JP6464086B2 - 多相核酸増幅 - Google Patents
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Description
この出願は、2012年8月30日に出願された米国仮出願第61/695,106号および2013年7月15日に出願された米国仮出願第61/846,538号の利益を主張する。これらの先の出願の全体の開示は、参考として本明細書に援用される。
本発明は、全般的には、分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ユニプレックスおよびマルチプレックス反応の両方における増幅の効率および精度を増加させるために有用であり、定量化の特徴が改善されたより高感度の核酸標的検出ならびにマルチプレックス反応における分析物間のより低い干渉を可能にする、核酸の多相in vitro増幅に関する。
核酸増幅は、相対的に稀なもしくは未知の核酸配列の複数コピーを生成するため、核酸の供給源を同定するため、または容易に検出可能な量の提供に十分な核酸を作製するための手段を提供する。増幅は、多くの応用、例えば、配列決定、診断法、創薬、法医学検査、環境解析や食品検査において有用である。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、レプリカーゼ媒介性増幅、鎖置換増幅(SDA)、「ローリングサークル」型の増幅および様々な転写関連増幅方法等、in vitroで核酸配列を増幅するための多くの方法が公知である。これらの公知の方法は、種々の方法を使用することにより通常検出される、増幅された配列を作製する異なる技法を使用する。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
(項目1)
試料中の標的核酸配列を定量化する方法であって、前記方法は:
(a)前記標的核酸配列の第1の部分への第1の増幅オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記試料を、前記標的核酸配列の前記第1の部分に特異的な前記第1の増幅オリゴヌクレオチドと接触させ、これにより、前記第1の増幅オリゴヌクレオチドおよび前記標的核酸配列を含む増幅前ハイブリッドを生成するステップと、
(b)固体支持体上に標的捕捉し、続いて洗浄して、ステップ(a)において前記標的核酸配列の前記第1の部分にハイブリダイズしなかったあらゆる前記第1の増幅オリゴヌクレオチドを除去することにより、前記増幅前ハイブリッドを単離するステップと、
(c)第1相増幅反応混合物において、その線形増幅を支持するが、その指数関数的増幅を支持しない条件下で、第1相の実質的に等温性の転写関連増幅反応で、ステップ(b)において単離された前記増幅前ハイブリッドの前記標的核酸配列の少なくとも一部分を増幅し、これにより、第1の増幅産物を含む反応混合物をもたらすステップであって、ここで
前記第1相増幅反応混合物が、第2の増幅オリゴヌクレオチドを含み、前記第2の増幅オリゴヌクレオチドが、前記第1の増幅オリゴヌクレオチドの伸長産物の部分に相補的であり、かつ
前記第1の増幅産物が、前記第1相の実質的に等温性の転写関連増幅反応中の核酸合成の鋳型ではない、ステップと、
(d)前記第1の増幅産物を含む前記反応混合物を、前記第1の増幅産物の指数関数的増幅に関与するが、前記第1の増幅産物を含む前記反応混合物から欠如している少なくとも1種の構成成分と組み合わせて、第2相増幅反応混合物を産生するステップであって、ここで
前記第2相増幅反応混合物が、配列特異的ハイブリダイゼーションプローブをさらに含む、ステップと、
(e)前記第2相増幅反応混合物において、第2相の実質的に等温性の転写関連増幅反応で、前記第1の増幅産物の指数関数的増幅を行い、これにより、第2の増幅産物を合成するステップと、
(f)前記配列特異的ハイブリダイゼーションプローブを用いて、規則的な時間間隔で、前記第2相増幅反応混合物における前記第2の増幅産物の合成を検出するステップと、
(g)ステップ(f)の結果を使用して、前記試料中の前記標的核酸配列を定量化するステップと
を含む、方法。
(項目2)
前記第1の増幅オリゴヌクレオチドが、3’標的特異的配列と、RNAポリメラーゼの5’プロモーター配列とを含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記RNAポリメラーゼが、T7 RNAポリメラーゼである、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記第2の増幅オリゴヌクレオチドが、前記第1相の等温性の転写関連増幅反応で酵素的に伸長される、項目1〜3のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
前記固体支持体が、固定化された捕捉プローブを含む、項目1〜4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
ステップ(a)が、前記試料を、前記標的核酸配列にハイブリダイズする標的捕捉オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含み、そして
前記増幅前ハイブリッドが、前記標的捕捉オリゴヌクレオチドおよび前記第1の増幅オリゴヌクレオチドのそれぞれにハイブリダイズした前記標的核酸配列を含む、
