CN109487008B - 呼吸道病原体的多重pcr检测试剂盒、用途及其使用方法 - Google Patents

呼吸道病原体的多重pcr检测试剂盒、用途及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了呼吸道病原体的多重PCR检测试剂盒、该试剂盒的用途以及该试剂盒的使用方法，PCR检测试剂盒中包括扩多种引物及探针的混合物，PCR反应液，PCR酶液，内质控品以及核酸提取试剂，该检测试剂盒用于检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感1、副流感II、副流感III、腺病毒、偏肺病毒和肠道或者鼻病毒中的一种或者多种病原体，使用该试剂盒首先需要采样再需要PCR扩增以及检测，最后得出检测结果，采用本试剂盒中的核酸提取试剂、引物对、探针、PCR程序、PCR反应液和PCR酶液的结合、协同，最后达到缩短检测时间、检测灵敏度好以及特异性好的技术效果。

Description

呼吸道病原体的多重PCR检测试剂盒、用途及其使用方法
技术领域
本发明属于核酸扩增技术领域，主要涉及一种用于检测呼吸道病原体的试剂盒，用途及其使用方法。
背景技术
呼吸道感染在临床上极为常见，但由于引起呼吸道感染的病原体种类多种多样，快速准确对病原体进行鉴定对于临床诊疗以及防止药物滥用具有重要意义。基于Taqman探针的荧光定量PCR技术能够特异性对病原体核酸分子进行大量扩增，同时利用荧光信号的积累实现阴阳性结果判读。相比于生化指标及免疫方法，分子诊断灵敏度极高，能够基于不同病原体基因序列的差异性实现病原体种类鉴定以及亚型区分，在疾病的诊疗中具有明显优势。
然而，传统分子诊断方法的一些问题阻碍了该方法在呼吸道病毒感染中的大规模使用。首先是检测流程偏长，分子诊断操作复杂，涉及到核酸提取以及产物扩增，如何简化操作流程，节省实验时间，对于患者迅速得到正确治疗具有重要意义；其次是目前分子诊断测试多为单重体系，检测项目有限，但是呼吸道病毒种类繁多，单单是引起普通感冒最为常见的鼻病毒就有约145种血清型，单重PCR体系常常会出现患者测试结果为阴性情况，无法对患者给与有价值的信息，目前国内外对呼吸道病原体检测方法有很多种，它们各有优缺点，检测技术包括传统的分离培养法、免疫学检测技术以及新兴的分子生物学技术，以核酸为基础的分子检测方法以其快速、灵敏、特异以及省时省力的特点，成为呼吸道病原体检测的革命性技术，多重PCR是指在同一反应体系中，加入多对特异性引物，于此同时，如何让加入的引物不互相干扰并且其检测灵敏度也不低于单项PCR检测灵敏度成为一大技术难点，并且在遇到病危或者紧急情况下，如何提高整个检测过程的效率，让病人得到及时准确的治疗成为一种紧急需求，因此，开发一种快速、检测灵敏度高、具有良好重现性的多重检测呼吸道病原体感染的PCR检测试剂盒具有明确的临床意义及潜在应用价值。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种快速、检测灵敏度高、具有良好重现性的多重检测呼吸道病原体感染的PCR检测试剂盒。
本发明提供了一种呼吸道病原体的多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感1、副流感II、副流感III、腺病毒、偏肺病毒和肠道或者鼻病毒中的一种或者多种病原体的引物对及探针的混合物。
进一步的，本发明中的引物对如下所示：
由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的两条序列组成的引物对，所述引物对针对甲型流感病毒；
由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的两条序列组成的引物对，所述引物对针对乙型流感病毒；
由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的两条序列组成的引物对，所述引物对针对呼吸道合胞病毒；
由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的两条序列组成引物对，所述引物对针对副流感I；
由SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的两条序列组成的引物对，所述引物对针对副流感II；
由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的两条序列组成的引物对，所述引物对针对副流感III；
由SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的两条序列组成的引物对，所述引物对针对腺病毒；
由SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的两条序列组成的引物对，所述引物对针对偏肺病毒；
由SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的两条序列组成的引物对，所述引物对针对肠道或者鼻病毒。
进一步的，本发明中的探针如下所示：
SEQ ID NO:19所示的序列或其反向互补序列，所述序列组成的探针针对甲型流感病毒；
SEQ ID NO:20所示的序列或其反向互补序列，所述序列组成的探针针对乙型流感病毒；
SEQ ID NO:21所示的序列或其反向互补序列，所述序列组成的探针针对呼吸道合胞病毒；
