CN102994651B - 用于18种高危型人乳头瘤病毒荧光pcr检测的引物和探针及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于18种高危型人乳头瘤病毒荧光PCR检测的引物和探针及其试剂盒，通过添加不同的特异性探针达到检测不同分型试剂盒，能一次检测国际公认和宫颈癌密切相关的常见的18种高危型人乳头瘤病毒DNA，并对HPV16、18型进行分型检测。本申请提供6条通用引物和18条特异的分子信标探针，该6条通用引物能将18种高危型人乳头瘤病毒DNA扩增出来，而18条探针是针对18种高危型设计的特异的分子信标探针，可以根据检测的需求添加不同型的探针，从而组合成针对不同高危型检出需求的试剂盒，同时对所添加的探针进行不同报告基团的标记达到对高危型HPV进行分型检测的目的。
Description
技术领域
本发明涉及人乳头瘤病毒检测的试剂盒领域，尤其涉及用于18种高危型人乳头瘤病毒荧光PCR检测的引物和探针及其试剂盒。
背景技术
人乳头瘤病毒（Hμman papillomvirμs，HPV）是一种嗜上皮性病毒，有高度的特异性，人类是它唯一的宿主。目前已经确定HPV型别已经超过了120种，约30余种定向感染人体生殖道皮肤及粘膜的复层鳞状上皮，从而导致尖锐湿疣以及宫颈病变，甚至可能引起宫颈癌的发生。不同亚型的HPV感染导致不同病变，根据病变的程度高低，将HPV亚型分为高危型和低危型。低危型与性传播疣或尖锐湿疣有关，一般不诱发癌变，常见的型有6、11、42、43、44；高危型与子宫颈癌及子宫上皮内瘤变的发生有关，常见的高危型有16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，2004年发布的HPV handbook中国际上公认的导致宫颈癌的HPV高危型为HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82等18种型。研究显示HPV感染存在多样性和地区差异性，各国各地区型别不同，国际癌症研究协会（IARC）的研究显示，在全世界范围内最常见亚型为HPV16，其次往往是HPV18。除了这两个基因型外，其他HPV基因型的分布存在明显的地域差异，非洲较为流行的是HPV45和HPV33，欧洲较为流行的是HPV45，南、北美洲是HPV31、33和45。在亚洲相对较为流行的是HPV58和52。HPV的型别还与宫颈癌的病理类型有关，在宫颈鳞状上皮细胞癌中以HPV16为主（占51%），而在宫颈腺癌和宫颈腺鳞细胞癌中HPV分别占56%和39%。高危型HPV的持续性感染是宫颈癌发生的必要条件。HPV感染使得宫颈癌的相对危险性增加250倍，而从高危型HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变最终发展宫颈癌大约需要5-10年。因此，有针对性地对高危型HPV进行全面检测，对宫颈癌的早期诊断和治疗具有重要的意义。
目前常见的HPV检测方法包括测序法、杂交捕获法、导流杂交法及荧光PCR法。测序法的结果相对准确，但操作繁琐，且对操作者的要求较高，灵敏度低，不适于临床应用；杂交捕获法假阳性高、操作时间长、无法区分具体型别、成本较高，不宜在经济较不发达的发展中国家推广；导流杂交法在市场上虽仍有一定占有量，但该方法无法避免因产物污染造成的假阳性现象，这也就限制了其在临床上的大规模应用；荧光PCR法不但灵敏度高特异性强，而且自动化程度高，成本适中，几乎不会造成污染，为人乳头瘤病毒的早期诊断提供优势。
目前国内市场已批准上市的HPV检测试剂有多种，有表面等离子谐振法（SPR）、PCR-荧光偏振技术、基因芯片法、流式荧光杂交技术即液态芯片法、PCR+膜杂交法、杂交捕获法、PCR-反向点杂交法、实时荧光PCR法等多种平台技术的产品共34个。生产厂家主要有QIAGEN、潮州凯普生物化学有限公司、亚能生物技术（深圳）有限公司、港龙生物技术(深圳)有限公司、凯杰生物工程(深圳)有限公司、上海之江生物科技有限公司、中山大学达安基因股份有限公司、北京金菩嘉医疗科技有限公司、上海透景生命科技有限公司、上海科华生物工程股份有限公司、泰普生物科学(中国)有限公司等。
目前荧光PCR产品共计19个，均使用Taqman探针，不同的产品检测的型别各不相同，其中有6个产品只能检测低危型，检测高危型产品中最多只能检测13中常见的高危型。分别是港龙生物技术（深圳）有限公司、潮州凯普生物化学有限公司、上海之江生物科技有限公司、泰普生物科学（中国）有限公司生产的产品。目前市面上还没有同时检测18种高危型HPV的荧光PCR产品。PCR检测中，同一试剂盒检测的型别越多，对引物和探针的灵敏度、特异性的要求就越高，现有技术的探针没有办法实现18种高危型HPV同时检测。
表1.与本发明相关的已经公开的专利申请相关统计对比
所以，现有实时荧光PCR技术检测HPV产品不少，大部分产品检测的基因型比较少，但不管产品检测的基因型多少，检测是否采用特异型的探针，现有产品都是一组引物探针只能提供一种试剂盒。而本发明所提供的引物探针，可以根据需要组合成个性化的检测试剂盒。最多可以同管检测18种高危型HPV且同时区分16、18型，填补了国内临床对18种高危型荧光PCR试剂盒可以同时检测又可以分型检测的空白。该试剂盒检测时间短、扩增效率及灵敏度高、成本低、操作方便。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供用于18种高危型人乳头瘤病毒荧光PCR检测的通用引物和特异探针。
本发明所要解决的第二个技术问题是，提供高危型人乳头瘤病毒荧光PCR检测试剂盒。
为了解决上述问题，本发明提供了一种用于18种高危型人乳头瘤病毒荧光PCR检测的引物和探针，所述18种高危型人乳头瘤病毒是指HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73和HPV82，其特征在于，所述引物为一组通用引物，序列如SEQ ID NO：1—SEQ ID NO：4所示，所述探针为特异探针，序列如SEQ ID NO：7—SEQ ID NO：24所示：
