CN101550455B - 人副流感病毒分型及定量检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及三种人副流感病毒1、2、3型实时荧光聚合酶链式反应检测试剂盒。三种试剂盒分别采用一步法RT-PCR，两步法RT-PCR和多色荧光RT-PCR能对多种类型标本中人副流感病毒进行分型和定量。试剂盒的检测方法操作简单，耗时短，灵敏度高，特异性强，可广泛用于人副流感病毒感染的辅助诊断，指导临床用药以及进行流行病学回顾性研究等多个领域。
Description
技术领域
本发明涉及三种人副流感病毒1、2、3型实时荧光聚合酶链式反应检测试剂盒。三种试剂盒分别采用一步法RT-PCR，两步法RT-PCR和多色荧光RT-PCR反应对多种类型标本中人副流感病毒进行分型和定量，可广泛用于人副流感病毒感染的辅助诊断，指导临床用药以及进行流行病学回顾性研究等多个领域。
背景技术
人副流感病毒(Human Parainfluenzavirus，HPIV)是一种属于副黏液病毒族的单胞RNA病毒，根据其抗原性与遗传性的不同可分为4种血清型即人副流感病毒1型(HPIV1)、人副流感病毒2型(HPIV2)、人副流感病毒3型(HPIV3)及人副流感病毒4型(HPIV4)。人副流感病毒是常见的急性病毒性呼吸道感染性疾病的病原体，在婴儿主要引起下呼吸道感染，在成人主要表现为上呼吸道感染。此外，人副流感病毒还曾有感染泌尿道的报道，被认为是前列腺炎的一种病因。
人副流感病毒是通过与感染者近距离密切接触或接触了污染物而传播的。具有传染性的物质接触了人的眼睛、口腔或者鼻内的黏膜后就会发生感染，或者通过吸入由于喷嚏和咳嗽产生的呼吸道分泌物的飞沫而感染。HPIV感染呈全球性分布，是常见的社区获得性呼吸道感染的病原，没有种族、社会经济条件、性别、年龄和地理位置的限制，营养不良、非母乳喂养、吸烟和有毒环境等是其易感因素(Kelly J.Henrickson，Parainfluenza Viruses，CLINICALMICROBIOLOGY REVIEWS，Apr.2003，Vol.16，No.2)。由于机体对HPIV不能产生有效、持久的免疫保护，＜2岁的儿童较易感染此病毒。四型人副流感病毒中，除了HPIV4仅引起轻微的呼吸道疾病，分离和流行病学很少有报道外，1、2、3型引起呼吸道疾病的报道都比较常见。HPIV1一般为隔年发生一次较大的交替流行，全球都可发病。HPIV2流行趋势与HPIV1相似，一般为每两年一次或与HPIV1交叉流行，但也有个别地区每年都流行。HPIV3较易感染婴儿，主要引起毛细支气管炎和肺炎，是引起呼吸道感染暴发流行的主要原因之一(Laurichesse H，DedmanD，Watson JM，et al.Epidemiological features of parainfluenza virusinfections：lavoratory surveillance in England and Wales，1975-1997.Eur JEpidemiol，1999，15(5)：475-484；Denny FW，Clyde WA.Acute lower respiratory infection innonhospitalized children.J Pediatr，1986，108(5)：635-646；黄志英，董琳人副流感病毒的病原学、流行病学及所致疾病的特点，国际呼吸杂志，2006，9(26))。为了减轻HPIV对婴幼儿健康的危害，近年来，世界各国均加强了对HPIV的监控，并将重点放于HPIV感染的早期诊断和早期预防中。
目前，副流感病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗和亚单位疫苗均已研究成功，但由于接种后产生的免疫力不完全，因此，至今副流感病毒疫苗的人体实际应用仍然没有获得成功(陈行昀，高琦，许楠副流感病毒的分子生物学性状及其疫苗的研究进展，国外医学病毒学分册，2004，11(5))。人们迫切需要一种快速、敏感、成本低的副流感病毒早期诊断试剂盒，能及时有效的诊断人副流感病毒。
常用的检测副流感病毒感染的方法主要有两种：
1)病毒培养：病毒培养法被认为是呼吸道病毒检测的金标准，但这种方法与标本的收集、运输、保存以及培养细胞的类型相关。此外，培养法一般耗时几天到几星期，因此，不能作为副流感病毒快速诊断的方法；；
2)直接免疫荧光检测法：需要取患者急性期和病后10～14天恢复期血清，恢复期抗体呈4倍升高才有诊断价值，因此，只能为病毒的流行病学提供参考。此外，混杂病毒、隐性感染或潜伏病毒的混淆等情况的存在，使直接免疫荧光法容易得出假阳性的结果。这些缺点都使其临床应用受到限制。