SEQ ID NO:22所示的序列或其反向互补序列，所述序列组成的探针针对副流感I；
SEQ ID NO:23所示的序列或其反向互补序列，所述序列组成的探针针对副流感II；
SEQ ID NO:24所示的序列或其反向互补序列，所述序列组成的探针针对副流感III；
SEQ ID NO:25所示的序列或其反向互补序列，所述序列组成的探针针对腺病毒；
SEQ ID NO:26所示的序列或其反向互补序列，所述序列组成的探针针对偏肺病毒；
SEQ ID NO:27所示的序列或其反向互补序列，所述序列组成的探针针对肠道或者鼻病毒。
进一步的，本发明中的探针的两端分别带有荧光基团和猝灭基团，荧光基团为VIC，ROX，FAM和CY5中的一种，猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3和MGBNFQ中的一种。
进一步的，本发明中的荧光基团为FAM，所述猝灭基团为MGBNFQ。
进一步的，本发明中的检测试剂盒还包括PCR反应液，反应液主要由如下组分组成：10×Bufferfor Taq 10％-50％；MgCl21-10 mM；DTT 0-5mM；dATP 0.05-1mM；dCTP0.05-1mM；dGTP 0.05-1mM；dUTP 0.1-2mM。
进一步的，本发明中的PCR反应液还包括BSA 0-10mg/mL和甘油0％-10％。
进一步的，本发明中的PCR反应液主要由如下组分组成：10×Buffer for Taq15％；MgCl22 mM；DTT 1mM；dATP 0.2mM；dCTP 0.2mM；dGTP 0.2mM；dUTP 0.4mM；BSA 1.5mg/mL和甘油5％。
进一步的，本发明中的检测试剂盒还包括PCR酶液，PCR酶液主要由如下组分组成：Taq DNAPolymerase 10-50％；UNG 0-20％；Superscript V 0.1％-10％；DTT 0-5mM；甘油0-50％。
进一步的，本发明中的PCR酶液还包括Anti-Taq 0-50％。
更进一步的，本发明中的PCR酶液主要由如下组分组成：Taq DNAPolymerase15％；UNG 5％；Superscript V 4％；DTT 2mM；甘油40％；Anti-Taq 15％。
进一步的，本发明中的检测试剂盒还包括内控质控品，所述内质控品的的引物对如SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所示，所述内质控品的探针序列如SEQ ID NO:30所示，内质控品质粒扩增子如SEQ ID NO:31所示。
进一步的，本发明中的检测试剂盒还包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂包括裂解结合液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液和硅油，裂解结合液包括如下组分：0.5％～2％的脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠、3％-5％的磁珠、异硫氰酸胍或盐酸胍1～5M，乙酸钠或乙酸钾1～5M，乙基苯基聚乙二醇1％～3％，蛋白酶K10％～20％，所述裂解结合液的pH值为7.0～9.0；洗涤缓冲液包括如下组分：碘化钠或碘化钾1～10mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10～50mM，乙醇75％，所述洗涤缓冲液的pH值为5.0～7.0；洗脱缓冲液包括如下组分：乙二胺四乙酸1-5mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10-50mM，所述洗脱缓冲液的pH值为7.4-8.0；硅油为100-200μL；
更进一步的，本发明中裂解结合液包括如下组分：1％的脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠、4％的100-1000nm的超顺磁性羧基氧化硅纳米微球磁珠、异硫氰酸胍或盐酸胍4M，乙酸钠或乙酸钾2M，乙基苯基聚乙二醇1.5％，蛋白酶K15％，所述裂解结合液的pH值为8.0；本发明中的洗涤缓冲液包括如下组分：碘化钠或碘化钾5M，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐40mM，乙醇75％，所述洗涤缓冲液的pH值为6.0；本发明中的洗脱缓冲液包括如下组分：乙二胺四乙酸1mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10mM，所述洗脱缓冲液的pH值为8.0；硅油为150μL。
本发明还提供了此检测试剂盒的用途，本发明中的检测试剂盒用于检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感1、副流感II、副流感III、腺病毒、偏肺病毒和肠道或者鼻病毒中的一种或者多种病原体。
本发明还提供了使用此试剂盒的方法，该方法包括如下步骤：
1)采样，并采用核酸提取试剂对样本中的RNA或者DNA进行提取，得核酸提取产物，内质控品质粒扩增子序列SEQ ID NO:31同步参与提取过程；
2)PCR扩增：其中PCR反应体系如下：PCR反应液0-50％；PCR酶液0-10％；单项目的正向引物和反向引物分别0.05-1μM；探针0.01-0.5μM；核酸提取产物0-50％；其中的扩增程序如下：
Figure GDA0003488988370000041