检测HPV16型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:7所示；
检测HPV18型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:8所示；
检测HPV26型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:9所示；
检测HPV31型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:10所示；
检测HPV33型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:11所示；
检测HPV35型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:12所示；
检测HPV39型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:13所示；
检测HPV45型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:14所示；
检测HPV51型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:15所示；
检测HPV52型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:16所示；
检测HPV53型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:17所示；
检测HPV56型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:18所示；
检测HPV58型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:19所示；
检测HPV59型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:20所示；
检测HPV66型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:21所示；
检测HPV68型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:22所示；
检测HPV73型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:23所示；
检测HPV82型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:24所示；
所述分子信标探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
作为一个优选方案，所述荧光基团为FAM、ROX、JOE、HEX和TAMRA中的一种或几种，所述淬灭基团为BHQ-1、BHQ-2和DABCYL中的一种或几种。
作为一个优选方案，所述引物还包括SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列中的一种或两种。即引物可以为SEQ ID NO：1—SEQ ID NO：4所示序列，也可以为SEQ ID NO：1—SEQ ID NO：5所示序列，或者SEQ ID NO：1—SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6所示序列，或者SEQ ID NO：1—SEQ ID NO：6所示序列。
为了解决上述第二个技术问题，本发明提供了一种高危型人乳头瘤病毒荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含序列如SEQ ID NO：1—SEQ ID NO：4所示的引物，以及序列如SEQ ID NO:7—SEQ ID NO:24所示的探针序列中的一种或几种。
作为一个优选方案，所述试剂盒包含的引物序列如SEQ ID NO：1—SEQ IDNO：4所示，以及包括SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列中的一种或两种，探针序列如SEQ ID NO:7—SEQ ID NO:24所示序列中的一种或几种。
作为一个优选方案，所述试剂盒检测18种高危型人乳头瘤病毒，包含的引物序列如SEQ ID NO：1—SEQ ID NO：6所示，探针序列如SEQ ID NO:7—SEQ ID NO:24所示。即当18种全型检测的时候，优选使用SEQ ID NO：1—SEQ ID NO：6所示引物序列。
试剂盒中含有的扩增试剂、提取试剂、质量控制对照品等都是现有常规选择。
本发明采用多重PCR技术即在同一PCR反应体系中含有多个引物对多个靶序列进行PCR检测。采用多重PCR优势在于可以高效、经济简便，可以在同一反应管中同时检出多种高危型HPV，可以大大节省时间和成本，更能满足临床的要求；而多重PCR劣势在于体系中使用过多引物，引物之间的相互反应，影响彼此的扩增效率。因此多重PCR引物探针设计的难点在于如何避免引物与引物之间、引物与探针之间和探针与探针之间的交叉反应。为了解决这个问题，本发明采用了通用的引物和特异的型荧光探针，通用的引物减少了引物的使用量，而特异的型探针保证了各型检测的特异性。本发明采用分子信标探针，在退火温度不变的情况下，尽可能减少探针的长度，从而降低和引物及其他探针交叉反应的几率，提高扩增效率，提高产品的灵敏度。
