CN104755630B - 多阶段核酸扩增 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于核酸扩增的改进方法，所述核酸扩增包括多重扩增，其中所述扩增是在两种或更多种不同的阶段中进行的。所述第一阶段扩增反应优选地缺乏指数级扩增所需的一种或多种组分。随后在扩增的第二、第三或进一步阶段(一个或多个)中提供所述缺乏组分，从而导致快速的指数级扩增反应。所述多阶段方案得到在低分析物浓度下更快速和更灵敏的检测，以及较低的可变性。还公开了用于进行所述受权利要求书保护的方法的组合物。

Description

多阶段核酸扩增
相关专利申请
本申请要求于2012年8月30日提交的美国临时申请No.61/695,106；和于2013年7月15日提交的美国临时申请No.61/846,538的权益。这些较早申请的全部公开内容据此以引用方式并入。
技术领域
本发明整体涉及分子生物学领域。更具体地讲，本发明涉及核酸的多阶段体外扩增，所述扩增可用于增加单重反应和多重反应两者中扩增的效率和精度，以允许更灵敏地检测核酸靶，该检测具有改进的定量特性并且在多重反应中分析物之间的干扰更少。
背景技术
核酸扩增提供产生相对稀少或未知的核酸序列的多个拷贝的方式，以用于鉴定核酸来源或者用于制备足够的核酸来提供易于检测的量。扩增可用于多种应用，例如测序、诊断、药物开发、法医学鉴定、环境分析和食品检测。已知有多种用于体外扩增核酸序列的方法，包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、复制酶介导的扩增、链置换扩增(SDA)、“滚环”型扩增，以及各种转录相关的扩增方法。这些已知方法使用不同技术来制备扩增序列，所述扩增序列通常是使用各种方法来检测的。
PCR扩增使用DNA聚合酶、寡核苷酸引物以及热循环来合成双链DNA(dsDNA)或者从cDNA制备的dsDNA的两条链的多个拷贝(美国专利No.4,683,195、4,683,202和4,800,159)。LCR扩增使用过量的单链探针的两个互补对，所述单链探针杂交至邻接靶序列并且进行连接以形成与原始靶互补的融合探针，这允许所述融合探针在杂交、连接和变性的多个循环中用作进一步融合的模板(美国专利No.5,516,663和EP 0320308 B1)。复制酶介导的扩增使用连接到分析物序列的自复制RNA序列和复制酶(诸如Qβ-复制酶)来合成特异于所选复制酶的自复制序列(诸如，Qβ病毒序列)的拷贝(美国专利No.4,786,600)。所述扩增序列作为分析物序列的替代物或报告分子而被检测出。SDA使用含有限制性核酸内切酶的识别位点的引物，这使得所述核酸内切酶在包括靶序列的半甲基化(hemi-modified)dsDNA的一条链上打开缺口，然后进行一系列引物延伸和链置换步骤(美国专利No.5,422,252和5,547,861)。滚环型扩增依赖于用作模板的环状或连体(concatenated)核酸结构，以用于从所述模板酶法复制多个单链拷贝(例如，美国专利No.5,714,320和5,834,252)。转录-相关的扩增是指通过从核酸模板产生多个转录物来扩增序列的方法。此类方法一般使用一种或多种寡核苷酸(其中一种寡核苷酸提供启动子序列)和具有RNA聚合酶和DNA聚合酶活性的酶以在靶序列附近形成功能性启动子序列，然后从启动子转录靶序列(例如，美国专利No.4,868,105、5,124,246、5,130,238、5,399,491、5,437,990、5,554,516和7,374,885；以及PCT公布No.WO1988/010315)。
核酸扩增方法可扩增特定的靶序列(例如，基因序列)，一组相关靶序列，或可称为标签序列的替代(surrogate)序列。此标签序列可用于多种目的，诸如检测、进一步扩增、作为结合标签以用于固定化、作为衔接子以用于测序反应(包括下一代测序)中的多种功能等。仅当所述分析物靶序列存在于反应中的某一点时该标签序列针对其预期目的发挥作用。改进的核酸扩增方法可使用“通用”引物(一种或多种)或通用引物启动(priming)来扩增不止一个潜在的靶序列。一种形式的PCR扩增使用结合至保守序列的通用引物来在PCR反应中扩增相关的序列(Okamoto et al.,1992,J.Gen.Virol.73:673-679(Okamoto等人，1992年，《普通病毒学》，第73卷，第673-679页)，Persing et al.,1992,J.Clin.Microbiol.30:2097-2103(Persing等人，1992年，《临床微生物学》，第30卷，第2097-2103页)。使用通用引物的方法通常与种特异性、基因特异性或类型特异性的一种或多种引物的使用配对，从而产生对于种、遗传性变型或者病毒类型唯一的扩增序列，所述扩增序列可以通过测序或者检测扩增核酸的一些其他特性来鉴定。锚定PCR是另一种改进的PCR方法，该方法使用通用引物或“衔接子”引物来扩增仅部分已知的序列。锚定PCR将“衔接子”或“通用”序列引入cDNA中并且随后在后续的扩增步骤中使用结合至所引入序列的引物。一般来讲，锚定PCR使用指向已知序列的引物来制备cDNA，将已知序列(例如，聚鸟嘌呤)添加到cDNA中或者使用cDNA中的共有序列(例如，聚胸腺嘧啶)，并且使用结合至该cDNA中的添加序列或共有序列的通用引物和下游靶特异性引物来进行PCR(Loh et al.,1989,Science 243:217-220(Loh等人，1989年，《科学》，第243卷，第217-220页)；Lin et al.,1990,Mol.Cell.Biol.10:1818-1821(Lin等人，1990年，《分子和细胞生物学》，第10卷，第1818-1821页)。巢式PCR可使用包含与分析物靶序列无关的通用序列的引物(一种或多种)来在反应中由未知的靶序列扩增核酸(Sullivan et al.,1991,Electrophoresis 12:17-21(Sullivan等人，1991年，《电泳》，第12卷，第17-21页)；Sugimoto et al.,1991,Agric.Biol.Chem.55:2687-2692(Sugimoto等人，1991年，《农业与生物化学》，第55卷，第2687-2692页))。
Chamberlain et al.(Nucleic Acid Res.,1988,16:11141-11156)(Chamberlain等人，《核酸研究》，1988年，第16卷，第11141-11156页)首次展示了人类肌营养不良基因的多重PCR分析。多重反应是通过对特异性引物的仔细筛选和优化完成的。开发稳健的、灵敏的和特异性的多重反应需要大量特异性设计依据和经验性优化。这导致较长的开发时间并且向降低测定灵敏度的反应条件妥协。继而，新型诊断测试的开发变得代价非常高。已确定有多个限制多重反应的具体问题。掺入针对不止一个靶的引物组需要仔细匹配反应效率。如果一个引物以甚至稍好一点的效率扩增其靶，那么扩增将变得偏向该更有效扩增的靶，从而导致低效率的扩增、变化的灵敏度并且可能造成多重反应中其他靶基因的完全失败。这被称为“优先扩增”。优先扩增有时可以通过将所有的引物序列按类似长度和GC含量仔细匹配并且优化引物浓度(例如通过增加效率较低的靶的引物浓度)来校正。也已经使用将肌苷掺入引物来试图调整引物扩增效率(美国专利No.5,738,995)。另一种方法为设计嵌合引物，其中每个引物包含与序列特异性靶识别互补的3’区和由通用序列组成的5’区。使用通用序列引物允许不同靶的扩增效率归一化(Shuber et al.,Genome Res.,1995,5:488-493(Shuber等人，《基因组研究》，1995年，第5卷，第488-493页)；以及美国专利No.5,882,856)。嵌合引物也已被用于多重等温链置换扩增(美国专利No.5,422,252、5,624,825和5,736,365)。
由于在多重扩增反应中存在多个引物组，多重扩增在很多情况下会因引物的交叉反应性所产生的假象而复杂化。必须分析所有可能的组合，从而当靶数量增加时这种情况变得极其复杂并且严重地限制了引物筛选。甚至仔细设计的引物组合往往会产生非特异性扩增(spurious)产物，该非特异性扩增产物会导致假阴性或假阳性结果。当不止一个反应同时发生时，反应动力学和效率发生改变。每种不同标本类型的每一多重反应必须针对以下方面进行优化：MgCl2浓度以及该浓度与脱氧核苷酸浓度的比率、KCl浓度、扩增酶浓度，以及扩增反应时间和温度。多重反应中的试剂之间存在竞争，使得所有的反应平台提前。因此，多重反应一般来讲灵敏性较差并且通常倾向于比对应的单重反应更易变。
同时扩增反应的另一考虑因素是必须有鉴别和检测每个靶的方法。多重靶的数量则进一步受限于反应中染料或其他可分辨标记物部分的数量。随着待检测的不同荧光部分的数量增加，结果解释所需的光学系统和数据分析程序的复杂性也增加。一种方法为将经扩增的多重产物杂交成固相然后再检测每个靶。这种方法可利用具有定义模式的捕获探针的平面杂交平台(美国专利No.5,955,268)，或者捕获到可通过流式细胞术分类的微球集(bead set)上(美国专利No.5,981,180)。
由于所讨论的大量技术问题，用于多重基因检测的当前技术是高代价的并且严重受限于可分析的基因的数量和组合。一般来讲，这些反应多重化仅两个或三个靶，最多约十个靶。等温扩增反应比PCR更复杂甚至更难以多重化(Van Deursen et al.,Nucleic AcidRes.,1999,27:e15(Van Deursen等人，《核酸研究》，1999年，第27卷，第e15页))。美国专利No.6,605,451公开了一种两步PCR多重反应，其中将少量的每种引物对添加到第一PCR反应混合物中，并且进行第一指数级扩增来增加反应中靶核酸的量。该第一反应终止于对数中期，然后分成多个第二反应，每个第二反应包含针对一种靶核酸的引物对。然后进行完全的指数级扩增。尽管在第一反应中存在有限量的每种多重引物对，但是仍然存在上文讨论的多重扩增常见问题。此外，这些多种引物对种类可全部转移到二级扩增反应中，仍然会造成常见的多重扩增问题。
因此，仍然需要允许多重扩增大量的靶而没有过量设计和优化约束、并且避免在存在多个不同的扩增寡核苷酸对的情况下进行多重扩增的常见问题的方法。此外，持续需要改善在多重扩增反应和单重扩增反应两者的检测限和/或定量限处的灵敏度和精度。本发明满足了这些和其他需要。
发明内容
如在本领域中所实践的，当开始扩增时，核酸扩增所需的所有组分存在于反应混合物中(本文中称为“单阶段方法”)。这种单阶段方法产生的问题是非所需的副反应通常会伴随所需的扩增反应而被引发。这些副反应往往与所需的扩增反应竞争并从而降低所需的扩增反应的总体性能。此外，在多重扩增反应中，在该反应混合物中以较高量存在的分析物或者其总体扩增效率高于其他分析物扩增效率的分析物的扩增与该混合物中其他分析物的扩增过度竞争并从而使其他分析物的扩增减弱。
本文公开的改进方法通过以多阶段进行扩增反应解决了这些问题。使用这种方法，所需的一个或多个反应被引发并且被允许进行到某一程度，而其他竞争反应的引发或发展则不受反应条件的支持。以此种方式，所需反应实质上在竞争的各反应中领先一步，使所需反应的总体性能得以改善。此外，通过进行分阶段的总体扩增过程，可使多重扩增反应彼此之间的竞争性变得较小。因此，类似于上文所述的情况，较低效率的反应和/或那些对应于较低的初始靶分析物水平的反应被允许进行，而发展未受抑制并且在竞争中比这些反应明显占优势的其他反应则不被允许进行。可以预期多阶段扩增的一般原理广泛适用于多种扩增技术并且可以体现为各种不同的模式，如在本文中更详细地描述。
因此，在第一方面，本发明提供了一种用于扩增样品中的靶核酸序列、包括至少两个步骤的方法。首先，在不支持靶核酸序列的指数级扩增的条件下，使该靶核酸序列经受第一阶段扩增反应。该第一阶段扩增反应产生第一扩增产物，该第一扩增产物随后在允许该第一扩增产物的指数级扩增的条件下经受第二阶段扩增反应，从而产生第二扩增产物。
如上所述，在许多情况下希望检测和定量同一样品中的多个靶核酸序列。因此，在第二方面，本发明提供了一种用于扩增样品中的多个不同靶核酸序列、包括至少两个步骤的方法。首先，在不支持或者抑制任何靶核酸序列的指数级扩增的条件下，使所述靶核酸序列经受第一阶段扩增反应。该第一阶段扩增反应产生多个第一扩增产物，该第一扩增产物随后在允许该第一扩增产物的指数级扩增的条件下经受第二阶段扩增反应，从而产生多个第二扩增产物。
