CN103993104A

CN103993104A - 用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群、探针群及其应用方法和试剂盒

Info

Publication number: CN103993104A
Application number: CN201410226772.7A
Authority: CN
Inventors: 陈愉生; 沈晓娜; 伍严安; 王毅
Original assignee: FUJIAN CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION; Shanghai Toujing Life Sci & Tech Co Ltd; FUJIAN PROVINCIAL HOSPITAL
Current assignee: FUJIAN CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION; Shanghai Toujing Life Sci & Tech Co Ltd; FUJIAN PROVINCIAL HOSPITAL
Priority date: 2014-05-27
Filing date: 2014-05-27
Publication date: 2014-08-20

Abstract

本发明提供一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群，病原体包括人巨细胞病毒、腺病毒等14种呼吸道传染性疾病的病原体，所述的引物群包括上述14种病原体的引物中的任意1组或者2组以上的引物；本发明还提供与引物群中的引物一一对应配对的探针组成的探针群；并提供将上述引物群和探针群用于液态芯片快速检测方法中的应用方法。此应用方法可检测1种或者同时检测多种急性呼吸道传染性疾病病原体，且，灵敏度高、特异性好。

Description

用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群、探针群及其应用方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及疾病检测领域，尤其是一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群、探针群及其应用方法和试剂盒。

背景技术

急性呼吸道传染性疾病一旦爆发，便以极迅速的方式进行传播，因此，防治急性呼吸道传染性疾病的关键在于早期诊断、早期隔离、早期治疗。

现有的急性呼吸道传染性疾病的检测方法主要有：（1）病原体分离培养法：此法不仅操作过程繁琐，灵敏度低，时间长，且技术上难度高，普通医务场所难以开展；（2）免疫检测法：该方法为回顾性方法，患者需感染产生抗体后方可得以检测，无法适应快速检测的需求，且由于抗体交叉反应易出现假阳性；（3）病原体为病毒时，对于病毒种类的检测，需将病毒接种到活的真核细胞中，对病毒进行细胞培养、病毒繁殖，选择的最佳细胞株，并根据该细胞株是否存在细胞病变效应( CPE) 或者是否有早期抗原，进行病毒种类的鉴定，但是，费时费力；（4）近年来发展的聚合酶链反应( PCR) ，可实现快速检测病原体的目的，但是，此法只可对单一病原进行检测，且非特异性结合以及假阴性、假阳性问题较明显。

2001年美国Luminex 公司开发了一种液态芯片( liquid chip)，创新性地将细胞大小的微球作为探针的载体，为生物分子相互作用提供一种能够充分反应的液相环境，同时将激光检测、高速数字信号处理器应用到该技术中，这种基于微球的芯片技术能够对单孔内多达 100 种不同的反应同时进行检测,与固相芯片或片膜芯片相比, 具有多重、快速、灵敏度高(可达0.01pg)、重复性好(CV<5%)以及检测动态范围宽（可达 0.2-32000pg/ ml) 等优点，实现了多指标同步分析的功能。该技术已用于肿瘤标志物、过敏原筛查、自身免疫病、细胞因子等方面的研究，并已为美国 FDA 批准用于临床进行自身免疫病、人类白细胞抗原分型的诊断。但是，该技术尚未在临床检测病毒、细菌等方面进行应用。

发明内容

本发明旨在提供一种可用于检测1种或多种病原体的检测急性呼吸道传染性疾病的引物群、探针群及其应用方法和试剂盒，且，此应用方法可同时进行多种病原体的检测，且，灵敏度高、特异性好。

一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群，由14组引物中的任意1组或者2组以上的引物组成，所述的14组引物的核苷酸序列分别为：

①人巨细胞病毒（简称：HCMV）

HCMV-F：biotin（生物素）–AAGTTTGTGCCCCAACGGTA、

HCMV-R：biotin –GCGTGCTTTTTAGCCTCTGC；

②腺病毒（简称：AD）

AD-F：biotin –CGCAGTGGTCTTACATGCACA、

AD-R：biotin –ACGCCGCGGATGTCAAAGT；

③副流感病毒1型（简称：PIV1）

PIV1-F：biotin -CCTTGGAGCGGAGTTGTTAAG、

PIV1-R：biotin –CCGGTAATTTCTCATACCTATG；

④副流感病毒2型（简称：PIV2）

PIV2-F：biotin –ATGGAATCAATCGCAAAAGC、

PIV2-R：biotin –GATGATAGATCCCGCTTCCA；

⑤副流感病毒3型（简称：PIV3）

PIV3-F：biotin –CTCGAGGTTGTCAGGATATAG、

PIV3-R：biotin –CTTTGGGAGTTGAACACAGTT；

⑥呼吸道合胞病毒（简称：RSV）

RSV -F：biotin –CAAGTTGTTGAGGTTTATGAATATGC、

RSV -R：biotin –TTCTGCTGTCAAGTCTAGTACACTGTAGT；

⑦金黄色葡萄球菌（简称：SA）

SA-F：biotin –ATGGAAGTTCGTGACTTATTAAGC、

SA-R：biotin –AACAGTTGTTTTAGATGTGTCATGT；

⑧肺炎链球菌（简称：SP）

SP-F：biotin – GTGATATTTCTGTAACAGCTACC、

SP-R：biotin –GAGAATTCCCTGTCTTTTCAAA；

⑨肺炎支原体（简称：MP）

MP-F：biotin– TGCCATCTACCCGCGCTTA、

MP-R：biotin–GTGATCTGCCCGGTTTGGTC；

⑩肺炎衣原体（简称：CP）

CP-F：biotin–AGTTGAGCATATTCGTGAGG、

CP-R：biotin–TTTATTTCCGTGTCGTCCAG；

⑾肺炎克雷伯菌（简称：KP）

KP-F：biotin–CTGGATCTGACCCTGCAGTA、

KP-R：biotin–CCGTCGCCGTTCTGTTTC；

⑿鲍曼不动杆菌（简称：AB）

AB-F：biotin–TCGTGCTTCGACCGAGTAT、

AB-R：biotin–AACCAACACGCTTCACTTCC；

⒀铜绿假单胞菌（简称：PA）

PA-F：biotin–GGCGTGGGTGTGGAAGTC、

PA-R：biotin–GTGGCGATCTTGAACTTCTT；

⒁嗜麦芽窄食单胞菌（简称：SM）`

SM-F：biotin–CAGCCTGCGAAAAGTA、

SM-R：biotin–TTAAGCTTGCCACGAACAG。

上述的HCMV-F、AD-F、PIV1-F、PIV2-F、PIV3-F、RSV –F、SA-F、SP-F、MP-F、CP-F、KP-F、AB-F、PA-F、SM-F中的“-F”均指相应病原体的上游引物，而HCMV-R、AD- R、PIV1- R、PIV2- R、PIV3- R、RSV –R、SA- R、SP- R、MP- R、CP- R、KP- R、AB- R、PA- R、SM- R中的“-R”指的是相应病原体的下游引物。本发明对病原体的保守序列的选择非常关键，本申请人经过了无数次的试验，选择了病原体的最佳保守序列，并对各个保守序列的引物进行筛选，获得了适用于液体芯片法检测急性呼吸道疾病的病原体特异性引物。