3)结果判读。
进一步的，本发明中的PCR反应体系如下：PCR反应液30％；PCR酶液7％；单项目的正向引物和反向引物分别0.7μM；探针0.4μM；核酸提取产物25％。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：采用本试剂盒中的核酸提取试剂、引物对、探针、PCR程序、PCR反应液和PCR酶液的结合、协同，最后达到缩短检测时间、检测灵敏度好以及特异性好的技术效果，整个检测时间达到一个半小时以内，时间缩短的原因有两方面，首先是提取试剂大大节约时间，利用半自动核酸提取仪或者全自动核酸提取仪可以9分钟得到32个样本核酸提取产物，达到同行业最快水平，有显著优势；其次是优化PCR程序以及反应液、酶液配方，保证性能的基础上缩短了逆转录时间。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为采用不同反应液的扩增图；
图2为对采用核酸提取试剂1提取出来的病原体检测的扩增图；
图3为采用核酸提取试剂2提取出来的病原体检测的扩增图；
图4为采用核酸提取试剂3提取出来的病原体检测的扩增图；
图5为单重(检测甲型流感病毒)的扩增图；
图6为单重(检测乙型流感病毒)的扩增图；
图7为单重(检测呼吸道合胞病毒)的扩增图；
图8为单重(检测副流感I)的扩增图；
图9为单重(检测副流感II)的扩增图；
图10为单重(检测副流感III)的扩增图；
图11为单重(检测偏肺病毒)的扩增图；
图12为单重(检测腺病毒)的扩增图；
图13为单重(检测肠道或者鼻病毒)的扩增图；
图14为采用本发明检测试剂盒对甲型流感病毒检测的扩增图；
图15为采用本发明检测试剂盒对乙型流感病毒检测的扩增图；
图16为采用本发明检测试剂盒对合胞病毒检测的扩增图；
图17为采用本发明检测试剂盒对副流感I检测的扩增图；
图18为采用本发明检测试剂盒对副流感II检测的扩增图；
图19为采用本发明检测试剂盒对副流感III检测的扩增图；
图20为采用本发明检测试剂盒对偏肺病毒检测的扩增图；
图21为采用本发明检测试剂盒对腺病毒检测的扩增图；
图22为采用本发明检测试剂盒对肠道或者鼻病毒检测的扩增图；
图23为体现本发明试剂盒特异性检测的扩增图；
图24为采用本试剂盒检测甲型流感病毒的扩增图；
图25为采用本试剂盒检测甲型流感病毒的扩增图。
具体实施方式
实施例1呼吸道病原体多种PCR检测试剂盒中PCR反应液成分的确定(序列合成厂家：Takara)
1、反应体系
1)PCR反应液
PCR反应液1：
10×Buffer for Taq 15％；MgCl22 mM；DTT 1mM；dATP 0.2mM；dCTP 0.2mM；dGTP0.2mM；dUTP 0.4mM
PCR反应液2：
10×Buffer for Taq 15％；MgCl22 mM；DTT 1mM；dATP 0.2mM；dCTP 0.2mM；dGTP0.2mM；dUTP 0.4mM；BSA 1.5mg/mL
PCR反应液3：
10×Buffer for Taq 15％；MgCl22 mM；DTT 1mM；dATP 0.2mM；dCTP 0.2mM；dGTP0.2mM；dUTP 0.4mM；BSA 1.5mg/mL和甘油5％
2)PCR酶液
Taq DNAPolymerase 15％；UNG 5％；Superscript V 4％；DTT 2mM；甘油40％；Anti-Taq15％。
3)引物对：如下所示：
由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的两条序列组成的引物对，所述引物对针对甲型流感病毒；
由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的两条序列组成的引物对，所述引物对针对乙型流感病毒；
由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的两条序列组成的引物对，所述引物对针对呼吸道合胞病毒；
由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的两条序列组成引物对，所述引物对针对副流感I；
由SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的两条序列组成的引物对，所述引物对针对副流感II；
由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的两条序列组成的引物对，所述引物对针对副流感III；
由SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的两条序列组成的引物对，所述引物对针对腺病毒；
由SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的两条序列组成的引物对，所述引物对针对偏肺病毒；
由SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的两条序列组成的引物对，所述引物对针对肠道或者鼻病毒。
4)探针：如下所示：
SEQ ID NO:19所示的序列或其反向互补序列，所述序列组成的探针针对甲型流感病毒；
SEQ ID NO:20所示的序列或其反向互补序列，所述序列组成的探针针对乙型流感病毒；
SEQ ID NO:21所示的序列或其反向互补序列，所述序列组成的探针针对呼吸道合胞病毒；
