CN105441589A - 人副流感病毒ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ型四重pcr检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

人副流感病毒ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ型四重pcr检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明适用于病毒检测试剂盒技术领域，提供了一种人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括人副流感病毒特异性引物和基因探针，该检测方法使用上述人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒进行检测。本发明人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒及其检测方法与现有技术比较，能够同时检测人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型，且具有灵敏度高、特异性强、周期短、准确度高等优点。

Description

人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于病毒检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用，其基本原理为：在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，如图1所示，在曲线指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。
人类副流感病毒(HPIVs)常常引起儿童下呼吸道感染的一种病毒，其致病性仅次于呼吸道合胞病毒(RSV)。与RSV一样，人类副流感病毒可以造成反复发作的上呼吸道感染(如感冒和喉咙痛)。它也能造成严重的反复感染的下呼吸道疾病(如肺炎，支气管炎和细支气管炎)，特别是在老年人中和有免疫缺陷人群中。人类副流感病毒是单链的RNA病毒。病毒表面含有溶合酶和红血球凝聚素-神经氨酸苷酶的醣蛋白。从血清学上人类副流感病毒可分为4型(Ⅰ型到Ⅳ型)，其中Ⅳ型又分a和b两个亚型。病毒颗粒大小不一(平均直径大小在150-300nm之间)，形态各异。人类副流感病毒的四种亚型各有不同的临床和流行病学特征。其中，Ⅰ型和Ⅱ型的最典型临床特征是造成儿童喉气管支气管炎，而Ⅰ型是这种儿童喉气管支气管炎的主要原因，Ⅱ型次之，此外，Ⅰ型和Ⅱ型均能造成其它的上呼吸道和下呼吸道疾病；Ⅲ型经常导致肺炎和细支气管炎；Ⅳ型很难检出，可能是因为它很少导致严重的疾病。人类副流感病毒的潜伏期一般在1-7天左右。
人副流感病毒存在于呼吸道分泌物中，通过人与人的直接接触和飞沫经呼吸道传播。对于成人，HPIV主要侵犯呼吸道黏膜的表层组织，在上皮细胞内增殖，引起的病变较轻，一般表现为上呼吸道感染(URI)。小于5岁的婴幼儿，病毒常侵犯气管、支气管黏膜上皮细胞，引起细胞变性、坏死增生和黏膜糜烂。当侵犯肺泡上皮及间质细胞，则引起间质性肺炎或表现为急性阻塞性喉气管支气管炎和肺炎。HPIV感染可产生局部抗体和血清抗体。人副流感病毒感染后人的免疫力下降，到目前为止，尚未找到有效的预防与特效治疗方法。
婴幼儿呼吸道感染是最常见的感染性疾病，主要由多种病毒引起，据统计大约30-40％的婴幼儿急性呼吸道感染都是副流感病毒引起的。副流感病毒引起的感染症状和流感病毒相似，仅依靠临床症状及常规的检测方法进行病毒病原的确定并不可靠。因此早期快速诊断呼吸道病毒感染能够及时指导临床治疗，为合理选择抗病毒、抗细菌药物提供依据，并在避免滥用抗生素方面具有重要意义。目前，检测病毒感染的方法很多，呼吸道病毒感染病毒学诊断方法主要包括病毒培养、免疫荧光技术、血清学试验、常规分子生物学方法等，以培养法为金标准。其中，病毒分离培养最为经典，过去常作为金标准，但该方法耗时、耗力，不能及时指导临床治疗，而且标本内所含病毒数量少可出现假阴性；电镜可检测病毒颗粒，但操作复杂、昂贵，不适用于临床；病毒核酸检测灵敏度高，但实验条件严格，容易被污染。病毒特异性抗体检测是临床常见的检测病毒感染的指标，但特异性IgG阳性只能表明有相应病毒感染，不能用于早期感染判断和疗效监测，IgM类抗体是感染早期或潜伏病毒活化时产生的，但婴幼儿可因免疫反应较弱而出现假阴性，且病毒特异性抗体检测一次只能检测一种呼吸道病毒。抗原检测较抗体检测更敏感，是快速而又准确的方法，被广泛引用于HPIV感染的快速诊断，但结果并不稳定，而且有些HPIV病毒株不容易被特异性单克隆抗体检测到。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒，旨在解决现有技术操作繁琐、准确度不高的问题。
本发明的另一目的在于提供一种人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测方法。