荧光定量PCR(FQ-PCR)是在普通PCR的基础上发展起来的核酸检测方法，它将荧光值的积累与PCR产物扩增的过程相结合，通过测量指数扩增期的荧光值来计算待测样本中核酸的原始量。将FQ-PCR用于病原学诊断，是PCR技术领域的一项创新(Alma C van de Poll，TomFWWolfsl，Nicolaas JG Jansen2，et al，Diagnostic value of real- time polymerase chainreaction to detect viruses in young children admitted to the paediatric inten
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以同时对人副流感病毒进行分型和定量的一步法RT-PCR检测试剂盒(下称一步法试剂盒)。
本试剂盒检测的基本原理是利用三对分别针对人副流感病毒1，2，3型特异核酸序列的靶多核苷酸的特异性引物和三条靶多聚核苷酸的特异性探针，在耐热DNA聚合酶、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg2+等PCR反应缓冲液中，通过荧光PCR扩增仪实现循环扩增，从而达到快速、实时、分型并定量检测人副流感病毒的目的。
为了特异性地检出尽可能多的人副流感病毒，本发明在对GeneBank中现有的所有人副流感病毒1、2、3型基因序列进行生物信息学分析的基础上，分别找出了三个型别副流感病毒的特异性保守区，并针对这三个保守区设计了多对引物、探针。通过对标准株的检测，筛选出了灵敏度高、特异性好，分别针对副流感病毒1、2、3型的三对引物、探针。
一步法试剂盒中含有三种分别针对人副流感病毒1，2，3型的RT-PCR反应管，反应管中同时含有逆转录体系和PCR体系，使逆转录过程和PCR扩增过程可以在同一管中完成。从标本中提取的核酸同时加入三管RT-PCR反应体系中，反应结束后，根据PCR扩增曲线进行结果判断。
本发明所涉及的一步法试剂盒中主要包括1)RNA提取液、HPIV1反应管、HPIV2反应管、HPIV3反应管、经焦炭酸乙二脂(DEPC)处理的纯水、阳性质控品、阴性质控品、定量参考品，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
本发明的一个优选实施方案是一步法试剂盒中HPIV1反应管内含有RT-PCR反应缓冲液、一对HPIV1特异性的正、反向引物、一条HPIV1特异性的探针、Taq酶、逆转录酶mMLV和RNA酶抑制剂，其特征在于用于HPIV1靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别是5′-GCCATA ACA AGT AGT GCT GGT C-3′(SEQ ID NO：1)和5′-ACC TTC AAC TGT GTC TCC TGT-3′(SEQ ID NO：2)，用于HPIV1靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针的序列是5′-CATTCA GAC AGG ATG GAA CCG TT-3′(SEQID NO：7)，探针的两端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团。
本发明的另一个优选实施方案是一步法试剂盒中HPIV2反应管内含有RT-PCR反应缓冲液、一对HPIV2特异性的正、反向引物、一条HPIV2特异性的探针、Taq酶、逆转录酶mMLV和RNA酶抑制剂，其特征在于用于HPIV2靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别是5′-TCT GCA GCT ATG AGT AAT CAC AT-3′(SEQ ID NO：3)和5′-GCA TCT GGA ATG ACTCGG AA-3′(SEQ ID NO：4)，用于HPIV2靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针的序列是5′-TCA CCA GAA GCC AGC ATA GAT AGA G-3′(SEQ ID NO：8)，探针的两端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团。
本发明的另一个优选实施方案是一步法试剂盒中HPIV3反应管内含有RT-PCR反应缓冲液、一对HPIV3特异性的正、反向引物、一条HPIV3特异性的探针、Taq酶、逆转录酶mMLV和RNA酶抑制剂，其特征在于用于HPIV3靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别是5′-CTT TCA GAC AAG ATG GAA CAG T-3′(SEQ ID NO：5)、5′-AAG CT CTG TTG AGA CCGCA-3′(SEQ ID NO：6)，用于HPIV3靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针的序列是5′-TCC ACT GTG TCA CCG CTC AAT ACC-3′(SEQ ID NO：9)，探针的两端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团。
