CN107937613A - 呼吸系统常见的七种流感病毒病原体实时荧光多重pcr引物探针及试剂盒 - Google Patents

呼吸系统常见的七种流感病毒病原体实时荧光多重pcr引物探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种呼吸系统常见的七种流感病毒病原体实时荧光多重PCR引物探针及试剂盒，所述七种流感病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、呼吸道合胞病毒和腺病毒。本公开还提供了一种多重荧光定量PCR检测七种流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括本公开所述的引物探针组。通过上述技术方案本公开显著地提高了呼吸系统常见病原体检测的敏感性、特异性和简便性。

Description

呼吸系统常见的七种流感病毒病原体实时荧光多重PCR引物 探针及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及呼吸系统常见的七种流感病毒病原体的实时荧光多重PCR引物探针及快速检测试剂盒。
背景技术
呼吸道感染疾病常见于成人和儿童当中，具有很高的发病率和死亡率。急性上呼吸道和下呼吸道的感染主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。临床上常见的呼吸道病毒有甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感I型病毒、副流感II型病毒及副流感III型病毒。由于这些病毒引起的感染症状和流行特点相似，仅靠临床症状对病原进行区分非常不可靠，实验室诊断方法有病毒分离、抗原检测与核酸检测等。
病毒分离培养仍是呼吸道病毒感染诊断的金标准，但传统病毒培养存在周期长、运输和存贮过程中不易保存病毒感染性等问题。自上个世纪90时代初期开始，载玻片培养法作为检测病毒应用于临床试验，比起病毒分离法的检测时间大大缩短，由原来的8-10d缩短至1-2d，但由于病毒繁殖具有严格的嗜宿主性，因此病毒分离培养需要根据不同病毒选择合适的敏感细胞，具有一定的局限性。经典的血清学试验，如中和试验、补体结合试验等，高效省时、特异性强、灵敏度高、适用于大量样本检测，但检测中经常会出现假阳性反应、降低检测的灵敏度，并且制备抗血清的时间较长且利用该方法一次只能检测一种病毒。免疫学技术也是国内外常用的呼吸道病毒的检测技术，最常用的是采用酶联免疫吸附试验，其敏感性高、特异性强、无放射性污染，应用范围很广。但结果判读影响因素较多，很容易造成结果失真，对样本量有要求等缺点。
基于聚合酶链反应的分子诊断方法具有快速、灵敏、特异等显著特点，已经成为呼吸道病毒检测的新标准。但是因为一次检测能够鉴定的病毒种类有限，仍旧比较耗费人力、试剂和时间，并且需要对每一次检测做好质量控制，保证检测结果的均一性。现有技术中并没有同时检测以上六种病毒的检测方法。
发明内容
本发明的目的是解决多种呼吸道病毒同时检测与鉴定的问题，提供一种七种流感病毒的荧光定量PCR引物探针组和试剂盒，同时准确鉴定七种呼吸系统常见病原体，建立一种基于荧光定量PCR平台的多重PCR检测方法。
为达到以上目的，本发明提供一种多重PCR检测七种流感病毒用引物探针组，包括组分A和组分B，
其中，所述组分A包括：
SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的副流感病毒I型上游引物，
SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的副流感病毒I型下游引物，
具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的副流感病毒I型探针，所述副流感病毒I型探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；
SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型上游引物，
SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型下游引物，
具有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型探针，所述副流感病毒Ⅱ型探针的5’端标记有VIC发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；
SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型上游引物，
SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型下游引物，
具有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型探针，所述副流感病毒Ⅲ型探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；
SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的乙型流感病毒上游引物，
SEQ ID NO.11所示核苷酸序列的乙型流感病毒下游引物，
具有SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的乙型流感病毒探针，所述乙型流感病毒探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；
其中，所述组分B包括：
SEQ ID NO.13所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒上游引物，
SEQ ID NO.14所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒下游引物，
具有SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒探针，所述呼吸道合胞病毒探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；
SEQ ID NO.16所示核苷酸序列的腺病毒上游引物，
SEQ ID NO.17所示核苷酸序列的腺病毒下游引物，
具有SEQ ID NO.18所示核苷酸序列的腺病毒探针，所述腺病毒探针的5’端标记有VIC发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；