本发明的优点在于，本发明公开了一种实现一次检测18种高危人乳头瘤病毒，同时又可以分型检测的PCR检测试剂盒。通过添加不同的特异性探针达到检测不同分型试剂盒，能一次检测国际公认和宫颈癌密切相关的常见的18种高危型人乳头瘤病毒DNA，并对HPV16、18型进行分型检测，同时采用分子信标荧光探针的实时荧光PCR检测技术。本申请提供6条通用引物和18条特异的分子信标探针，该6条通用引物能将18种高危型人乳头瘤病毒DNA扩增出来，而18条探针是针对18种高危型设计的特异的分子信标探针，可以根据检测的需求添加不同型的探针，从而组合成针对不同高危型检出需求的试剂盒，同时对所添加的探针进行不同报告基团的标记达到对高危型HPV进行分型检测的目的。
附图说明
图1：HPV16型特异型探针对HPV16阳性样本和其他型HPV阳性标本的检测结果，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图2：HPV18型特异型探针对HPV18阳性样本和其他型HPV阳性标本的检测结果，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图3：HPV26型特异型探针对HPV26阳性样本和其他型HPV阳性标本的检测结果，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图4：HPV31型特异型探针对HPV31阳性样本和其他型HPV阳性标本的检测结果，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图5：HPV33型特异型探针对HPV33阳性样本和其他型HPV阳性标本的检测结果，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图6：HPV35型特异型探针对HPV35阳性样本和其他型HPV阳性标本的检测结果，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图7：HPV39型特异型探针对HPV39阳性样本和其他型HPV阳性标本的检测结果，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图8：HPV45型特异型探针对HPV45阳性样本和其他型HPV阳性标本的检测结果，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图9：HPV51型特异型探针对HPV51阳性样本和其他型HPV阳性标本的检测结果，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图10：HPV52型特异型探针对HPV52阳性样本和其他型HPV阳性标本的检测结果，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图11：HPV53型特异型探针对HPV53阳性样本和其他型HPV阳性标本的检测结果，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图12：HPV56型特异型探针对HPV56阳性样本和其他型HPV阳性标本的检测结果，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图13：HPV58型特异型探针对HPV58阳性样本和其他型HPV阳性标本的检测结果，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图14：HPV59型特异型探针对HPV59阳性样本和其他型HPV阳性标本的检测结果，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图15：HPV66型特异型探针对HPV66阳性样本和其他型HPV阳性标本的检测结果，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图16：HPV68型特异型探针对HPV68阳性样本和其他型HPV阳性标本的检测结果，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图17：HPV73型特异型探针对HPV73阳性样本和其他型HPV阳性标本的检测结果，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图18：HPV82型特异型探针对HPV82阳性样本和其他型HPV阳性标本的检测结果，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图19：2种高危型人乳头瘤病毒核酸试剂盒准确性和特异性试验，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图20：5种高危型人乳头瘤病毒核酸试剂盒准确性和特异性试验，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图21：8种高危型人乳头瘤病毒核酸试剂盒准确性和特异性试验，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图22：13种高危型人乳头瘤病毒核酸试剂盒准确性和特异性试验，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
图23：18种高危型人乳头瘤病毒核酸试剂盒准确性，试验的模板包括18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82。
图24：18种高危型人乳头瘤病毒核酸试剂盒特异性试验，试验的模板包括16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明所述试剂盒包括提取和反应两大系统，其中反应系统包括PCR反应混合液、酶液、阳性对照、阴性对照。本发明的各种不同型检出要求的个性化试剂盒，除了PCR反应混合液不同外其他的都相同。试剂盒中阳性对照为HPV16型质粒，阴性对照为超纯水。
使用仪器：具备三色检测功能的荧光PCR仪，例如ABI7500\7300\7000等荧光PCR扩增检测仪。
