CN110607395A - 横跨内含子的高危型人乳头瘤病毒mRNA的检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及横跨内含子的高危型人乳头瘤病毒mRNA的检测方法及试剂盒，同时公开了该试剂盒的检测方法。该方法包括标本的核酸提取纯化，使用一步法多重RT‑PCR系统扩增检测18种中高危型HPV mRNA和内参基因。针对18种中高危型HPV设计的引物和探针，可快速实现特异性高危HPV mRNA的检测及分型检测，特点是通过设计横跨内含子的寡核苷酸引物或探针来实施特异性mRNA的检测。本发明的试剂盒具有快速、高效、敏感度高、特异性好、分型准确、可实时分析等特点，为HPV的普查和宫颈癌防治提供了快速准确的分子检测方法，同时大大降低了检验成本，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术核酸诊断领域，尤其涉及高危型人乳头瘤病毒专一性检测mRNA 的引物、探针及试剂盒，及其检测方法，并包括分型检测方法。可以单管不完全分型，也可以通过多管扩增实施中高危型的分型检测。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)属乳头多瘤空泡病毒科，是一种嗜上皮细胞病毒，为无包膜的双链环状DNA病毒。其基因组共由3个基因区组成，包括早期区(E区)、晚期区(L区)和与非编码区(UCR)。E区按顺序为E6、E7、E1、E2、E3、E4和E5共 7个基因，参与病毒DNA的复制、转录、编码病毒蛋白、维持细胞内病毒的高拷贝数的基因，其中E6和E7是HPV的主要致癌基因，与病毒细胞转化功能及致癌性有关。L区主要有编码衣壳蛋白的L1和编码次要衣壳蛋白的L2。L1较为保守，特异性适中，L2编码的衣壳蛋白较小，但变异多。UCR含有复制起点和调控转录与表达所必需的元件。HPV可归类成120多种基因型，其中有50余种定向感染人体生殖道皮肤及粘膜的复层鳞状上皮，导致尖锐湿疣糜烂，可能引起癌症的发生。根据其是否可以引起癌变，HPV亚型可分为“低危”型、“中危”、“高危”型，“低危”主要引起良性的生殖器疣和低度的宫颈上皮坏死(CIN)，“高危”的感染是引发宫颈癌的主要致病因素，“中危”则是介于二者之间。在大多数情况下，免疫系统能在HPV造成伤害之前将其清除，95％以上的生殖道HPV感染能在3-5年内痊愈，但也有少数HPV感染不能被清除，经过多年的系列病变后，发展为宫颈癌。宫颈癌是危害女性健康的第2大恶性肿瘤，而高危型HPV的持续性感染是宫颈癌发生的必要条件。HPV感染使宫颈癌的相对危险性增加了250倍，从高危型HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变最终发展为宫颈癌大约需要5-10年。约99.7％的宫颈癌都是由高危型HPV造成，尤其是HPV 16、18、31、33、35的反复或持续感染所致。因此，高危HPV 病毒是目前最明确的致癌病毒，高危型HPV的检测，对宫颈癌的早期诊断和治疗具有重要的意义。另一方面，研究表明至少50％有性活动的成年人在其一生中曾感染HPV，至少80％的妇女在50岁之前曾感染HPV。但80％HPV感染者2年内会自行消退，这部分人如果以 HPV DNA作为检测靶标，将会呈阳性。只有20％的HPV感染者会进一步发展，即E6/E7基因整合到人类基因组通过转录出E6/E7 mRNA后翻译为E6/E7蛋白，诱发癌前病变及宫颈癌。因此，以高危HPV DNA为检测靶标的分子诊断试剂已在普遍使用，可以用作排除宫颈癌的手段之一：未检出高危型HPV DNA，一般提示不会发生宫颈癌；检出高危型HPV DNA，也未必会发生宫颈癌，需持续跟踪检测。因此，如果把高危DNA与发生宫颈癌概率作为临床研究来看，高危HPV DNA的检测有很高的临床阴性预示值，却有较低的临床阳性预示值。现有研究表明，以高危HPV m RNA尤其是E6/E7 mRNA或E1/E2 mRNA作为检测靶标可以大幅度提高阳性预示值，而不降低阴性预示值。故当前HPV m RNA的检测正成为研究热点。
另外，宫颈细胞的病变程度不仅与病毒类型以及浓度相关，也与致癌基因的活动程度密切相关。HPV E6/E7信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)是病毒癌基因的转录产物，它在宫颈组织中表现出癌基因的活性，HPV E6/E7 mRNA水平与病变的严重程度相关。研究表明，与HPVDNA检测相比，HPV E6/E7 mRNA检测可能是一种更有效的方式，为感染高危型HPV的妇女提供了更准确的风险预测。2006年欧洲生殖器感染及肿瘤研究组织认为HPV E6/E7 mRNA检测可以作为HPV相关的分子标记物之一。后续的研究显示，HPV mRNA的检测比HPVDNA检测更具临床意义。