本发明的另一个优选实施方案是HPIV1反应管、HPIV2反应管、HPIV3反应管中RT-PCR反应缓冲液均由Tri s-Ac、KAc、(NH4)2SO4、DTT、MgSO4和dNTP组成。
本发明的另一个优选实施方案是，HPIV1反应管、HPIV2反应管、HPIV3反应管在相同的条件下进行扩增：40℃30分钟；94℃3分钟；93℃15秒，55℃45秒，共10个循环；93℃15秒，55℃45秒，共30个循环。
本发明的另一个优选实施方案是一步法试剂盒中阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为HPIV1体外转录RNA、HPIV2体外转录RNA和HPIV3体外转录RNA的混合物。其中，建立HPIV1体外转录RNA的技术路线如下：使用HPIV1特异性正、方向引物定性扩增病毒核酸，扩增产物纯化后克隆至pGEM-T载体中，阳性克隆测序确定目的片段是否正确插入并确定插入方向。提取重组质粒pGEM-T-HPIV1质粒进行酶切反应，割胶纯化后得到模板，用于体外转录。体外转录后消化DNA模板，进行RNA纯化，得到HPIV1-RNA。其中，用于HPIV1体外转录的正向和反向引物的序列分别是5′-CTCACTACAAACGGTGTCAATG-3′(SEQ ID NO：10)，5′-CCATCTTCGTTTCTACACCATAC-3′(SEQ ID NO：11)。HPIV2体外转录的技术路线同HPIV1，用于HPIV2体外转录的正向和反向引物的序列分别是5′-AGGAGCTTCAGGAGCAATCT-3′(SEQ ID NO：12)，5′-CATGCCTGCATAAGCACACT-3′(SEQ ID NO：13)。HPIV3体外转录的技术路线同HPIV1，用于HPIV3体外转录的正向和反向引物的序列分别是5′-TGGAGGATTTGTGGTTAAGACG-3′(SEQ ID NO：14)，5′-TGAAGAATGAAGCGAGACCTG-3′(SEQ ID NO：15)。
将三种体外转录RNA等量混合作为阳性质控品。试剂盒中两种质控品核酸的提取和检测与待检标本同时进行，仅当阳性质控品检测呈阳性，阴性质控品检测呈阴性时，同批标本的检测结果才有效。
本发明的另一个优选实施方案是一步法试剂盒中定量参考品为104～107copies/mlHPIV1(或HPIV2或HPIV3)体外转录RNA。体外转录步骤同上，体外转录后的RNA用紫外分光光度计测定A260进行定量，根据定量结果，用DEPC处理水将体外转录的HPIV1(或HPIV2或HPIV3)-RNA分别稀释至104～107copies/ml作为试剂盒中定量参考品。所有定量参考品与标本中提取的RNA同时进行扩增，PCR仪会根据定量参考品绘制出标准曲线，并依此对检测标本中人副流感病毒的感染量进行自动测定。
本发明的另一个目的在于提供一种可以同时对人副流感病毒进行分型和定量的两步法RT-PCR检测试剂盒(下称两步法试剂盒)。
两步法试剂盒的实施方案与一步法试剂盒实施方案的差别在于：两步法试剂盒将人副流感病毒RNA的检测分为逆转录和PCR扩增两个步骤。从标本中提取的RNA先在混合逆转录体系(包含了三条分别针对人副流感病毒1，2，3型的反向引物)中转录为cDNA后，再同时加入三管分别针对人副流感病毒1，2，3型的PCR反应体系中，通过PCR扩增曲线进行结果判断。
本发明所涉及的两步法试剂盒中主要包括1)RNA提取液、混合逆转录反应管、逆转录酶系、HPIV1反应管、HPIV2反应管、HPIV3反应管、经焦炭酸乙二脂(DEPC)处理的纯水、阳性质控品、阴性质控品、定量参考品，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
本发明的一个优选实施方案是两步法试剂盒中混合逆转录反应管包含RT缓冲液和三条特异性反向引物，其中，RT缓冲液由Tris-HCl(pH8.0)、MgCl2、KCl、DTT、dNTPs组成，三条特异性反向引物的特征在于用于HPIVl靶多核苷酸逆转录的反向引物的序列是5′-ACCTTC AAC TGT GTC TCC TGT-3′(SEQID NO：2)，用于HPIV2靶多核苷酸逆转录的反向引物是5′-GCA TCT GGA ATG ACT CGG AA-3′(SEQ ID NO：4)，用于HPIV3靶多核苷酸逆转录的反向引物是5′-AAG CT CTG TTG AGA CCG CA-3′(SEQ ID NO：6)。
本发明的另一个优选实施方案是两步法试剂盒中逆转录酶系由mMLV酶和RNA酶抑制剂组成。