实施例1：DNA的提取
采用磁珠法提取法提取HPV病毒DNA（也可用全自动核酸提取仪提取）。其工作原理和步骤主要细胞裂解、核酸和磁珠的结合、洗涤磁珠和核酸的复合物和洗脱核酸。细胞裂解过程是破坏细胞结构，让核酸从细胞释放出来；核酸和磁珠的结合过程是纯化核酸的过程，以除去杂质如蛋白质、多糖等生物大分子物质。洗涤磁珠和核酸的复合物是进一步纯化核酸，除去复合物表面残留物及痕量盐离子。洗脱核酸是让核酸和磁珠分离，以得到所需高纯度的核酸。
实施例2：引物设计和合成
从GeneBank中调出各亚型人乳头瘤病毒的L1区DNA序列，然后通过DNAStar软件对各亚型L1区序列进行比较，在高危型序列相对保守的区域设计引物序列并进行合成。本发明中设计的引物序列有：
用于扩增人乳头瘤病毒的引物1，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示；
用于扩增人乳头瘤病毒的引物2，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示；
用于扩增人乳头瘤病毒的引物3，其碱基序列如SEQ ID NO:3所示；
用于扩增人乳头瘤病毒的引物4，其碱基序列如SEQ ID NO:4所示；
用于扩增人乳头瘤病毒的引物5，其碱基序列如SEQ ID NO:5所示；
用于扩增人乳头瘤病毒的引物6，其碱基序列如SEQ ID NO:6所示。
表2引物系列
实施例3：探针设计和合成
从GeneBank中调出各亚型人乳头瘤病毒的L1区DNA序列，然后通过DNAStar软件对各亚型L1区序列进行比较，为了保证各型的特异性我们在各高危型序列特异的区域设计的针对各高危型的分子信标探针并进行合成。共设计了18条探针，探针序列如下：
特异检测人乳头瘤病毒16型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:7所示；
特异检测人乳头瘤病毒18型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:8所示；
特异检测人乳头瘤病毒26型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:9所示；
特异检测人乳头瘤病毒31型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:10所示；
特异检测人乳头瘤病毒33型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:11所示；
特异检测人乳头瘤病毒35型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:12所示；
特异检测人乳头瘤病毒39型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:13所示；
特异检测人乳头瘤病毒45型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:14所示；
特异检测人乳头瘤病毒51型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:15所示；
特异检测人乳头瘤病毒52型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:16所示；
特异检测人乳头瘤病毒53型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:17所示；
特异检测人乳头瘤病毒56型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:18所示；
特异检测人乳头瘤病毒58型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:19所示；
特异检测人乳头瘤病毒59型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:20所示；
特异检测人乳头瘤病毒66型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:21所示；
特异检测人乳头瘤病毒68型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:22所示；
特异检测人乳头瘤病毒73型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:23所示；
特异检测人乳头瘤病毒82型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:24所示。
所述分子信标探针5’端用荧光染料标记，3’端淬灭荧光染料标记。
表3探针系列
本发明设计通用的PCR引物和特异的探针，HPV特异的探针5’端标记报告荧光基团，3’端标记淬灭基团。荧光基团可以为FAM（发射波长：522nm）、ROX（发射波长：608nm）、JOE（发射波长：548nm）、VIC/HEX（发射波长：555nm）、TAMRA（发射波长：582nm），而淬灭基团可以为BHQ-1或BHQ-2或DABCYL。由于本试剂盒HPV16分子信标探针荧光基团标记FAM，淬灭基团BHQ-1，HPV18分子信标探针荧光基团标记ROX，淬灭基团标记BHQ-2，其他型分子信标探针荧光基团标记HEX，淬灭基团BHQ-1。
16、18和除了16、18型外的其他高危型探针标记以上荧光基团的任意一种，三者可以不相同。
实施例4：特异性探针的筛选