然而，特异性检测m RNA是有难度的，在于如何不扩增基因组DNA而只扩增m RNA。当前的NASBA(NucliSense EasyQ HPV assay，Biomérieux)或TMA(Aptima humanpapillomavirus E6/E7 mRNA Test,Gen-probe/Hologic)借助恒温(37-42℃)反应进行扩增,基因组DNA因为双链结构溶解温度较高,42℃下未能完全变性而无法参与扩增,RNA为单链且片段小、溶解温度低，经逆转录酶及逆转录引物结合后，逆转录成c DNA,由T7或T3 噬菌体RNA聚合酶识别其启动子后转录放大。用RT-PCR来检测m RNA，因为PCR无法直接扩增RNA，须经逆转录成c DNA后再行PCR扩增，如何区分扩增子来自c DNA还是基因组DNA，只能通过引物探针设计解决。另外的途径是在起始核酸模板中使RNA与DNA分离：如DNA酶消化基因组DNA、待测标本实施倾向于RNA的提取法等。然而这种途径并不十分有效，难以完全排除基因组DNA的阳性信号：DNA酶消化的残留片段足以使基于短片段的 TaqMan PCR扩增检出信号，而倾向于RNA的提取方法包括oligodT捕获m RNA法等区分能力均更为有限，仅为百分比差异而已。这些手段可以作为辅助而不能解决基因组DNA与其 m RNA的区分。综上所述，只有通过引物探针设计，从原理上排除基因组DNA的影响，才是解决问题的关键：通常一个基因有多个内含子，转录时发生拼接，成为一个或多个转录本或称剪切体。利用外显子拼接的事实可以设计专一性检测m RNA,如TaqMan PCR可将检测探针设计在两个外显子的拼接处，使得基因组DNA无法结合探针而m RNA可以结合探针；也可以将引物设计在拼接处，使得基因组DNA不能结合引物而无法扩增。
当然，剪切体的检测依赖于拼接位点的准确信息，序列信息乃至生物信息学是一切基于核酸分析的分子诊断的基础。病毒基因转录时还可拥有多种转录本，丰度可以不同，对这些基因表达的详尽研究是设计合理的检测靶标的依据。随着研究深入，学者们通过设计基因两侧的引物对活跃表达的HPV病毒进行RT-PCR，获得大小不一的扩增子，其中最大的为基因组DNA，小片段则为m RNA扩增产物，电泳分离纯化后测序，可获知m RNA拼接位点。不同型别HPV的E6/E7或E1/E2 m RNA拼接位点不尽相同，产生的剪切体数目不尽相同，德国学者Sotlar K等人“Detection of high-risk human papillomavirus E6 and E7 oncogenetranscripts in cervical scrapes by nested RT-polymerase chain reaction”【J MedVirol.2004 74(1):107-116】报道了HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、 56、58、59、66、68型的E6/E7 m RNA剪切位点，Halec G等人“Biological activity of probable/possiblehigh-risk human papillomavirus types in cervical cancer”【Int J Cancer.2013；132(1):63-71】报道了20种HPV的E6*ⅠmRNA的拼接位点。至今仍有很多型的HPV m RNA拼接位点尚不明确，未有报道。
发明内容
针对现有HPV分子诊断试剂的缺陷：HPV L1 DNA为靶标，序列保守，但整合时可能丢失而漏检，分型存在交叉反应；以HPV E6/E7 DNA或E1/E2 DNA为靶标，阳性检出能力突出但与宫颈癌及宫颈上皮细胞内瘤变2-3级(CIN2-3)相关性差。国际上，当前已商业化的HPVmRNA检测产品有Hologic公司的Aptima HPV(TMA技术)、DiaCarta公司的QuantiVirus HPV(b DNA技术)、BioMerieux公司的NucliSENS Easy HPV(NASBA技术)挪威PreTectAS公司的PreTect HPV-Proofer(NASBA-分子信标技术)。这些技术涉及基于转录介导等温扩增技术(TMA)原理、基于分支链DNA信号放大技术(bDNA)原理以及基于实时多重核酸序列依赖性扩增技术(Real-Time NASBA)原理。这些产品虽可有效检测临床样本中存在的高危型HPV E6/E7 mRNA，但操作步骤繁琐、成本较高、E6/E7 DNA干扰信号等，不利于开展高危型HPV 日常筛查。国内已商业化的HPV E6/E7 mRNA检测产品仅有河南新乡科蒂亚生物的HPV E6/E7mRNA检测试剂盒(支链DNA信号扩增法)、而迪安诊断申请有HPV E6/E7 mRNA检测的专利却只有DNA检测分型的产品(PCR分子信标-溶解曲线法，类似于厦门至善生物的同类产品)。科蒂亚的产品基于b DNA技术，从技术角度来看，一般认为其灵敏度、特异性逊色于实时荧光PCR产品。