本发明是这样实现的，一种人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括人副流感病毒特异性引物和基因探针；
所述人副流感病毒特异性引物包括：
人副流感病毒Ⅰ上游引物：5’-CAGTAGCCAGATGTGTGTCCTTC-3’；
人副流感病毒Ⅰ下游引物：
5’-CTTAGGGTTAAAGACAATCCAGYCAAC-3’；
人副流感病毒Ⅱ上游引物：5’-ACCATTTACCTAAGTGATGGAATCA-3’；
人副流感病毒Ⅱ下游引物：5’-GATCAGTYGTGGCATAATCTTCT-3’；
人副流感病毒Ⅲ上游引物：5’-CAGGRAGCATTGTRTCATCTGTC-3’；
人副流感病毒Ⅲ下游引物：5’-GCCAGCTCGTTTACYCTTT-3’；
人副流感病毒Ⅳ上游引物：5’-CCTGGAGTCCCATCAAAAGT-3’；
人副流感病毒Ⅳ下游引物：5’-AACACCTGCTCGTCTCTCAT-3’；
所述人副流感病毒基因探针包括：
人副流感病毒Ⅰ基因探针：
5’-CCGTGGARTTRTCATTTCGGGTTGTAGA-3’；
人副流感病毒Ⅱ基因探针：
5’-CGCAAAAGCTGTTCAGTCACTGCTATACC-3’；
人副流感病毒Ⅲ基因探针：
5’-CCCAGTCATAACTTACTCAACAGCAACCG-3’；
人副流感病毒Ⅳ基因探针：5’-TAGCAAGACCCATATTATCTGGAACC-3’。
以及，一种人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测方法，该方法使用上述人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：
标本处理；
实时荧光PCR检测；
结果判断，
其中，所述实时荧光PCR检测的参数设置为：
50-55℃：5-10min；
94-95℃：2-3min；
94-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S；45个循环。
本发明提供的人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒及其检测方法，采用特异性设计的病原体引物和病原体基因探针，进行RT-PCR，可以大大提高了扩增效率，从而用普通的TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检测灵敏度，解决了传统多重PCR扩增效率低和检测灵敏度低的问题。本发明具有灵敏度高、操作简单、快速、安全等优点，可应用于人副流感分型的快速检测，早期快速诊断人副流感病毒感染并及时指导临床治疗。此外，所述试剂盒运用分装技术，比一般的PCR试剂盒节省配制反应液的步骤，更有利用临床的大量样本检测，省时方便。
附图说明
图1是提供的实时荧光定量PCR扩增曲线示意图；
图2是本发明实施例提供的人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测方法示意图；
图3是本发明实施例提供的人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测方法阳性结果和阴性结果示意图；
图4是本发明实施例提供的人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例中，对下述名词作出如下解释。
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)：是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。
实时荧光PCR法：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性定量分析的方法。
Ct值：每个PCR反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
本发明实施例提供了一种人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括人副流感病毒特异性引物和基因探针；
所述人副流感病毒特异性引物包括：
人副流感病毒Ⅰ上游引物：5’-CAGTAGCCAGATGTGTGTCCTTC-3’；
人副流感病毒Ⅰ下游引物：
5’-CTTAGGGTTAAAGACAATCCAGYCAAC-3’；
人副流感病毒Ⅱ上游引物：5’-ACCATTTACCTAAGTGATGGAATCA-3’；
人副流感病毒Ⅱ下游引物：5’-GATCAGTYGTGGCATAATCTTCT-3’；
人副流感病毒Ⅲ上游引物：5’-CAGGRAGCATTGTRTCATCTGTC-3’；
人副流感病毒Ⅲ下游引物：5’-GCCAGCTCGTTTACYCTTT-3’；
人副流感病毒Ⅳ上游引物：5’-CCTGGAGTCCCATCAAAAGT-3’；
人副流感病毒Ⅳ下游引物：5’-AACACCTGCTCGTCTCTCAT-3’；