本发明的另一个优选实施方案是两步法试剂盒中HPIVl反应管内含有PCR反应缓冲液、一对HPIVl特异性的正、反向引物、一条HPIVl特异性的探针、Taq酶，其特征在于用于HPIVI靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别是5′-GCC ATA ACA AGT AGT GCT GGT C-3′(SEQ ID NO：1)和5′-ACC TTC AAC TGT GTC TCC TGT-3′(SEQ ID NO：2)，用于HPIV1靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针的序列是5′-CAT TCA GAC AGG ATG GAA CCG TT-3′(SEQ ID NO：7)，探针的两端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团。
本发明的另一个优选实施方案是两步法试剂盒中HPIV2反应管内含有PCR反应缓冲液、一对HPIV2特异性的正、反向引物、一条HPIV2特异性的探针、Taq酶，其特征在于用于HPIV2靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别是5′-TCT GCA GCT ATG AGT AAT CAC AT-3′(SEQ ID NO：3)和5′-GCA TCT GGA ATG ACT CGG AA-3′(SEQ ID NO：4)，用于HPIV2靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针的序列是5′-TCA CCA GAA GCC AGC ATA GAT AGAG-3′(SEQID NO：8)，探针的两端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团。
本发明的另一个优选实施方案是两步法试剂盒中HPIV3反应管内含有PCR反应缓冲液、一对HPIV3特异性的正、反向引物、一条HPIV3特异性的探针、Taq酶，其特征在于用于HPIV3靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别是5′-CTT TCA GAC AAG ATG GAA CAG T-3′(SEQ ID NO：5)、5′-AAG CT CTG TTG AGA CCG CA-3′(SEQ ID NO：6)，用于HPIV3靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针的序列是5′-TCC ACT GTG TCA CCG CTC AAT ACC-3′(SEQID NO：9)，探针的两端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团。
本发明的另一个优选实施方案是HPIVl反应管、HPIV2反应管、HPIV3反应管中PCR反应缓冲液均由Tris-HCl(pH8.0)、MgCl2、KCl、甲酰胺组成。
本发明的另一个优选实施方案是，逆转录条件为：37℃60min，95℃3min；PCR反应条件为93℃2分钟；93℃15秒，55℃45秒，共10个循环；93℃15秒，55℃45秒，共30个循环。
两步法试剂盒中阳性质控品，阴性质控品和定量参考品同一步法试剂盒。
本发明的再一个目的在于可以提供一种可以同时对人副流感病毒进行分型和定量的多色荧光RT-PCR检测试剂盒(下称多色荧光试剂盒)。
多色荧光试剂盒的实施方案与一步法试剂盒实施方案的差别在于：只有一种多色荧光RT-PCR反应管，反应管中包含了三对特异性的正、反向引物、三条特异性探针，以及其它组分。其中，三条特异性探针分别标记了不同的荧光发生基团和荧光淬灭基团，在PCR扩增的过程中被Taq酶切断时，三条探针将发出不同的荧光，在PCR扩增仪上显示不同颜色的扩增曲线。因此，通过一次PCR反应就可以检出样本中三种类型人副流感病毒的感染情况。
本发明所涉及的多色荧光试剂盒中主要包括1)RNA提取液、多色荧光RT-PCR反应管、经焦炭酸乙二脂(DEPC)处理的纯水、阳性质控品、阴性质控品、定量参考品，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
本发明的一个优选实施方案是多色荧光试剂盒中多色荧光RT-PCR反应管内包含Tris-Ac、KAc、(NH4)2SO4、DTT、MgSO4、dNTP、mMLV酶、RNasin、Taq酶、三对特异性正、反向引物、三条特异性探针。其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别是5′-GCC ATA ACA AGT AGT GCT GGT C-3′(SEQID NO：1)、5′-ACC TTC AAC TGT GTCTCC TGT-3′(SEQID NO：2)、5′-TCT GCA GCT ATG AGT AAT CAC AT-3′(SEQ ID NO：3)、5′-GCA TCT GGA ATG ACT CGG AA-3′(SEQID NO：4)、5′-CTT TCA GAC AAG ATGGAA CAG T-3′(SEQ ID NO：5)、5′-AAG CT CTG TTG AGA CCG CA-3′(SEQ ID NO：6)。用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针的序列是5′-CAT TCA GAC AGG ATG GAA CCGTT-3′(SEQ ID NO：7)、5′-TCA CCA GAA GCC AGC ATA GAT AGA G-3′(SEQ ID NO：8)、5′-TCC ACT GTG TCA CCG CTC AAT ACC-3′(SEQ ID NO：9)，三条探针的两端分别结合有不同的荧光发生基团和荧光淬灭基团。