SEQ ID NO:22所示的序列或其反向互补序列，所述序列组成的探针针对副流感I；
SEQ ID NO:23所示的序列或其反向互补序列，所述序列组成的探针针对副流感II；
SEQ ID NO:24所示的序列或其反向互补序列，所述序列组成的探针针对副流感III；
SEQ ID NO:25所示的序列或其反向互补序列，所述序列组成的探针针对腺病毒；
SEQ ID NO:26所示的序列或其反向互补序列，所述序列组成的探针针对偏肺病毒；
SEQ ID NO:27所示的序列或其反向互补序列，所述序列组成的探针针对肠道或者鼻病毒。
5)核酸提取产物：采用本发明中的核酸提取试剂，200μL临床样本(鼻咽拭子或肺灌洗液)上样，65μL洗脱缓冲液洗脱作为核酸提取产物。
2、实验过程：
1)样本的处理：
鼻咽拭子的临床标本采集过程以清晨为宜，用清水漱口，由检查者用压舌板辅助，将咽拭子越过舌根，到达咽峡部的病变处，反复涂抹数次，取出时避免接触舌及口腔黏膜等处，将取样后的拭子放入约1mL生理盐水或细胞保存液中充分洗涤，贴壁挤干丢弃。待测标本4℃保存不应超过24小时，-20℃保存不应超过48小时，-80℃保存不应超过三个月，标本运输采用冰壶或加冰的泡沫箱。肺灌洗液应由临床医生按照操作规程，局部麻醉后于支气管及肺部进行采集。
采用本发明中的核酸提取试剂，200μL临床样本(鼻咽拭子或肺灌洗液)上样，65μL洗脱缓冲液洗脱作为核酸提取产物。其中裂解结合液包括如下组分：1％的脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠、4％的100-1000nm的超顺磁性羧基氧化硅纳米微球磁珠、异硫氰酸胍或盐酸胍4M，乙酸钠或乙酸钾2M，乙基苯基聚乙二醇1.5％，蛋白酶K15％，裂解结合液的pH值为8.0；其中洗涤缓冲液包括如下组分：碘化钠或碘化钾5M，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐40mM，乙醇75％，洗涤缓冲液的pH值为6.0；其中洗脱洗脱缓冲液包括如下组分：乙二胺四乙酸1mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10mM，所述洗脱缓冲液的pH值为8.0；硅油为150μL；
2)PCR扩增
为实现呼吸道病毒九重检测，需利用三个独立的PCR反应管同时进行扩增，每一管中三个项目占用三个独立的荧光通道，如VIC，FAM，ROX以及CY5，优选选择FAM，第四个通道是内标，用来检测核酸提取和产物扩增，防止假阴性结果，内标可选用VIC通道，优选外源性内标。
三管检测体系的组成相同，每一管中具有PCR反应液，PCR酶液，引物探针以及核酸提取产物四种组分。每一管中引物探针是三个项目以及外源性内标引物探针的组合。每管PCR反应体系成分和PCR扩增程序如下：
本发明中的PCR反应体系如下：PCR反应液30％；PCR酶液7％；单项目的正向引物和反向引物分别0.7μM；探针0.4μM；核酸提取产物25％。
PCR扩增程序如下表所示：
Figure GDA0003488988370000081
3)结果判读
根据PCR扩增曲线判定PCR反应液性能，采用同一甲型流感临床样本经核酸提取后采用上述三种不同的反应液进行扩增，主要关注是否为标准S形扩增曲线，平台期的荧光增量以及Ct值。进一步的，Ct值具有定量意义，更能反映PCR体系逆转录以及扩增效率，是主要评判指标。
3、实验结果：见图1所示。
4、实验结果分析
结果显示对于三种PCR反应液，曲线均为标准S形，平台期荧光增量一致，但是对于反应液3，体系表现出更小的Ct值，提示该溶液具有更高的扩增效率及优良的扩增效果。
实施例2核酸提取试剂中溶液成分的确定
1、反应体系
1)PCR反应液
10×Buffer for Taq 15％；MgCl22 mM；DTT 1mM；dATP 0.2mM；dCTP 0.2mM；dGTP0.2mM；dUTP 0.4mM；BSA 1.5mg/mL和甘油5％。
2)PCR酶液
Taq DNAPolymerase 15％；UNG 5％；Superscript V 4％；DTT 2mM；甘油40％；Anti-Taq15％。
3)引物对(与实施例1中相同)
4)探针(与实施例1中相同)
5)核酸提取产物：：采用本发明中的核酸提取试剂，200μL临床样本(鼻咽拭子或肺灌洗液)上样，65μL洗脱缓冲液洗脱作为核酸提取产物。
2、核酸提取试剂
核酸提取试剂1
其中裂解结合液包括如下组分：1％的脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠、4％的100-1000nm的超顺磁性羧基氧化硅纳米微球磁珠、异硫氰酸胍或盐酸胍4M，乙酸钠或乙酸钾2M，乙基苯基聚乙二醇1.5％，蛋白酶K15％，裂解结合液的pH值为8.0；其中洗涤缓冲液包括如下组分：碘化钠或碘化钾5M，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐40mM，乙醇75％，洗涤缓冲液的pH值为6.0；其中洗脱缓冲液包括如下组分：乙二胺四乙酸1mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10mM，所述洗脱缓冲液的pH值为8.0；硅油为150μL；
核酸提取试剂2