所述人副流感病毒基因探针包括：
人副流感病毒Ⅰ基因探针：
5’-CCGTGGARTTRTCATTTCGGGTTGTAGA-3’；
人副流感病毒Ⅱ基因探针：
5’-CGCAAAAGCTGTTCAGTCACTGCTATACC-3’；
人副流感病毒Ⅲ基因探针：
5’-CCCAGTCATAACTTACTCAACAGCAACCG-3’；
人副流感病毒Ⅳ基因探针：5’-TAGCAAGACCCATATTATCTGGAACC-3’。
本发明实施例所述试剂盒上述人副流感病毒特异性引物和基因探针，是针对人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型高度保守基因区域设计。优选的，所述人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述人副流感病毒基基因探针上标记的荧光信号不相同，提高了单一反应管中可识别的探针的数目，从而提高PCR单管中能够检测的靶的数目。具体的，所述人副流感病毒基因探针优选包括：
人副流感病毒Ⅰ基因探针：
5’-(FAM)CCGTGGARTTRTCATTTCGGGTTGTAGA(BHQ1)-3’；
人副流感病毒Ⅱ基因探针：
5’-(HEX)CGCAAAAGCTGTTCAGTCACTGCTATACC(BHQ1)-3’；或
5’-(VIC)CGCAAAAGCTGTTCAGTCACTGCTATACC(BHQ1)-3’；或
5’-(JOE)CGCAAAAGCTGTTCAGTCACTGCTATACC(BHQ1)-3’
人副流感病毒Ⅲ基因探针：
5’-(ROX)CCCAGTCATAACTTACTCAACAGCAACCG(BHQ2)-3’；
人副流感病毒Ⅳ基因探针：
5’-(CY5)TAGCAAGACCCATATTATCTGGAACC(BHQ2)-3’。
进一步的，本发明实施例所述PCR反应液还包括逆转录酶、Taq酶、dNTP、不含镁离子的缓冲液、氯化镁、溴酚蓝、50％甘油和DEPC水。更进一步地，所述试剂盒运用分装技术，将所述逆转录酶、Taq酶、50％甘油、溴酚蓝，和所述dNTP、不含镁离子的缓冲液、氯化镁、DEPC水、人副流感病毒特异性引物和基因探针，采用石蜡隔离，有效保证了DNA聚合酶的活性，延长了本发明实施例试剂盒的保存时间。优选的，所述石蜡的熔化温度为42-50℃。在PCR反应过程中，由于温度在50-55℃，石蜡熔融，使得上述反应液混合，PCR反应得以进行。
本发明实施例中，所述PCR反应液的规格为8管×6条，20μL/管。作为优选实施例，所述PCR反应液的组成如下所述：
本发明实施例人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒是通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系的荧光扩增曲线图，当扩增曲线图Ct值≤40，并呈现明显指数增长时，结果表现为阳性；当扩增曲线图Ct值＞40或无Ct值，结果表现为阴性。因此，为了形成对照，用于人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒设置阴性对照液和阳性对照液。具体的，所述阳性对照包括人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型检测区域合成序列转录的RNA。更具体的，所述阳性对照使用Tris-EDTA缓冲液对人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型转录RNA进行稀释后冷冻保存，所述Tris-EDTA缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为8.0，可以用0.6mL普通带盖离心管包装。作为具体实施例，每个试剂盒中设置40μL/管的所述阳性对照1管。所述阴性对照为不含有人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型基因的Tris-EDTA缓冲液，所述Tris-EDTA缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为8.0，可以用0.6mL普通带盖离心管包装。作为具体实施例，每个试剂盒中设置40μL/管的所述阴性对照1管。
应当理解，应不同实验需要，本发明实施例各组分的规格可依照上述含量进行调整。为了避免操作时取错组分或实验过程中由于混淆瓶盖造成的标品交叉污染，本发明实施例优选采用不同类型和/或颜色的盖子对不同样品进行区分，具体的，所述PCR反应液采用无色透明PCR反应管；阴性对照使用紫色透明带盖离心管；阳性对照使用橙红色透明带盖离心管。
以及，本发明实施例还提供了一种人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测方法，该方法使用上述人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒进行检测，包括以下步骤，如图2所示：
S01.标本处理；
S02.实时荧光PCR检测；