本发明的另一个优选实施方案是，多色荧光RT-PCR反应条件为：40℃30分钟；94℃3分钟；93℃15秒，55℃45秒，共10个循环；93℃15秒，55℃45秒，共30个循环。
本试剂盒中阳性质控品，阴性质控品和定量参考品同一步法试剂盒。
本发明所涉及的试剂盒包括一步法试剂盒、两步法试剂盒和多色荧光试剂盒，三种试剂盒均可进行样本中HPIV RNA的检测。检测过程和定量分析由仪器自动完成，操作简单，耗时少，且最大限度地减少了污染的发生。经实验检测，一步法试剂盒、两步法试剂盒和多色荧光试剂盒的检测灵敏度分别达到1×103copies/ml，1×103copies/ml和5×103copies/ml。
本发明所述的三种试剂盒均可检测痰液、咽拭子、支气管肺泡灌洗液等多种样本中的人副流感病毒，并对感染的病毒进行分型，既可用于进行人副流感病毒感染的早期诊断，又可用于流行病学中人副流感病毒感染的调查。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：(1)同时检测待检样本中人副流感病毒感染的型别和数量，可真实反映出患者体内病原体类型、拷贝数的高低和复制情况，有助于判断疾病预后，选择治疗方案及监测治疗效果；(2)与血清学相比，具有更高的灵敏性，适用于痰液、咽拭子、支气管肺泡灌洗液等多种样本的检测；(3)针对病毒特异性序列设计引物探针，与血清学检验所用的抗原片段相比，具有更高的特异性，避免了常规血清学检测中与其它呼吸道病毒的交叉反应；(4)将PCR的敏感性与探针杂交的特异性相结合，在很大程度上改变了传统PCR的缺陷，降低了反应时间，简化了操作步骤；(5)闭管检测不需PCR后处理，避免了由于样本间的交叉污染引起的假阳性和环境污染；(6)实时检测技术可连续不断地检测PCR过程中荧光信号的变化，避免了传统PCR的“平台期效应”，并且模板的定量不通过终产物，而由Ct值计算出，准确性和灵敏度均有提高。
附图说明
图1显示一步法试剂盒阴性质控品扩增曲线。HPIV1、HPIV2、HPIV3体系分别对应的三条扩增曲线均为不规则的折线，不呈S型。说明检测过程中没有HPIV核酸的污染。
图2显示一步法试剂盒阳性质控品扩增曲线。HPIV1、HPIV2、HPIV3体系分别对应的三条扩增曲线均为S型曲线，且CT值＜27。说明检测体系可以有效地扩增HPIV1、HPIV2、HPIV3的核酸序列。
图3显示一步法试剂盒4管定量参考品扩增曲线
图4显示一步法试剂盒Std curve窗口下的标准曲线。定量参考品的含量为103PFU/ml～106PFU/ml，经PCR分析，绘制出的标准曲线斜率为-3.406584，在Y轴截距为31.065121，R2＝0.999827。在阴、阳性参考品检测合格的前提下，说明定量结果有效。
图5显示一步法试剂盒阴、阳性样本的扩增曲线。两个阴性样本扩增曲线不呈S型，且与荧光检测阈值线没有交点，三个阳性样本的扩增曲线呈S型。
图6显示两步法试剂盒阴性质控品扩增曲线。HPIV1、HPIV2、HPIV3体系分别对应的三条扩增曲线均为不规则的折线，与荧光检测阈值线没有交点，且曲线不呈S型。说明检测过程中没有HPIV核酸的污染。
图7显示两步法试剂盒阳性质控品扩增曲线。HPIV1、HPIV2、HFIV3体系分别对应的三条扩增曲线均为S型曲线，且CT值＜27。说明检测体系可以有效地扩增HPIV1、HPIV2、HPIV3的核酸序列。
图8显示两步法试剂盒4管定量参考品扩增曲线
图9显示两步法试剂盒Std curve窗口下的标准曲线。定量参考品的含量为103PFU/ml～106PFU/ml，经PCR分析，绘制出的标准曲线斜率为-3.340875，在Y轴截距为32.309769，R2＝0.995243。在阴、阳性参考品检测合格的前提下，说明定量结果有效。
图10显示两步法试剂盒阴、阳性样本的扩增曲线。两个阴性样本扩增曲线不呈S型，且与荧光检测阈值线没有交点，两个阳性样本的扩增曲线呈S型。
图11显示多色荧光试剂盒阴性质控品扩增曲线。HPIV1、HPIV2、HPIV3体系分别对应的三条扩增曲线均为不规则的折线，与荧光检测阈值线没有交点，且曲线不呈S型。说明检测过程中没有HPIV核酸的污染。
图12显示多色荧光试剂盒阳性质控品扩增曲线。HPIV1，HPIV2，HPIV3体系分别对应的三条扩增曲线均为S型曲线，且CT值＜27。说明检测体系可以有效地扩增HPIV1、HPIV2、HPIV3的核酸序列。
图13显示多色荧光试剂盒4管定量参考品扩增曲线