在第二方面的改进型式中，本发明提供了一种用于扩增样品中的多个不同靶核酸序列的方法，其中在该反应的至少一个阶段中，一些而并非所有靶核酸序列经受线性扩增，和/或一些而并非所有靶核酸序列经受指数级扩增。因此，第一阶段扩增的至少四种可能的变型被设想为：(1)靶序列中的一些经受线性扩增，而剩余的则保持为未扩增；(2)靶序列中的一些经受指数级扩增，而剩余的则保持为未扩增；(3)靶序列中的一些经受线性扩增，一些经受指数级扩增，而剩余的则保持为未扩增；以及(4)靶序列中的一些经受线性扩增，而剩余的则经受指数级扩增。因此，在本发明的这个方面，第一阶段扩增可导致所有靶核酸序列的扩增(选项4)或者仅其子集的扩增(选项1-3)。该靶核酸序列的子集可表示已知以相对较低的量存在的靶和/或相比于其他靶难以扩增的靶。第一阶段扩增反应产生一种或多种第一扩增产物。第一扩增产物(一种或多种)和该样品中任何未扩增的靶核酸序列(一种或多种)然后在允许该序列的指数级扩增的条件下经受第二阶段扩增反应，从而产生多个第二扩增产物。或者，可以存在不止两个阶段，其中上述条件1-4可应用于除最终阶段以外的所有阶段，并且其中对于最后阶段，样品中任何未扩增或者经线性扩增的靶核酸序列(一种或多种)在允许该序列的指数级扩增的条件下经受扩增反应。
在第三方面，本发明提供了一种用于扩增样品中的靶核酸序列的组合物。该组合物包含以下组分：(a)扩增寡核苷酸，该寡核苷酸杂交至该靶核酸序列的第一部分；(b)任选的靶捕获寡核苷酸，该寡核苷酸杂交至该靶核酸序列的第二部分；以及(c)扩增酶。本发明组合物的一个关键特征是该组合物缺乏靶核酸序列的指数级扩增所需的至少一种组分。如在本申请的其他地方详细解释的，本发明的组合物的一个优点是该组合物帮助减少非特异性的扩增，从而使扩增资源集中在靶序列上。
在第四方面，本发明提供了一种用于扩增样品中的多个不同靶核酸序列的替代性组合物。该组合物包含以下组分：(a)多个不同的扩增寡核苷酸复合物，该复合物杂交至多个不同的靶核酸序列，其中每种扩增寡核苷酸复合物包含具有第一靶特异性序列的第一扩增寡核苷酸，该第一扩增寡核苷酸接合到具有第二靶特异性序列的第二扩增寡核苷酸；(b)靶捕获寡核苷酸，该靶捕获寡核苷酸杂交至该靶核酸的第二部分，以及(c)扩增酶。再次地，所述组合物缺乏靶核酸序列的指数级扩增所需的至少一种组分。
在第五方面，本发明提供了一种用于定量样品中的靶核酸序列的方法。根据所述方法，首先是步骤(a)在允许第一扩增寡核苷酸杂交至靶核酸序列的第一部分的条件下，使该样品与特异于该靶核酸序列的第一部分的第一扩增寡核苷酸接触，从而产生包含该第一扩增寡核苷酸和该靶核酸序列的预扩增杂交体。接着是步骤(b)通过靶捕获到固体载体上，然后洗涤以移除任何未在步骤(a)中杂交至该靶核酸序列的第一部分的第一扩增寡核苷酸来分离该预扩增杂交体。这个步骤之后是步骤(c)在支持在步骤(b)中分离的预扩增杂交体的靶核酸序列的至少一部分的线性扩增但是不支持其指数级扩增的条件下，在第一阶段扩增反应混合物中，在第一阶段的、基本上等温的、转录相关的扩增反应中扩增该序列的至少一部分，从而获得包含第一扩增产物的反应混合物。一般来讲，该第一阶段扩增反应混合物包含第二扩增寡核苷酸，该第二扩增寡核苷酸与第一扩增寡核苷酸的延伸产物的一部分互补。同样，第一扩增产物不是用于在第一阶段的、基本上等温的、转录相关的扩增反应期间进行核酸合成的模板。接着是步骤(d)将包含第一扩增产物的反应混合物与参与第一扩增产物的指数级扩增但是在包含该第一扩增产物的反应混合物中缺乏的至少一种组分合并，以产生第二阶段扩增反应混合物。一般来讲，该第二阶段扩增反应混合物另外包含序列特异性杂交探针。接着是步骤(e)在第二阶段的、基本上等温的、转录相关的扩增反应中在第二阶段扩增反应混合物中进行第一扩增产物的指数级扩增，从而合成第二扩增产物。这个步骤之后是步骤(f)用该序列特异性杂交探针以固定的时间间隔检测该第二阶段扩增反应混合物中该第二扩增产物的合成；然后(g)使用从检测步骤(f)获得的结果来定量该样品中的靶核酸序列。在一个通常优选的方法中，所述第一扩增寡核苷酸包含对于RNA聚合酶的3’靶特异性序列和5’启动子序列。在优选的情形中，该RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶。在另一通常优选的方法中，该第二扩增寡核苷酸是在该第一阶段的、等温的、转录相关的扩增反应中酶促延伸的。在另一通常优选的方法中，该固体载体包含经固定的捕获探针。在另一通常优选的方法中，步骤(a)还包括使该样品与杂交至该靶核酸序列的靶捕获寡核苷酸接触；并且该预扩增杂交体包含杂交至靶捕获寡核苷酸和第一扩增寡核苷酸中的每一者的靶核酸序列。在另一通常优选的方法中，该固体载体包括磁性吸引的粒子。在另一通常优选的方法中，第一阶段的、等温的、转录相关的扩增反应和第二阶段的、等温的、转录相关的扩增反应中的每一者包含RNA聚合酶和逆转录酶，并且该逆转录酶包含内源性的RNaseH活性。在另一通常优选的方法中，所述至少一种组分包括第一扩增寡核苷酸。在另一通常优选的方法中，步骤(c)的第一扩增产物是与该样品中的靶核酸序列具有相同极性的cDNA分子，并且步骤(e)的第二扩增产物是RNA分子。在另一通常优选的方法中，步骤(d)中的序列特异性杂交探针是构象敏感的探针，该探针在杂交至第二扩增产物时产生可检测的信号。在另一通常优选的方法中，步骤(d)中的序列特异性杂交探针是荧光标记的序列特异性杂交探针。在另一通常优选的方法中，步骤(g)包括使用线性校正曲线和从步骤(f)获得的结果来定量样品中的靶核酸序列。在另一通常优选的方法中，步骤(c)包括在第一阶段扩增反应混合物中扩增10倍至10,000倍。
附图说明
图1示出双阶段正向转录介导的扩增(TMA)的实施例。在该实施例中，包含T7启动子(“T7引物”)的扩增引物在靶捕获期间杂交至靶核酸序列，然后移除过量的T7引物。该扩增过程被分成至少两个不同的阶段。在第一阶段期间，将非T7引物与所有必需的扩增试剂和酶试剂(分别为AR和ER)一起引入，额外的T7引物除外(RT：逆转录酶；T7：T7RNA聚合酶)。在存在逆转录酶的情况下，延伸杂交至该靶的T7引物，构建cDNA拷贝，并且通过RT的RNaseH活性使靶RNA模板降解。非T7引物随后杂交至该cDNA然后被延伸，从而填充该T7引物的启动子区并且构建有活性的双链模板。T7聚合酶随后从该模板产生多个RNA转录物。非T7引物随后杂交至所述RNA转录物并且被延伸，从而产生靶RNA模板的无启动子cDNA拷贝。RNA链随后通过RT的RNase活性而降解。因为在第1阶段的扩增混合物中没有T7引物可用，所以该反应无法进一步进行。然后用T7引物的添加起始第二阶段，从而引发在第1阶段中产生的cDNA库的指数级扩增。
图2A-图2B示出在标准单阶段正向TMA(图2A)和在本文所述的一些操作实例中用作对照的改进的单阶段正向TMA(图2B)之间的比较。标准单阶段正向TMA方案是本领域熟知的并且在本申请的其他地方详细地描述。在改进的单阶段TMA方案中，T7引物在靶捕获期间杂交至靶核酸序列，从而消除在靶捕获之后常用的60℃下T7引物退火步骤。随后，将非T7引物与额外的T7引物以及所有必需的扩增试剂和酶试剂一起添加，从而允许指数级扩增进行。如从图2A和图2B可见，这两种单阶段TMA方案看起来在低端具有类似的灵敏度，可靠地检测人免疫缺陷病毒1(HIV-1)靶模板的100个或更多个拷贝，但是在靶模板的10个拷贝时表现不佳。
图3A-图3C示出改进的单阶段正向TMA和双阶段正向TMA之间的比较。在图3A中，如上文所述的改进的单阶段TMA被用于扩增HIV-1靶模板。在图3B中，该相同的HIV-1模板使用在图1中描述的双阶段TMA技术扩增，即，该T7引物起初从该扩增混合物中被扣留并且在该第二阶段中被提供以起始指数级扩增。图3C描绘校正曲线线性拟合，示出单阶段扩增反应和双阶段扩增反应之间敏感性的显著偏移。
图4A-图4D示出在扩增的第二阶段中添加的T7引物的浓度优化。在图4A中，该改进的单阶段正向TMA被用于扩增HIV-1靶模板。在图4B-图4D中，该T7引物从第1阶段的扩增混合物中被扣留，并且在该第二阶段中提供不同浓度的T7引物以引发指数级扩增。在1pmol/rxn、5pmol/rxn和10pmol/rxn的T7引物处观察到了单阶段扩增反应和双阶段扩增反应之间敏感性和稳健性的相当显著的偏移。
图5A-图5D示出在扩增的第一阶段中添加的非T7引物的浓度优化。在图5A中，该改进的单阶段正向TMA被用于扩增HIV-1靶模板。在图5B-图5D中，T7引物从第1阶段的扩增混合物中被扣留，并且在该第二阶段中被提供以引发指数级扩增。在10pmol/rxn和15pmol/rxn的非T7引物处观察到了单阶段扩增反应和双阶段扩增反应之间敏感性和稳健性的相当显著的偏移。在存在2pmol/rxn的非T7引物的情况下，该偏移一定程度上较不显著。
图6A-图6C示出第二阶段扩增中酶试剂(RT和T7 RNA聚合酶)对总体测定性能的影响。在图6A中，该改进的单阶段正向TMA被用于扩增HIV-1靶模板。如前所述，在图6B-图6C中，该T7引物从第1阶段的扩增混合物中被扣留，并且在该第二阶段中被提供以引发指数级扩增。在图6B中，在扩增反应的第一阶段和第二阶段中添加等量的酶试剂。在图6C中，在第一阶段扩增中添加相同总量的酶试剂，而在第二阶段中不添加酶试剂。在两个实验中都观察到了单阶段扩增反应和双阶段扩增反应之间敏感性和稳健性的相当显著的偏移。
图7A-图7C示出使用人乳头瘤病毒亚型16(HPV16)靶模板进行的标准单阶段正向TMA(图7A)和双阶段正向TMA(图7B)之间的比较。如上文参照HIV-1靶模板所讨论的，在双阶段形式中，该T7引物从第1阶段的扩增混合物中被扣留并且在第二阶段中被提供以引发指数级扩增。图7C描绘校正曲线线性拟合，示出单阶段扩增反应和双阶段扩增反应之间敏感性的显著偏移。
图8A-图8C示出使用前列腺癌抗原3(PCA3)靶模板进行的标准单阶段正向TMA(图8A)与双阶段正向TMA(图8B)之间的比较。如上文参照HIV-1靶模板和HPV16靶模板所讨论的，在双阶段形式中，该T7引物从第1阶段的扩增混合物中被扣留并且在第二阶段中被提供以引发指数级扩增。图8C描绘校正曲线线性拟合，类似地示出单阶段扩增反应和双阶段扩增反应之间敏感性的显著偏移。
图9A-图9F示出用于PCA3和T2-ERG的双重扩增的标准单阶段正向TMA(图9A和图9D)和双阶段正向TMA(图9B和图9E)之间的比较，T2-ERG是一种通过雄性激素调节的跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSS2)与ETS转录因子(ERG)的基因融合形成的前列腺癌标记物。图9A和图9B示出在存在T2-ERG的情况下对PCA3的检测，而图9D和图9E示出在存在PCA3的情况下对T2-ERG的检测。图9C和图9F描绘校正曲线线性拟合，示出针对双重扩增情形中的两种靶，单阶段扩增反应和双阶段扩增反应之间敏感性的显著偏移。
图10A-图10I示出用于PCA3、T2-ERG和前列腺特异性抗原(PSA)的三重扩增的标准单阶段正向TMA(图10A、图10D和图10G)和双阶段正向TMA(图10B、图10E和图10H)之间的比较。图10A和图10B示出在存在T2-ERG和PSA的情况下对PCA3的检测；图10D和图10E示出在存在PCA3和PSA的情况下对T2-ERG的检测；以及图10G和图10H示出在存在PCA3和T2-ERG的情况下对PSA的检测。图10C、图10F和图10I描绘校正曲线线性拟合，示出针对三重扩增情形中的所有三个靶，单阶段扩增反应和双阶段扩增反应之间敏感性的显著偏差。
图11A-图11C示出改进的单阶段反向TMA和双阶段反向TMA之间的比较。在图11A中，改进的单阶段反向TMA被用于扩增T2-ERG靶模板。在改进的单阶段反向TMA中，非T7引物在靶捕获期间杂交至靶核酸序列，从而消除在靶捕获之后常用的60℃下非T7引物退火步骤。随后，将T7引物与额外的非T7引物以及所有必需的扩增试剂、检测试剂和酶试剂一起添加，从而允许指数级扩增进行。在图11B中，使用双阶段反向TMA方案扩增相同的T2-ERG模板，其中该非T7引物从第1阶段的扩增混合物中被扣留并且在该第二阶段中被提供以引发指数级扩增。图11C描绘校正曲线线性拟合，示出单阶段扩增反应和双阶段扩增反应之间敏感性的显著偏移。