S03.结果判断，
其中，所述实时荧光PCR检测的参数设置为：
50-55℃：5-10min；
94-95℃：2-3min；
94-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S；45个循环。
具体的，上述步骤S01中，所述标本处理推荐使用深圳市生科源技术有限公司生产的病毒核酸DNA/RNA提取试剂盒，操作步骤参照说明书。如使用其他产家的提取试剂，请参考相应提取试剂的使用说明书进行操作。
作为优选实施例，所述标本处理包括对所述人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述人副流感病毒基基因探针上标记的荧光信号不相同。
上述步骤S02包括取待检样本RNA，加入RT-PCR反应液，上机检测。值得注意的是，每次试验设置有阴性对照和阳性对照，否则该次试验视为无效试验。本发明实施例中，用于人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测的荧光定量PCR仪包括但不限于：ABI系列、Bio-Rad系列(ICycler/MJOpticon2)、StratageneMX系列、RocheLightCycler、CepheidSmartCycler、CorbettRotor-Gene、杭州博日系列。
上述步骤S03中，根据检测的荧光强度结果进行分析判断，当扩增曲线图Ct值≤40，并呈现明显指数增长时，结果表现为阳性，如图3A所示；当扩增曲线图Ct值＞40或无Ct值，结果表现为阴性，如图3B所示。本发明实施例中，通过不同的通道(采用不同荧光基团标记)得到的结果可进行判定，具体的，当采用FAM标记人副流感病毒Ⅰ时，阳性结果表示样品中检测出人副流感病毒Ⅰ，而阴性结果未检出人副流感病毒Ⅰ；当采用HEX/VIC/JOE中的一种标记人副流感病毒Ⅱ时，阳性结果表示样品中检测出人副流感病毒Ⅱ，而阴性结果未检出人副流感病毒Ⅱ；当采用ROX中的一种标记人副流感病毒Ⅲ时，阳性结果表示样品中检测出人副流感病毒Ⅲ，而阴性结果未检出人副流感病毒Ⅲ；当采用CY5中的一种标记人副流感病毒Ⅳ时，阳性结果表示样品中检测出人副流感病毒Ⅳ，而阴性结果未检出人副流感病毒Ⅳ。
本发明实施例提供的人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒及其检测方法，采用特异性设计的病原体引物和病原体基因探针，进行RT-PCR，可以大大提高了扩增效率，从而用普通的TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检测灵敏度，解决了传统多重PCR扩增效率低和检测灵敏度低的问题。本发明具有灵敏度高、操作简单、快速、安全等优点，可应用于人副流感分型的快速检测，早期快速诊断人副流感病毒感染并及时指导临床治疗。此外，所述试剂盒运用分装技术，比一般的PCR试剂盒节省配制反应液的步骤，更有利用临床的大量样本检测，省时方便。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
一种人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒，包括PCR反应液、阴性对照和阳性对照，其中，所述PCR反应液的规格为：8管×6条，20μl/管，成分如下表1所示；所述阳性对照规格为1管，40μl/管，成分为人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型检测区域合成序列后体外转录的RNA，使用Tris-EDTA缓冲液(0.01MpH8.0)稀释后冷冻保存；所述阴性对照规格为1管，40μl/管，成分为不含有人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型基因的Tris-EDTA缓冲液(0.01MpH8.0)。
表1
一种人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测方法，该方法使用上述人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：
S11.标本处理；
S12.实时荧光PCR检测；
S13.结果判断，
其中，所述实时荧光PCR检测的参数设置为：
50-55℃：5-10min；
94-95℃：2-3min；
94-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S；45个循环。
PCR扩增图谱如图4所示。
对比例1
由深圳市疾控培养确定提供人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型各一株采用培养法进行培养。
本发明实施例和对比例的检测结果如下表2所示。
表2
由上表2可见，人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒检出结果与培养法结果一致，但是，采用试剂盒进行检测，检出只需要约5小时，培养法则需要15天以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括人副流感病毒特异性引物和基因探针；
