3000，Stratagene Mx3005p仪器：如果样品Ct值≤35，则为阳性。

注：如待检样本CT值在32～35之间，需重复检测，如仍在32～35之间，且扩增曲线呈典型的S型，则判为阳性；如扩增曲线呈非典型的S型，则判为阴性。

本发明有益的效果是:本发明试剂盒利用特异性的探针来检测16&18型人乳头瘤病毒基因，检测完成后无需开盖电泳，避免了产物污染及对实验室人员的伤害。本发明使用LNA探针探针来实现16&18型人乳头瘤病毒基因PCR检测从传统的分管到并管检测的飞跃，灵敏度达10个基因拷贝数每毫升检测样品，10倍优于普通荧光定量PCR法。并且在该试剂盒中引入反污染措施，有效的控制了由于操作过程中所引起的假阳性的出现；而且与国内其它PCR试剂盒相比，又加入内标于操作过程中，有效的避免了由于操作不当而引起的试验结果的误判。它具有高度的特异性、灵敏度与准确性，且技术操作简便、自动化程度高，由于采用闭管操作，不需要PCR产物后处理，有效解决PCR污染问题等特点，结果可靠。

附图说明

图1是本发明实施例1中提供的实验结果图；

图2是本发明实施例2中提供的实验结果图；

图中：图1、图2横坐标表示：表示循环数（Cycle number），纵坐标表示：荧光值（DeltaRn）；

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合举例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的举例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供了一种16&18型人乳头瘤病毒基因核酸检测试剂盒，本试剂盒包括PCR反应混合液，包括灭菌水、dNTP Mixture、10×PCR Buffer、含有Mg²⁺离子的溶液、dUTP、16&18型人乳头瘤病毒基因正向引物、16&18型人乳头瘤病毒基因反向引物、16&18型人乳头瘤病毒基因探针；内标T7噬菌体基因正向引物、内标T7噬菌体基因反向引物、内标T7噬菌体基因探针；酶混合液，其中包括Taq酶和UDG酶；其中Taq酶为具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶；核酸提取液，主要成分为TE溶液，其中包括EDTA、Tris.HCl成分；HPV内标溶液，包括T7噬菌体成分；阴性质控品，为不含目的基因的无菌纯化水；阳性质控品，为1.0×10⁶copy/mL含16&18型人乳头瘤病毒基因的阳性质粒标准品；临界阳性质控品，为1.0×10³copy/mL含16&18型人乳头瘤病毒基因的阳性质粒标准品。

试剂盒的制造：

1．试剂

本试剂盒制造过程中所用的试剂主要购自硕世生物科技有限公司。

2．PCR反应混合液制备

（1）引物及探针设计与合成：

选择人乳头瘤病毒16和18型基因的L1区的保守区作为目标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)检索，获得在多种人乳头瘤病毒16型L1区基因序列（NCBI检索号:NC_001526.2）和18型L1区基因序列(NCBI检索号:NC_001357.1)，并用MEGA4.0软件对2个序列进行比对，分别选择其中一段保守序列，且该两端序列含有一段相同的序列，人乳头瘤病毒16型L1区基因保守如序列表中SEQ IDNO.5所示，人乳头瘤病毒16型L1区基因保守如序列表中SEQ ID NO.6所示，两端共有保守序列如序列表中SEQ ID NO.7所示：

SEQ ID NO.9

5-TCATTTTATAATCCAGATACACAGCGGCTGGTTTGGGCCTGTGTAGGTG

TTGAGGTAGGTCGTGGTCAGCCATTAGGTGTGGGCATTAGTGGCCATCCTTTAT-3

SEQ ID NO.10

5-ATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTG

GAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGGCATCCATTTT-3

SEQ ID NO.11 5-GGTCAGCCATTAGGTGT-3

利用实时TaqMan荧光定量PCR的专业设计软件Primer Express3.0设计引物、探针序列，引物、探针序列要满足软件中各项指标。在本发明中，人乳头瘤病毒16和18型基因探针的5’端修饰的荧光染料可选自：FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3或Cy5；3’端修饰的荧光染料可选自：TAMRA、Eclipse，BHQ1，BHQ2，BHQ3或DABCYL。本实施例中荧光报告基团设计为FAM，FAM的激发波长为485nm，接收波长为527nm，淬灭基团设计为BHQ。

设计结果如下表所示：

引物名称	碱基	纯化方式	引物序列（5’-3’）
				HPV16-F	26bp	PAGE	TCATTTTATAATCCAGATACACAGCG
HPV16-R	22bp	PAGE	ATAAAGGATGGCCACTAATGCC
				HPV18-F	26bp	PAGE	AGCATTTATAATCCTGAAACACAACG
HPV18-R	21bp	PAGE	AAAATGGATGCCCACTAAGGC
				探针名称	报告基团	淬灭基团	合成序列
HPV16&18-P	FAM	BHQ-1	acaCctAawGgcTgacc