本发明的目的是针对现有技术存在的检测结果不准确，灵敏度低的缺陷，提出用于检测高危型人乳头瘤病毒E6/E7或(和)E1/E2 mRNA分型的引物和探针及试剂盒，检测结果具有较好的临床参考价值。本发明人根据文献、实验室长期研究、临床标本验证等工作进行总结、创新、实践，提供了用于检测高危型人乳头瘤病毒E6/E7或(和)E1/E2 mRNA分型的引物及探针组，该引物及探针组包括18种中高危型HPV及内参引物及探针组。其核心是：利用外显子拼接的事实专一性检测m RNA,将检测探针设计在两个外显子的拼接处，使得基因组DNA无法结合探针而m RNA可以结合探针，也可以将引物设计在拼接处，使得基因组DNA不能结合引物而无法扩增。本检测技术可以结合自动化核酸提取试剂与配套仪器，一步法多重RT-PCR扩增检测，整个流程在3小时内完成，大大提高了筛查效率，灵敏度高，特异性强，分型准确，不同型无交叉反应，具有很大的使用价值。
根据本发明人的既往发明技术，自动化核酸提取试剂由裂解液、蛋白酶K，洗涤液A，洗涤液B，洗脱液，磁珠组成。并可制成预封装即用型试剂。
裂解液：1-5M异硫氰酸胍或盐酸胍、0.2-1％SDS、10-50％异丙醇或乙醇、0.5-5M尿素、 0.1-2％DTT、0.5-20％Triton x-100或吐温20或CA630或Brij-35等
蛋白酶K，10-20mg/ml
洗涤液A:2-4M异硫氰酸胍或盐酸胍、0.05-0.5％SDS、30-60％异丙醇或乙醇等
洗涤液B:2-20m M NaCL、60-90％异丙醇或乙醇、0.1％Tween20等
洗脱液：TE(PH7.2-8.2),可含少量吐温20等
磁珠：硅基磁珠，可选倾向于RNA结合的磁珠，与RNA亲和力显著优于DNA(基于粒径或者表面修饰基团优选)，悬于异丙醇中。
为了避免基因组DNA的影响，还可以在蛋白酶K中加入DNA酶。
而一步法多重RT-PCR扩增检测体系由50mM Tricine(p H8.3)、75mM KOAc、2.5-5mM Mn(OAc)2、 0.1m M EDTA、5-50U MMLV、2-10U热启动耐热聚合酶、0.1-2U不耐热UNG、2-10U RN asin、0.2m M d NTPs(含d U不含d T)、适量BSA及防腐剂及增强剂等组成。
本发明的核心内容，是设计了18组特异性扩增检测HPV m RNA的引物探针组，并经临床标本的验证。要求保护的主题，就是要求以下的引物探针序列用作HPV m RNA检测时，落入本发明人要求的保护内容之中。
(1)检测HPV16的引物对与探针如SEQ ID NO.1-2,NO.3及SEQ ID NO.4-5,NO.6所示，
由于HPV16主要的剪切体有2种，故分别针对其设计；
(2)检测HPV18的引物对与探针如SEQ ID NO.7-8,NO.9所示；
(3)检测HPV31的引物对与探针如SEQ ID NO.10-11,NO.12所示；
(4)检测HPV33的引物对与探针如SEQ ID NO.13-14,NO.15所示；
(5)检测HPV35的引物对与探针如SEQ ID NO.16-17,NO.18所示；
(6)检测HPV39的引物对与探针如SEQ ID NO.19-20,NO.21所示；
(7)检测HPV45的引物对与探针如SEQ ID NO.22-23,NO.24所示；
(8)检测HPV51的引物对与探针如SEQ ID NO.25-26,NO.27所示；
(9)检测HPV52的引物对与探针如SEQ ID NO.28-29,NO.30所示；
(10)检测HPV56的引物对与探针如SEQ ID NO.31-32,NO.33所示；
(11)检测HPV58的引物对与探针如SEQ ID NO.34-35,NO.36所示；
(12)检测HPV59的引物对与探针如SEQ ID NO.37-38,NO.39所示；
(13)检测HPV66的引物对与探针如SEQ ID NO.40-41,NO.42所示；
(14)检测HPV68的引物对与探针如SEQ ID NO.43-44,NO.45所示；
(15)检测HPV73的引物对与探针如SEQ ID NO.46-47,NO.48所示；
(16)检测HPV82的引物对与探针如SEQ ID NO.49-50,NO.51所示；
(17)检测HPV26(中危型)的引物对与探针如SEQ ID NO.52-53,NO.54所示；
(18)检测HPV53(中危型)的引物对与探针如SEQ ID NO.55-56,NO.57所示；