图12A-图12C示出用于T2-ERG、PCA3、PSA和内部对照(CAP)的四重扩增的改进的单阶段反向TMA(图12A)、图11中描述的双阶段形式反向TMA(图12B)和不同的双阶段形式反向TMA(图12C)之间的比较。图12A、图12B和图12C示出在存在PCA3、PSA和CAP的情况下对T2-ERG的检测。在图12B中，所有的四个靶经受如上文结合图11B所描述的相同的双阶段反向TMA。在图12C中，在反应的第一阶段中PCA3、PSA和CAP(或者仅CAP)经受线性扩增，而T2-ERG经受指数级扩增，并且在第二阶段中PCA3、PSA和CAP经受指数级扩增，而T2-ERG继续指数级地扩增(所有的这些扩增反应在相同的容器中进行)。
图13A-图13C示出用于T2-ERG、PCA3、PSA和内部对照(CAP)的四重扩增的改进的单阶段反向TMA(图13A)、双阶段反向TMA(图13B)和三阶段反向TMA(图13C)之间的比较。图13A、图13B和图13C示出在存在PCA3、PSA和CAP的情况下对T2-ERG的检测。在图13B中，所有的四个靶经受如上文结合图11B所描述的相同的双阶段反向TMA。在图13C中，在第1阶段中T2-ERG经受线性扩增而其他3种分析物不扩增，在第2阶段中T2-ERG经受指数级扩增而其他3种分析物不扩增，以及在第3阶段中PCA3、PSA和CAP(或者仅CAP)经受指数级扩增而T2-ERG继续指数级地扩增(所有的这些扩增反应在相同的容器中进行)。
具体实施方式
为了本发明的清楚性并且不以限制性方式，本发明的具体实施方式被划分为以下的子部分。
A.定义
除非另有说明，否则本文所使用的科学和技术术语具有与分子生物学领域内的那些技术人员基于技术文献或者与分子生物学相关的其他熟知的技术出版物通常所理解的相同含义，所述技术文献例如，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,2nd ed.(Singleton et al.,1994,John Wiley&Sons,New York,NY)(Singleton等人，《微生物学和分子生物学词典》，第2版，1994年，纽约州纽约市约翰威立父子出版公司)。除非另有说明，否则本文中使用或考虑的技术是分子生物学领域中熟知的标准方法。为了帮助理解所公开方法和组合物的各方面，通过本文所述的实施例更详细地描述或解释一些术语。
本文提及的所有专利、专利申请、已公布专利申请和其他出版物全文以引用方式并入。如果此部分示出的定义与以引用方式并入本文的专利、专利申请、已公布专利申请和其他出版物示出的定义相反或者不一致，则此部分示出的定义优于以引用方式并入本文的定义。
如本文所用，“一个”或“一种”意指“至少一个/至少一种”或“一个或多个/一种或多种”。
如本文在整个说明书和权利要求书中所使用的近似表述可应用于修饰任何定量或定性表示，这些定量或定性表示可获许可地变化而不会导致与其相关的基本功能的变化。因此，由术语诸如“约”或“大约”修饰的值并不限于所指定的精确值，而是可包括与该指定值不同的值。
如本文所用，术语“样品”是指可包含所关注的分析物的标本，例如，微生物、病毒、核酸诸如基因，或者它们的组分，所述组分包含分析物中或者从分析物取得的核酸序列。样品可来自任何来源，诸如生物标本或者环境来源。生物标本包括从活生物体或死亡生物体取得的任何组织或材料，该组织或材料可包含分析物或者分析物中或从分析物取得的核酸。生物样品的例子包括呼吸组织、渗出物(例如，支气管肺泡灌洗液)、活组织标本、痰、外周血、血浆、血清、淋巴结、胃肠组织、粪便、尿液或者其他流体、组织或材料。环境样品的例子包括水、冰、土壤、混悬液、残渣、生物膜、大气尘粒子以及气溶胶。样品可为经处理的标本或材料，诸如通过使用过滤、离心、沉淀或者吸附至介质(诸如，基体或载体)处理样品而获得。样品的其他处理可包括物理或机械地破碎组织、细胞凝聚体或细胞的处理，从而将包括核酸在内的细胞内组分释放到可包含其他组分的溶液中，所述其他组分诸如酶、缓冲液、盐、洗涤剂等等。
如本文所用，术语“接触”意味使两种或更多种组分合并在一起。可以通过在流体或半流体混合物中混合所有的组分来实现接触。当一种或多种组分在固体表面上与一种或多种其他组分发生物理接触时也可实现接触，该固体表面诸如固体组织切片或者底物。
如本文所用，术语“核酸”是指包括寡核苷酸的多核苷酸化合物，所述寡核苷酸包含核苷或者核苷类似物，所述核苷或者核苷类似物具有通过标准的磷酸二酯键或者其他键而共价连接的含氮杂环碱基或碱基类似物。核酸包括RNA、DNA、嵌合的DNA-RNA聚合物或其类似物。在核酸中，主链可由多种键组成，包括糖磷酸二酯键、肽核酸(PNA)键(PCT公布No.WO 95/32305)、硫代磷酸酯键、甲基磷酸酯键或其组合中的一者或多者。核酸中的糖基部分可为核糖、脱氧核糖或者具有取代基的类似化合物，所述取代基例如，2’甲氧基和2’卤离子(例如，2’-F)取代基。含氮碱基可为常规的碱基(A、G、C、T、U)、其类似物(例如，肌苷；The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36,Adams et al.,ed.,11th ed.,1992(《核酸的生物化学》，第5-36页，Adams等人编辑，第11版，1992年))、嘌呤或嘧啶碱基的衍生物(例如，N4-甲基脱氧鸟苷、脱氮或者氮杂嘌呤、脱氮或者氮杂嘧啶、在多个化学位置的任一者处具有改变的或者置换的取代基的嘧啶或嘌呤(例如,2-氨基-6-甲胺基嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、4-硫代-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶，以及O4-烷基-嘧啶)，或者吡唑化合物，诸如未取代的或者3-取代的吡唑[3,4-d]嘧啶(例如，美国专利No.5,378,825、6,949,367和PCT公布No.WO 93/13121))。核酸可包括“脱碱基”位置，其中主链在一个或多个位置处不具有含氮碱基(美国专利No.5,585,481)，例如，一个或多个脱碱基位置可形成接头区，该接头区将单独的寡核苷酸序列接合到一起。核酸可仅包含如存在于常规RNA和DNA中的常规糖基、碱基和键，或可包括常规组分和取代物(例如由2’甲氧基主链连接的常规碱基，或包含常规碱基与一种或多种碱基类似物的混合物的聚合物)。所述术语包括“锁核酸”(LNA)，该“锁核酸”包含一种或多种LNA核苷酸单体，该单体具有锁定为RNA模拟糖构象的双环呋喃糖单元，该构象增强了ssRNA、ssDNA或者dsDNA中互补序列的杂交亲和力(Vester etal.,2004,Biochemistry 43(42):13233-41(Vester等人，2004年，《生物化学》，第43卷，第42期，第13233-13241页))。
如本文所用，可互换的术语“寡核苷酸”和“低聚物”是指一般由少于1,000个核苷酸(nt)构成的核酸聚合物，包括尺寸范围具有约2至5nt的下限和约500至900nt的上限的那些聚合物。优选的寡核苷酸的尺寸范围具有5至15nt的下限和50至500nt的上限，并且特别优选的实施例的尺寸范围具有10至20nt的下限和25至150nt的上限。优选的寡核苷酸是通过使用任何熟知的体外化学或酶促方法合成制备的，并且可在合成之后通过使用标准方法而纯化，所述标准方法例如高效液相色谱(HPLC)。本文讨论的代表性的寡核苷酸举例来说包括启动寡核苷酸引物(例如，引物、非T7引物、T7启动子-引物等)、启动子提供者(是包含阻断的3’端的启动子引物)、检测探针寡核苷酸、靶捕获寡核苷酸，以及阻断剂。启动寡核苷酸引物和启动子提供者一般被称为“扩增寡核苷酸”。
“启动寡核苷酸引物”(或者更简洁地“引物”)是寡核苷酸，该寡核苷酸的至少3'端与核酸模板互补，并且该寡核苷酸与模板复合(通过氢键或杂交)以得到引物：模板复合物，该复合物适合于通过RNA或DNA依赖性的DNA聚合酶引发合成。启动寡核苷酸引物是通过将共价键合的核苷酸碱基添加到该引物的3'端而延伸的，该碱基与所述模板互补。所获得的是引物延伸产物。本发明的启动寡核苷酸引物通常为至少10个核苷酸的长度，并且可延伸至最长至15、20、25、30、35、40、50或者更多个核苷酸的长度。本文描述了合适的和优选的启动寡核苷酸引物。事实上所有已知的DNA聚合酶(包括逆转录酶)需要将寡核苷酸复合至单链模板(“启动引物”)来引发DNA合成，而RNA复制和转录(从DNA拷贝RNA)一般不需要引物。就其通过DNA聚合酶延伸的本质来说，启动寡核苷酸引物不包含3'-阻断部分。
如本文所用，术语“扩增寡核苷酸复合物”是指直接或间接地接合在一起得两种扩增寡核苷酸，如下文所讨论的。因此，扩增寡核苷酸复合物由接合在一起的第一扩增寡核苷酸和第二扩增寡核苷酸构成。
在此所用的“带标签的寡核苷酸”是指包含至少第一区和第二区的寡核苷酸，其中第一区包含“靶杂交序列”，该靶杂交序列杂交所关注的靶核酸序列，并且其中第二区包含位于该靶杂交序列的5'端并且无法稳定地杂交或结合至包含该靶核酸序列的靶核酸的“标签序列”。该靶杂交序列与该靶核酸序列的杂交产生“带标签的靶核酸序列”。该靶杂交序列组分的特征和设计依据将与本文所讨论的启动寡核苷酸引物的特征和设计依据相同。该“标签序列”或者“异源标签序列”可为基本上任何序列，前提条件是该序列无法稳定地杂交至所关注的靶核酸序列，从而该序列在任何序列修饰之前参与天然靶的可检测扩增(即，如将在生物样品中发现的)。该标签序列优选地无法稳定地杂交至从所测试的生物体的基因组取得的任何序列，或者更具体地讲无法在反应条件下杂交至任何靶核酸。存在于带标签的寡核苷酸中的标签序列优选地经设计为使得不会实质上损害或者妨碍该靶杂交序列杂交至其靶序列的能力。此外，该标签序列将具有足够长度并且为组合物，使得一旦已经将该标签序列的互补序列掺入到初始的DNA引物延伸产物中，随后就可使用标签特异性的启动寡核苷酸引物来参与后续轮的扩增，如本文所述。本发明的标签序列通常为至少10个核苷酸的长度，并且可延伸至最长至15、20、25、30、35、40、50或者更多个核苷酸的长度。熟练的技术人员将认识到，用于本发明的标签序列和带标签的寡核苷酸的设计可沿循多个合适策略中的任一者，同时仍然实现本文所述的目标和优势。在某些实施例中，带标签的寡核苷酸是包含标签序列和靶杂交序列的“带标签的启动寡核苷酸引物”。在其他实施例中，带标签的寡核苷酸是包含标签序列、靶杂交序列和启动子序列的“带标签的启动子寡核苷酸”，所述启动子序列位于该标签序列的5'端并且作用为从该5'端引发转录。在序列号为61/451,285的、共同拥有的美国临时专利申请中公开了示例性的标签序列和用于鉴定特别有用的标签序列的方法。这个临时专利申请的公开内容以引用方式并入。
非酶促延伸的寡核苷酸包括启动子提供者寡核苷酸和阻断剂寡核苷酸。这些寡核苷酸杂交至靶核酸或者该靶核酸的互补序列，但是并非是以模板导向的方式通过酶促聚合酶活性延伸的。为了阻止寡核苷酸的酶促延伸，可以使用阻断部分化学地或者结构地阻断该寡核苷酸的3’端，如在本领域中公知的。阻断的寡核苷酸在例如美国专利No.5,399,491、5,554,516、5,824,518和7,374,885中有所描述。阻断的寡核苷酸是指包括化学和/或结构修饰的寡核苷酸，该化学和/或结构修饰通常接近或者在3’端处并且阻止或者阻碍由该寡核苷酸通过酶促方式引发DNA合成。这种修饰的例子包括3’2’-双脱氧核苷酸碱基的使用、阻止酶促延伸的3’非核苷酸部分的使用，或者3’至5’取向的短序列连接至该寡核苷酸，以制备具有两个5’端的最终寡核苷酸(即，第一个5’至3’的寡核苷酸连接到第二个、通常较短的5’至3’寡核苷酸是通过在这两个寡核苷酸的3’端处共价地接合这两个寡核苷酸)。修饰的另一个例子是“帽”，该“帽”由与寡核苷酸的3’端处的至少3nt互补的序列构成，使得该帽的5’端碱基与该寡核苷酸的3’端碱基互补。虽然阻断的寡核苷酸并非酶促地延伸，但是该阻断的寡核苷酸可参与核酸扩增，例如通过杂交至核酸模板链上的特定位置来阻碍超出该阻断的寡核苷酸所结合至的位置的互补链合成。