SEQ ID NO.19所示核苷酸序列的甲型流感病毒上游引物，
SEQ ID NO.20所示核苷酸序列的甲型流感病毒下游引物，
具有SEQ ID NO.21所示核苷酸序列的甲型流感病毒探针，所述甲型流感病毒探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。
所述七种流感病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、呼吸道合胞病毒和腺病毒。
本公开的第二个方面提供一种多重荧光定量PCR检测七种流感病毒的检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总核酸；
(2)以所述总核酸为PCR模板，利用本公开第一个方面所述的引物探针组对所述PCR模板进行多重荧光定量PCR扩增；
其中，所述多重荧光定量PCR同时在两个体系中进行，
在第一个体系中，利用所述组分A对所述PCR模板进行第一扩增，
在第二个体系中，利用所述组分B对所述PCR模板进行第二扩增；
(3)分别收集第一个体系中CY5、VIC、FAM和ROX荧光通道信号，收集第二个体系中CY5、VIC、FAM和ROX荧光通道信号。
本公开的第三个方面提供一种多重荧光定量PCR检测七种流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括本公开第一个方面所述的引物探针组。
本发明建立的副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和甲型流感病毒七重实时荧光PCR检测方法，能够对常见的呼吸道毒感染进行快速、准确的检测，以便进行及时治疗，避免血清学、病原培养学等方法的繁琐操作，达到如下的检测效果：
(一)多重检测
本发明所建立的检测方法能够在不超过2次PCR反应中同时筛查副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和甲型流感病毒，快速简便确认呼吸道病毒感染的病原种类，节省时间、人力和试剂成本。
(二)灵敏度高
本发明所建立的检测方法能够实现超过7个基因的同时检测，反应体系中每个目标基因的检测灵敏度均可达到102PFU/ml，与单重实时荧光PCR检测敏感度相当。
(三)特异性高
本发明所建立的检测方法特异性主要体现在一整套特异性引物探针，所有引物都经过BLAST比对分析，具有高度的保守性和特异性，不仅在本发明中检测目标能够相互区分，而且还能与核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他微生物区别开，这包括人冠状病毒、巨细胞病毒、肠道病毒、麻疹病毒、人偏肺病毒、流行性腮腺炎病毒、鼻病毒、百日咳杆菌、肺炎衣原体、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、无毒结核分枝杆菌、脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄杆菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、唾液链球菌、棒状杆菌、大肠杆菌、乳杆菌、卡他莫拉菌、淋球菌、铜绿假单胞杆菌、表皮葡萄球菌等，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非检测目标准确分辨出来。
(四)预防假阴性结果
体系中添加的IAC，可以有效的提示假阴性检测结果。
本发明为呼吸道传染临床样本中副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和甲型流感病毒的快速筛查提供了完备的解决方案，能实现对常见的呼吸道病毒进行快速、准确的筛查，有效预防突发公共卫生事件的发生。
具体实施方式
以下是对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本发明的一种实施方式提供了多重PCR检测七种流感病毒用引物探针组。
所述七种流感病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、呼吸道合胞病毒和腺病毒。
本发明的引物探针组选择特异性的检测基因或保守序列，甲型流感病毒选择保守的M基因，乙型流感病毒选择NS基因，人副流感病毒I型、II型和III型选择HN基因，呼吸道合胞病毒选择G基因，腺病毒选择hexon基因。
针对目标序列设计引物探针。设计过程中充分考虑不同目标基因的引物探针在一个反应体系内共扩增的问题，因此，引物探针设计时要综合的考虑到Tm值一致性、GC含量均一化，同时尽可能避免出现发夹结构、引物二聚体等情况，以保证后期不同引物探针同时扩增的概率。最终获得本发明提供的一套特异的引物探针序列，所述引物探针组包括组分A和组分B。
其中，所述组分A包括：
SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的副流感病毒I型上游引物，
SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的副流感病毒I型下游引物，
具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的副流感病毒I型探针，所述副流感病毒I型探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；
SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型上游引物，
SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型下游引物，
具有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型探针，所述副流感病毒Ⅱ型探针的5’端标记有VIC发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；
SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型上游引物，
SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型下游引物，
具有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型探针，所述副流感病毒Ⅲ型探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；
SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的乙型流感病毒上游引物，