表中：F：forward，正向；HPV16-F表示HPV16基因正向引物。

R：reverse，反向；HPV16-R表示HPV16基因反向引物。

P：probe，探针；HPV16&18-P表示HPV16和HPV18基因共有探针，探针为LNA探针。

FAM：荧光报告基团。

BHQ-1：荧光淬灭基团。

按照上表的设计结果，委托硕世生物科技有限公司合成引物和探针。

选择T7噬菌体作为该试剂盒的内标，并以T7噬菌体基因作为内标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)检索，获得T7噬菌体基因序列（NCBI检索号:GU071091）。

利用实时TaqMan荧光定量PCR的专业设计软件Primer Express3.0设计引物、探针序列，引物、探针序列要满足软件中各项指标。在本发明中，T7噬菌体基因作为内标检测基因探针的5’端修饰的荧光染料可选自：FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3或Cy5；3’端修饰的荧光染料可选自：TAMRA、Eclipse，BHQ1，BHQ2，BHQ3或DABCYL。本实施例中荧光报告基团设计为HEX，HEX最大激发波长是535nm,最大发射波长是553nm，淬灭基团设计为BHQ-2。

设计结果如下表所示：

引物名称	碱基	纯化方式	引物序列（5’-3’）
				T7-F	20bp	PAGE	GAAGTGAAAGCTAAGCGCGG
T7-R	23bp	PAGE	GTATTGTCAGCACTGGTTAGGCA
				探针名称	报告基团	淬灭基团	合成序列
T7-P	HEX	BHQ-2	CGCCCGACAGCCTTCCAGTTCC

表中：F：forward，正向；T7-F表示T7基因正向引物。

R：reverse，反向；T7-R表示T7基因反向引物。

P：probe，探针；T7-P表示T7基因探针。

HEX：荧光报告基团。

BHQ-2：荧光淬灭基团。

（2）PCR反应混合液配制：10×PCR Buffer用量Buffer5μl；浓度为10mmol/L的dNTPMixture用量1μL；浓度为25mmol/L的MgCl₂溶液用量10μL；浓度为10μmol/L的正向引物用量均为1.5μL；浓度为10μmol/L的反向引物用量1.5μL；浓度为10μmol/L的探针用量1μL；浓度为5U/μL的热启动Taq酶用量0.5μL；UDG的用量为0.1μl；Dutp的用量为0.1μl。

（3）酶混合液的配制：热启动Taq酶用量0.5μL；UDG酶用量0.1μL。

（4）内标溶液的制备：T7噬菌体培养后，纯化稀释获得。

（4）阴性质控品制备：不含目的基因的无菌纯化水。

取经检验合格的阴性质控品为纯化水，直接吸取20μL作模板。

（5）阳性质控品制备：高浓度含HPV16&18基因的阳性质粒

取含HPV16&18基因的重组质粒，转入大肠杆菌TOP10增殖，质粒合成和菌株由上海桑尼生物科技有限公司提供。先经过12h过夜活化，在培养增殖4～5h，用生工生物（上海）有限公司的质粒提取试剂盒提取含HPV16&18基因的重组质粒，利用微量分光光度计测A₂₆₀定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×10⁶copy/ml，即可作为阳性质控品模板。

6．临界阳性质控品制备：低浓度含HPV16&18基因的阳性质粒

取含HPV16&18基因的重组质粒，转入大肠杆菌TOP10增殖，质粒合成和菌株由上海桑尼生物科技有限公司提供。先经过12h过夜活化，在培养增殖4～5h，用生工生物（上海）有限公司的质粒提取试剂盒提取含HPV16&18基因的重组质粒，利用微量分光光度计测A₂₆₀定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×10³copy/ml，即可作为临界阳性质控品模板。

7.核酸提取液，为TE溶液，其中包括：1mM EDTA+1%NP40，10mM pH8.0Tris.HCl。

本发明的试剂盒可以按照下表进行配置（24人份/盒）：

组分名称	规格	数量	成分
				核酸提取液	2500μl/管	1	含NaCl、EDTA-Na2等成分的溶液
PCR反应液混合液	710μl/管	1	含HPV16\HPV18、内标引物探针等成分的溶液
				酶混合液	15μl/管	1	含Taq酶、UNG酶等成分的溶液
HPV内标溶液	50μl/管	1	含有T7噬菌体的稀释液
				HPV阴性质控品	50μl/管	1	水
HPV临界阳性质控品	50μl/管	1	低浓度HPV(16&18型)基因组DNA溶液
				HPV阳性质控品	50μl/管	1	高浓度HPV(16&18型)基因组DNA溶液
说明书	--	1份	1份

本发明的试剂盒在-20℃±5℃避光储存，避免反复冻融；有效期6个月适用仪器（ABI7500，ABI7300，Bio-Rad iQ5^TM，Stratagene Mx3000P、Stratagene Mx3005P，达安7600）等。

实施例1：用本发明的试剂盒在达安7600荧光定量PCR仪上检测HPVHPV16&18型阳性模版样本扩增的方法

（1）样本制备

阳性模板为HPV-16L1区片段质粒克隆而成，并稀释成1.0×10⁷copy/ml、1.0×10⁶copy/ml、1.0×10⁵copy/ml、1.0×10⁴copy/ml。