其中裂解结合液包括如下组分：1％的SDS、4％的100-1000nm的超顺磁性羧基氧化硅纳米微球磁珠、异硫氰酸胍或盐酸胍4M，乙酸钠或乙酸钾2M，乙基苯基聚乙二醇1.5％，蛋白酶K15％，裂解结合液的pH值为8.0；其中洗涤缓冲液包括如下组分：碘化钠或碘化钾5M，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐40mM，乙醇75％，洗涤缓冲液的pH值为6.0；其中洗脱缓冲液包括如下组分：乙二胺四乙酸1mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10mM，所述洗脱缓冲液的pH值为8.0；硅油为150μL；
核酸提取试剂3
其中裂解结合液包括如下组分：4％的100-1000nm的超顺磁性羧基氧化硅纳米微球磁珠、异硫氰酸胍或盐酸胍2M，乙酸钠或乙酸钾2M，乙基苯基聚乙二醇1.5％，蛋白酶K15％，裂解结合液的pH值为8.0；其中洗涤缓冲液包括如下组分：碘化钠或碘化钾5M，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐40mM，乙醇75％，洗涤缓冲液的pH值为6.0；其中洗脱缓冲液包括如下组分：乙二胺四乙酸1mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10mM，所述洗脱缓冲液的pH值为8.0；硅油为150μL。
3、实验过程
1)样本的处理：具体过程与实施例1中的步骤一致
2)PCR扩增：具体过程与实施例1中的步骤一致
3)结果判断
根据PCR扩增曲线判定PCR反应液性能，采用同一甲型流感临床样本经三种不同的核酸提取后进行扩增，首先关注是否为标准S形扩增曲线以及平台期的荧光增量，曲线形态不标准以及荧光增量偏低预示着提取产物较低的纯度以及抑制物的存在。随后关注Ct值，因Ct值具有定量意义，能反映核酸提取的回收效率，较高的回收效率有助于提高检测精密度。
4、实验结果：见图2、图3和图4所示。
5、实验结果分析
第一个图是最好的，甲型流感8次平行测试灵敏度，全部检出信号，并且精密度也很好，8次实验重复性强，后两次实验精密度很差，并且有未检出情况，证实采用核酸提取试剂1提取核酸的效果最好，此外本提取过程仅需9分钟，速度远快于常规柱提取、采用常规核酸提取试剂等方法，大幅节省时间。
实施例3检测试剂盒引物探针在单重与多重PCR体系中的性能验证
1、反应体系
1)PCR反应液
10×Buffer for Taq 15％；MgCl22 mM；DTT 1mM；dATP 0.2mM；dCTP 0.2mM；dGTP0.2mM；dUTP 0.4mM；BSA 1.5mg/mL和甘油5％。
2)PCR酶液
Taq DNA Polymerase 15％；UNG 5％；Superscript V 4％；DTT 2mM；甘油40％；Anti-Taq 15％。
3)引物对：与实施例1中的一致
4)探针：与实施例1中的一致
5)核酸提取产物：与实施例1中的一致
2、实验过程：选用甲型流感，乙型流感，呼吸道合胞病毒，副流感1，副流感II，副流感III，腺病毒，偏肺病毒，肠道或鼻病毒临床样本，对于检测甲型流感病毒，将国家参考品S1梯度稀释E1，E2，E3，E4，E5，E6倍，对应的浓度分别为2.5E4，2.5E3，2.5E2，2.5E1，2.5,0.25TCID50/L，对各个浓度的样本进行甲型流感病毒的检测，最后比较各项目的单重及多重PCR检测的性能差异。
3、实验结果
单重检测逐级稀释扩增结果，见图5-图13；
多重检测逐级稀释扩增结果：见图14-图22。
4、实验结果分析
对九个项目来说，无论单重检测还是多重检测，均体现出良好的曲线形态，尤其是联检体系在Ct＞35以后的弱阳性区仍可检出并保持与单重体系一致的扩增效果。本体系经过引物探针筛选基本去除引物二聚对多重检测体系灵敏度的影响，使之达到与单重检测类似的性能指标，由图14看出，对于检测甲型流感病毒，当浓度为0.25TCID50/L时，能够达到很好的检测信号，国家参考品S1规定标准为25TCID50/L，本发明中的检测最低值远超国家检测标准，能够达到很好的检测灵敏度。
实施例4检测试剂盒特异性检测
1、反应体系
1)PCR反应液
10×Buffer for Taq 15％；MgCl22 mM；DTT 1mM；dATP 0.2mM；dCTP 0.2mM；dGTP0.2mM；dUTP 0.4mM；BSA 1.5mg/mL和甘油5％。
2)PCR酶液
Taq DNA Polymerase 15％；UNG 5％；Superscript V 4％；DTT 2mM；甘油40％；Anti-Taq 15％。
3)引物对：与实施例1中的一致
4)探针：与实施例1中的一致
5)核酸提取产物：与实施例1中的一致
2、实验过程：选用其他呼吸道常见病原体，包括肺炎支原体，肺炎链球菌，流感嗜血杆菌以及人类基因组的临床样本，进行核酸提取，比较各项目在多重PCR体系中的实验结果。核酸提取过程中加入内质控品质粒扩增子序列SEQ ID NO:31，同时多重PCR体系中加入内质控品引物对与探针SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30，用来检测PCR反应的正常进行。
3、实验结果：见图23。
4、实验结果分析
实验结果表明内控质粒均存在扩增信号，表明核酸提取与PCR反应的有效性。当体系中存在常见的其他呼吸道病原体或人基因组，由于引物探针设计的特异性以及反应体系的协同，无非特异性扩增信号出现。
实施例5呼吸道病原体的多重PCR检测试剂盒
1、反应体系
1)PCR反应液
10×Buffer forTaq 10％；MgCl21 mM；dATP 0.05mM；dCTP 0.05mM；dGTP 0.05mM；dUTP 0.1mM；