SEQ ID NO.11所示核苷酸序列的乙型流感病毒下游引物，
具有SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的乙型流感病毒探针，所述乙型流感病毒探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；
其中，所述组分B包括：
SEQ ID NO.13所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒上游引物，
SEQ ID NO.14所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒下游引物，
具有SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒探针，所述呼吸道合胞病毒探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；
SEQ ID NO.16所示核苷酸序列的腺病毒上游引物，
SEQ ID NO.17所示核苷酸序列的腺病毒下游引物，
具有SEQ ID NO.18所示核苷酸序列的腺病毒探针，所述腺病毒探针的5’端标记有VIC发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；
SEQ ID NO.19所示核苷酸序列的甲型流感病毒上游引物，
SEQ ID NO.20所示核苷酸序列的甲型流感病毒下游引物，
具有SEQ ID NO.21所示核苷酸序列的甲型流感病毒探针，所述甲型流感病毒探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。
在本公开的一种优选的实施方式中，所述组分A和组分B中还含有阳性内对照引物探针，
阳性内对照上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，
阳性内对照下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，
阳性内对照探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，所述阳性内对照探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。
阳性内对照引物探针用于扩增质粒模板pET28a。
在本发明的一种多重荧光定量PCR检测七种流感病毒的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总核酸；
(2)以所述总核酸为PCR模板，利用本公开所述的引物探针组对所述PCR模板进行多重荧光定量PCR扩增；
其中，所述多重荧光定量PCR同时在两个体系中进行，
在第一个体系中，利用所述组分A对所述PCR模板进行第一扩增，
在第二个体系中，利用所述组分B对所述PCR模板进行第二扩增；
(3)分别收集第一个体系中CY5、VIC、FAM和ROX荧光通道信号，收集第二个体系中CY5、VIC、FAM和ROX荧光通道信号。
可选的，所述检测方法还包括在第二个体系中添加阳性内对照pET28a质粒模板。
在第一个体系中，CY5荧光通道用于检测副流感病毒I型、VIC荧光通道用于检测副流感病毒II型、FAM荧光通道
用于检测副流感病毒III型、ROX荧光通道用于检测乙型流感病毒。
在第二个体系中，CY5荧光通道用于检测呼吸道合胞病毒、VIC荧光通道用于检测腺病毒、FAM荧光通道用于检测甲型流感病毒、ROX荧光通道用于检测阳性内对照。
在本公开的一种实施方式中，通过如下方法判断每个荧光通道中被检测物是否为阳性：在各个荧光检测通道中：
a)若有S型扩增，且CT值小于35，则判定为相应被检测物阳性；
b)若有S型扩增，且CT值小于40并大于等于35，则判定为不确定样本，需重新提取核酸后进行复检；若复检仍有S型扩增，且CT值小于40，则判定相应被检测物为阳性，否则为阴性；
c)若无明显S型扩增曲线，但报告有CT值，则判定为非特异性扩增。
在本公开的一种具体的实施方式中，在阳性内质控成立的情况下可以通过如下表1的方法进行检测结果的判定。
表1
可选的，本公开的两个多重荧光定量PCR的反应体系包括以下含量的各组分：
25μL反应液中含2-3U的Hotstar DNA聚合酶、20-30U的RNase抑制剂、100-200U的MMLV逆转录酶，浓度为20mM且pH为8.3的Tris-HCl缓冲液，0.0003ng/μL的pET28a，0.5mMdNTP，5mM MgCl2。
在本公开的一种具体的实施方式中，多重荧光定量PCR引物探针浓度及反应体系配置如下：
2×RT PCR缓冲液12.5μL(含IAC模板)；RT-PCR enzyme mix 1μL；10×引物探针混合物2.5μL(每条引物的浓度为0.3-6μM，每条探针的浓度为1-3uM)，RNA模板5μL，超纯水补至25μL。
为提高PCR反应的灵敏度，本公开提供了特定的反应温度，这与公认设置不同，并且具有良好的效果。
多重荧光定量PCR的反应条件包括如下步骤：
a：45℃9-11min；
b：95℃4-6min；
c：95℃15-60s；
d：50-60℃15-60s，c-d循环40个反应。
本发明还提供了一种含有前述多重荧光定量PCR检测引物探针组的试剂盒。
优选的，所述试剂盒中还含有阳性内对照质粒模板pET28a。
优选的，所述试剂盒还包括5×反应体系缓冲液、Hotstar DNA聚合酶、10×引物探针混合物、阳性对照和超纯水。
优选的，所述试剂盒中每条引物的最终使用浓度各自为0.3-0.6μM，每条探针的最终使用浓度各自为0.1-0.3μM。
以下，通过实施例进一步详细说明本公开，以下实施例中，腺病毒来自中科院武汉病毒所，编号为401；呼吸道合胞病毒来自中科院武汉病毒所，编号为1547；副流感病毒I型来自中科院武汉病毒所，编号为1505；副流感病毒II型来自中科院武汉病毒所，编号为1503；副流感病毒III型来自中科院武汉病毒所，编号为1506；甲型流感病毒来自中科院武汉病毒所，编号为1686；乙型流感病毒来自中科院武汉病毒所，编号为1689。
实施例1
第一个体系的组建：
引物探针包括：
SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的副流感病毒I型上游引物，
SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的副流感病毒I型下游引物，
具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的副流感病毒I型探针，所述副流感病毒I型探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；
SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型上游引物，
SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型下游引物，
具有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型探针，所述副流感病毒Ⅱ型探针的5’端标记有VIC发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；
SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型上游引物，
SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型下游引物，
具有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型探针，所述副流感病毒Ⅲ型探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；
SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的乙型流感病毒上游引物，
SEQ ID NO.11所示核苷酸序列的乙型流感病毒下游引物，
具有SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的乙型流感病毒探针，所述乙型流感病毒探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。
10×酶混合液管包括Hotstar DNA聚合酶、RNase抑制剂、MMLV逆转录酶，5×RT-PCR缓冲液(Tris-HCl 100mM(PH 8.3)，KCl 100mM，Tween-200.2％，pET28a 0.0003ng，5mMdNTP，20mM MgCl2)，10×引物探针混合物，包含阳性内对照(pET28a质粒模板)在内的每条引物的浓度为3μM，每条探针的浓度为2μM；阳性对照(每种均为106拷贝/ml)。
试剂盒检测的反应体系为25μL，其配置如下：5×RT-PCR缓冲液5μL；10×酶混合物2.5μL；10×引物混合物2.5μL；模板5μL，超纯水10μL。
第二个体系的组建：
引物探针包括：
SEQ ID NO.13所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒上游引物，
SEQ ID NO.14所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒下游引物，
具有SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒探针，所述呼吸道合胞病毒探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；
SEQ ID NO.16所示核苷酸序列的腺病毒上游引物，
SEQ ID NO.17所示核苷酸序列的腺病毒下游引物，
具有SEQ ID NO.18所示核苷酸序列的腺病毒探针，所述腺病毒探针的5’端标记有VIC发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；
SEQ ID NO.19所示核苷酸序列的甲型流感病毒上游引物，
SEQ ID NO.20所示核苷酸序列的甲型流感病毒下游引物，
具有SEQ ID NO.21所示核苷酸序列的甲型流感病毒探针，所述甲型流感病毒探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。
10×酶混合物包括Hotstar DNA聚合酶、RNase抑制剂、MMLV逆转录酶，5×RT-PCR缓冲液(Tris-HCl 100mM(PH 8.3)，KCl 100mM，Tween-200.2％，pET28a 0.0003ng，5mMdNTP，20mM的MgCl2)，10×引物探针混合物，包含阳性内对照(pET28a质粒模板)在内的每条引物的浓度为0.3μM，每条探针的浓度为0.2μM；阳性对照(每种均为106拷贝/ml)。
试剂盒检测的反应体系为25μL，其配置如下：5×RT-PCR缓冲液5μL；10×酶混合物2.5μL；10×引物混合物2.5μL；模板5μL，超纯水补至25μL。
实施例2试剂盒的操作和结果判断
1、基因组的提取
咽拭子放入采样液后，需要充分震荡洗涤后，室温静置10min，待大块状物下沉后，取上清立即离心，其后的沉淀即可用于核酸的提取。
2、反应体系的配制
试剂盒检测的反应体系为25μL，其配置如下：5×RT-PCR缓冲液5μL(其中B管的缓冲液中含IAC模板)；10×酶混合物2.5μL；10×引物探针混合物2.5μL(每条引物的浓度为0.5μM，每条探针的浓度为0.2μM)，RNA模板5μL，超纯水补至25μL。
3、PCR反应
将PCR管放入荧光定量PCR仪中，按照如下程序进行PCR反应：45℃，10min；95℃，5min；95℃，15s，60℃，45s，循环45个反应。
4、结果判断
1)调整阈值：仪器根据前15个循环反应背景值，自动调整判定阈值。
2)质量控制：空白对照、阳性对照和阳性内对照成立，否则视实验无效。
3)每个荧光检测通道的判断与解释：a)若样本有S型扩增，且CT值小于35，则判定样本为阳性；b)若样本有S型扩增，且CT值小于40并大于等于35，则判定为不确定样本，需重新提取核酸后进行复检；若复检的样本仍有S型扩增，且CT值小于40，则判定样本为阳性，否则为阴性；c)若样本无明显S型扩增曲线，但报告有CT值，则判定为非特异性扩增；可能为探针降解所释放的非特异性荧光信号。具体判定方式参照表1。
结果显示，第一反应体系中，FAM通道为S型曲线，对应副流感III型病毒阳性、其他目标在该通道阴性；VIC通道为S型曲线，对应副流感II型病毒阳性、其他目标在该通道阴性；CY5通道为S型曲线，对应副流感I型病毒阳性、其他目标在该通道阴性：ROX通道为S型曲线，对应乙型流感病毒阳性、其他目标在该通道阴性。第二反应体系中，FAM通道为S型曲线，对应甲型流感病毒阳性、其他目标在该通道阴性；VIC通道为S型曲线，对应腺病毒阳性、其他目标在该通道阴性；CY5通道为S型曲线，对应呼吸道合胞病毒阳性、其他目标在该通道阴性。
实施例3试剂盒的保存期试验