与上述引物群配合使用的探针群，此探针群中的探针与引物群中的引物按照序号一一对应配合，探针群的核苷酸序列为：

①HCMV：5'NH2 C12-AAACAGCGTGACGATGACCTGC；

②AD：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTGCCTGAATAACAAGTTTAGAA；

③PIV1：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTGGAAAGACCAAATCTCATCG；

④PIV2：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTGCTGAACTGAGACTTGC；

⑤PIV3：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTGATCTCTCATACTTTTAACAT；

⑥RSV：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTTCAATTTCCTCACTTCTCCA ；

⑦SA：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTTGATTCGACAAACCATT；

⑧SP：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTAAGTGGAAGACCCCAGCAAT；

⑨MP：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTTAACAAACCACGTATGAAC；

⑩CP：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTAGACTTTAACTTGGCGAA；

⑾KP：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTAAAAACGAAGGCCGTGA；

⑿AB：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTACCATCCCACTTAAATAC；

⒀PA：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTGCTTCACCAACAACAT；

⒁SM：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTGAGGGGAGTGAAATAGAA。

与常见的探针序列（20bp左右）相比，本申请人设计的探针序列较短，多在14~18bp，使得探针与引物的配对特异性好，更适合液体芯片法检测急性呼吸道疾病的要求。

本发明提供用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群、探针群的应用方法，其应用步骤为：

（1）以上述引物群中的引物作为扩增引物、待测样品的DNA作为DNA模板，进行PCR扩增，获得扩增产物；

（2）上述探针群中的每一种探针分别与不同颜色标记的微球进行偶联，形成探针-微球偶联体，不同探针所对应的探针-微球偶连体的颜色各不相同，将所有的探针-微球偶连体混合，制成探针-微球偶联体混合液；

（3）将扩增产物、探针-微球偶联体混合液、Tris-Cl缓冲液（简称：TE）、藻红蛋白（简称：SA-PE）混合，进行杂交，获得杂交产物，采用液态悬浮芯片系统检测杂交产物的荧光值；

（4）结果判定：产生某种病原菌相应颜色的微球，

荧光值≥200时，为阳性；

荧光值＜150为阴性；

荧光值在150 ～ 200之间时，样品需重复试验，若荧光值≥150的样品判定为阳性，若荧光值＜150的样品判定为为阴性。

本发明的用于急性呼吸道传染性疾病病原体引物群、探针群的应用方法的作用原理为：若待测样品的DNA中含有与引物对应的病原体DNA时，经过PCR扩增后，可扩增出相应病原菌的核苷酸序列，即扩增产物中将含有此病原体的核苷酸序列；每一种病原体对应的核苷酸序列可与对应的探针进行碱基配对组合，从而与探针-微球偶联体进行组合，形成病原菌核苷酸序列-探针-微球的三联体结构，由于病原菌核苷酸序列的一端带有生物素标记，在杂交过程中，与藻红蛋白结合形成藻红蛋白荧光。检测装置中的红激光和绿激光检测反应混合物。如果病原体核酸被扩增，绿激光可激发藻红蛋白，并检测其荧光强度，而红激光激发微球来识别微球的颜色编码，进而来确定检测的病原体种类。

本发明在对引物群中的各个引物进行设计时，充分考虑到尽量使其在相同条件下各病原体的引物的Tm值相差最小（Tm值相差越小，各个病原体引物所对应的PCR扩增产物量相差越小，尽量避免假阳性的出现），再加上，本发明的探针群中的探针均为14~18bp，探针序列较常见的探针序列（20bp左右）更短，降低了探针与扩增产物杂交过程中非特异性结合的可能，提高检测结果的特异性，减少假阳性结果的出现，采用此引物群和探针群建立了可同时检测1种或多种病原体的急性呼吸道传染性疾病液态芯片方法，并且，具有很高的检测灵敏度，当荧光值 ≥200时可以检测到病原体DNA浓度为10³-10⁴/μl的呼吸道传染性疾病的病原体；另外，该方法还具有很高的特异性，其重复性好，可作为检测临床标本的手段，提高急性呼吸道传染病病原体的检测的阳性率，可在5小时内检测病原体，大大缩短检测周期，同时还具有高通量的优点，最多可同时检测14种病原体。

上述应用方法的步骤（1）中优选为采用多组PCR扩增体系，每组PCR扩增体系中含有1~6组引物，可排除引物之间相互影响，互相竞争资源，提高低丰度标本的检测。

再考虑到不同细菌、病毒核酸的不同，提取方式存在差异，可将细菌和病毒分开扩增，设计更合理。具体改进为，步骤（1）：将上述引物群中的金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎支原体、肺炎衣原体所对应的引物作为扩增引物、以待测样品的DNA作为DNA模板，进行PCR扩增体系A，收集扩增产物A，同时，将上述引物群中的呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒2型、巨细胞病毒、人副流感病毒1型、人副流感病毒3型所对应的引物作为扩增引物、以待测样品的DNA作为DNA模板，进行PCR扩增体系B，收集扩增产物B；步骤（3）为将扩增产物A、扩增产物B、探针-微球偶联体混合液、Tris-Cl缓冲液（简称：TE）、藻红蛋白（简称：SA-PE）混合，进行杂交，获得杂交产物，采用液态悬浮芯片系统检测杂交产物的荧光值；其他步骤不变。

步骤（1）可采用PCR扩增体系A、B、C三组PCR扩增体系，PCR扩增体系A优选为：

试剂终浓度/体积

dNTP 2mM

Bestar Taq Buffer 10×

Bestar Taq DNA Polymerase 2.5U/μl

SA-F 10μM~25μM

SA-R 10μM~25μM

AB-F 10μM~25μM

AB-R 10μM~25μM

KP-F 10μM~25μM

KP-R 10μM~25μM

CP-F 10μM~25μM

CP-R 10μM~25μM

PA-F 10μM~25μM

PA-R 10μM~25μM

待测样品的DNA 2~2.5μl ，

加入双蒸水，使总体积为20~25μL；

PCR扩增体系B优选为：

试剂终浓度/体积

dNTP 2mM

Bestar Taq Buffer 10×

Bestar Taq DNA Polymerase 2.5U/μl

SP-F 10μM~25μM

SP-R 10μM~25μM

SM-F 10μM~25μM

SM-R 10μM~25μM

MP-F 10μM~25μM

MP-R 10μM~25μM

待测样品的DNA 2~2.5μl，

加入双蒸水，使总体积为20~25μL；

PCR扩增体系C优选为：

试剂终浓度/体积

dNTP 2mM

Bestar Taq Buffer 10×

Bestar Taq DNA Polymerase 2.5U/μl

HCMV-F 10μM~25μM

HCMV-R 10μM~25μM

AD-F 10μM~25μM

AD-R 10μM~25μM

PIV1-F 10μM~25μM

PIV1-R 10μM~25μM

PIV2-F 10μM~25μM

PIV2-R 10μM~25μM

PIV3-F 10μM~25μM

PIV3-R 10μM~25μM

RSV-F 10μM~25μM

RSV-R 10μM~25μM

待测样品的DNA 2~2.5μl，

加入双蒸水，使总体积为20~25μL；

扩增体系的反应条件均为：95℃ DNA聚合酶热启动10min，1个循环；94℃变性30s；退火，退火温度为56~66℃，退火时间为30s ；72℃延伸30s，38个循环；72℃充分延伸10min。