（2）试剂配制

按所需检测样品数，取PCR反应管（样品数4+3）。每人份PCR反应体系配制如下：

计算上述试剂的使用量，加入一适当体积的离心管中，充分混匀后，2000rpm离心10秒。按30ul/管分装至各PCR反应管中，备用。

（3）加样

分别加入20ul阳性质粒样品、阴性质控品、临界阳性质控品、阳性质控品，盖紧反应管，5000rpm离心数秒，备用。

（4）荧光定量PCR扩增

a)定义样品孔及设置反应条件

37℃5分钟；

94℃5分钟；

94℃30秒、58℃45秒，5个循环；

94℃30秒、58℃45秒，5个循环（58℃收集荧光信号）。

反应体系50ul,荧光反应通道选择FAM和HEX.

b)完成设置反应条件后，运行反应程序

（5）结果分析

a)反应结束后保存反应结果；

（6）质量控制：

a)阴性质控品：FAM检测通道扩增曲线不成S型或CT值为空白；

c)内标质控：所有检测样品CY5通道CT＜38；

【检测结果的解释】

Ct值小于28的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于或等于28且小于或等于32的为临界阳性，且所有检测样品CY5通道CT＜38。

本发明实施例1的试验结果如图1所示，具体检测结果见下表：

其中，所有样本检测结果均有效。图1中不同浓度梯度稀释阳性样本呈平行的标准S形扩增曲线，其结果均达到一定的可靠性，达到了99.8%。

实施例2：用本发明的试剂盒在达安7600荧光定量PCR仪上检测HPV16&18型临床阳性样本的方法

（1）标本采集：共采集10份阳性感染的样本

子宫颈上脱落的上皮细胞

（3）标本处理

（4）试剂配制

计算上述试剂的使用量，加入一适当体积的离心管中，充分混匀后，2000rpm离心10秒。按30ul/管分装至各PCR反应管中，然后将反应管转移至样本处理区。

（5）加样

（6）荧光定量PCR扩增

a)定义样品孔及设置反应条件

37℃5分钟；

94℃5分钟；

94℃30秒、58℃45秒，5个循环；

94℃30秒、58℃45秒，5个循环（58℃收集荧光信号）。

反应体系50ul,荧光反应通道选择FAM和CY5.

b)完成设置反应条件后，运行反应程序

（7）结果分析

a)反应结束后保存反应结果；

（8）质量控制：

a)阴性质控品：FAM检测通道扩增曲线不成S型或CT值为空白；

c)内标质控：所有检测样品CY5通道CT＜38；

【检测结果的解释】

3.阴性结果判定：ABI7000，ABI7300，Bio-rad iCycler iQ等其他仪器：如果样品Ct值＞32，则为阴性。

4.阳性结果判定：ABI7000，ABI7300，Bio-rad iCycler iQ等其他仪器：如果样品Ct值≤32，则为阳性。

本发明实施例2的试验结果如图2所示，具体检测结果见下表：

其中，所有样本检测结果均有效，均能检测出阳性结果。图2中不同临床阳性样本扩增曲线均成S形，显示为阳性结果。

Claims

1.一种荧光检测16&18型人乳头瘤病毒的试剂盒，其包含PCR核酸反应混合液、酶混合液、核酸提取液、内标溶液、阴性及阳性质控品及临界阳性质控品；所述PCR核酸反应混合液包括灭菌水、dNTP Mixture、10×PCR Buffer、含有Mg²⁺离子的溶液、dUTP、16&18型人乳头瘤病毒基因正向引物、16&18型人乳头瘤病毒基因反向引物、16&18型人乳头瘤病毒基因荧光探针、内标T7噬菌体基因正向引物、内标T7噬菌体基因反向引物、内标T7噬菌体基因荧光探针，所述酶混合液包括Taq酶和UDG酶，所述内标溶液为含T7噬菌体的溶液，所述阴性质控品为不含目的基因的无菌纯化水，所述阳性质控品为含1.0×10⁶copy/mL的16&18型人乳头瘤病毒基因的阳性质粒标准品，所述临界阳性质控品为含1.0×10³copy/mL的16&18型人乳头瘤病毒基因的阳性质粒标准品，所述内标T7噬菌体基因正向引物、内标T7噬菌体基因反向引物、内标T7噬菌体基因荧光探针及阳性质粒标准品的序列依次分别为如SEQ ID NO.6-9所示；其中，所述16&18型人乳头瘤病毒基因正向引物及反向引物序列分别为：

18型反向引物如序列表中SEQ ID NO.4所示：5-AAAATGGATGCCCACTAAGGC-3；

所述16&18型人乳头瘤病毒基因荧光探针如序列表中SEQ ID NO.5所示：5-acaCctAawGgcTgacc-3，序列中大写碱基位置处已进行锁核酸(LNA)修饰。

2.根据权利要求1所述的荧光检测16&18型人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于：所述16&18型人乳头瘤病毒基因荧光探针的5’端修饰的荧光染料选自：FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3或Cy5；3’端修饰的荧光染料选自：TAMRA、Eclipse，BHQ1，BHQ2，BHQ3或DABCYL。