分别以105PFU/mL副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型和乙型流感病毒的混合模板以及腺病毒、呼吸道合胞病毒和甲型流感病毒的混合模板作为评估用检测样本，在第0天时，分装成9份冻存于-70℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、10、15、30、60、90、120、150、180和200天的试剂盒进行保存期试验。保存期检测结果如表2所示：
表2保存期试验结果
保存期 检测7个目标病毒的有效性
第0天 3个均有效
第10天 3个均有效
第15天 3个均有效
第30天 3个均有效
第60天 3个均有效
第90天 3个均有效
第120天 3个均有效
第150天 3个均有效
第180天 3个均有效
第200天 3个均有效
由表2可知，试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测7个目标病毒均有效，实验结果表明该试剂盒的保存期至少为6个月。
实施例4试剂盒的特异性试验
选择人冠状病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为2233)、巨细胞病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为303)、肠道病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为977)、麻疹病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为1513)、人偏肺病毒(源自中国人民解放军军区医院，编号为1768)、流行性腮腺炎病毒(源自中国人民解放军军区医院，编号为3145)、鼻病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为2343)、百日咳杆菌(源自中国人民解放军军区医院，编号为23524)、肺炎衣原体(源自中国人民解放军军区医院，编号为14127)、肺炎支原体(源自中国人民解放军军区医院，编号为14121)、流感嗜血杆菌(来自中国医学菌种保藏中心，编号为58532)、无毒结核分枝杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为93009)、脑膜炎奈瑟菌(源自中国人民解放军军区医院，编号为21123)、金黄色葡萄杆菌(源自中国人民解放军军区医院，编号为31122)、肺炎链球菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为31108)、化脓链球菌(源自中国人民解放军军区医院，编号为25341)、唾液链球菌(源自中国人民解放军军区医院，编号为25346)、棒状杆菌(源自中国人民解放军军区医院，编号为32451)、大肠杆菌(源自中国人民解放军军区医院，编号为32516)、乳杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为34106)、卡他莫拉菌(源自中国人民解放军军区医院，编号为11256)、淋球菌(源自中国人民解放军军区医院，编号为13251)、铜绿假单胞杆菌(源自中国人民解放军军区医院，编号为15204)、表皮葡萄球菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为26069)这些与待检测目标核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他微生物。
应用本发明试剂盒检测这些待检微生物，阴性对照、阳性对照和阳性内对照均为成立，证明检测系统成立；待检微生物均未出现非特异性的荧光信号，表明本发明试剂盒能够有效区分非目标，具有较好的特异性。
实施例5试剂盒的最低检出限试验
评估用检测样本：选择副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和甲型流感病毒的样品，将7个待检目标病毒悬液分别调整至108PFU/mL，分别提取7种目标的基因组RNA。将7个模板分别梯度稀释成相当于107PFU/mL，106PFU/mL，105PFU/mL，104PFU/mL，103PFU/mL，102PFU/mL，10PFU/mL的检测样本。
使用本发明试剂盒分别检测副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和甲型流感病毒不同稀释度的模板。根据实施例2进行操作和结果判断，试剂盒检测7个目标病毒的最低检出限试验结果如表3所示：
表3试剂盒检测副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和甲型流感病毒最低检出限试验结果
从表3看出，试剂盒检测7种目标病毒的最低检出限均达到102PFU/mL，试剂盒总体的最低检出限为每个反应检测1拷贝的目标分子。
对比例1
按照与实施例1相同的引物序列的方法，调整试剂盒A、B管的检测目标，将副流感病毒I型与呼吸道合胞病毒进行调换，区别仅在于，将SEQ ID NO.1-3所示的引物探针调整至B管，将SEQ ID NO.13-15所示的引物探针调整至A管，获得对比试剂盒1。
其中，所述组分A包括：
SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型上游引物，
SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型下游引物，
具有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型探针，所述副流感病毒Ⅱ型探针的5’端标记有VIC发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；
SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型上游引物，
SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型下游引物，
具有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型探针，所述副流感病毒Ⅲ型探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；
SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的乙型流感病毒上游引物，
SEQ ID NO.11所示核苷酸序列的乙型流感病毒下游引物，
具有SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的乙型流感病毒探针，所述乙型流感病毒探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；