本发明采用PCR扩增体系A、B、C均为多重PCR，可对多种病原体进行同时扩增，具有高效性、系统性、经济简便性的优点；并且，由于多重PCR反应很灵敏，本发明对反应条件和酶的选择进行优化，保证多重PCR高效进行，不会出现脱靶现象；另外，本专利的扩增体系分组首先考虑到不同细菌、病毒核酸的不同，将细菌和病毒分开扩增；其次，细菌部分的组合经过不同组合摸索，优选采用上述组合方式，排除了引物之间相互影响，互相竞争资源，提高低丰度标本的检测。

本发明的步骤（3）中的杂交过程中，杂交体系优选为：

试剂体积终浓度

扩增产物A 1μl /

扩增产物B 1μl /

扩增产物C 1μl /

探针-微球偶联体混合液 1.4μl 1.25×10⁷beads/ml

四甲基氯化铵 20.6μl 1.5×

SA-PE 0.3μl 1mg/mL

TE 74.7μl 1.0×；

杂交体系的反应条件为：将扩增产物、探针-微球偶联体混合液、去核酸水（简称：TE）混合；95℃变性5min；杂交，杂交温度为46℃～50℃，杂交时间为30-60min；然后，加入报告混合液藻红蛋白（简称：SA-PE），46℃反应15min，获得杂交产物。

此杂交体系中的四甲基氯化铵（简称：TMAC），可有效消除探针与目的同源序列杂交时A、T配对和C、G配对的强度差异。

一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的试剂盒，所述的试剂盒包括试剂组份1~4，其中，试剂组份1为权利要求1所述的用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群；试剂组份2为根据权利要求3所述的用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群和探针群的应用方法所制得的探针-微球偶联体混合液；试剂组份3为权利要求6所述的用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群和探针群的应用方法中的dNTP、Bestar Taq Buffer、Bestar Taq DNA Polymerase和双蒸水；试剂组份4为权利要求7所述的用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群和探针群的应用方法中的四甲基氯化铵、报告混合液藻红蛋白和去核酸水，从而实现本发明的商品化。

具体实施方式

实施例1

（一）一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群，由14种引物中的任意2组以上的引物组成，所述的引物的构建过程为：本发明人用Clustal Omega与Vector NTI Suite 8.0 软件对病原体已知特异基因的DNA序列进行比对，筛选出急性呼吸道传染性疾病的病原体特异性序列，其核苷酸序列如下所示：

①巨细胞病毒（简称HCMV）的特异序列：

AAGTTTGTGCCCCAACGGTACGGGCTGCAGGTAAAGTGCGATCAAGAACGCGATAACGCCGATCACAAACAGCGTGACGATGACCTGCCATCGACGGTGATTATGGCCGGCTAGACCCGTGACGCAGCTGCAGAGGCTAAAAAGCACGC；

②腺病毒(简称AD) 的特异序列：

CGCAGTGGTCTTACATGCACATCTCGGGCCAGGACGCCTCGGAGTACCTGAGCCCCGGGCTGGTGCAGTTCGCCCGCGCCACCGAGACGTACTTCAGCCTGAATAACAAGTTTAGAAACCCCACGGTGGCGCCTACGCACGACGTGACCACAGACCGGTCTCAGCGTTTGACGCTGCGGTTCATCCCCGTGGACCGCGAGGATACTGCGTACTCGTACAAGGCGCGGTTCACCCTAGCTGTGGGTGATAACCGTGTGCTAGACATGGCTTCCACGTACTTTGACATCCGCGGCGT；

③人副流感病毒1型（简称PIV1）的特异序列：

ccggaaat ttctcatacc tatgacatca acgacaacag gaaatcatgt tctgtaatagctgcaggaac aaggggttat cagttatgct ccttgcccac tgtaaatgag actacagattactcgagtga aggtatagaa gatttagtat ttgacatatt agatctcaag ggaaagaccaaatctcatcg atacaaaaat gaagatataa cttttgacca tcctttttct gcaatgtatccaagtgtagg aagtgggata aagattgaaa atacactcat cttcttaggg tacggtggcttaacaactcc gctccaagg；

④人副流感病毒2型(简称PIV2) 的特异序列：

ATGGAATCAATCGCAAAAGCTGTTCAGTCACTGCTATACCAGGAGGTTGTGTCTTGTATTGCTATGTAGCTACAAGATCTGAGAAAGAAGATTATGCCACAACTGATCTAGCTGAACTGAGACTTGCTTTCTATTATTATAATGATACCTTTATTGAAAGAGTCATATCTCTTCCAAATACAACAGGGCAATGGGCCACAATCAATCCTGCAGTTGGAAGCGGGATCTATCATC；

⑤人副流感病毒3型（简称PIV3）的特异序列：

ctcgaggttgt caggatatag gaaaatcata tcaagtctta cagataggga taataactgt aaactcagac ttggtacctg acttaaatcc caggatctct catactttta acataaatga caataggaag tcatgttctc tagcactcct aaatacagat gtatatcaac tgtgttcaac tcccaaag；

⑥呼吸道合胞病毒(简称RSV) 的特异序列：

CAAGTTGTTGAGGTTTATGAATATGCCCAAAAATTGGGTGGTGAAGCAGGATTCTACCATATATTGAACAACCCAAAAGCATCATTATTATCTTTGACTCAATTTCCTCACTTCTCCAGTGTAGTATTAGGCAATGCTGCTGGCCTAGGCATAATGGGAGAGTACAGAGGTACACCGAGGAATCAAGATCTATATGATGCAGCAAAGGCATATGCTGAACAACTCAAAGAAAATGGTGTGATTAACTACAGTGTACTAGACTTGACAGCAGAA ；

⑦金黄色葡萄球菌（简称SA）的特异序列：

GGAAGTTCGTGACTTATTAAGCGAATATGACTTCCCAGGTGACGATGTACCTGTAATCGCTGGTTCAGCATTAAAAGCTTTAGAAGGCGATGCTCAATACGAAGAAAAAATCTTAGAATTAATGGAAGCTGTAGATACTTACATTCCAACTCCAGAACGTGATTCTGACAAACCATTCATGATGCCAGTTGAGGACGTATTCTCAATCACTGGTCGTGGTACTGTTGCTACAGGCCGTGTTGAACGTGGTCAAATCAAAGTTGGTGAAGAAGTTGAAATCATCGGTTTACATGACACATCTAAAACAACTGU；

⑧肺炎链球菌（简称SP）的特异序列：

GTGATATTTCTGTAACAGCTACCAACGACAGTCGCCTCTATCCTGGAGCACTTCTCGTAGTGGATGAGACCTTGTTAGAGAATAATCCCACTCTTCTTGCGGTCGATCGTGCTCCGATGACTTATAGTATTGATTTGCCTGGTTTGGCAAGTAGCGATAGCTTTCTCCAAGTGGAAGACCCCAGCAATTCAAGTGTTCGCGGAGCGGTAAACGATTTGTTGGCTAAGTGGCATCAAGATTATGGTCAGGTCAATAATGTCCCAGCTAGAATGCAGTATGAAAAAATCACGGCTCACAGCATGGAACAACTCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGACTTTGAAAAGACAGGGAATTCTC；