所述人副流感病毒特异性引物包括：
人副流感病毒Ⅰ上游引物：5’-CAGTAGCCAGATGTGTGTCCTTC-3’；
人副流感病毒Ⅰ下游引物：
5’-CTTAGGGTTAAAGACAATCCAGYCAAC-3’；
人副流感病毒Ⅱ上游引物：5’-ACCATTTACCTAAGTGATGGAATCA-3’；
人副流感病毒Ⅱ下游引物：5’-GATCAGTYGTGGCATAATCTTCT-3’；
人副流感病毒Ⅲ上游引物：5’-CAGGRAGCATTGTRTCATCTGTC-3’；
人副流感病毒Ⅲ下游引物：5’-GCCAGCTCGTTTACYCTTT-3’；
人副流感病毒Ⅳ上游引物：5’-CCTGGAGTCCCATCAAAAGT-3’；
人副流感病毒Ⅳ下游引物：5’-AACACCTGCTCGTCTCTCAT-3’；
所述人副流感病毒基因探针包括：
人副流感病毒Ⅰ基因探针：
5’-CCGTGGARTTRTCATTTCGGGTTGTAGA-3’；
人副流感病毒Ⅱ基因探针：
5’-CGCAAAAGCTGTTCAGTCACTGCTATACC-3’；
人副流感病毒Ⅲ基因探针：
5’-CCCAGTCATAACTTACTCAACAGCAACCG-3’；
人副流感病毒Ⅳ基因探针：
5’-TAGCAAGACCCATATTATCTGGAACC-3’。
2.如权利要求1所述的人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述人副流感病毒基因探针为采用不同荧光标记物进行编码标记的基因探针，包括：
人副流感病毒Ⅰ基因探针：
5’-(FAM)CCGTGGARTTRTCATTTCGGGTTGTAGA(BHQ1)-3’；
人副流感病毒Ⅱ基因探针：
5’-(HEX)CGCAAAAGCTGTTCAGTCACTGCTATACC(BHQ1)-3’；或
5’-(VIC)CGCAAAAGCTGTTCAGTCACTGCTATACC(BHQ1)-3’；或
5’-(JOE)CGCAAAAGCTGTTCAGTCACTGCTATACC(BHQ1)-3’；
人副流感病毒Ⅲ基因探针：
5’-(ROX)CCCAGTCATAACTTACTCAACAGCAACCG(BHQ2)-3’；
人副流感病毒Ⅳ基因探针：
5’-(CY5)TAGCAAGACCCATATTATCTGGAACC(BHQ2)-3’。
3.如权利要求1所述的人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括逆转录酶、Taq酶、dNTP、不含镁离子的缓冲液、氯化镁、溴酚蓝、50％甘油和DEPC水。
4.如权利要求3所述的人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述逆转录酶、Taq酶、50％甘油、溴酚蓝，和所述dNTP、不含镁离子的缓冲液、氯化镁、DEPC水、人副流感病毒特异性引物和基因探针，采用石蜡隔离。
5.如权利要求1-4任一所述的人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照包括人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型检测区域合成序列转录的RNA。
6.如权利要求1-4任一所述的人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为不含有人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型基因的Tris-EDTA缓冲液。
7.如权利要求1-4任一所述的人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液的组成如下所述：
8.一种人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测方法，其特征在于，该方法使用如权利要求1-7任一项所述人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：
标本处理；
实时荧光PCR检测；
结果判断，
其中，所述实时荧光PCR检测的参数设置为：
50-55℃：5-10min；
94-95℃：2-3min；
94-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S；45个循环。
9.如权利要求8所述的人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四重PCR检测方法，其特征在于，所述标本处理包括对所述人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述人副流感病毒基基因探针上标记的荧光信号不相同。
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