SEQ ID NO.13所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒上游引物，
SEQ ID NO.14所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒下游引物，
具有SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒探针，所述呼吸道合胞病毒探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；
其中，所述组分B包括：
SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的副流感病毒I型上游引物，
SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的副流感病毒I型下游引物，
具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的副流感病毒I型探针，所述副流感病毒I型探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；
SEQ ID NO.16所示核苷酸序列的腺病毒上游引物，
SEQ ID NO.17所示核苷酸序列的腺病毒下游引物，
具有SEQ ID NO.18所示核苷酸序列的腺病毒探针，所述腺病毒探针的5’端标记有VIC发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；
SEQ ID NO.19所示核苷酸序列的甲型流感病毒上游引物，
SEQ ID NO.20所示核苷酸序列的甲型流感病毒下游引物，
具有SEQ ID NO.21所示核苷酸序列的甲型流感病毒探针，所述甲型流感病毒探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。
按照与实施例4和5相同的方法进行特异性和最低检出限试验，结果显示对比试剂盒1的A管在检测呼吸道合胞病毒时，最低检出限仅为103PFU/mL；对比试剂盒1中B管在检测副流感病毒I型时，最低检出限也仅为103PFU/mL，效果均差于实施例1中组建的试剂盒。
本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司
<120> 呼吸系统常见的七种流感病毒病原体实时荧光多重PCR引物探针及试剂盒
<130> 7079ABT
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gttgcagaag atgcccctgt ta 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggttattaaa ctctcataaa ggat 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
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<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
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<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
aatggctgta aggagtgttg attc 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
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<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tacattaatg gcatcaatca g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
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<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
taagaagtgg gccaagtgtc 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
acagactaat ggcaatatac t 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tgaatatgat agccttcttc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
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<210> 14
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<213> Artificial Sequence
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<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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atctatagca caaatcacat t 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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agctccaagg tcagctcaat t 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
aaatgaactt gcttcagtat 20
<210> 18
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<210> 20
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<212> DNA
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