图14显示多色荧光试剂盒Std curve窗口下的标准曲线。定量标准品的含量为103PFU/ml～106PFU/ml，经PCR分析，绘制出的标准曲线斜率为-3.761655，在Y轴截距为34.239212，R2＝0.999542。在阴、阳性参考品检测合格的前提下，说明定量结果有效。
图15显示多色荧光试剂盒阴样本的扩增曲线。一个阴性样本扩增出的三条扩增曲线均不呈S型，且与荧光检测阈值线没有交点。
图16显示多色荧光试剂盒阳样本的扩增曲线。一个阳性样本扩增出的三条扩增曲线中，HPIV1和HPIV3扩增曲线均不呈S型，HPIV2扩增曲线呈S型，说明该样本中有人副流感病毒的感染，且感染病毒为人副流感病毒2型。
具体实施方式
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
实施例1.人副流感病毒RT-PCR一步法分型、定量检测试剂盒的组成
1.1提取试剂：DEPC.H2O；RNA提取液A(为DEPC.H2O稀释，并高压灭菌后的10％SiO2)；Trizol；氯仿。
1.2RT-PCR反应试剂
包括HPIV1反应管、HPIV2反应管、HPIV3反应管
1.3质控品：阳性质控品-P(HPIV1、HPIV2和HPIV3体外转录RNA混合液)；阴性质控品-N(生理盐水)；定量参考品-S1~S4(为104copies/ml～107copies/mlHPIV1或HPIV2或HPIV3体外转录RNA)
实施例2.用人副流感病毒RT-PCR一步法分型、定量检测试剂盒检测待检样本中人副流感病毒的感染
2.1标本的采集、保存和运输：可检测的标本包括，痰液、咽拭子和支气管肺泡灌洗液。采集方法如下：①痰液：负压下吸取痰液，密封送检；②咽拭子：用拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子浸入4-5ml采样液中，密封送检；③支气管肺泡灌洗液：由临床医生收集支气管肺泡灌洗液约1ml，密封送检。标本可立即用于测试，也可以保存于-70℃待测，保存期为6个月。标本运送采用0℃冰壶。
2.2核酸提取：①将痰液标本吸取100μl至1.5ml灭菌离心管中；咽拭子采样液或支气管肺泡灌洗液12,000rpm离心5分钟，弃上清，留约100ul，转至1.5ml灭菌离心管中；阴、阳性质控品解冻后混匀，2000rpm离心30sec，分别取100ul至1.5ml灭菌离心管中；②加入300μl TRIzol及100μl氯仿，强力振荡30秒后静置3分钟，然后12,000rpm离心2分钟；③小心取出上清液(注意不可触及中间絮状层)，转移至新灭菌的1.5ml离心管，然后加入10μl RNA提取液A(充分混匀后吸取)，用振荡器充分混匀，8,000rpm离心1分钟，小心弃去所有液体；④加入预冷的75％乙醇(用试剂盒中提供的DEPC.H2O配置)500μl，振荡混匀，8,000rpm离心1分钟，小心弃去所有液体；⑤打开管盖，60℃干燥5分钟，加入35μlDEPC H2O，混悬沉淀物，静置1分钟后8,000rpm离心1分钟。
处理过的样品可直接用于后续RT-PCR检测或于-20℃保存。若保存一个月以上，最好存于-70℃。
2.3定量参考品的准备：取出定量参考品，解冻后混匀，2000rpm离心30sec，置冰上待用。
2.4RT-PCR检测：取三种RT-PCR反应管若干，解冻待用。取处理后的样品(标本、阴性质控品、阳性质控品)上清液10μl分别加入三种RT-PCR反应管中，定量参考品S1~S4各10μl加入HPIV3RT-PCR反应管，8,000rpm离心数秒，放入仪器样品槽，参照仪器操作说明设定阴阳性质控品，定量参考品和待检样本编号。
反应程序设定：第一步40℃30分钟；第二步94℃3分钟；第三步93℃15秒，55℃45秒，共10个循环；第四步93℃15秒，55℃45秒，共30个循环。荧光设置：ReporterDye：FAM，Quencher Dye：TAMRA，Passive Reference：NONE，在第四步55℃收集荧光。
2.5结果分析：根据定量参考品扩增曲线设置Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值(start值可以在1～10、stop值可以在5～20、Value值可以在0.01～0.2范围选择)，使Std curve窗口下的标准曲线图达到最佳，即correlation数值介于-1.0～-0.97。在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。
2.6结果判定：
a.所有阳性质控品扩增曲线呈S型，且CT值＜27，所有阴性质控品扩增曲线不呈S型时，待测样本的HPIV分型结果有效，否则，结果无效，需重新检测；(参见附图1，2)
b.在满足a条件时，如果定量参考品标准曲线correlation＞0.97，则待测样本的定量结果有效，否则，定量结果无效，需重新检测。(参见附图3，4)
c.扩增曲线呈S形，且CT值＜27，待检样本判为人副流感病毒阳性；扩增曲线不呈S形，或CT值＞27，待检样本判为人副流感病毒阴性(参见附图5)。