本发明采用多重PCR技术即在同一PCR反应体系中含有多个引物对多个靶序列进行PCR检测。采用多重PCR优势在于可以高效、经济简便，可以在同一反应管中同时检出多种高危型HPV，可以大大节省时间和成本，更能满足临床的要求；而多重PCR劣势在于体系中使用过多引物，引物之间的相互反应，影响彼此的扩增效率。因此多重PCR引物探针设计的难点在于如何避免引物与引物之间、引物与探针之间和探针与探针之间的交叉反应。为了解决这个问题，本发明采用了通用的引物和特异的型荧光探针，通用的引物减少了引物的使用量，而特异的型探针保证了各型检测的特异性。本发明采用分子信标探针，在退火温度不变的情况下，尽可能减少探针的长度，从而降低和引物及其他探针交叉反应的几率，提高扩增效率，提高产品的灵敏度。
本发明特异性探针采用遵循的原则，当特异性探针在单条探针的体系中对阳性标本检测能力和特异性没有问题时，再将该条特异性型探针添加到多探针体系中，最后该条特异性探针在多探针体系中对阳性标本的检测能力和特异性没有问题时才会被采用。
具体检测结果见图1——图18。
实施例5：常见高危型组合的试验
（1）2种常见高危型人乳头瘤病毒核酸试剂盒的试验
该发明试剂盒为一种可以同时检测HPV16、18高危型人乳头瘤病毒检测试剂盒，反应体系采用4条的通用引物（SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4）和2条特异型探针HPV16、HPV18（SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8）。用该发明试剂盒对18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304进行检测。
试验结果见图19。从图19扩增结果可以看出，本发明方法和试剂盒对其他的高危型人乳头瘤病毒DNA和低危型人乳头瘤病毒DNA检测特异性符合率达100%。
（2）5种常见高危型人乳头瘤病毒核酸试剂盒试验
该发明试剂盒为一种同时检测HPV16、18、33、52、58高危型人乳头瘤病毒检测试剂盒，反应体系采用4条的通用引物（SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4）和5条特异型探针HPV16、HPV18、HPV33、HPV52、HPV58（SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19）。用该发明试剂盒对18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304进行检测。试验结果见图20。从图20扩增结果可以看出，本发明方法和试剂盒对其他的高危型人乳头瘤病毒DNA和低危型人乳头瘤病毒DNA检测特异性符合率达100%。
（3）8种常见高危型人乳头瘤病毒核酸试剂盒试验
该发明试剂盒为一种同时检测HPV16、18、31、33、45、52、56、58高危型人乳头瘤病毒检测试剂盒，反应体系采用4条的通用引物（SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4）和8条特异型探针HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58（SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19）。用该发明试剂盒对18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304进行检测。试验结果见图21。从图21扩增结果可以看出，本发明方法和试剂盒对其他的高危型人乳头瘤病毒DNA和低危型人乳头瘤病毒DNA检测特异性符合率达100%。
（4）13种常见高危型人乳头瘤病毒核酸试剂盒试验
该发明试剂盒为一种同时检测HPV16、18、33、52、58高危型人乳头瘤病毒检测试剂盒，反应体系采用5条的通用引物（SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：5）和13条特异型探针HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68（SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22）。用该发明试剂盒对18种高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和16种低危型HPV即HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304进行检测。试验结果见图22。从图22扩增结果可以看出，本发明方法和试剂盒对其他的高危型人乳头瘤病毒DNA和低危型人乳头瘤病毒DNA检测特异性符合率达100%。
实施例6：18种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒的准确性检测
用该发明试剂盒对中国药品生物制品检定所建立的HPV基因分型质控品盘中的18种高危型人乳头瘤病毒DNA质粒模板进行检测。检测结果见图23。从图23扩增结果可以看出，本发明方法和试剂盒对国家panel中18种高危型人乳头瘤病毒DNA检测结果均为阳性，说明试剂盒阳性符合率达100%。
实施例7：18种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒对低危型DNA的特异性检测。
将中国药品生物制品检定所建立的HPV基因分型质控品盘中16种低危型人乳头瘤病毒DNA质粒（浓度为1.0×107-1.0×108copies/ml）为模板，使用本发明18种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒进行检测，检测结果见附图24。中国药品生物制品检定所建立的HPV基因分型质控品盘中16种低危型人乳头瘤病毒具体为：HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81、83、8304。从图24扩增结果可以看出，本试剂盒对浓度约为1.0×107-1.0×108copies/ml的各低危型乳头瘤病毒DNA模板的检测结果呈阴性，说明试剂盒的特异性符合率达100%。