该扩增寡核苷酸的尺寸通常是由包括在该寡核苷酸中的功能部分所确定的。启动子引物或者启动子提供者寡核苷酸的组成部分包括特异于RNA聚合酶(RNP)的启动子序列。RNP及其相应的启动子序列是熟知的并且可以从多个来源纯化或者通过使用从多个来源取得的材料在体外合成制备，所述来源例如，病毒、噬菌体、真菌、酵母、细菌、动物、植物或者人类细胞。RNP和启动子的例子包括RNA聚合酶III及其启动子(美国专利No.7,241,618)、噬菌体T7 RNA聚合酶及其启动子或其突变体(美国专利No.7,229,765和7,078,170)、源自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的RNA聚合酶和启动子(美国专利No.7,186,525)，源自HIV-1或者HCV的RNA聚合酶，以及植物RNA引导的RNP(美国专利No.7,060,813)。启动子引物或者提供者寡核苷酸包括功能性地连接至所选RNP的启动子序列。启动子引物或者启动子提供者寡核苷酸的优选实施例包括与T7 RNP一起使用的T7启动子序列，其中该启动子序列在25至30nt的范围内，诸如SEQ ID NO:1(aatttaatacgactcactatagggaga)或者SEQ ID NO:2(gaaattaatacgactcactatagggaga)的启动子序列。
包括标签部分的扩增寡核苷酸通常包括在5至40nt的范围内的标签序列，其中优选的实施例在10至25nt，或10至30nt，或15至30nt的范围内。包括靶特异性(TS)部分的扩增寡核苷酸通常包括在10至45nt的范围内的TS序列，其中优选的实施例在10至35nt，或20至30nt的范围内。包括多个标签序列和/或多个TS序列和/或一启动子序列的扩增寡核苷酸将在由该扩增寡核苷酸的各功能序列的长度所决定的尺寸范围内。例如，包括标签序列和TS序列的启动子引物或者提供者寡核苷酸将为启动子序列、标签序列和TS序列的尺寸的总和，并且可任选地包括连接的核苷酸或非核苷酸部分(例如，脱碱基接头)。由如本文所述的多个功能性组分构成的扩增寡核苷酸可通过标准磷酸二脂键、核酸类似物键或者非核酸键直接在不同的功能性部分之间共价地连接，或者可通过使用充当功能性部分之间的间隔子和/或键的额外的核酸序列或者非核酸的(例如，脱碱基键)化合物而非共价地连接在一起。扩增寡核苷酸的一些实施例可通过使用非共价键，诸如通过使用所述寡核苷酸之间的结合对成员的相互作用，或者通过寡核苷酸复合物的各结合对成员所结合至的连接组分(包括一种或多种额外的寡核苷酸)连接在一起形成复合物，所述相互作用包括两种或更多种寡核苷酸中所包含的互补序列的直接杂交。
如本文所用，靶核酸的“扩增”是指体外构建与靶核酸序列或者充当该靶核酸序列的替代序列的通用序列或标签序列的至少一部分相同或互补的核酸链的过程，仅当该靶核酸存在于样品中时才能发生所有的这些过程。通常，核酸扩增使用一种或多种核酸聚合酶和/或转录酶来产生靶多核苷酸或者其片段的多个拷贝，或者与该靶多核苷酸或者其片段互补的序列的多个拷贝，或者已经引入到该扩增体系中充当该靶多核苷酸的替代序列的通用序列或者标签序列的多个拷贝，所述通用序列或者标签序列诸如在检测步骤中用于指示在测定的某一时刻靶多核苷酸的存在，或者作为位点用于在扩增反应中进一步引发，或者用于测序相关的工作流或者测序反应。体外核酸扩增技术是熟知的并且包括转录相关的扩增方法，诸如转录介导的扩增(TMA)或者基于核酸序列的扩增(NASBA)，以及其他方法，诸如聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶-PCR(RT-PCR)、复制酶介导的扩增，以及连接酶链式反应(LCR)。
如本文所用，术语“线性扩增”是指经设计以在反应中与靶核酸量成线性比例地使靶核酸产生增长的扩增机理。例如，可使用转录相关的反应从DNA靶制备多个RNA拷贝，其中拷贝数量的增加可用线性因子(例如，模板的起始拷贝×100)来描述。在优选的实施例中，多阶段扩增程序中的第一阶段线性扩增使得在第二阶段扩增反应开始前，靶核酸链或该靶核酸链的互补链的起始数量增加至少10倍，更优选地100倍，或者仍然更优选地10至1,000倍。线性扩增体系的一个例子是“基于T7的DNA线性扩增”(TLAD；参见Liu et al.,BMCGenomics,4:Art.No.19,May 9,2003(Liu等人，《英国医学委员会—基因组学》，第4卷，文献号19，2003年5月9日))。本文公开了其他方法。因此，术语“线性扩增”是指不会导致靶核酸序列的指数级扩增的扩增反应。术语“线性扩增”并非是指仅制备核酸链的单拷贝的方法，诸如如在逆转录(RT)-PCR的情形中一样将RNA分子转录成单个cDNA分子。
如本文所用，术语“指数级扩增”是指经设计以在反应中与靶核酸量成几何比例地使靶核酸产生增长的核酸扩增。例如，PCR针对每一原始靶链以及针对存在的每一合成链产生一条DNA链。类似地，转录相关的扩增针对每一原始靶链以及针对每一随后合成的链产生多个RNA转录物。该扩增是指数级的，因为所合成的链被用作后续轮扩增中的模板。扩增反应不需要实际上产生指数级增长量的核酸才能被视为指数级扩增，只要该扩增反应被设计为产生此类增长即可。
如本文所用，术语“基本上等温的扩增”是指在基本上恒定的温度下进行的扩增反应。在该反应的等温部分之前或之后可为一个或多个温度变化的步骤，例如，第一变性步骤和最终的热失活步骤或冷却步骤。应当理解的是这个定义并不排除某些优选较小的温度变化，而是相反地用于区分等温扩增技术与本领域中已知的基本上依赖于“循环温度”来产生扩增产物的其他扩增技术。等温扩增与PCR不同，例如不同之处在于PCR依赖于如下循环：通过加热进行的变性，然后是引物杂交以及低温聚合。
所公开方法的优选实施例使用等温扩增体系的各方面，所述方面通常被称为“转录相关的扩增”方法，该方法通过从核酸模板产生多个转录物来扩增靶序列。此类方法通常使用一种或多种寡核苷酸(其中一种寡核苷酸提供启动子序列、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、核糖核苷三磷酸(rNTP))和具有RNA聚合酶和DNA聚合酶活性的酶，以在靶序列附近生成功能性启动子序列，然后从启动子转录靶序列(例如，美国专利No.4,868,105、5,124,246、5,130,238、5,399,491、5,437,990、5,554,516和7,374,885；以及PCT公布No.WO 1988/001302、WO 1988/010315和WO 1995/003430)。例子包括转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)以及自动维持序列扩增(3SR)。虽然所公开的优选实施例依赖于TMA(美国专利No.5,399,491和5,554,516)或者单引物转录相关的扩增(美国专利No.7,374,885、7,696,337和7,939,260)，但是本领域内的普通技术人员将会意识到，基于寡核苷酸序列的聚合酶介导的延伸的替代性扩增方法也可与本文所述的组合物和/或方法步骤一起使用。
为了帮助理解本文公开的一些实施例，简要概述此前已经详细描述的TMA方法(例如，美国专利No.5,399,491、5,554,516和5,824,518)。在TMA中，包含待扩增序列的靶核酸以单链核酸提供(例如，ssRNA或者ssDNA)。可以使用用于将双链核酸(例如，dsDNA)转换成单链核酸的任何常规方法。启动子引物在其靶序列处特异性地结合至靶核酸，并且逆转录酶(RT)使用靶链作为模板延伸该启动子引物的3’端，从而构建cDNA拷贝，获得RNA:cDNA双链体。RNase活性(例如，RT酶的RNase H)消化该RNA:cDNA双链体中的RNA，并且第二引物在该启动子-引物端的下游特异性地结合至cDNA中该第二引物的靶序列。随后RT通过使用该cDNA作为模板延伸该第二引物的3’端来合成新的DNA链，从而构建包含功能性启动子序列的dsDNA。特异于该功能性启动子的RNA聚合酶引发转录以产生与初始靶链互补的约100至1000个RNA转录物(经扩增的拷贝或者扩增子)。该第二引物特异性地结合至其在每个扩增子中的靶序列，并且RT从扩增子RNA模板构建cDNA以产生RNA:cDNA双链体。RNase从该RNA:cDNA双链体消化扩增子RNA，并且该启动子引物的靶特异性序列结合至其在新合成的DNA中的互补序列，并且RT延伸该启动子引物的3’端以及该cDNA的3’端，从而构建包含该RNA聚合酶所结合至的功能性启动子并且转录与该靶链互补的额外扩增子的dsDNA。在反应期间重复使用这些步骤的自催化循环产生该初始靶序列的约十亿倍扩增。可以通过使用特异性地结合至包含在扩增子中的序列的探针来在扩增期间(实时检测)或者在反应的终点(终点检测)检测扩增子。检测到从所结合的探针获得的信号指示样品中存在靶核酸。
此前已经详细描述了另一种形式的转录相关的扩增，其使用单引物以及一种或多种额外的扩增寡核苷酸通过制备指示靶核酸存在的转录物来在体外扩增核酸(美国专利No.7,374,885、7,696,337和7,939,260)。简而言之，该单引物方法使用启动寡核苷酸引物、经修饰以阻止从寡核苷酸的3’端引发DNA合成的启动子寡核苷酸(或者启动子提供者寡核苷酸)，以及任选地阻断剂分子(例如，3’-阻断的寡核苷酸)来终止从该靶链延伸cDNA。该方法通过用以下物质处理包括RNA靶序列的靶核酸来合成靶序列的多个拷贝：(i)启动寡核苷酸引物，其杂交至该靶序列的3’端使得可以从该3’端引发引物延伸反应，以及(ii)阻断剂分子，其结合至与该靶序列的5’端邻近或者在该靶序列的5’端附近的靶核酸。通过使用DNA聚合酶在引物延伸反应中延伸该启动寡核苷酸引物，以获得与该靶序列互补的DNA引物延伸产物，其中该DNA引物延伸产物具有由该阻断剂分子确定并且与该靶序列的5’端互补的3’端。该方法随后通过使用选择性降解靶序列的酶从该靶序列分离DNA引物延伸产物，并且使用由第一区和第二区构成的启动子寡核苷酸处理该DNA引物延伸产物，其中第一区杂交至该DNA引物延伸产物的3’区以形成启动子寡核苷酸：DNA引物延伸产物杂交体，并且第二区为RNA聚合酶的启动子，位于该第一区的5’处，其中该启动子寡核苷酸经修饰以阻止从该启动子寡核苷酸引发DNA合成。该方法延伸该启动子寡核苷酸：DNA引物延伸产物杂交体中的DNA引物延伸产物的3’端以添加与该启动子寡核苷酸的第二区互补的序列，该方法用于使用识别该启动子并且从其引发转录的RNA聚合酶来转录与该DNA引物延伸产物互补的多个RNA产物。该方法产生与该靶序列基本上相同的RNA转录物。
单引物转录介导的扩增方法的一个实施例通过使引物在该靶序列的3’部分中的某一位置处杂交至靶RNA以及使引物在该靶序列的5’部分中的某一位置处杂交至3’阻断的寡核苷酸(即，阻断剂寡核苷酸)来合成RNA靶序列的多个拷贝。随后RT的DNA聚合酶活性从该引物的3’端引发延伸，从而产生与该模板链形成的双链体(RNA:cDNA双链体)中的cDNA。该3’阻断的寡核苷酸在邻近于待扩增序列的预期的5’端的位置处结合至该靶链，因为该结合的3’阻断的寡核苷酸阻碍该cDNA延伸超出该位置。即，该cDNA的3’端是由阻断剂分子的位置决定的，因为当该延伸产物到达结合至靶链的阻断分子时聚合停止。该RNA:cDNA双链体是通过降解RNA的RNase活性(RT的RNase H)分离的，但是本领域的技术人员将会意识到，可以使用任何形式的链分离。启动子提供者寡核苷酸包含RNA聚合酶的5’启动子序列和与该寡核苷酸杂交至的cDNA的3’区中的序列互补的3’序列。该启动子提供者寡核苷酸具有经修饰的3’端，该3’端包括阻断部分以阻止从该启动子提供者寡核苷酸的3’端引发DNA合成。在由杂交至cDNA的启动子提供者构成的双链体中，cDNA的3’端通过使用RT的DNA聚合酶活性而延伸，并且该启动子提供者寡核苷酸充当模板以将启动子序列添加到该cDNA的3’端，这将构建由该启动子提供者寡核苷酸上的序列与用该启动子提供者模板制备的互补cDNA序列构成的功能性双链启动子。特异于该启动子序列的RNA聚合酶结合至该功能性启动子，并且转录与该cDNA互补且与初始靶RNA链的靶序列基本上相同的多个RNA转录物。所得的扩增RNA可通过结合引物以及充当进一步cDNA制备的模板来再次循环通过所述过程，最终从存在于样品中的初始靶核酸产生多个扩增子。该单引物转录相关的扩增方法的实施例不需要使用充当阻断剂分子的3’阻断的寡核苷酸，并且如果不包括结合分子，那么从引物制备的cDNA产物具有不明确的3’端，但是扩增与上文所述的基本上相同地进行。由于这种扩增方法的实质，这种方法在基本上等温的条件下进行，即，无需如在基于PCR的方法中所使用的提高和降低温育温度的循环来分离链或者允许引物的杂交。