(19)检测内参基因(ACTB)的引物对与探针如SEQ ID NO.58-59,NO.60所示；
附图说明
图1为本发明实施例FAM荧光对应着除HPV16,18之外的剩余16种中高危型HPV
图2为本发明实施例VIC荧光对应着HPV16
图3为本发明实施例ROX荧光对应着HPV18
图4为本发明实施例CY5荧光对应着ACTB mRNA(内标)
具体实施方式
很明显，本发明将不仅限于实施例。
实施如下：
TCT、PAP或宫颈脱落细胞等标本，取50-200μl，加入400μl裂解液(4.5M异硫氰酸胍、0.5％SDS、10％异丙醇、0.5M尿素、10％Triton x-100、0.5％DTT、20m M Tris p H7.5),加入20μl 10mg/ml蛋白酶K、50U/ml DNase I(RNase-free)混合物，37℃10分钟后，加入悬在异丙醇中的硅基磁珠300μl(磁珠浓度为2mg/ml),混匀结合10分钟，900μl洗涤液A(2M异硫氰酸胍、0.05％SDS、50％异丙醇)洗涤1分钟、900μl洗涤液B(70％乙醇， 0.1％Tween20)洗涤1分钟、100μl洗脱液(0.1TE)37-70℃5分钟洗脱。
以ABI7500为例，取一步法多重RT-PCR主反应液10μl、酶混合物(3μl)、引物探针混合液5μl，提取产物32μl，上机扩增检测，RT-PCR程序为：50℃10分钟，95℃2分钟， 95℃10秒、60℃30秒(60℃末读取FAM、VIC、NED、ROX、CY5荧光)，循环45次。其中，一步法多重RT-PCR主反应液、酶混合物、引物探针混合液的反应终浓度为：50mM Tricine(p H8.3)、75m MKOAc、2.5m M Mn(OAc)2、0.1m M EDTA、10U MMLV、5U热启动耐热聚合酶、0.2U不耐热UNG、4URN asin、0.2m M d NTPs、0.1％BSA、0.02％NaN3,0.1M betaine,0.2μM引物、0.05μM 荧光探针。荧光探针标记可选FAM、VIC、NED、ROX，CY5或根据扩增仪的荧光通道设置，由于ABI7500只有5通道，内标占据一个通道，HPV16、HPV18各占一通道，剩余两个通道由其余的16个中高危型别分成两组占有。
附表：引物探针组为，上述序列SEQ ID NO.1-60。
结果如附图所示。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确立的保护范围之内。
Claims (5)
1.横跨内含子的高危型人乳头瘤病毒mRNA的检测方法及试剂盒，其特征在于设计横跨内含子的寡核苷酸引物或探针来实施特异性mRNA的检测。而这些横跨内含子的引物及探针序列具备HPV mRNA的专一检测功能，为本发明要求保护的内容。
2.根据权利要求1所述的横跨内含子的高危型人乳头瘤病毒mRNA的检测方法及试剂盒，采用的引物或探针，分别针对18种中高危HPV E6/E7 mRNA及(或)E1/E2 mRNA。其引物对及探针分别如附表所示。
3.根据权利要求1所述的横跨内含子的高危型人乳头瘤病毒mRNA的检测方法及试剂盒，其特征还在于使用磁珠法核酸提取纯化试剂，选用与RNA亲和力优于DNA的硅基磁珠，并可在提取纯化中可选加DNA酶消化的步骤。虽然与RNA亲和力高的磁珠及DNA酶的使用均非必须，然而，如果基因组DNA显著超过其m RNA浓度，尽管对检测特异性无影响，却对检测灵敏度有负面作用。因此在核酸提取阶段，选用RNA亲和力高的硅基磁珠及DNA酶是本发明得以最佳体现的辅助手段。
4.根据权利要求1所述的横跨内含子的高危型人乳头瘤病毒mRNA的检测方法及试剂盒，其特征还在于使用一步法多重RT-PCR试剂，其配方为：
50m M Tricine(p H8.3)、75m M KOAc、2.5m M Mn(OAc)2、0.1m M EDTA、10U MMLV(RNase H minus)、5U热启动耐热聚合酶、0.2U不耐热UNG、4U RN asin、0.2m Md NTPs、0.1％BSA、0.02％NaN3,0.1M betaine,0.2μM引物、0.05μM荧光探针。
5.根据权利要求1所述的横跨内含子的高危型人乳头瘤病毒mRNA的检测方法及试剂盒，其特征还在于使用培养上皮细胞系如HcerEpiC细胞为阴性对照，而含有设计序列扩增区的RNA假病毒颗粒为阳性对照。二者均为外购或委托技术服务公司如厦门致善生物定制。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191224 |
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