实施例8：18种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒的灵敏度检测
将中国药品生物制品检定所建立的HPV基因分型质控品盘中的18种高危型人乳头瘤病毒DNA质粒（浓度为1.0×102-1.0×103copies/ml）为模板，使用本发明组合试剂盒进行检测，具体检测结果见表4。从表4可以看出本试剂盒对各高危型人乳头瘤病毒DNA模板的检测能力完全满足行业标准不高于104copies/反应的要求，可以满足临床的需求。
表4.18种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒灵敏度试验结果
实施例9：18种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒对临床标本的检测
使用本发明的18种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，对300份已经用凯普芯片试剂确认的临床宫颈标本进行检测，其中165例含高危型人乳头瘤病毒DNA，24例含低危型人乳头瘤病毒DNA，另外111例不含人乳头瘤病毒DNA。结果显示，165例高危型人乳头瘤病毒DNA阳性临床样本用本发明的18种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒检测，有7例呈阴性，158例呈阳性，阳性符合率为95.75%；而24例低危型人乳头瘤病毒DNA阳性临床样本和111例不含人乳头瘤病毒DNA的临床样本用本发明的18种高危型人乳头瘤病毒检测试剂盒检测，结果均为阴性，特异性符合率100%。可见本发明的方法和试剂盒完全可以满足临床检测的需要。本发明的试剂与凯普芯片试剂的比较结果如下表5所示。
表5.18种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒与凯普芯片试剂盒对临床标本检测结果比较
以下为使用上述实施例的试剂盒使用步骤：
样品准备：
1.适用标本类型：女性宫颈分泌物、男女性尿道分泌物。
2.标本采集
1）采集分泌物：
男性尿道——把棉拭子伸入尿道约3厘米，捻动棉拭子采集分泌物（采集分泌物前2小时禁小便）；
女性生殖道—用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦拭干净，再把新的棉拭子伸入宫颈内，停留数秒后旋动棉拭子采集宫颈分泌物；
女性尿道——用棉拭子将尿道口擦拭干净，再把新的棉拭子伸入尿道约2厘米，捻动棉拭子采集分泌物。
2）将取样后的棉拭子放入约1ml的生理盐水中充分漂洗，丢弃棉拭子，密闭送检。
3）采集好的标本在2～8℃保存不超过24小时，-18～-20℃保存不超过6个月，需长期保存的应放置在-70℃，避免反复冻融。
操作步骤
1样本处理（在样本处理区进行）
1.1取出待测样本、HPV18质粒和超纯水，置于室温解冻，并振荡混匀。
1.2取1.5ml离心管，分别加入20μl蛋白酶K（20mg/ml）、200μl待测样本、480μl裂解液，振荡充分混匀。
1.3放入预先加热至65℃水浴锅中，静置5min。
1.4加入20μl磁珠，振荡使充分混匀，室温放置5min。
1.5将离心管放至磁架上，静置使磁珠完全被吸附，弃上清。
1.6加入500μl洗涤液A至1.5ml离心管中，震荡使充分混匀。
1.7将离心管放至磁架上，静置使磁珠完全被吸附，弃上清。
1.8加入500μl洗涤液B至1.5ml离心管中，震荡充分混匀。
1.9将离心管放至磁架上，静置使磁珠完全被吸附，弃上清。
1.10室温放置5min使参与液体挥发干净。
1.11加入100μl洗脱液，震荡混匀，室温静置2min。
1.12将1.5ml离心管放至磁架上，静置使磁珠完全吸附，取上清作扩增模板（如果当天不用，取出上清，于-20℃保存）。
注：阳性对照无需处理，可直接用于PCR扩增。
2扩增试剂准备（在PCR配液区进行）
从试剂盒中取出HPV PCR反应混合液、酶混合液，平衡至室温后取出相应分数的量（PCR反应混合液48μl/人份、酶混合液0.6μl/人份）混匀，向每个PCR反应管内分装48μl，转移至样本处理区。
3加样（在样本处理区进行）
在对应的PCR反应管中分别加入2μl处理好的样本DNA、阳性对照、阴性对照，盖好管盖转移至扩增区。
备注：先把阴性对照加入PCR反应管中，盖好盖子后，再加其他的模板。
4扩增（在扩增区进行）
4.1把加好模板的PCR反应管置于全自动荧光PCR检测仪中，参照仪器操作说明设定好PCR反应所需的各参数，记录好样本摆放顺序及名称。
4.2反应程序设定：
第一步：50℃2min，1个循环；
第二步：95℃5min，1个循环；
第三步：95℃5s，40℃30s，72℃30s，10个循环；
第四步：95℃5s，60℃35s，72℃30s，40个循环。
在60℃35秒时采集荧光，选择的荧光通道是FAM、HEX和ROX。
5结果判断
5.1基线、阈值的设定
基线值一般以仪器默认为准，特殊情况也可适当调整。
阈值设定原则如下：刚好超过阴性对照扩增曲线的最高值。
5.2质控品结果
5.2.1阴性对照Ct值均应显示为Undet。
5.2.2阳性对照Ct值≤26。
5.3结果判断
5.3.1样品的Ct值显示为Undet。判断为阴性。
5.3.2样本的Ct值≤35，判断为阳性；若为35＜Ct值＜40的样本建议重做，重做结果Ct值＜40者为阳性，否则为阴性。
5.3.3在FAM通道的扩增曲线明显呈或有“S”型趋势（Ct<35），则判断为HPV18型阳性。
5.3.4在ROX通道的扩增曲线明显呈或有“S”型趋势（Ct<35），则判断为HPV16型阳性。
5.3.5在HEX通道的扩增曲线明显呈或有“S”型趋势（Ct<35），则判断为除了其他高危型阳性。
5.3.3在FAM通道和HEX通道的扩增曲线明显呈或有“S”型趋势（Ct<35），则判断为HPV18和其他高危型阳性。