实施例3.人副流感病毒RT-PCR两步法分型、定量检测试剂盒的组成
3.1提取试剂：同实施例2中2.1
3.2RT-PCR反应试剂
包括混合逆转录反应管(含有HPIV1，HPIV2，HPIV3引物)，逆转录酶系，HPIV1反应管、HPIV2反应管、HPIV3反应管
3.3质控品：同实施例2中2.3
实施例4.用人副流感病毒RT-PCR两步法分型、定量检测试剂盒检测待检样本中人副流感病毒的感染
4.1标本的采集、保存和运输，核酸提取同实施例2中2.1～2.2(核酸提取中，⑤改为：打开管盖，60℃干燥5分钟，待用)
4.2定量参考品的准备同实施例2中2.3
4.3混合逆转录反应：按一定数量和比例混合逆转录反应液和逆转录酶系，取每人份的反应混合液加入处理后的样本(标本、阴性质控品、阳性质控品)管中，混悬沉淀物。反应条件：37℃60min，93℃3min。8,000rpm离心1分钟，冰上待用。
逆转录产物可直接用于后续PCR检测或于-20℃保存。若保存一个月以上，最好存于-70℃。
4.4PCR检测：取三种PCR反应管若干，解冻待用。取逆转录产物上清液10μl分别加入三种PCR反应管中，定量参考品S1~S4各10μl加入HPIV1或HPIV2或HPIV3 PCR反应管中，8,000rpm离心数秒，放入仪器样品槽，参照仪器操作说明设定阴阳性质控品，定量参考品和待检样本编号。
反应程序设定：第一步40℃30分钟；第二步94℃3分钟；第三步93℃15秒，55℃45秒，共10个循环；第四步93℃15秒，55℃45秒，共30个循环。荧光设置：ReporterDye：FAM，Quencher Dye：TAMRA，Passive Reference：NONE，在第四步55℃收集荧光。
4.4结果分析和结果判定同实施例2中2.5～2.6(参见附图6～10)
实施例5.人副流感病毒多色荧光RT-PCR分型、定量检测试剂盒的组成
5.1提取试剂：同实施例2中2.1
5.2多色荧光RT-PCR反应试剂
多色荧光RT-PCR反应管
5.3质控品：同实施例2中2.3
实施例6.用多色荧光RT-PCR分型、定量检测试剂盒检测待检样本中人副流感病毒的感染
6.1标本的采集、保存和运输，核酸提取，定量参考品的准备同实施例4中4.1
6.2多色荧光RT-PCR检测：取多色荧光RT-PCR管若干，解冻待用。在抽提的RNA干粉中加入25μl DEPC H2O，混悬沉淀物，静置1分钟后8,000rpm离心1分钟。取上清液10μl加入多色荧光RT-PCR体系中，定量参考品S1~S4也各取10μl加入多色荧光RT-PCR体系，8,000rpm离心数秒，放入仪器样品槽，参照仪器操作说明设定阴阳性质控品，定量参考品和待检样本编号。
反应程序设定：第一步40℃30分钟；第二步94℃3分钟；第三步93℃15秒，55℃45秒，共10个循环；第四步93℃15秒，55℃45秒，共30个循环。荧光设置：选择三条探针中标记的三种荧光报告基团和淬灭基团，在第四步55℃收集荧光。
6.3结果分析同实施例2中2.5
6.4结果判定：
a.根据不同颜色扩增曲线对待测样本感染的HPIV进行分析，仅当阳性质控品有三条扩增曲线，且扩增曲线均呈S型，CT值＜27，阴性质控品有三条扩增曲线，且扩增曲线不呈S型时，对待测样本的HPIV分型结果有效，否则，结果无效，需重新检测；(见附图11，12)
b.在满足a条件时，如果定量参考品标准曲线correlation＞0.97，则待测样本的定量结果有效，否则，定量结果无效，需重新检测。(参见附图13，14)
c.扩增曲线呈S形，且CT值＜27，待检样本判为人副流感病毒阳性；扩增曲线不呈S形，或CT值＞27，待检样本判为人副流感病毒阴性(参见附图15，16)。
序列表
<110>中山大学达安基因股份有限公司
<120>人副流感病毒分型及定量检测试剂盒
<140>
<141>
<160>15
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>1
gccataacaagtagtgctggtc
<210>2
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>2
accttcaactgtgtctcctgt
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
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tctgcagctatgagtaatcacat
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gcatctggaatgactcggaa
<210>5
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ctttcagacaagatggaacagt
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>15