2)PCR酶液
Taq DNA Polymerase 10％；Superscript V 0.1％；
3)引物对：与实施例中的一致
4)探针：与实施例1中的一致
5)核酸提取试剂：0.5％的脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠、3％的100-1000nm的超顺磁性羧基氧化硅纳米微球磁珠、异硫氰酸胍或盐酸胍1M，乙酸钠或乙酸钾1M，乙基苯基聚乙二醇1％，蛋白酶K10％，裂解结合液的pH值为7.0；其中洗涤缓冲液包括如下组分：碘化钠或碘化钾1M，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10mM，乙醇75％，洗涤缓冲液的pH值为5.0；其中洗脱缓冲液包括如下组分：乙二胺四乙酸1mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10mM，所述洗脱缓冲液的pH值为7.4；硅油为100μL。
2、使用方法
反应体系量如下：PCR反应液：50％；PCR酶液10％；单项目的正向引物和反向引物分别1μM；探针：0.5μM；核酸提取产物：50％
扩增程序如下：
Figure GDA0003488988370000121
Figure GDA0003488988370000131
3、实验过程：选用甲型流感国家参考品S1进行梯度稀释，对提取出的样本进行甲型流感病毒的检测，稀释浓度与实施例3中的保持一致。
4、实验结果：见图24所示。
实施例6呼吸道病原体的多重PCR检测试剂盒
1、反应体系
1)PCR反应液
10×Buffer forTaq 50％；MgCl210mM；DTT 5mM；dATP 1mM；dCTP 1mM；dGTP 1mM；dUTP 2mM；BSA 10mg/mL和甘油10％
2)PCR酶液
Taq DNA Polymerase 35％；UNG 20％；Superscript V 10％；DTT 5mM；Anti-Taq35％
3)引物对(与实施例1中相同)
4)探针(与实施例1中相同)
5)核酸提取试剂：2％的脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠、5％的100-1000nm的超顺磁性羧基氧化硅纳米微球磁珠、异硫氰酸胍或盐酸胍5M，乙酸钠或乙酸钾5M，乙基苯基聚乙二醇3％，蛋白酶K 20％，裂解结合液的pH值为9.0；其中洗涤缓冲液包括如下组分：碘化钠或碘化钾10M，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐50mM，乙醇75％，洗涤缓冲液的pH值为7.0；其中洗脱缓冲液包括如下组分：乙二胺四乙酸5mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐50mM，所述洗脱缓冲液的pH值为8.0；硅油为200μL。
2、使用方法
反应体系量如下：PCR反应液：50％；PCR酶液10％；单项目的正向引物和反向引物分别1μM；探针：0.5μM；核酸提取产物：50％
扩增程序如下：
Figure GDA0003488988370000132
Figure GDA0003488988370000141
3、实验过程:选用甲型流感国家参考品S1进行梯度稀释，对提取出的样本进行甲型流感病毒的检测，稀释浓度与实施例3中的保持一致。
4、实验结果：如图25所示。
序列表
<110> 重庆中元汇吉生物技术有限公司
<120> 呼吸道病原体的多重PCR检测试剂盒、用途及其使用方法
<130> 无
<140> 无
<141> 2018-12-21
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 1
agaccaatcc tgtcacctct gac 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 2
aaccgtctac gctgcagtcc 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 3
tgcaggttgg cacggatac 19
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 4
gtgtcagctc tgagatcatc cact 24
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 5
gtactaattt agctggacat tggattct 28
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 6
aagaaaactt tcaaattaat gaacatatga tcag 34
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 7
atctcacaca attaatagag aagtcatgca ac 32
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 8
gatccagaaa gtagacttgg tcc 23
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 9