如本文所用，术语“标签”是指为了赋予除结合至靶序列以外的一些额外的功能性而共价地连接到寡核苷酸的靶特异性序列的核苷酸序列。寡核苷酸标签的非限制性例子包括RNA聚合酶的5’启动子、引物结合位点、测序标签、质谱标签(mass tag)、条形码标签、捕获标签等等(例如，美国专利No.5,422,252、5,882,856、6,828,098，以及PCT公布No.05/019479)。寡核苷酸标签可根据具体测定的详情而对于每一靶序列为唯一的或者为通用的(由多个靶序列共享，例如，美国专利No.5,104,792)。
如本文所用，扩增产物的“检测”可通过使用任何已知的方法来完成。例如，该扩增核酸可以与导致可检测的物理变化(例如，电性变化)的表面相关联。经扩增的核酸可以在溶液相中检测，或者通过在基质中或者基质上浓缩该核酸并且检测与其相关联的标记物(例如，嵌入剂，诸如溴化乙锭或者核酸绿(cyber green))来检测。其他检测方法使用与扩增产物中的序列互补的探针并且检测探针：产物复合物的存在，或者使用探针复合物扩增从扩增产物中检测到的信号(例如，美国专利No.5,424,413、5,451,503和5,849,481)。其他检测方法使用其中信号产生与靶序列的存在相关联的探针，因为仅当该被标记探针诸如在分子信标、分子火炬或者杂交开关探针中结合至扩增产物时才发生信号变化(例如，美国专利No.5,118,801、5,312,728、5,925,517、6,150,097、6,361,945、6,534,274、6,835,542、6,849,412和8,034,554；以及美国公布No.2006/0194240 A1)。这样的探针通常使用连接到该探针一端的标记物(例如，荧光团)以及连接到该探针的另一位置的相互作用化合物(例如，淬灭剂)来在所述探针处于指示该探针并未杂交至扩增产物的一个构象中(“关闭”)时抑制信号从该标记物产生，但是当该探针杂交至改变探针构象(改变成“打开”)的扩增产物时产生可检测的信号。从与扩增产物特异性关联的直接或间接标记的探针检测到信号指示经扩增的靶核酸的存在。
如本文所用，术语“标记物”是指可以被检测或产生可检测响应的分子部分或化合物，所述分子部分或化合物可直接或间接地接合至核酸探针。直接标记可使用键或相互作用来连接标记物和探针，所述键或相互作用包括共价键、非共价的相互作用(氢键、疏水的和离子的相互作用)，或者螯合物或配位络合物。间接标记可使用直接或间接标记的桥联部分或接头(例如抗体、寡核苷酸或者其他化合物)，该桥联部分或接头可放大信号。标记物包括任何可检测的部分。可用的可检测部分的例子包括放射性核素、配体(诸如，生物素或者亲和素)、酶、酶底物、反应基团、发色团(可检测的染料、粒子或者珠粒)、荧光团，或者发光化合物(例如，生物发光标记物、磷光标记物，或者化学发光标记物)。优选的化学发光标记物包括吖啶酯(“AE”)及其衍生物(美国专利No.5,639,604、5,656,207和5,658,737)。优选的标记物是在均相测定中可检测的，其中混合物中结合的标记探针相比于未结合的标记探针表现出可检测的变化，例如，稳定性或者差异性降解，而无需从未结合形式中物理分离结合形式(例如，美国专利No.5,283,174、5,656,207和5,658,737)。合成标记物、将标记物连接至核酸，以及检测标记物的方法是熟知的(例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY,1989),Chapter 10(Sambrook等人，《分子克隆实验指南》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港，1989年，第10章))；美国专利No.4,581,333、5,283,174、5,547,842、5,656,207和5,658,737)。
特异性结合对(或者结合伴侣)的成员为特异性识别彼此并且与彼此结合的部分。成员可被称为第一结合对成员(BPM1)和第二结合对成员(BPM2)，所述成员代表特异性结合在一起的多个部分。特异性结合对的示例为受体及其配体、酶及其底物、辅因子或辅酶、抗体或Fab片段及其抗原或配体、糖和凝集素、生物素及链亲和素或亲和素、配体和螯合剂、蛋白质或氨基酸及其特异性的结合金属(诸如组氨酸和镍)、基本上互补的多核苷酸序列(包括完全或部分互补的序列)，以及互补的同聚物序列。具体的结合对可为天然存在的(例如，酶和底物)、合成的(例如，合成受体和合成配体)，或者天然存在的BPM与合成的BPM的组合。
如本文所用，术语“靶捕获”是指将靶核酸与样品混合物中的其他组分选择性地分开，所述其他组分诸如细胞片段、细胞器、蛋白质、脂质、碳水化合物，或者其他核酸。靶捕获体系可为特异性的并且从其他样品组分中选择性地分离预定的靶核酸(例如，通过使用特异于预期的靶核酸的序列)，或者该靶捕获体系可为非特异性的并且通过使用靶的其他特性(例如，靶核酸的区分其与其他样品组分的物理性状，所述其他样品组分不表现出那种物理特性)从其他样品组分选择性地分离靶核酸。此前已经详细地描述了优选的靶捕获方法和组合物(美国专利No.6,110,678和6,534,273；以及美国公布No.2008/0286775 A1)。优选的靶捕获实施例使用溶液相中的靶捕获寡核苷酸以及连接到载体的经固定捕获探针来形成与该靶核酸的复合物并且将所捕获的靶从其他组分分离。
如本文所用，术语“靶捕获寡核苷酸”是指通过使用结合对成员桥接或者接合靶核酸和经固定的捕获探针的至少一种核酸寡核苷酸，所述结合对成员诸如互补的核酸序列或者生物素和链亲和素。在一种方法中，该靶捕获寡核苷酸非特异性地结合至靶核酸并且将该靶核酸固定至固体载体。在另一方法中，该靶捕获寡核苷酸的靶特异性(TS)序列特异性地结合至该靶核酸中的一序列。在这两种方法中，该靶捕获寡核苷酸包括经固定的捕获探针-结合区域，该区域结合至经固定的捕获探针(例如，通过特定的结合对相互作用)。在其中TS序列和经固定的捕获探针-结合区域均为核酸序列的实施例中，所述TS序列和经固定的捕获探针-结合区域可共价地彼此接合，或者可通过一个或多个接头接合在不同的寡核苷酸上。
“经固定的捕获探针”提供了用于将靶捕获寡核苷酸接合至固体载体的方式。该经固定的捕获探针是接合至固体载体的碱基序列识别分子，所述探针促进从未结合材料分离结合的靶多核苷酸。可以使用任何已知的固体载体，诸如基质和溶液中游离的粒子。例如，固体载体可为硝化纤维、尼龙、玻璃、聚丙烯酸酯、混合的聚合物、聚苯乙烯、硅烷聚丙烯，以及优选地磁性吸引的粒子。特别优选的载体包括单分散性的磁球体(即，大小均匀度为±约5％)，从而提供一致的结果，这特别有利于用于自动化测定。该经固定的捕获探针可直接接合(例如，通过共价键或离子相互作用)，或者间接接合至该固体载体。可用的固体载体的常见例子包括磁性粒子或磁珠。
如本文所用，术语“分离”或“纯化”一般是指移除混合物中的一种或多种组分诸如样品，以与该混合物中的一种或多种其他组分分离。样品组分包括大体水溶液相中的核酸，所述样品组分可包括细胞片段、蛋白质、碳水化合物、脂质，以及其他化合物。优选实施例从该混合物的其他组分分离或移除至少70％至80％，以及更优选地约95％的靶核酸。
B.多阶段扩增的方法
如上所述，本发明的第一方面涉及一种扩增样品中的靶核酸序列的方法，该方法包括以下步骤。首先，在不支持靶核酸序列的指数级扩增的条件下，使该靶核酸序列经受第一阶段扩增反应。该第一阶段扩增反应产生第一扩增产物，该第一扩增产物随后在允许该第一扩增产物的指数级扩增的条件下经受第二阶段扩增反应，从而产生第二扩增产物。
在这个方面，该靶核酸序列可为任何RNA或者DNA序列；然而，在优选的实施例中，该靶序列是RNA序列。在一些实施例中，在该第一扩增步骤之前，该样品可在允许该第一扩增寡核苷酸杂交至样品中的靶核酸序列的一部分的条件下与第一扩增寡核苷酸接触。该第一扩增寡核苷酸通常包括靶特异性序列以及任选地一个或多个标签序列。在优选的实施例中，该标签序列可为由RNA聚合酶(诸如，T7 RNA聚合酶)识别的5’启动子序列、扩增引物结合位点、用于捕获的特异性结合位点，或者测序引物结合位点。在一些实施例中，在该第一扩增步骤之前，第二扩增寡核苷酸可与该第一扩增寡核苷酸联合使用。
在许多情况中，可能希望在该第一阶段扩增之前分离靶核酸序列。为此，该样品可在允许该靶捕获寡核苷酸杂交至该靶核酸序列的一部分的条件下与靶捕获寡核苷酸接触。在一些实施例中，该靶核酸例如通过与经固定的捕获探针相互作用被直接捕获到固体载体上。或者，该靶核酸被捕获到固体载体上作为三分子复合物的成员，其中靶捕获寡核苷酸桥接该靶核酸和经固定的捕获探针。在任何情形中，该固体载体通常包括多个磁性或者可磁化的粒子或珠粒，所述粒子或珠粒可使用磁场来操纵。优选地，分离靶核酸序列的步骤还包括洗涤该靶捕获寡核苷酸：靶核酸序列杂交体以除去可能干扰后续扩增的不期望的组分。
分离靶核酸序列的步骤有时可包括使该样品在允许第一扩增寡核苷酸杂交至该靶核酸序列的一部分的条件下与第一扩增寡核苷酸接触。在一些实施例中，该靶序列的由第一扩增寡核苷酸靶定的部分可与由靶捕获寡核苷酸靶定的部分完全不同(例如，不重叠)。或者，该靶序列的由第一扩增寡核苷酸靶定的部分可与由靶捕获寡核苷酸靶定的部分完全或者部分重叠，或者甚至相同。该第一扩增寡核苷酸通常包括靶特异性序列以及任选地一个或多个标签序列。在优选的实施例中，该标签序列可为由RNA聚合酶(诸如，T7 RNA聚合酶)识别的5’启动子序列，以及如上文所述的其他功能性位点。在一些实施例中，在靶核酸序列的分离步骤期间，第二扩增寡核苷酸可以与第一扩增寡核苷酸联合使用。预期第一扩增寡核苷酸和第二扩增寡核苷酸可形成复合物，例如，直接杂交(DH)复合物。在一些实施例中，第一扩增寡核苷酸和第二扩增寡核苷酸中的至少一者可包括位于靶特异性序列的5’处的标签序列(例如，通用标签)，在第二阶段扩增期间该标签序列可由扩增寡核苷酸靶定。
该扩增寡核苷酸引物往往提供于靶捕获试剂中。在某些优选的实施例中，该靶捕获试剂包括将用于在第一阶段扩增反应中产生特定扩增产物的多个扩增寡核苷酸中的仅一者。该扩增寡核苷酸可杂交至靶核酸，并且在靶捕获步骤期间与该靶序列一起分离。这种方法的一个优点为通过在靶捕获期间将该扩增寡核苷酸杂交至靶核酸，可洗涤捕获的核酸来除去样品组分，诸如未杂交的扩增寡核苷酸引物、提供者和/或复合物。在多重反应中，除去未杂交的扩增寡核苷酸允许发生多重扩增反应而不受过量扩增寡核苷酸的干扰，从而基本上减少或者消除多重反应常见的问题。此外，如果该扩增寡核苷酸或者扩增寡核苷酸复合物包含标签序列，那么将该标签掺入第一扩增产物，从而允许使用特异于该标签序列的引物进行后续扩增。
如上所述，第一阶段扩增反应是在不支持靶核酸序列的指数级扩增的条件下进行的。在优选的实施例中，该第一阶段扩增反应是线性扩增反应。第一阶段扩增反应将通常产生约2倍至约10,000倍的靶核酸序列扩增，以及优选地约10倍至约10,000倍的靶核酸序列扩增。在一些实施例中，第一阶段扩增反应是基本上等温的，即，该第一阶段扩增反应不涉及具有PCR以及其他普遍的扩增技术特征的热循环。通常，第一阶段扩增反应将涉及使该靶核酸序列与第一阶段扩增反应混合物接触，所述第一阶段扩增反应混合物支持靶核酸序列的线性扩增但是缺乏靶核酸序列的指数级扩增所需的至少一种组分。在一些实施例中，第一阶段扩增反应混合物包括扩增酶，该扩增酶选自逆转录酶、聚合酶，以及它们的组合。聚合酶通常选自RNA依赖性的DNA聚合酶、DNA依赖性的DNA聚合酶、DNA依赖性的RNA聚合酶，以及它们的组合。在优选的实施例中，第一阶段扩增反应混合物还包括核糖核酸酶(RNase)，诸如RNase H或者具有RNase H活性的逆转录酶。优选地，第一阶段扩增混合物包括具有RNase H活性的逆转录酶，以及RNA聚合酶。
在一些实施例中，第一阶段扩增混合物还可包括扩增寡核苷酸。优选地，该扩增寡核苷酸包含RNA聚合酶(诸如，T7 RNA聚合酶)的5’启动子序列和/或阻断的3’端，该阻断的3’端阻止该寡核苷酸的酶促延伸。此外，第一阶段扩增混合物有时可包括阻断剂寡核苷酸以阻止该靶核酸序列酶促延伸超出所需的终点。