⑨肺炎支原体(简称MP) 的特异序列：

TGCCATCTACCCGCGCTTAACCCCGTGAACGTATCGTAACACGAGCTTTTCCTCCCTCCCCCTCACGGGTGAAAATCCCGGGGCGTGGGCCTTAGTGCGCGACAACAGCGCTAAGGGCATCACTGCCGGCAGTGGCAGTCAACAAACCACGTATGAACCCACCCGAACCGAAGCGGCTTTGACCGCATCAACCACCTTTGCGTTACGCCGGTATGACCTCGCCGGGCGCGCCTTATACGACCTCGATTTTTCGAAGTTAAACCCGCAAACGCCCACGCGCGACCAAACCGGGCAGATCAC；

⑩肺炎衣原体(简称CP) 的特异序列：

TTTATTTCCGTGTCGTCCAGCCATTTTATCTCCAACTTGAAGTTTTCTCTTAGAGGCAACGTAGACTTTAACTTGGCGAATGACACCATGATCTAAATCTGCATCTCCCTCACGAATATGCTCAACT；

⑾肺炎克雷伯菌(简称KP) 的特异序列：

CTGGATCTGACCCTGCAGTACCAGGGTAAAAACGAAGGCCGTGAAGCGAAGAAACAGAACGGCGACGG；

⑿鲍曼不动杆菌(简称AB) 的特异序列：

AACCAACACGCTTCACTTCCTTAGACATGAGCTCAAGTCCAATACGACGAGCTAAATCTTGATAAACTGGAATAGCGGAAGCTTTCATGGCATCGCCTAGGGTCATGTCCTTTTCCCATTCTGGGAATAACCTTTTTTTACCATCCCACTTAAATACTTCTGTGGTGGTTGCCTTATGGTGCTCAAGGCCGATCAAAGCATTAAGCATTTTGAAGGTCGAAGCAGGTACATACTCGGTCGAAGCACGA；

⒀铜绿假单胞菌(简称PA)的特异序列：

GGCGTGGGTGTGGAAGTCGCCTTGCAGTGGAACGACAGCTTCAACGAGAACCTGCTCTGCTTCACCAACAACATCCCGCAGCGTGACGGCGGTACCCACCTGGCCGGTTTCCGTTCGGCGCTGACGCGTAACCTGAACAACTACATCGAGGCCGAAGGCCTGGCGAAGAAGTTCAAGATCGCCAC；

⒁嗜麦芽窄食单胞菌（简称SM）的特异序列：

CAGCCTGCGAAAAGTATCGGGGAGCTGGCAACAAGCTTTGATCCGGTAATGTCCGAATGGGGAAACCCACCCGCTTGCGGGTATCCTGCAGTGAATACATAGCTGCTGGAAGCGAACCTGGTGAACTGAAATATCTAAGTAACCAGAGGAAAAGAAATCAACCGAGATTCCGTAAGTAGCGACGAGCGAACGCGGACTAGCCCTTAAGCTGATTTGGTTCTAGGAAAACACTCTGGAAAGAGTGGCCATAGAAGGTGATAGCCCTGTATCTGAAAGGGCCATTTCAGTGAAGACGAGTAGGGCGGGGCACGTGAAACCCTGTCTGAACATGGGGGGACCATCCTCCAAGGCTAAATACTACTGACCGACCGATAGTGAACCAGTACCGTGAGGGAAAGGCGAAAAGAACCCCGGAGAGGGGAGTGAAATAGAACCTGAAACCGTGTGCGTACAAGCAGTAGGAGCTCCGCAAGGAGTGACTGCGTACCTTTTGTATAATGGGTCAGCGACTTACTGTTCGTGGCAAGCTTAA；

再根据上述特异性序列，使用Primer 5软件设计得到与上述特异性序列的序号一一对应的14对用于检测急性呼吸道传染性疾病的特异性引物，病原体特异性引物5’端标记生物素基因（简称：Biotin）。引物核苷酸序列为：

①人巨细胞病毒（简称：HCMV）

HCMV-F：biotin（生物素）–AAGTTTGTGCCCCAACGGTA、

HCMV-R：biotin –GCGTGCTTTTTAGCCTCTGC；

②腺病毒（简称：AD）

AD-F：biotin –CGCAGTGGTCTTACATGCACA、

AD-R：biotin –ACGCCGCGGATGTCAAAGT；

③副流感病毒1型（简称：PIV1）

PIV1-F：biotin -CCTTGGAGCGGAGTTGTTAAG、

PIV1-R：biotin –CCGGTAATTTCTCATACCTATG；

④副流感病毒2型（简称：PIV2）

PIV2-F：biotin –ATGGAATCAATCGCAAAAGC、

PIV2-R：biotin –GATGATAGATCCCGCTTCCA；

⑤副流感病毒3型（简称：PIV3）

PIV3-F：biotin –CTCGAGGTTGTCAGGATATAG、

PIV3-R：biotin –CTTTGGGAGTTGAACACAGTT；

⑥呼吸道合胞病毒（简称：RSV）

RSV -F：biotin –CAAGTTGTTGAGGTTTATGAATATGC、

RSV -R：biotin –TTCTGCTGTCAAGTCTAGTACACTGTAGT；

⑦金黄色葡萄球菌（简称：SA）

SA-F：biotin –ATGGAAGTTCGTGACTTATTAAGC、

SA-R：biotin –AACAGTTGTTTTAGATGTGTCATGT；

⑧肺炎链球菌（简称：SP）

SP-F：biotin – GTGATATTTCTGTAACAGCTACC、

SP-R：biotin –GAGAATTCCCTGTCTTTTCAAA；

⑨肺炎支原体（简称：MP）

MP-F：biotin– TGCCATCTACCCGCGCTTA、

MP-R：biotin–GTGATCTGCCCGGTTTGGTC；

⑩肺炎衣原体（简称：CP）

CP-F：biotin–AGTTGAGCATATTCGTGAGG、

CP-R：biotin–TTTATTTCCGTGTCGTCCAG；

⑾肺炎克雷伯菌（简称：KP）

KP-F：biotin–CTGGATCTGACCCTGCAGTA、

KP-R：biotin–CCGTCGCCGTTCTGTTTC；

⑿鲍曼不动杆菌（简称：AB）

AB-F：biotin–TCGTGCTTCGACCGAGTAT、

AB-R：biotin–AACCAACACGCTTCACTTCC；

⒀铜绿假单胞菌（简称：PA）

PA-F：biotin–GGCGTGGGTGTGGAAGTC、

PA-R：biotin–GTGGCGATCTTGAACTTCTT；

⒁嗜麦芽窄食单胞菌（简称：SM）`

SM-F：biotin–CAGCCTGCGAAAAGTA、

SM-R：biotin–TTAAGCTTGCCACGAACAG。

（二）与本申请的引物群按照序号一一对应配合使用的探针群，探针群中的探针的设计过程为：根据上述特异性序列，本发明避开序列的突变点，使用Primer 5软件筛选设计得到14对与上述急性呼吸道传染性疾病的病原体特异性引物配合使用的探针，探针的5’端均标记NH₂。探针的核苷酸序列为：