5.3.4在FAM通道和ROX通道的扩增曲线明显呈或有“S”型趋势（Ct<35），则判断为HPV18/16以及其他高危型均为阳性。
5.3.5在ROX通道和HEX通道的扩增曲线明显呈或有“S”型趋势（Ct<35），则判断为HPV16和其他高危型均为阳性。
5.3.3在FAM通道、ROX通道和HEX通道的扩增曲线明显呈或有“S”型趋势（Ct<35），则判断为HPV18/16以及其他高危型均为阳性。
6有效期
有效期为12个月。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.用于18种高危型人乳头瘤病毒荧光PCR检测的引物和探针，所述18种高危型人乳头瘤病毒是指HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73和HPV82，其特征在于，所述引物为一组通用引物，序列如SEQ ID NO：1—SEQ ID NO：4所示，所述探针为特异探针，序列如SEQ ID NO：7—SEQ ID NO：24所示：
检测HPV16型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:7所示；
检测HPV18型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:8所示；
检测HPV26型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:9所示；
检测HPV31型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:10所示；
检测HPV33型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:11所示；
检测HPV35型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:12所示；
检测HPV39型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:13所示；
检测HPV45型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:14所示；
检测HPV51型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:15所示；
检测HPV52型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:16所示；
检测HPV53型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:17所示；
检测HPV56型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:18所示；
检测HPV58型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:19所示；
检测HPV59型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:20所示；
检测HPV66型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:21所示；
检测HPV68型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:22所示；
检测HPV73型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:23所示；
检测HPV82型分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO:24所示；
所述分子信标探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的用于18种高危型人乳头瘤病毒荧光PCR检测的引物和探针，其特征在于，所述荧光基团为FAM、ROX、JOE、HEX和TAMRA中的一种或几种，所述淬灭基团为BHQ-1、BHQ-2和DABCYL中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的用于18种高危型人乳头瘤病毒荧光PCR检测的引物和探针，其特征在于，所述引物还包括SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列中的一种或两种。
4.一种利用权利要求1所述引物和探针的高危型人乳头瘤病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含序列如SEQ ID NO：1—SEQ ID NO：4所示的引物，以及序列如SEQ ID NO:7—SEQ ID NO:24所示的探针序列中的一种或几种。
5.一种利用权利要求3所述引物和探针的高危型人乳头瘤病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含的引物序列如SEQ ID NO：1—SEQID NO：4所示，以及包括SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列中的一种，探针序列如SEQ ID NO:7—SEQ ID NO:24所示序列中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的高危型人乳头瘤病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测18种高危型人乳头瘤病毒，包含的引物序列如SEQID NO：1—SEQ ID NO：6所示，探针序列如SEQ ID NO:7—SEQ ID NO:24所示。
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