如上所述，第一阶段扩增反应的关键特征为该反应无法支持指数级扩增反应，因为缺乏指数级扩增所需的一种或多种组分，和/或存在抑制指数级扩增的一种试剂，和/或该反应混合物的温度不利于指数级扩增等。非限制地，缺乏的指数级扩增所需组分和/或抑制剂和/或反应条件可选自以下组：扩增寡核苷酸(例如，包含RNA聚合酶的5’启动子序列的扩增寡核苷酸、非启动子的扩增寡核苷酸，或者它们的组合)、酶(例如，聚合酶，诸如RNA聚合酶)、核酸酶(例如，核酸外切酶、核酸内切酶、裂解酶、核糖核酸酶、磷酸化酶、糖基化酶等)、酶辅因子、螯合剂(例如，EDTA或者EGTA)、核糖核苷三磷酸(rNTP)、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、Mg2+、盐、缓冲液、酶抑制剂、阻断寡核苷酸、pH、温度、盐浓度，以及它们的组合。在一些情况下，该缺乏组分可间接地涉及，诸如反转存在于第一阶段反应中的指数级扩增抑制剂的效果的试剂。
如上所述，第二阶段的(或者更晚阶段的，如果存在不止2个阶段的话)扩增反应是在允许该靶核酸序列的指数级扩增的条件下进行的。因此，在优选的实施例中，第二阶段扩增反应是指数级扩增反应。就像第一阶段扩增反应一样，第二阶段扩增反应优选地是基本上等温的反应，诸如转录相关的扩增反应或者链置换扩增反应。在特别优选的实施例中，第二阶段扩增反应是转录介导的扩增(TMA)反应。
第二(或者更晚)阶段的扩增通常涉及使第一扩增产物与第二阶段扩增反应混合物接触，该第二阶段扩增反应混合物与第一阶段扩增反应混合物结合将支持靶核酸序列的指数级扩增。因此，第二阶段扩增反应混合物通常包括最少量的第一阶段扩增反应混合物所缺乏的、指数级扩增所需的一种或多种组分。在一些实施例中，第二阶段扩增反应混合物包括选自以下的组分：扩增寡核苷酸、逆转录酶、聚合酶、核酸酶、磷酸化酶、酶辅因子、螯合剂、核糖核苷三磷酸(rNTP)、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、Mg2+、最佳pH、最佳温度、盐，以及它们的组合。聚合酶通常选自RNA依赖性的DNA聚合酶、DNA依赖性的DNA聚合酶、DNA依赖性的RNA聚合酶，以及它们的组合。在一些实施例中，第二阶段扩增反应混合物还包含RNase，诸如RNase H或者具有RNase H活性的逆转录酶。在一些情况下，第二阶段扩增反应混合物包括扩增寡核苷酸、具有RNase H活性的逆转录酶，以及RNA聚合酶。
本发明的方法可用于定量生物样品中的靶核酸序列。为此，第二阶段扩增反应优选地为定量的扩增反应。通常，本发明的方法将包括使用多种检测技术检测第二扩增产物的额外步骤，所述检测技术例如，检测探针、测序反应、电泳、质谱、熔解曲线分析，或者它们的组合。优选地，第二扩增产物使用检测探针定量。在一些实施例中，该定量步骤可实时进行，例如如果用于定量的检测探针是分子信标、分子火炬(torch)、杂交开关探针，或者它们的组合，那么该定量步骤可完成。该检测探针可包括在具有基本上相同成功度的第一和/或第二阶段扩增反应中。
在一些实施例中，本发明方法还包括使第二扩增产物与另一大剂量的扩增组分接触的步骤，该另一大剂量的扩增组分选自：扩增寡核苷酸、逆转录酶(例如，具有RNase H活性的逆转录酶)、聚合酶(例如，RNA聚合酶)、核酸酶、磷酸化酶、酶辅因子、螯合剂、核糖核苷三磷酸(rNTP)、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、Mg2+、盐，以及它们的组合。这个额外步骤的目的是当一些扩增反应组分可能随时间推移而变得耗尽时提高所述组分在第二阶段扩增反应中的量。
本发明的一个密切相关的方面涉及一种用于扩增样品中的多个不同的靶核酸序列的方法，该方法包括以下步骤。首先，在不支持任何靶核酸序列的指数级扩增的条件下，使所述靶核酸序列经受第一阶段扩增反应。该第一阶段扩增反应产生多个第一扩增产物，该第一扩增产物随后在允许该第一扩增产物的指数级扩增的条件下经受第二(或者更晚)阶段扩增反应，从而产生多个第二扩增产物。
在第二方面的改进型式中，本发明提供了一种用于扩增样品中的多个不同靶核酸序列的方法，其中一些而并非所有靶核酸序列经受线性扩增，和/或一些而并非所有靶核酸序列经受指数级扩增。第一阶段扩增的至少三个变型被设想为：(1)靶序列中的一些经受线性扩增，而剩余的则保持为未扩增；(2)靶序列中的一些经受指数级扩增，而剩余的则保持为未扩增；以及(3)靶序列中的一些经受线性扩增，而剩余的则经受指数级扩增。因此，第一阶段扩增可导致所有靶核酸序列的扩增(选项3)或者仅其子集的扩增(选项1和2)。该靶核酸序列的子集可表示已知以相对较低的量存在的靶和/或相比于其他靶难以扩增的靶。第一阶段扩增反应产生一种或多种第一扩增产物。第一扩增产物(一种或多种)和该样品中任何未扩增的靶核酸序列(一种或多种)然后在允许该序列的指数级扩增的条件下经受第二阶段扩增反应，从而产生多个第二扩增产物。
应当理解的是上文结合多阶段单重(即，单个靶)扩增讨论的各种任选的要素和参数也适用于本文所述的多阶段多重扩增模式。
C.用于多阶段扩增的组合物
如上所述在第三方面中，本发明提供用于扩增样品中的靶核酸序列的组合物，该组合物包括以下组分：(a)扩增寡核苷酸，该寡核苷酸杂交至该靶核酸序列的第一部分；(b)任选的靶捕获寡核苷酸，该寡核苷酸杂交至该靶核酸序列的第二部分；以及(c)扩增酶。本发明组合物的一个关键特征是该组合物缺乏靶核酸序列的指数级扩增所需的至少一种组分。如在本申请的其他地方详细解释的，本发明的组合物的一个优点是该组合物帮助减少非特异性的扩增，从而使扩增资源集中在靶序列上。
在这个方面，该靶核酸序列可为任何RNA或者DNA序列。在一些实施例中，该靶序列的由第一扩增寡核苷酸靶定的部分可与由靶捕获寡核苷酸(如果使用的话)靶定的部分完全不同(例如，不重叠)。或者，该靶序列的由第一扩增寡核苷酸靶定的部分可与由靶捕获寡核苷酸靶定的部分完全或者部分重叠，或者甚至相同。在一些特殊情况中，该靶捕获寡核苷酸还可与该扩增寡核苷酸在结构上相同，并且除了靶捕获之外还执行扩增功能。该靶捕获寡核苷酸可直接偶联至固体载体(例如，通过共价键合)；或者，该组合物还可包括偶联至固体载体的捕获探针，使得该捕获探针杂交至该靶捕获寡核苷酸的一部分。该固体载体优选地包括多个磁性或者可磁化的粒子或珠粒，所述粒子或珠粒可使用磁场来操纵。
如上所述，本发明组合物的扩增寡核苷酸可包含靶特异性序列和由RNA聚合酶(诸如，T7 RNA聚合酶)识别的5’启动子序列。在一些实施例中，该组合物可包括至少两种扩增寡核苷酸，其中一种可包含RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶)的5’启动子序列。包含启动子的扩增寡核苷酸还可包括阻断的3’端，该阻断的3’端阻止该寡核苷酸的酶促延伸。在那些其中所述组合物包括两种或更多种扩增寡核苷酸的情况中，所述寡核苷酸可形成复合物，例如，DH复合物。该DH复合物可包括非启动子的扩增寡核苷酸，该非启动子的扩增寡核苷酸包括在其5’端处接合至连接成员的靶特异性序列，该连接成员用于将该非启动子的扩增寡核苷酸连接至该DH复合物中的第二扩增寡核苷酸。第二扩增寡核苷酸通常包含RNA聚合酶(诸如T7 RNA聚合酶)的5’启动子序列。如在上文结合单引物扩增更详细解释的，该第二扩增寡核苷酸有时可包括阻断的3’端，该阻断的3’端阻止该寡核苷酸的酶促延伸。该非启动子的扩增寡核苷酸的连接成员通常包括与第二扩增寡核苷酸的一部分互补的核苷酸序列。在其中第二扩增寡核苷酸包括启动子序列的情况中，第一扩增寡核苷酸的连接成员优选地包括与第二扩增寡核苷酸的启动子序列的一部分互补的核苷酸序列。在一些实施例中，所述扩增寡核苷酸中的至少一者可包括位于靶特异性序列的5’处的标签序列(例如，通用标签)。此外，本发明组合物可包括阻断剂寡核苷酸以阻止该靶核酸序列酶促延伸超出所需的终点。
本发明组合物的扩增酶可为以下形式：逆转录酶、聚合酶，或者它们的组合。聚合酶可选自RNA依赖性的DNA聚合酶、DNA依赖性的DNA聚合酶、DNA依赖性的RNA聚合酶，以及它们的组合。该组合物优选地还包括RNase，诸如RNase H或者具有RNase H活性的逆转录酶。在一些情况下，该组合物还可包括检测探针以实时监测等温扩增反应，该检测探针可选自分子信标、分子火炬、杂交开关探针，以及它们的组合。
如上所述，本发明组合物的一个关键特征是该组合物缺乏靶核酸序列的指数级扩增所需的至少一种组分。缺乏的指数级扩增所需组分可为扩增寡核苷酸(例如，启动子引物或者非启动子引物)、聚合酶(例如，RNA聚合酶)、核酸酶、磷酸化酶、酶辅因子、螯合剂、一种或多种核糖核苷三磷酸(rNTP)、Mg2+、最佳pH、最佳温度、盐、最佳盐浓度，或者它们的组合。应当理解的是，该罗列并非为穷举性的并且可包括进行指数级扩增反应所必需的其他组分。
在希望达成多重扩增的情况下，本发明组合物可包括多个不同的靶捕获寡核苷酸和多个不同的扩增寡核苷酸，所述寡核苷酸杂交至多个不同的靶核酸序列。
如上所述，本发明还提供了一种用于扩增样品中的多个不同靶核酸序列的替代性组合物。这种替代性组合物包括以下组分：(a)多个不同的扩增寡核苷酸复合物，该复合物杂交至多个不同的靶核酸序列，其中每种扩增寡核苷酸复合物包括具有第一靶特异性序列的第一扩增寡核苷酸，该第一扩增寡核苷酸直接或间接地接合到具有第二靶特异性序列的第二扩增寡核苷酸；以及(b)扩增酶。再次地，所述组合物缺乏靶核酸序列的指数级扩增所需的至少一种组分。
第一扩增寡核苷酸和第二扩增寡核苷酸中的一者通常包含RNA聚合酶(诸如T7RNA聚合酶)的5’启动子序列。如在上文结合单引物扩增更详细解释的，该包含启动子的扩增寡核苷酸可包括阻断的3’端，该阻断的3’端阻止该寡核苷酸的酶促延伸。在一些实施例中，第一扩增寡核苷酸和第二扩增寡核苷酸中的至少一者还可包括位于靶特异性序列的5’处的标签序列(例如，通用标签)。该组合物还可包括阻断剂寡核苷酸以阻止该靶核酸序列酶促延伸超出所需的终点。
在一些实施例中，该组合物还可包括杂交至该靶核酸序列的多个不同的靶捕获寡核苷酸。该靶捕获寡核苷酸可直接偶联至固体载体(例如，通过共价键合)；或者，该组合物还可包括偶联至固体载体的捕获探针，使得该捕获探针杂交至该靶捕获寡核苷酸的一部分。该固体载体优选地包括多个磁性或者可磁化的粒子或珠粒，所述粒子或珠粒可使用磁场来操纵。
如上所述，本文公开的方法和组合物可用于体外扩增靶核酸序列，从而产生可检测的扩增序列来指示样品中靶核酸的存在。所述方法和组合物可用于合成扩增核酸，从而提供可用的信息来进行医疗病症的诊断和/或预后、检测环境和/或食物样品的纯度或质量，或者探索法医证据。所述方法和组合物是有利的，因为它们允许合成各种核酸以提供相对迅速且进行成本低的、宽动态范围的高灵敏度测定，这使得它们适用于高通量和/或自动化体系。所述方法和组合物可用于分析单一靶序列即单重扩增体系的测定，并且特别可用于同时分析多个不同的靶序列，即多重扩增体系的测定。优选的组合物和反应混合物被提供于包括所定义的可用测定组分的试剂盒中，因为所述试剂盒允许使用者在测定中有效地执行一起使用所述组分的方法，从而扩增所需的靶。
本文所述的组合物和方法的实施例可通过以下例子来进一步了解。本文已经描述了在所述例子中使用的方法步骤，并且以下信息描述了在具有更多特殊性的方法中使用的典型试剂和条件。核酸扩增领域内的技术人员将会意识到，也可使用将不会实质上影响过程或结果的其他试剂和条件，只要遵循以上说明中所提供的指导即可。例如，尽管转录介导的扩增(TMA)方法在以下例子中有所描述，但是受权利要求书保护的方法不限于基于TMA的实施例。此外，分子生物学领域内的技术人员还将了解到，所公开的方法和组合物可手动进行或者以在自动化装置中执行一个或多个步骤(例如，移液、混合、温育等)的系统进行，或者可用于任何类型的已知装置(例如，试管、多管单元装置、多孔装置诸如96孔微孔板等等)。
实例
在所述实例所描述的方法中使用的示例性试剂包括以下物质。
“样品运送培养基”或者“STM”是磷酸盐缓冲液(pH 6.7)，该缓冲液包括EDTA、EGTA，以及十二烷基硫酸锂(LLS)。
“靶捕获试剂”或者“TCR”是HEPES缓冲液(pH 6.4)，该缓冲液包括氯化锂和EDTA，以及250μg/mL的磁性粒子(1微米的SERA-MAGTMMG-CM粒子，印第安纳州印第安纳波利斯的Seradyn公司(Seradyn,Inc.Indianapolis,IN))，其中(dT)14寡核苷酸共价地结合至所述磁性粒子。
“靶捕获洗涤液”或者“TC洗涤液”是HEPES缓冲液(pH 7.5)，该缓冲液包括氯化钠、EDTA、0.3％(v/v)的无水乙醇、0.02％(w/v)的对羟基苯甲酸甲酯、0.01％(w/v)的对羟基苯甲酸丙酯，以及0.1％(w/v)的月桂基硫酸钠。