①HCMV：5'NH2 C12-AAACAGCGTGACGATGACCTGC；

②AD：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTGCCTGAATAACAAGTTTAGAA；

③PIV1： 5'NH2 C6-TTTTTTTTTTGGAAAGACCAAATCTCATCG；

④PIV2：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTGCTGAACTGAGACTTGC；

⑤PIV3：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTGATCTCTCATACTTTTAACAT；

⑥RSV：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTTCAATTTCCTCACTTCTCCA；

⑦SA：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTTGATTCGACAAACCATT；

⑧SP：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTAAGTGGAAGACCCCAGCAAT；

⑨MP：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTTAACAAACCACGTATGAAC；

⑩CP：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTAGACTTTAACTTGGCGAA；

⑾KP：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTAAAAACGAAGGCCGTGA；

⑿AB：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTACCATCCCACTTAAATAC；

⒀PA：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTGCTTCACCAACAACAT；

⒁SM：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTGAGGGGAGTGAAATAGAA。

（三）本发明的用于急性呼吸道传染性疾病病原体的引物群、探针群的应用方法，在具体实施过程中，引物群由14种引物组成，探针群由与引物群的14种引物一一对应的14种探针组成，其应用步骤为：

（1）以上述引物群中的引物作为扩增引物、待测样品的DNA作为DNA模板，形成3组PCR扩增体系（PCR扩增体系A、B、C），进行PCR扩增；其中，PCR扩增体系A的组分为：

试剂体积终浓度

dNTP 2μl 2mM

Bestar Taq Buffer 4.5μl 10×

Bestar Taq DNA Polymerase 0.8μl 2.5U/μl

双蒸水 8.7μl /

SA-F 0.2μl 10μM

SA-R 0.2μl 10μM

AB-F 0.2μl 10μM

AB-R 0.2μl 10μM

KP-F 0.2μl 10μM

KP-R 0.2μl 10μM

CP-F 0.2μl 10μM

CP-R 0.2μl 10μM

PA-F 0.2μl 10μM

PA-R 0.2μl 10μM

待测样品的DNA 2μl / ；

PCR扩增体系B的组分为：

试剂体积终浓度

dNTP 2μl 2mM

Bestar Taq Buffer 4.5μl 10×

Bestar Taq DNA Polymerase 0.8μl 2.5U/μl

双蒸水 9.5μl /

SP-F 0.2μl 10μM

SP-R 0.2μl 10μM

SM-F 0.2μl 10μM

SM-R 0.2μl 10μM

MP-F 0.2μl 10μM

MP-R 0.2μl 10μM

待测样品的DNA 2μl / ；

PCR扩增体系C的组成为：

试剂体积终浓度

dNTP 2μl 2mM

Bestar Taq Buffer 4.5μl 10×

Bestar Taq DNA Polymerase 0.8μl 2.5U/μl

双蒸水 8.3μl /

HCMV-F 0.2μl 10μM

HCMV-R 0.2μl 10μM

AD-F 0.2μl 10μM

AD-R 0.2μl 10μM

PIV1-F 0.2μl 10μM

PIV1-R 0.2μl 10μM

PIV2-F 0.2μl 10μM

PIV2-R 0.2μl 10μM

PIV3-F 0.2μl 10μM

PIV3-R 0.2μl 10μM

RSV-F 0.2μl 10μM

RSV-R 0.2μl 10μM

待测样品的DNA 2μl / ；

PCR扩增体系A、B、C的反应条件均为：95℃ DNA聚合酶（Bestar Taq DNA Polymerase）热启动10min，1个循环；94℃变性30s；退火，退火温度为58℃退火30s，72℃延伸30s，38个循环；72℃充分延伸10min；

（3）将扩增产物、探针-微球偶联体混合液、去核酸水（简称：TE）混合，95℃变性5min，44℃～50℃杂交30-60min，加入报告混合液藻红蛋白（简称：SA-PE） 46℃反应15min，其中，此杂交体系具体为：

试剂体积终浓度

扩增产物A 1μl /

扩增产物B 1μl /

扩增产物C 1μl /

各探针包被微球 1.4μl 1.25×10⁷beads/ml

TMAC 20.6μl 1.5×

SA-PE 0.3μl 1mg/mL

Tris-Cl缓冲液 74.7μl 1.0×，

杂交体系的反应条件为：将扩增产物A、扩增产物B、扩增产物C、探针-微球偶联体混合液、Tris-Cl缓冲液混合；95℃变性5min；杂交，杂交温度为46℃，杂交时间为60min；然后，加入藻红蛋白，46℃反应15min，获得杂交产物，并采用液态悬浮芯片系统检测杂交产物的荧光值。同时设立无模板阴性对照，根据扩增曲线判定结果；

（4）结果判定：可产生某种病原菌相应颜色的微球，

荧光值≥200时，为阳性；

荧光值＜150为阴性；

（四）一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的试剂盒，所述的试剂盒包括试剂组份1~4，其中，试剂组份1为实施例1的用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群；试剂组份2为实施例1的用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群和探针群的应用方法所制得的探针-微球偶联体混合液；试剂组份3为实施例1所述的用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群和探针群的应用方法中的dNTP、Bestar Taq Buffer、Bestar Taq DNA Polymerase和双蒸水；试剂组份4为实施例1所述的用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群和探针群的应用方法中的四甲基氯化铵、报告混合液藻红蛋白和去核酸水，从而实现本发明的商品化。

现对本发明的用于急性呼吸道传染性疾病病原体的引物群、探针群的应用方法的特性进行评价。

（1）灵敏度评价

本实验所用的样品DNA均经测序验证，其样品DNA提取液的来源为：

表1

人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus HCMV）上海瀚宇构建重组质粒

腺病毒(Adenovirus AD) 上海瀚宇构建重组质粒

副流感病毒1型(Parainfluenza virus Type1 PIV1) 上海瀚宇构建重组质粒

副流感病毒2型(Parainfluenza virus Type2 PIV2) 上海瀚宇构建重组质粒

副流感病毒3型(Parainfluenza virus Type3 PIV3) 上海瀚宇构建重组质粒

呼吸道合胞病毒（ Respiratory syncytial virus RSV）上海瀚宇构建重组质粒

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae MP) 临床分离株抽提

肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae CP) 临床分离株抽提

金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus SA) 临床分离株抽提

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae SP) 临床分离株抽提

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoiae KP) 临床分离株抽提

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa PA) 临床分离株抽提

嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia SM) 临床分离株抽提

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii AB 临床分离株抽提

分别提供上述14种样品DNA提取液的10⁰/μL、10¹/μL、10²/μL、10³/μL、10⁴/μL 5个稀释度，并以5个稀释度的病原体DNA提取液（即待测样品DNA）作为DNA模板，按照本申请的检测方法，进行检测，读取荧光值，确定急性呼吸道传染病液态芯片检测方法检测各种病原体的灵敏度。现将各种病原菌的荧光值读取数据列出如下表2：

表2

由表2可知，急性呼吸道传染性疾病病原体浓度均在10³/μL～1×10⁴/μL可检测到荧光值≥200（即最低检测限为1.67×10⁵cfu/ml～1.67×10⁶cfu/ml），部分病原体如PA（铜绿假单胞菌）甚至可检出10⁰μL浓度（即最低检测限为1.67×10²cfu/ml）。其最低检测限均低于2008年第7版《内科学》中所公布的痰定量培养分离的致病菌或条件致病菌可认定为急性呼吸道疾病的最低检测限：10⁷cfu/ml。因此，本发明的最低检测限较低，灵敏度高，满足检测急性呼吸道疾病的需求。