tgaagaatgaagcgagacctg
Claims (2)
1.一种同时对人副流感病毒进行分型和定量的一步法RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：1)RNA提取液、HPIV1反应管、HPIV2反应管、HPIV3反应管、经DEPC处理的纯水、阳性质控品、阴性质控品、定量参考品，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中HPIV1反应管由RT-PCR反应缓冲液、一对HPIV1特异性的正、反向引物、一条HPIV1特异性的探针、Taq酶、逆转录酶mMLV和RNA酶抑制剂组成，HPIV2反应管由RT-PCR反应缓冲液、一对HPIV2特异性的正、反向引物、一条HPIV2特异性的探针、Taq酶、逆转录酶mMLV和RNA酶抑制剂组成，HPIV3反应管由RT-PCR反应缓冲液、一对HPIV3特异性的正、反向引物、一条HPIV3特异性的探针、Taq酶、逆转录酶mMLV和RNA酶抑制剂组成，HPIV1反应管中用于HPIV1靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别是5′-GCCATAACAAGTAGTGCTGGTC-3′和5′-ACCTTCAACTGTGTCTCCTGT-3′，用于HPIV1靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针的序列是5′-CATTCAGACAGGATGGAACCGTT-3′，探针的两端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团，HPIV2反应管中用于HPIV2靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别是5′-TCTGCAGCTATGAGTAATCACAT-3′和5′-GCATCTGGAATGACTCGGAA-3′，用于HPIV2靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针的序列是5′-TCACCAGAAGCCAGCATAGATAGAG-3′，探针的两端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团，HPIV3反应管中用于HPIV3靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别是5′-CTTTCAGACAAGATGGAACAGT-3′和5′-AAGCTCTGTTGAGACCGCA-3′，用于HPIV3靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针的序列是5′-TCCACTGTGTCACCGCTCAATACC-3′，探针的两端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团，HPIV1反应管、HPIV2反应管、HPIV3反应管中RT-PCR反应缓冲液均由Tris-Ac、KAc、(NH4)2SO4、DTT、MgSO4和dNTP组成。
2.一种同时对人副流感病毒进行分型和定量的多色荧光RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：1)RNA提取液、多色荧光RT-PCR反应管、经DEPC处理的纯水、阳性质控品、阴性质控品、定量参考品，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中多色荧光RT-PCR反应管由Tris-Ac、KAc、(NH4)2SO4、DTT、MgSO4、dNTP、mMLV酶、RNasin、Taq酶、三对特异性正、反向引物、三条特异性探针组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别是5′-GCCATAACAAGTAGTGCTGGTC-3′、5′-ACCTTCAACTGTGTCTCCTGT-3′、5′-TCTGCAGCTATGAGTAATCACAT-3′、5′-GCATCTGGAATGACTCGGAA-3′、5′-CTTTCAGACAAGATGGAACAGT-3′、5′-AAGCTCTGTTGAGACCGCA-3′，用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针的序列是5′-CATTCAGACAGGATGGAACCGTT-3′、5′-TCACCAGAAGCCAGCATAGATAGAG-3′、5′-TCCACTGTGTCACCGCTCAATACC-3′，三条探针的两端分别结合有不同的荧光发生基团和荧光淬灭基团。
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