“扩增试剂”或者“AR”是HEPES缓冲液(pH 7.7)，该缓冲液包括氯化镁、氯化钾、四种脱氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、四种核糖核苷三磷酸(rATP、rCTP、rGTP和rUTP)。可将引物和/或探针在扩增试剂中添加到反应混合物，或者该引物和/或探针可与试剂分开添加(无引物的扩增试剂)。
如在扩增或者预扩增反应混合物中所使用的“酶试剂”或者“ER”是HEPES缓冲液(pH 7.0)，该缓冲液包括MMLV逆转录酶(RT)、T7 RNA聚合酶、盐和辅因子。
实例1
标准单阶段扩增方案
用于实时检测结果的标准单阶段TMA反应的示例性方案如下所述。该测定包括在扩增前纯化靶核酸、扩增，以及在扩增期间检测扩增产物。
靶捕获是基本上如此前所详细描述地进行的(美国专利No.6,110,678、6,280,952和6,534,273)。简而言之，样品被制备为包含已知量的靶RNA(体外转录物(“IVT”)，该转录物在总体积为400mL的水和样品运送培养基的1:1(v:v)混合物中以每单位样品预定的拷贝水平存在)。将每一样品与100mL的TCR混合，该TCR通常包含5pmol的、特异于待捕获的分析物核酸(即，3'靶特异性结合区域)和5'尾部区域(例如，dT3A30序列)的靶捕获寡核苷酸(TCO)，该靶捕获寡核苷酸用于结合至经固定的探针(例如，连接到顺磁性粒子的聚胸腺嘧啶寡核苷酸；每一反应中有12.5μg的、连接有寡核苷酸的粒子)。将所述混合物在60±1℃下温育25至30分钟，然后在室温下(20至25℃)放置25至30分钟以形成杂交复合物，靶核酸通过该杂交复合物结合至通过磁性分离装置(例如，KingFisher96TM磁性粒子处理器(KingFisher96TM magnetic particle processor)，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Inc.,Waltham,MA))而分离的顺磁性粒子，并且使用TC洗涤液洗涤一次。
将粒子在0.075mL的扩增试剂中重悬，并且该粒子带有在扩增中所使用的扩增寡核苷酸。检测探针(例如，用荧光标记物化合物标记的分子信标或者分子火炬探针)可与扩增寡核苷酸一起添加，或者与酶一起添加，或者在此之后添加酶。反应混合物经遮盖以防止蒸发，并且在42±0.5℃下温育1至2分钟。在使所述混合物保持在42±0.5℃的同时，对其去除遮盖并与每单位混合物0.025mL的酶试剂混合，再次遮盖并且在42±0.5℃下温育30至40分钟，在该温育期间以固定的时间间隔测量荧光(例如，每分钟测量一次或者每分钟读取若干次)，所述时间间隔被称为用于数据采集和显示的“循环”，所述数据采集和显示通常为检测到的荧光单位对时间的曲线图，从该曲线图可以确定信号出现的时间(“T时间”，即样品的荧光信号变得高于预定的背景水平的时间)。
实例2
正向TMA形式的双阶段HIV-1扩增的评估
在该实例中，双阶段正向TMA使用人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)、包含pol区的亚型B靶模板进行评估。
在此处所使用的双阶段扩增方法(该方法在图1中简要概述)中，T7引物在靶捕获期间杂交至靶HIV-1序列，然后移除过量的T7引物。该扩增过程被分成两个不同的阶段。在第一阶段期间，将非T7引物与所有必需的扩增试剂、检测试剂和酶试剂一起引入，额外的T7引物除外。在存在逆转录酶的情况下，延伸杂交至该靶的T7引物，构建cDNA拷贝，并且通过该逆转录酶的RNase H活性使靶RNA模板降解。非T7引物随后杂交至该cDNA然后被延伸，从而填充该T7引物的启动子区并且构建有活性的双链模板。T7聚合酶随后从该模板产生多个RNA转录物。非T7引物随后杂交至所述RNA转录物并且被延伸，从而产生靶RNA模板的无启动子cDNA拷贝。该RNA链是通过逆转录酶的RNase活性降解的。因为在第1阶段的扩增混合物中没有T7引物可用，所以该反应无法进一步进行。然后用T7引物的添加起始第二阶段，从而引发在第1阶段中产生的cDNA库的指数级扩增。
从该双阶段方法的初始评估获得的结果示出于图3A-图3C中。图3A示出经改进以模拟该双阶段形式的单阶段扩增实验的结果。更具体地讲，在靶捕获步骤期间添加该T7引物(使得从该方案中消除标准的60℃退火步骤)；在第一阶段中未添加引物或酶试剂；并且将非T7引物和T7引物以及酶试剂添加至第二阶段以引发指数级扩增。为了解决用于标准单阶段对照的此改进方案可能已在一定程度上危害了该标准单阶段对照的性能的问题，我们将改进的单阶段正向方案与标准单阶段正向TMA(图2A-图2B)作比较。如从图2A和图2B可见，这两种方案得到高度相似水平的检测精度和灵敏度。相反地，与标准单阶段形式相比，在这些条件下双阶段方案在分析物浓度低端(约20拷贝/反应)处获得显著改善的灵敏度和精度(图3B)。要注意的是，该双阶段形式获得了在精度和较短检测时间方面的优越性能(图3C)。
实例3
双阶段HIV-1扩增参数的优化
在优化过程中需优先考虑的是减缓出现时间并且分离各个靶输入水平，从而允许准确和精确的定量，以及减少对非T7引物的任何推定性干扰。该优先考虑是通过在第二阶段中通过滴定降低T7引物浓度来实现的(在图3B中所示出的双阶段反应中的用量为10pmol/rxn)。该测定显示为在最低量的所测试的T7提供者(1.0pmol/rxn；图4A-图4D)时保持10拷贝/反应的灵敏度和高精度。
同样，非T7引物也通过滴定降低(在图3B中所示出的双阶段反应中的用量为15pmol/rxn)，同时保持T7引物恒定于1pmol/rxn。已发现10pmol/rxn的水平足以在不损失精度的情况下进行灵敏的扩增(图5A)。在2pmol/rxn的非T7引物水平时，10拷贝/反应时的精度不如10pmol/rxn的非T7引物水平时那样好(图3B)，但是测定的性能仍然优于单阶段对照的性能(图3A)。
因此，本发明人出乎意料地发现该双阶段扩增形式允许实质上降低引物浓度并仍然获得比单阶段形式优越的性能，同时减少副产物形成和多重干扰。
还检验了在第二阶段中对额外大剂量的酶的需要(图6A-图6C)。对第一阶段的酶添加的限制得到在所测试的分析物浓度低端处精度的适度改善(图6B和图6C)。此外，相对于其中在两个阶段中皆存在酶试剂的双阶段形式，每一拷贝水平迟大约五分钟出现。然而，此前观察到的灵敏度改善得到保持。
实例4
HPV16的双阶段扩增
为了确定该双阶段扩增形式是否具有超出HIV-1检测的广泛适用性，用人乳头瘤病毒亚型16(HPV16)测试该双阶段扩增形式。
该双阶段扩增方案与上文在实例2中所描述的方案基本上相同。简而言之，T7引物在靶捕获期间杂交至靶HPV16序列，然后移除过量的T7引物。在扩增的第一阶段期间，将非T7引物与所有必需的扩增试剂、检测试剂和酶试剂一起添加，额外的T7引物除外。在42℃下静置五分钟后，将T7引物添加到该反应混合物中以引发指数级扩增阶段，该阶段也在42℃下进行，伴有实时检测。使用与如在实例1中所述的标准单阶段正向TMA形式中相同的引物和检测探针进行该单阶段对照实验。
该HPV16扩增实验的结果示出于图7A-图7C中。如图7A所示，该单阶段形式能够检测最低至约500拷贝/毫升(约200拷贝/反应)的靶模板，而该双阶段形式使灵敏度改善了15倍以上，达到约30拷贝/毫升(约13拷贝/反应)(图7B)。此外，与我们先前的观察相符，相比于单阶段形式，该双阶段扩增形式与检测时间的显著减少相关联(图7C)。
实例5
PCA3的双阶段扩增
此外，用前列腺癌抗原3(PCA3)测试该双阶段扩增形式。
使用类似的双阶段扩增方案。简而言之，T7引物在靶捕获期间杂交至靶PCA3序列，然后移除过量的T7引物。在扩增的第一阶段期间，将非T7引物与所有必需的扩增试剂和酶试剂一起添加，额外的T7引物和分子火炬检测探针除外。在42℃下静置五分钟后，将T7引物和检测探针添加到该反应混合物中以起始指数级扩增阶段，该阶段也在42℃下进行，伴有实时检测。使用与标准单阶段TMA形式中相同的引物和检测探针进行该单阶段对照实验。
该PCA3扩增实验的结果示出于图8A-图8C中。如从图8A-图8B可见，相比于标准单阶段形式，双阶段形式在分析物浓度低端(约130拷贝/毫升，其等同于约50拷贝/反应)处获得显著改善的灵敏度和精度。此外，类似于我们先前的观察，相比于单阶段形式，该双阶段扩增形式与检测时间的显著减少相关联(图8C)。
实例6
PCA3和T2-ERG的双阶段共扩增
接下来，我们利用双阶段扩增形式来进行多个靶的同时扩增。在该实例中，使用双阶段正向TMA方案共扩增PCA3和T2-ERG靶模板，从而确定双重扩增是否将得到与我们此前在单重测定中已经观察到的(实例2-5)相同的灵敏度和精度改善，以及是否提供对在标准单阶段形式中往往会观察到的分析物之间干扰的减少。
简而言之，T7引物在靶捕获期间杂交至靶PCA3和T2-ERG序列，然后移除过量的T7引物。在扩增的第一阶段期间，将非T7引物与所有必需的扩增试剂、检测试剂和酶试剂一起添加，额外的T7引物除外。在42℃下静置五分钟后，将T7引物添加到该反应混合物中以引发指数级扩增阶段，该阶段也在42℃下进行，伴有使用两个不同的荧光通道(每个靶一个通道)的实时检测。使用与如在实例1中所述的标准单阶段正向TMA形式中相同的引物和检测探针进行该单阶段对照实验。
在存在T2-ERG的情况下的PCA3扩增结果示出于图9A-图9C。如从图9A-图9B可见，相比于标准单阶段形式，双阶段形式在分析物浓度低端(约1,250拷贝/毫升，其等同于约500拷贝/反应)处获得显著改善的灵敏度和精度。这些结果证明该双阶段形式有效减少了多重反应中分析物之间的干扰。此外，与我们先前的观察相符，相比于单阶段形式，该双阶段扩增形式与检测时间的显著减少相关联(图9C)。
在存在PCA3的情况下的T2-ERG扩增结果示出于图9D-图9F中。如图9D所示，该单阶段形式能够检测最低至约500拷贝/毫升(约200拷贝/反应)的靶模板，而该双阶段形式使灵敏度改善了至少10倍，达到约50拷贝/毫升(约20拷贝/反应)(图9E)。这些结果还证明了该双阶段形式有效减少了多重反应中分析物之间的干扰。此外，与我们先前的观察相符，相比于单阶段形式，该双阶段扩增形式与检测时间的显著减少相关联(图9F)。
要注意的是，多重扩增形式中经改善的测定灵敏度和精度，以及减少的竞争反应间干扰的组合优点(即，如通过单一分析物和双分析物性能的比较所证实的那样，诸如如图8A所示的单阶段形式中仅PCA3的性能，其中1.1×103个拷贝产生强信号，以及如图9A所示的单阶段形式中在存在T2的情况下PCA3的性能，其中1.25×103个PCA3拷贝产生弱信号(由于来自T2的干扰)，以及如图9B所示的双阶段形式中在存在T2的情况下PCA3的性能，其中1.25×103个PCA3拷贝产生非常强的信号，这是因为由T2造成的干扰显著减少)是双阶段形式的测定的一般特征。这些显著的优点在此陈述之前并未被预测到。该双阶段核酸扩增方法的这种特征的其他证明如下。
实例7
PCA3、PSA和T2-ERG的双阶段共扩增
在该实例中，使用双阶段正向TMA方案共扩增PCA3、PSA和T2-ERG靶模板，从而确定三重扩增是否将得到与我们此前在单重和双重测定中已经观察到的(实例2-6)相同的灵敏度和精度改善。
简而言之，T7引物在靶捕获期间杂交至靶PCA3、PSA和T2-ERG序列，然后移除过量的T7引物。在扩增的第一阶段期间，将非T7引物与所有必需的扩增试剂、检测试剂和酶试剂一起添加，额外的T7引物除外。在42℃下静置五分钟后，将T7引物添加到该反应混合物中以引发指数级扩增阶段，该阶段也在42℃下进行，伴有使用三个不同的荧光通道(每个靶一个通道)的实时检测。使用与如在实例1中所述的标准单阶段正向TMA形式中相同的引物和检测探针进行该单阶段对照实验。
在存在PSA和T2-ERG的情况下的PCA3扩增结果示出于图10A-图10C。如图10A所示，该单阶段形式能够检测最低至约12,500拷贝/毫升(约5,000拷贝/反应)的靶模板，而该双阶段形式使灵敏度改善了10倍，达到约1,250拷贝/毫升(约500拷贝/反应)(图10B)。此外，与我们先前的观察相符，相比于单阶段形式，该双阶段扩增形式与检测时间的显著减少相关联(图10C)。