(2)特异度评价，又称真阴性率评价，即非急性呼吸道传染性的病原体，按照该检测方法的标准被正确地判为非本次感染的病原体百分比。从表2可看出，非本次致病菌，荧光值在150以下，检测都为阴性，特异度为100％。

（3）重复性好，当病原菌浓度为1×10⁴/μL时，对每种病原菌的检测重复三次，其结果如下：

表3

由表3可看出，变异系数为6.3%~34.7%，对于多种病原菌同步检测来说，变异系数较小，重复性较好。

（4）模拟标本检测：

本申请人提供模拟标本1~4，其中，模拟标本1~4的组成分别为：

表4

现列出模拟标本1~4的检测结果：

表5

由表4和表5可知，本发明可同时进行多个病原体的检测，且，检测结果的特异性高。

实施例2

实施例2与实施例1不同的是：

（一）一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群，由14种引物中的任意1组引物组成，14种引物的核酸序列与实施例1相同。

（二）与上述引物群配合使用的探针群，此探针群的核苷酸序列与实施例1相同。

（三）本发明的用于急性呼吸道传染性疾病病原体的引物群、探针群的应用方法，在具体实施过程中，引物群均由SA对应的一组引物组成，探针群也均由SA对应的一种探针组成，其应用步骤为：

（1）以上述引物群中的引物作为扩增引物、待测样品的DNA作为DNA模板，形成1组PCR扩增体系，其中，PCR扩增体系的组分为：

试剂体积终浓度

dNTP 2μl 2mM

Bestar Taq Buffer 4.5μl 10×

Bestar Taq DNA Polymerase 0.8μl 2.5U/μl

双蒸水 10.3μl /

SA-F 0.2μl 10μM

SA-R 0.2μl 10μM

待测样品的DNA 2μl / ；

（3）将扩增产物混合液、探针-微球偶联体混合液、去核酸水（简称：TE）混合，95℃变性5min，44℃～50℃杂交30-60min，加入报告混合液藻红蛋白（简称：SA-PE） 46℃反应15min，其中，此杂交体系具体为：

试剂体积终浓度

扩增体系产物 1μl /

各探针包被微球 1.4μl 1.25×10⁷beads/ml

TMAC 20.6μl 1.5×

SA-PE 0.3μl 1mg/mL

TE 76.7μl 1.0×；

其他条件均与实施例1相同。

分别以HCMV 、AD 、SA、PIV1、Sp、Kp的DNA溶液作为待测样品DNA，按照实施例1的检测方法，进行检测，读取荧光值依次为：47、51、594、56、78、41，即检测SA呈阳性，而其他病原体均为阴性，特异性好。

（四）一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的试剂盒，所述的试剂盒包括试剂组份1~4，其中，试剂组份1为实施例2的用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群；试剂组份2为实施例2的用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群和探针群的应用方法所制得的探针-微球偶联体混合液；试剂组份3为实施例2所述的用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群和探针群的应用方法中的dNTP、Bestar Taq Buffer、Bestar Taq DNA Polymerase和双蒸水；试剂组份4为实施例2所述的用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群和探针群的应用方法中的四甲基氯化铵、报告混合液藻红蛋白和去核酸水，从而实现本发明的商品化。

本申请人经过了无数次的试验和不断的摸索，才获得了本申请的病原菌特异性引物和探针，进而，成功建立了可同时检测多种病原菌的快速检测方法。为了体现本发明的技术方案的来之不易，本申请人截取了探索过程中的部分试验数据。

首先，本申请人提供了除本发明之外的其他引物核苷酸序列，例如：

（1） 针对AB的引物序列：

引物序列：AB-F：TCTTGGTGGTCACTTGAAGC、

AB-R：ACTCTTGTGGTTGTGGAGCA，

以此引物进行AB DNA序列的扩增，理论上，可得到的目的基因为86bp的基因片段，但是，实际的电泳结果为：除了出现86bp左右的特异条带外，还出现了500bp左右的非特异条带，扩增效果不理想。

（2）针对SA的引物序列：

①引物序列：Sa-F1：AGCTGCACCCATGCCGACAC、

Sa-R1：GAATGTGAATGGTGGCGCTATTGCT；

②探针序列：Sa-F2：ATCATTATTGTAGGTGTATTGC、

Sa-R2：CAGGCGTATTCGGTTTC；

以上述引物序列①进行SA 的DNA序列的扩增，理论上，可得到的目的基因为151bp的基因片段，但是，实际的电泳结果为：除了出现151bp左右的特异条带外，还出现了250bp左右的非特异条带，扩增效果不理想；以上述引物序列②进行SA 的DNA序列的扩增，理论上，可得到的目的基因为223bp的基因片段，但是，实际的电泳结果为：未出现223bp的特异条带或者特异性条带太浅，扩增效果不理想。

其次，本申请人提供了在使用本发明的引物序列的前提下，采用除本发明之外的其他探针核苷酸序列，例如：

（1）针对HCMV的探针序列：

①探针序列：5'NH2C6-TTTTTTTTTTAAACAGCGTGACGATGACC、

②探针序列：5'NH2C6- TTTTTTTTTTCATCGACGGTGATTATG，试验结果显示：采用上述探针序列时，仅可检测出大于10⁴/ul的HCMV DNA标本（即最低检测限为1.67×10⁶cfu/ml），不符合检测急性呼吸道疾病的需求。

（2）针对AD的探针序列：

①探针序列：5'NH2C6-TTTTTTTTTTACGACGTGACCACAGACC、

②探针序列：5'NH2C6-TTTTTTTTTTTTTAGAAACCCCACG、

③探针序列：5'NH2C6-TTTTTTTTTTTCTCAGCGTTTGACG、

④探针序列：5'NH2C6-TTTTTTTTTTTTTGACGCTGCGGTTC，试验结果显示：采用上述探针序列时，仅可检测出大于10⁴/ul的HCMV DNA标本（即最低检测限为1.67×10⁶cfu/ml），不符合检测急性呼吸道疾病的需求。

（3）针对PA的探针序列：

①探针序列：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTAACAACATCCCGCAG、

②探针序列：5'NH2 C6-TTTTTTTTTTGCGTAACCTGAACAACTA、

③探针序列：5'NH2 C6- TTTTTTTTTTAACCTGCTCTGCTTCA，试验结果显示：采用上述探针序列①和③时，仅可检测出大于10⁴/ul的HCMV DNA标本（即最低检测限为1.67×10⁶cfu/ml），不符合检测急性呼吸道疾病的需求，采用上述探针序列②时，虽然，该探针在检测10⁴/ul浓度的标本时，荧光值为848，但，其他病原体检测时，会出现假阳性信号，特异度差，不符合要求。