caatggggat aatacaacaa tctgc 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 10
agaaagcaag tctcagttca gctag 25
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 11
cccrtctgtt ggaccaggga tat 23
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 12
cccaggacac ccagttgt 18
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 13
ggccactccc tcgatgatgc c 21
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 14
gtttcccagg gtgaagtagg tgtc 24
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 15
tcatayaarc atgctatatt aaaagagtct ca 32
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 16
cctatytcwg cagcatattt gtaatcag 28
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 17
gcctgcgtgg ctgcc 15
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 18
gaaacacgga cacccaaagt agt 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 19
acgctcaccg tgcccagtga gcg 23
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 20
ccatggatga actccacaac g 21
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 21
ccctctcccc aatctttttc aaaaatacc 29
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 22
ctggagatgt cccgtaggag aacccct 27
<210> 23
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 23
ctgttcagtc actgctatac caggaggttg tgt 33
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 24
ctygggtatg gaggtcttga aca 23
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 25
cgccggtcag gatgcctcgg agtacctg 28
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 26
acaccctcat cattgcaaca agaaa 25
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 27
tcctccggcc cctgaatg 18
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 28
atcttgggct acataatacc tgca 24
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 29
tgagggaggc tatacggtgt 20
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 30
tctccccaac cgccaaccgt tgttc 25
<210> 31
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 31
atcttgggct acataatacc tgcaaaacct gccagtttta aagctcgtaa agagcatgac 60
acctctgttg gttctcccca accgccaacc gttgttcatc gcactgactc acaccgtata 120
gcctccctca 130

Claims (11)

1.呼吸道病原体的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感1、副流感II、副流感III、腺病毒、偏肺病毒和鼻病毒九种病原体的引物对及探针的混合物；
所述甲型流感病毒的引物对由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的两条序列组成；
所述乙型流感病毒的引物对由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的两条序列组成；