在存在PCA3和PSA的情况下的T2-ERG扩增结果示出于图10D-图10F。如图10D所示，该单阶段形式能够检测最低至约5,000拷贝/毫升(约2,000拷贝/反应)的靶模板，而该双阶段形式使灵敏度改善了100倍，达到约50拷贝/毫升(约20拷贝/反应)(图10E)。此外，与我们先前的观察相符，相比于单阶段形式，该双阶段扩增形式与检测时间的显著减少相关联(图10F)。
在存在PCA3和T2-ERG的情况下的PSA扩增结果示出于图10G-图10I。如图10G所示，该单阶段形式能够检测最低至约125,000拷贝/毫升(约50,000拷贝/反应)的靶模板，而该双阶段形式使灵敏度改善了10倍以上，达到约12,500拷贝/毫升(约500拷贝/反应)(图10H)。此外，与我们先前的观察相符，相比于单阶段形式，该双阶段扩增形式与检测时间的显著减少相关联(图10I)。
实例8
T2-ERG的双阶段反向TMA形式扩增
在该实例中，我们使用T2-ERG作为靶模板测试了双阶段反向TMA方案。这与所有的先前操作实例相反，其中使用各种正向TMA方案。反向TMA的概述在上文中是结合单引物扩增陈述的。
在此处所用的双阶段反向TMA方案中，非T7引物在靶捕获期间杂交至靶T2-ERG序列的3’端，然后移除过量的非T7引物。该扩增过程被分成两个不同的阶段。在第一阶段期间，将T7启动子提供者与所有必需的扩增试剂、检测试剂和酶试剂一起引入，额外的非T7引物除外。该T7启动子提供者在3’端处被阻断，从而使该T7启动子提供者无法酶促地延伸。在存在逆转录酶的情况下，延伸杂交至该靶的非T7引物，构建cDNA拷贝，并且通过该逆转录酶的RNase H活性使靶RNA模板降解。该T7启动子提供者随后杂交至该cDNA的3’端，并且进一步延伸该cDNA的3’端，从而填充该T7启动子提供者的启动子区并且构建有活性的双链模板。T7聚合酶随后从该模板产生与该靶模板相同的多个RNA转录物。因为在第1阶段的扩增混合物中没有非T7引物可用，所以该反应无法进一步进行。然后用非T7引物的添加起始第二阶段，从而引发在第1阶段中产生的RNA转录物库的指数级扩增。
双阶段反向TMA实验的结果示出于图11B。图11A示出经改进以模拟该双阶段形式的对照单阶段反向TMA实验的结果。更具体地讲，在靶捕获步骤期间添加该非T7引物(使得从该方案中消除标准的60℃退火步骤)；在第一阶段中未添加引物或酶试剂；并且将非T7引物和T7启动子提供者以及酶试剂添加至第二阶段以引发指数级扩增。如从图11A和图11B可见，相比于改进的单阶段反向TMA形式，双阶段反向TMA形式在分析物浓度低端(约50拷贝/反应)处获得显著改善的灵敏度和精度。再次地，该双阶段形式获得在精度和较短检测时间方面的优越性能(图11C)。
实例9
T2-ERG、PCA3、PSA和CAP的双阶段反向TMA形式共扩增
在该实例中，使用两个不同的双阶段反向TMA方案共扩增T2-ERG、PCA3、PSA和内部对照(CAP)靶模板，从而确定四重扩增是否将得到与我们此前在单重、双重和三重测定中已经观察到的(实例2-8)相同的灵敏度和精度改善。
在存在500,000拷贝/反应的PCA3、5,000,000拷贝/反应的PSA和5,000拷贝/反应的CAP的情况下(空心圆形)或者在仅存在5,000拷贝/反应的CAP的情况下(实心菱形)，25拷贝/反应的T2-ERG(其非常难以在存在其他靶的情况下以低水平扩增)的检测示出于图12A-图12C中。图12A示出以如上文在实例8中所述的改进的单阶段反向TMA形式进行的对照实验的结果。图12B示出使用如也在实例8中所述的双阶段反向TMA形式的双阶段实验的结果。简而言之，非T7引物在靶捕获期间杂交至靶T2-ERG、PCA3、PSA和CAP序列，然后移除过量的非T7引物。在扩增的第一阶段期间，将T7启动子提供者与所有必需的扩增试剂、检测试剂和酶试剂一起添加，额外的非T7引物除外。在42℃下静置五分钟后，将非T7引物添加到该反应混合物中以引发指数级扩增阶段，该阶段也在42℃下进行，伴有使用四个不同的荧光通道(每个靶一个通道)的实时检测。如从图12A和图12B可见，相比于改进的单阶段反向TMA形式，双阶段反向TMA形式在存在PCA3、PSA和CAP的情况下于25拷贝/反应的T2-ERG处获得改善的灵敏度和精度，以及在仅存在CAP的情况下于25拷贝/反应的T2-ERG处获得显著改善的灵敏度和精度。这些结果还证明了该双阶段形式有效减少了多重反应中分析物之间的干扰。此外，与我们先前的观察相符，相比于单阶段形式，该双阶段扩增形式与检测时间的减少相关联。
图12C示出了不同双阶段形式的结果，其中在该反应的第一阶段中，PCA3、PSA和CAP(或者仅CAP)经受线性扩增，而T2-ERG经受指数级扩增，以及在第二阶段中，PCA3、PSA和CAP经受指数级扩增，而T2-ERG继续指数级地扩增(所有的四个扩增反应在相同容器中进行)。靶特异性引物在扩增的不同阶段之间的分布在下表1中示出。如从图12A和图12C可见，相比于改进的单阶段反向TMA形式，这种不同的双阶段反向TMA形式在存在PCA3、PSA和CAP的情况下或者在仅存在CAP的情况下于25拷贝/反应的T2-ERG处获得显著改善的灵敏度。如同在先前实例中所述的双阶段形式一样，这些结果证实这种不同的双阶段形式有效减少了多重反应中分析物之间的干扰。此外，相比于单阶段形式，这种不同的双阶段扩增形式与检测时间的减少相关联。
表1
分析物 靶捕获 第一阶段 第二阶段
T2-ERG 非T7引物 非T7引物+T7启动子提供者 ---
PCA3 非T7引物 T7启动子提供者 非T7引物
PSA 非T7引物 T7启动子提供者 非T7引物
CAP 非T7引物 T7启动子提供者 非T7引物
实例10
T2-ERG、PCA3、PSA和CAP的三阶段反向TMA形式共扩增
在该实例中，使用双阶段和三阶段反向TMA方案共扩增T2-ERG、PCA3、PSA和内部对照(CAP)靶模板，从而确定三阶段扩增是否可在分析物浓度低端处产生灵敏度和/或精度的额外改善。
在存在500,000拷贝/反应的PCA3、5,000,000拷贝/反应的PSA和5,000拷贝/反应的CAP的情况下(空心圆形)或者在仅存在5,000拷贝/反应的CAP的情况下(实心菱形)，150拷贝/反应的T2-ERG的检测示出于图13A-图13C中。图13A示出以如上文在实例8中所述的改进的单阶段反向TMA形式进行的对照实验的结果。图13B示出使用如也在实例8中所述的双阶段反向TMA形式的双阶段实验的结果。灵敏度和精度通过使用双阶段形式而得到改善。
图13C示出三阶段实验的结果，其中在第1阶段中T2-ERG经受线性扩增而其他3种分析物不扩增，在第2阶段中T2-ERG经受指数级扩增而其他3种分析物不扩增，以及在第3阶段中PCA3、PSA和CAP(或者仅CAP)经受指数级扩增而T2-ERG继续指数级地扩增(所有的这些扩增反应在相同的容器中进行)。靶特异性引物在扩增的不同阶段之间的分布在下表2中示出。如从图13A和图13C可见，相比于改进的单阶段反向TMA形式，这种三阶段反向TMA形式在存在PCA3、PSA和CAP的情况下或者在仅存在CAP的情况下于150拷贝/反应的T2-ERG处获得灵敏度和精度两者的极大改善。这些结果还证明了这种三阶段形式有效减少了多重反应中分析物之间的干扰。此外，相比于单阶段形式，这种三阶段扩增形式与检测时间的减少相关联。
表2
分析物 靶捕获 第一阶段 第二阶段 第三阶段
T2-ERG 非T7引物 T7启动子提供者 非T7引物 ---
PCA3 非T7引物 --- --- 非T7引物+T7启动子提供者
PSA 非T7引物 --- --- 非T7引物+T7启动子提供者
CAP 非T7引物 --- --- 非T7引物+T7启动子提供者
如上文所述，已经开发出并且证实多阶段扩增形式对于若干不同的核酸靶，以及这些靶的组合都可行。相比于标准单阶段形式，多阶段扩增形式使检测限得到显著改善，这种改善将转化成定量限的类似改善。
虽然已经参考某些优选的实施例相当详细地描述和示出本发明，但是本领域内的技术人员将易于理解本发明的其他实施例。因此，本发明被认为包括以下所附权利要求书的精神和范围所涵盖的所有修改形式和变型形式。

Claims (14)

1.一种定量样品中的靶核酸序列的方法，包括以下步骤：
(a)在允许第一扩增寡核苷酸杂交至所述靶核酸序列的第一部分的条件下，使所述样品与特异于所述靶核酸序列的所述第一部分的所述第一扩增寡核苷酸接触，从而产生包含所述第一扩增寡核苷酸和所述靶核酸序列的预扩增杂交体；
(b)通过靶捕获到固体载体上，然后洗涤以移除任何未在步骤(a)中杂交至所述靶核酸序列的所述第一部分的所述第一扩增寡核苷酸来分离所述预扩增杂交体；
(c)在支持在步骤(b)中分离的所述预扩增杂交体的所述靶核酸序列的至少一部分的线性扩增但是不支持其指数级扩增的条件下，在第一阶段扩增反应混合物中，在第一阶段等温的转录相关的扩增反应中扩增所述在步骤(b)中分离的所述预扩增杂交体的所述靶核酸序列的至少一部分，从而获得包含第一扩增产物的反应混合物，
其中，所述第一阶段扩增反应混合物包含第二扩增寡核苷酸，所述第二扩增寡核苷酸与所述第一扩增寡核苷酸的延伸产物的一部分互补，以及
其中，所述第一扩增产物不是用于在所述第一阶段等温的转录相关的扩增反应期间进行核酸合成的模板；
(d)将包含所述第一扩增产物的所述反应混合物与参与所述第一扩增产物的指数级扩增但是在包含所述第一扩增产物的所述反应混合物中缺乏的至少一种组分合并，以产生第二阶段扩增反应混合物，
其中所述第二阶段扩增反应混合物另外包含序列特异性杂交探针；
(e)在第二阶段等温的转录相关的扩增反应中在所述第二阶段扩增反应混合物中进行所述第一扩增产物的指数级扩增，从而合成第二扩增产物；
(f)用所述序列特异性杂交探针以固定的时间间隔检测所述第二阶段扩增反应混合物中所述第二扩增产物的合成；以及
(g)使用从步骤(f)获得的结果来定量所述样品中的所述靶核酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一扩增寡核苷酸包含对于RNA聚合酶的3’靶特异性序列和5’启动子序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述第二扩增寡核苷酸是在所述第一阶段的、等温的、转录相关的扩增反应中酶促延伸的。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述固体载体包含经固定的捕获探针。
6.根据权利要求5所述的方法，
其中步骤(a)还包括使所述样品与杂交至所述靶核酸序列的靶捕获寡核苷酸接触，并且
其中所述预扩增杂交体包含杂交至所述靶捕获寡核苷酸和所述第一扩增寡核苷酸中的每一者的所述靶核酸序列。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述固体载体包含磁性吸引的粒子。
8.根据权利要求1所述的方法，
其中所述第一阶段和第二阶段的、等温的、转录相关的扩增反应中的每一者包含RNA聚合酶和逆转录酶，并且
其中所述逆转录酶具有内源性的RNaseH活性。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种组分包含所述第一扩增寡核苷酸。
10.根据权利要求2所述的方法，
其中步骤(c)的所述第一扩增产物是cDNA分子，所述cDNA分子具有与所述样品中的所述靶核酸序列相同的极性，并且
其中步骤(e)的所述第二扩增产物是RNA分子。
11.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)中的所述序列特异性杂交探针是构象敏感的探针，所述探针在杂交至所述第二扩增产物时产生可检测的信号。
12.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)中的所述序列特异性杂交探针是荧光标记的序列特异性杂交探针。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中步骤(g)包括使用线性校正曲线和从步骤(f)获得的结果定量所述样品中的所述靶核酸序列。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括在所述第一阶段扩增反应混合物中扩增10倍至10,000倍。
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