当然，本发明的引物群的引物组合方式不限于为实施例2的1组引物或实施例1的14组引物的组合方式，同时，探针群的探针组合方式也不限于实施例2的1种探针或实施例1的14种探针的组合方式，但是，利用此引物群和探针群建立的应用方法相同，均可实现急性呼吸道传染性疾病病原体的检测。随着引物群中探针组数以及探针群中探针种类的增加，相应的应用方法可实现同时检测急性呼吸道传染性疾病的病原体种类也增加，其中，实施例1的应用方法可实现同时检测14种急性呼吸道传染性疾病病原体的技术效果，其检测的病原体种类最多，技术方案最为复杂，要想实现高特异性也最为困难。在实施例1和2的基础上对引物群的引物组合方式以及探针群的探针组合方式进行调整均可以实现对急性呼吸道传染性疾病的检测，且，检测结果与实施例1相仿。

另外，本发明的PCR扩增体系也可仅进行一种PCR扩增体系，此时，PCR扩增体系的组成为：

试剂体积终浓度

dNTP 2μl 2mM

Bestar Taq Buffer 4.5μl 10×

Bestar Taq DNA Polymerase 0.8μl 2.5U/μl

双蒸水 7.5μl /

SA-F 0.2μl 10μM

SA-R 0.2μl 10μM

AB-F 0.2μl 10μM

AB-R 0.2μl 10μM

KP-F 0.2μl 10μM

KP-R 0.2μl 10μM

CP-F 0.2μl 10μM

CP-R 0.2μl 10μM

PA-F 0.2μl 10μM

PA-R 0.2μl 10μM

SP-F 0.2μl 10μM

SP-R 0.2μl 10μM

SM-F 0.2μl 10μM

SM-R 0.2μl 10μM

MP-F 0.2μl 10μM

MP-R 0.2μl 10μM

但是，由于该PCR扩增体系中的引物种类过多，存在资源竞争的问题，使得PCR扩增效率变低，另外，PCR扩增体系也可进行4个或4个以上的 PCR扩增体系，但是，PCR扩增体系越多，资源浪费越大，成本就越高。因此，本发明的PCR扩增体系采用3种PCR扩增体系为最优的选择，当然，每种PCR扩增体系的引物数量均衡分配为最佳，但是，引物种类可随机组合，对实验结果基本无影响。

另外，PCR扩增体系的反应条件以及参数也不限于上述实施例中的具体数据，例如，PCR扩增体系中引物的终浓度只要保持在10~25μM范围内即可，但是，为10μM时即可满足检测需求，又可尽量节约资源；在扩增体系的各个组分的终浓度保持在本发明的范围值内的前提下，只要扩增体系的总体积保持在20~25μL范围内即可。

因此，本发明的引物选择、探针选择均是经过无数次试验才得到的，并配合优化后的扩增条件及参数、杂交条件及参数，才得以实现同时、快速检测多种急性呼吸道传染性疾病病原体的目的，且，该检测方法灵敏度高、特异性好、重复性好。

以上实施例仅为本发明的较佳实施例，不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省立医院；福建省疾病预防控制中心；上海透景生命科技有限公司

<120> 用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群、探针群及其应用方法和试剂盒

<130> 2014

<160> 42

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagtttgtgc cccaacggta 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcgtgctttt tagcctctgc 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcagtggtc ttacatgcac a 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgccgcgga tgtcaaagt 19

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccttggagcg gagttgttaa g 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccggtaattt ctcataccta tg 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggaatcaa tcgcaaaagc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gatgatagat cccgcttcca 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctcgaggttg tcaggatata g 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctttgggagt tgaacacagt t 21

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

caagttgttg aggtttatga atatgc 26

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttctgctgtc aagtctagta cactgtagt 29

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atggaagttc gtgacttatt aagc 24

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aacagttgtt ttagatgtgt catgt 25

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gtgatatttc tgtaacagct acc 23

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gagaattccc tgtcttttca aa 22

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tgccatctac ccgcgctta 19

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gtgatctgcc cggtttggtc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

agttgagcat attcgtgagg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tttatttccg tgtcgtccag 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ctggatctga ccctgcagta 20

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ccgtcgccgt tctgtttc 18

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tcgtgcttcg accgagtat 19

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aaccaacacg cttcacttcc 20

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ggcgtgggtg tggaagtc 18

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gtggcgatct tgaacttctt 20

<210> 27

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cagcctgcga aaagta 16

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ttaagcttgc cacgaacag 19

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

aaacagcgtg acgatgacct gc 22

<210> 30

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tttttttttt gcctgaataa caagtttaga a 31

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

tttttttttt ggaaagacca aatctcatcg 30

<210> 32

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

tttttttttt gctgaactga gacttgc 27

<210> 33

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tttttttttt gatctctcat acttttaaca t 31

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tttttttttt tcaatttcct cacttctcca 30

<210> 35

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

tttttttttt tgattcgaca aaccatt 27

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

tttttttttt aagtggaaga ccccagcaat 30

<210> 37

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

tttttttttt taacaaacca cgtatgaac 29

<210> 38

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

tttttttttt agactttaac ttggcgaa 28

<210> 39

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

tttttttttt aaaaacgaag gccgtga 27

<210> 40

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

tttttttttt accatcccac ttaaatac 28

<210> 41

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

tttttttttt gcttcaccaa caacat 26

<210> 42

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

tttttttttt gaggggagtg aaatagaa 28

Claims

1.一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群，由14组引物中的任意1组或者2组以上的引物组成，所述的14组引物的核苷酸序列分别为：

①人巨细胞病毒（简称：HCMV）

HCMV-F：biotin（生物素）–AAGTTTGTGCCCCAACGGTA、

HCMV-R：biotin –GCGTGCTTTTTAGCCTCTGC；

②腺病毒（简称：AD）

AD-F：biotin –CGCAGTGGTCTTACATGCACA、

AD-R：biotin –ACGCCGCGGATGTCAAAGT；

③副流感病毒1型（简称：PIV1）

PIV1-F：biotin -CCTTGGAGCGGAGTTGTTAAG、

PIV1-R：biotin –CCGGTAATTTCTCATACCTATG；

④副流感病毒2型（简称：PIV2）

PIV2-F：biotin –ATGGAATCAATCGCAAAAGC、

PIV2-R：biotin –GATGATAGATCCCGCTTCCA；

⑤副流感病毒3型（简称：PIV3）

PIV3-F：biotin –CTCGAGGTTGTCAGGATATAG、

PIV3-R：biotin –CTTTGGGAGTTGAACACAGTT；

⑥呼吸道合胞病毒（简称：RSV）

RSV -F：biotin –CAAGTTGTTGAGGTTTATGAATATGC、

RSV -R：biotin –TTCTGCTGTCAAGTCTAGTACACTGTAGT；

⑦金黄色葡萄球菌（简称：SA）

SA-F：biotin –ATGGAAGTTCGTGACTTATTAAGC、

SA-R：biotin –AACAGTTGTTTTAGATGTGTCATGT；

⑧肺炎链球菌（简称：SP）

SP-F：biotin – GTGATATTTCTGTAACAGCTACC、

SP-R：biotin –GAGAATTCCCTGTCTTTTCAAA；

⑨肺炎支原体（简称：MP）

MP-F：biotin– TGCCATCTACCCGCGCTTA、

MP-R：biotin–GTGATCTGCCCGGTTTGGTC；

⑩肺炎衣原体（简称：CP）

CP-F：biotin–AGTTGAGCATATTCGTGAGG、

CP-R：biotin–TTTATTTCCGTGTCGTCCAG；

⑾肺炎克雷伯菌（简称：KP）

KP-F：biotin–CTGGATCTGACCCTGCAGTA、

KP-R：biotin–CCGTCGCCGTTCTGTTTC；

⑿鲍曼不动杆菌（简称：AB）

AB-F：biotin–TCGTGCTTCGACCGAGTAT、

AB-R：biotin–AACCAACACGCTTCACTTCC；

⒀铜绿假单胞菌（简称：PA）

PA-F：biotin–GGCGTGGGTGTGGAAGTC、

PA-R：biotin–GTGGCGATCTTGAACTTCTT；

⒁嗜麦芽窄食单胞菌（简称：SM）`

SM-F：biotin–CAGCCTGCGAAAAGTA、

SM-R：biotin–TTAAGCTTGCCACGAACAG。

2.与权利要求1所述的一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群配合使用的探针群，其特征在于：所述的探针群的探针与权利要求1中的引物按照序号一一配合使用，探针的核苷酸序列为：