ggaccatcgc aatgctttgt t 21

Claims (8)

1.多重PCR检测七种流感病毒用引物探针组，其特征在于，包括组分A和组分B，
其中，所述组分A包括：
SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的副流感病毒I型上游引物，
SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的副流感病毒I型下游引物，
具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的副流感病毒I型探针，所述副流感病毒I型探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；
SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型上游引物，
SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型下游引物，
具有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型探针，所述副流感病毒Ⅱ型探针的5’端标记有VIC发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；
SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型上游引物，
SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型下游引物，
具有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型探针，所述副流感病毒Ⅲ型探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；
SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的乙型流感病毒上游引物，
SEQ ID NO.11所示核苷酸序列的乙型流感病毒下游引物，
具有SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的乙型流感病毒探针，所述乙型流感病毒探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；
其中，所述组分B包括：
SEQ ID NO.13所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒上游引物，
SEQ ID NO.14所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒下游引物，
具有SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒探针，所述呼吸道合胞病毒探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；
SEQ ID NO.16所示核苷酸序列的腺病毒上游引物，
SEQ ID NO.17所示核苷酸序列的腺病毒下游引物，
具有SEQ ID NO.18所示核苷酸序列的腺病毒探针，所述腺病毒探针的5’端标记有VIC发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；
SEQ ID NO.19所示核苷酸序列的甲型流感病毒上游引物，
SEQ ID NO.20所示核苷酸序列的甲型流感病毒下游引物，
具有SEQ ID NO.21所示核苷酸序列的甲型流感病毒探针，所述甲型流感病毒探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。
2.根据权利要求1所述引物探针组，其中，所述组分B中还含有阳性内对照引物探针，
阳性内对照上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，
阳性内对照下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，
阳性内对照探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，所述阳性内对照探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。
3.一种多重荧光定量PCR检测七种流感病毒的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总核酸；
(2)以所述总核酸为PCR模板，利用所述的引物探针组对所述PCR模板进行多重荧光定量PCR扩增；
其中，所述多重荧光定量PCR同时在两个体系中进行，
在第一个体系中，利用所述组分A对所述PCR模板进行第一扩增，
在第二个体系中，利用所述组分B对所述PCR模板进行第二扩增；
(3)分别收集第一个体系中CY5、VIC、FAM和ROX荧光通道信号，收集第二个体系中CY5、VIC、FAM和ROX荧光通道信号。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其中，所述检测方法还包括在第二个体系中添加阳性内对照pET28a质粒模板。
5.根据权利要求3或4所述的检测方法，其中，所述引物探针组中，每条引物的最终使用浓度各自为0.3-0.6μM，每条探针的最终使用浓度各自为0.1-0.3μM。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其中，两个多重荧光定量PCR的反应体系包括以下含量的各组分：
25μL反应液中含1-3U的Hotstar DNA聚合酶、20-60U的RNase抑制剂、100-300U的MMLV逆转录酶，浓度为20mM且pH为8.3的Tris-HCl缓冲液，0.00003-0.0003ng/μL的pET28a，0.2-0.4mM dNTP，2-6mM MgCl2。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其中，多重荧光定量PCR的反应条件包括如下步骤：
a：45℃9-11min，
b：95℃4-6min，
c：95℃15-60s，
d：50-60℃15-60s，c-d循环40个反应。
8.多重荧光定量PCR检测七种流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物探针组。
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