所述呼吸道合胞病毒的引物对由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的两条序列组成；
所述副流感病毒I的引物对由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的两条序列组成；
所述副流感病毒II的引物对由SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的两条序列组成；
所述副流感病毒III的引物对由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的两条序列组成；
所述腺病毒的引物对由SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的两条序列组成；
所述偏肺病毒的引物对由SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的两条序列组成；
所述鼻病毒的引物对由SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的两条序列组成；
所述甲型流感病毒的探针为SEQ ID NO:19所示的序列或其反向互补序列；
所述乙型流感病毒的探针为SEQ ID NO:20所示的序列或其反向互补序列；
所述呼吸道合胞病毒的探针为SEQ ID NO:21所示的序列或其反向互补序列；
所述副流感病毒I的探针为SEQ ID NO:22所示的序列或其反向互补序列；
所述副流感病毒II的探针为SEQ ID NO:23所示的序列或其反向互补序列；
所述副流感病毒III的探针为SEQ ID NO:24所示的序列或其反向互补序列；
所述腺病毒的探针为SEQ ID NO:25所示的序列或其反向互补序列；
所述偏肺病毒的探针为SEQ ID NO:26所示的序列或其反向互补序列；
所述鼻病毒的探针为SEQ ID NO:27所示的序列或其反向互补序列。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的探针的两端分别带有荧光基团和猝灭基团，所述荧光基团为VIC，ROX，FAM和CY5中的一种，所述猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3和MGBNFQ中的一种。
3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包括PCR反应液，所述反应液主要由如下组分组成：10×Bufferfor Taq 10％-50％；MgCl2 1-10mM；DTT 0-5mM；dATP 0.05-1mM；dCTP 0.05-1mM；dGTP 0.05-1mM；dUTP 0.1-2mM。
4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于：所述反应液还包括BSA 0-10mg/mL和甘油0％-10％。
5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述PCR反应液主要由如下组分组成：10×Buffer for Taq 15％；MgCl2 2mM；DTT 1mM；dATP 0.2mM；dCTP 0.2mM；dGTP0.2mM；dUTP 0.4mM；BSA 1.5mg/mL和甘油5％。
6.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包括PCR酶液，所述PCR酶液主要由如下组分组成：Taq DNA Polymerase 10-50％；UNG 0-20％；SuperscriptV0.1％-10％；DTT 0-5mM；甘油0-50％。
7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于：所述PCR酶液还包括Anti-Taq0-50％。
8.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于：所述PCR酶液主要由如下组分组成：Taq DNA Polymerase 15％；UNG5％；SuperscriptV 4％；DTT 2mM；甘油40％；Anti-Taq15％。
9.如权利要求1-8任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包括内质控品，所述内质控品的引物对如SEQ ID NO:28与SEQ ID NO:29所示，所述内质控品的探针序列如SEQ ID NO:30所示，所述内质控品质粒扩增子序列如SEQ ID NO:31所示。
10.如权利要求1-8任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂包括裂解结合液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液和硅油，所述裂解结合液包括0.5％～2％的脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠和3％-5％的磁珠。
11.如权利要求10所述的检测试剂盒，其特征在于：所述裂解结合液包括1％的脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠和4％的磁珠。
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