①HCMV 5'NH2 C12-AAACAGCGTGACGATGACCTGC

②AD 5'NH2 C6-TTTTTTTTTTGCCTGAATAACAAGTTTAGAA

③PIV1 5'NH2 C6-TTTTTTTTTTGGAAAGACCAAATCTCATCG

④PIV2 5'NH2 C6-TTTTTTTTTTGCTGAACTGAGACTTGC

⑤PIV3 5'NH2 C6-TTTTTTTTTTGATCTCTCATACTTTTAACAT

⑥RSV 5'NH2 C6-TTTTTTTTTTTCAATTTCCTCACTTCTCCA

⑦Sa 5'NH2 C6-TTTTTTTTTTTGATTCGACAAACCATT

⑧Sp 5'NH2 C6-TTTTTTTTTTAAGTGGAAGACCCCAGCAAT

⑨Mp 5'NH2 C6-TTTTTTTTTTTAACAAACCACGTATGAAC

⑩Cp 5'NH2 C6-TTTTTTTTTTAGACTTTAACTTGGCGAA

⑾Kp 5'NH2 C6-TTTTTTTTTTAAAAACGAAGGCCGTGA

⑿Ab 5'NH2 C6-TTTTTTTTTTACCATCCCACTTAAATAC

⒀Pa 5'NH2 C6-TTTTTTTTTTGCTTCACCAACAACAT

⒁Sm 5'NH2 C6-TTTTTTTTTTGAGGGGAGTGAAATAGAA。

3.一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物、探针的应用方法，其应用步骤为：

（1）以权利要求1所述的引物群中的引物作为扩增引物、待测样品的DNA作为DNA模板，进行PCR扩增，获得扩增产物；

（2）以权利要求2所述的探针群中的每一种探针分别与不同颜色标记的微球进行偶联，形成探针-微球偶联体，不同探针所对应的探针-微球偶连体的颜色各不相同，将所有的探针-微球偶连体混合，制成探针-微球偶联体混合液；

（4）结果判定：产生某种病原菌相应颜色的微球，

荧光值≥200时，为阳性；

荧光值＜150为阴性；

4.根据权利要求3所述的一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群、探针群的应用方法，其特征在于：步骤（1）采用多组PCR扩增体系，每组PCR扩增体系中含有1~6组引物。

5.根据权利要求4所述的一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群、探针群的应用方法，其特征在于，步骤（1）：将权利要求1所述的引物群中的金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎支原体、肺炎衣原体所对应的引物作为扩增引物、以待测样品的DNA作为DNA模板，进行PCR扩增体系A，收集扩增产物A，同时，将权利要求1所述的引物群中的呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒2型、巨细胞病毒、人副流感病毒1型、人副流感病毒3型所对应的引物作为扩增引物、以待测样品的DNA作为DNA模板，进行PCR扩增体系B，收集扩增产物B；步骤（3）为将扩增产物A、扩增产物B、探针-微球偶联体混合液、Tris-Cl缓冲液（简称：TE）、藻红蛋白（简称：SA-PE）混合，进行杂交，获得杂交产物，采用液态悬浮芯片系统检测杂交产物的荧光值；其他步骤不变。

6.根据权利要求5所述的一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群、探针群的应用方法，其特征在于：步骤（1）采用PCR扩增体系A、B、C三组PCR扩增体系，PCR扩增体系A优选为：

试剂终浓度/体积

dNTP 2mM

Bestar Taq Buffer 10×

Bestar Taq DNA Polymerase 2.5U/μl

SA-F 10μM~25μM

SA-R 10μM~25μM

AB-F 10μM~25μM

AB-R 10μM~25μM

KP-F 10μM~25μM

KP-R 10μM~25μM

CP-F 10μM~25μM

CP-R 10μM~25μM

PA-F 10μM~25μM

PA-R 10μM~25μM

待测样品的DNA 2~2.5μl ，

加入双蒸水，使总体积为20~25μL；

PCR扩增体系B优选为：

试剂终浓度/体积

dNTP 2mM

Bestar Taq Buffer 10×

Bestar Taq DNA Polymerase 2.5U/μl

SP-F 10μM~25μM

SP-R 10μM~25μM

SM-F 10μM~25μM

SM-R 10μM~25μM

MP-F 10μM~25μM

MP-R 10μM~25μM

待测样品的DNA 2~2.5μl，

加入双蒸水，使总体积为20~25μL；

PCR扩增体系C优选为：

试剂终浓度/体积

dNTP 2mM

Bestar Taq Buffer 10×

Bestar Taq DNA Polymerase 2.5U/μl

HCMV-F 10μM~25μM

HCMV-R 10μM~25μM

AD-F 10μM~25μM

AD-R 10μM~25μM

PIV1-F 10μM~25μM

PIV1-R 10μM~25μM

PIV2-F 10μM~25μM

PIV2-R 10μM~25μM

PIV3-F 10μM~25μM

PIV3-R 10μM~25μM

RSV-F 10μM~25μM

RSV-R 10μM~25μM

待测样品的DNA 2~2.5μl，

加入双蒸水，使总体积为20~25μL；

7.根据权利要求3所述的一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群、探针群的应用方法，其特征在于：本发明的步骤（3）中的杂交过程中，杂交体系为：

试剂体积终浓度

扩增产物A 1μl /

扩增产物B 1μl /

扩增产物C 1μl /

探针-微球偶联体混合液 1.4μl 1.25×10⁷beads/ml

四甲基氯化铵 20.6μl 1.5×

SA-PE 0.3μl 1mg/mL

TE 74.7μl 1.0×；

杂交体系的反应条件为：将扩增产物、探针-微球偶联体混合液、Tris-Cl缓冲液混合；95℃变性5min；杂交，杂交温度为46℃～50℃，杂交时间为30-60min；然后，加入藻红蛋白，46℃反应15min，获得杂交产物。

8.一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的试剂盒，所述的试剂盒包括试剂组份1~4，其中，试剂组份1为权利要求1所述的用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群；试剂组份2为根据权利要求3所述的用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群和探针群的应用方法所制得的探针-微球偶联体混合液；试剂组份3为权利要求6所述的用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群和探针群的应用方法中的dNTP、Bestar Taq Buffer、Bestar Taq DNA Polymerase和双蒸水；试剂组份4为权利要求7所述的用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群和探针群的应用方法中的四甲基氯化铵、报告混合液藻红蛋白和去核酸水。