項目1〜5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記固体支持体が、磁気的に誘引できる粒子を含む、項目1〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記第1相の等温性の転写関連増幅反応および前記第2相の等温性の転写関連増幅反応のそれぞれが、RNAポリメラーゼおよび逆転写酵素を含み、そして
前記逆転写酵素が、内在性RNaseH活性を含む、
項目1〜7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記少なくとも1種の構成成分が、前記第1の増幅オリゴヌクレオチドを含む、項目1〜8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
ステップ(c)の前記第1の増幅産物が、前記試料中の前記標的核酸配列と同じ極性を有するcDNA分子であり、そして
ステップ(e)の前記第2の増幅産物が、RNA分子である、
項目1〜9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
ステップ(d)における前記配列特異的ハイブリダイゼーションプローブが、前記第2の増幅産物にハイブリダイズすると検出可能なシグナルを産生するコンフォメーション感受性プローブである、項目1〜10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
ステップ(d)における前記配列特異的ハイブリダイゼーションプローブが、蛍光標識された配列特異的ハイブリダイゼーションプローブである、項目1〜11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
ステップ(g)が、線形較正曲線およびステップ(f)の結果を使用して、前記試料中の前記標的核酸配列を定量化するステップを含む、項目1〜12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
ステップ(c)が、前記第1相増幅反応混合物において10倍〜10,000倍増幅するステップを含む、項目1〜13のいずれか一項に記載の方法。
他に断りがなければ、本明細書に使用されている科学および技術用語は、技術文献、例えば、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology、第2版(Singletonら、1994年、John Wiley & Sons、New York、NY)または分子生物学に関する他の周知の技術刊行物に基づく、分子生物学の技術分野の当業者によって一般に理解されている意義と同じ意義を有する。他に断りがなければ、本明細書に用いられているまたは考慮されている技法は、分子生物学の技術分野において周知の標準方法である。開示されている方法および組成物の態様の理解に役立つように、本明細書に記載されている実施形態により、いくつかの用語をより詳細に説明または図解する。
上に記す通り、本発明の第1の態様は、次のステップを含む、試料中の標的核酸配列を増幅するための方法に関する。最初に、標的核酸配列は、標的核酸配列の指数関数的増幅を支持しない条件下で、第1相の増幅反応に付される。第1相の増幅反応は、第1の増幅産物を生成し、これはその後、第1の増幅産物の指数関数的増幅を可能にする条件下で、第2相の増幅反応に付され、これにより、第2の増幅産物を生成する。
上に記す通り、第3の態様では、本発明は、次の構成成分を含む、試料中の標的核酸配列を増幅するための組成物を提供する:(a)標的核酸配列の第1の部分にハイブリダイズする増幅オリゴヌクレオチド、(b)標的核酸配列の第2の部分にハイブリダイズする任意選択の標的捕捉オリゴヌクレオチドおよび(c)増幅酵素。本組成物の主要な特色の1つは、標的核酸配列の指数関数的増幅に必要とされる少なくとも1種の構成成分を欠くことである。本願の他の箇所に詳細に説明されている通り、本組成物の利点の1つは、非特異的増幅の低下に役立ち、これにより、標的配列に対し増幅資源を集中させることである。
標準単相増幅プロトコール
リアルタイムで結果を検出する標準単相TMA反応のための例示的なプロトコールを次に記す。アッセイは、増幅前の標的核酸の精製、増幅および増幅において増幅された産物の検出を含む。
フォワードTMAフォーマットにおける二重相HIV−1増幅の評価
本実施例において、pol領域を含有するヒト免疫不全ウイルス1(HIV−1)、サブタイプB標的鋳型を使用して、二重相フォワードTMAを評価した。
二重相HIV−1増幅パラメータの最適化
最適化プロセスにおける第1の優先順位は、出現時間を遅らせ、個々の標的インプットレベルを分離して、的確かつ正確な定量化を可能にすると共に、非T7プライマーへのいかなる推定上の干渉も低下させることであった。これは、第2相においてT7プライマー濃度を下げつつ用量設定することにより達成された(図3Bに描写されている二重相反応において使用された量は、10pmol/rxnであった)。アッセイは、検査した最低量のT7プロバイダーにより(1.0pmol/rxn;図4A〜図4D)、10コピー/rxn感度および高精度を保持することが示された。
HPV16の二重相増幅
二重相増幅フォーマットが、HIV−1検出を超える広い適用性を有するか否か決定するために、これをヒトパピローマウイルスサブタイプ16(HPV16)において検査した。
PCA3の二重相増幅
加えて、前立腺がん抗原3(PCA3)において二重相増幅フォーマットを検査した。
PCA3およびT2−ERGの二重相共増幅
次に、本発明者らは、複数標的の同時増幅のための二重相増幅フォーマットを用いた。本実施例において、二重相フォワードTMAプロトコールを使用してPCA3およびT2−ERG標的鋳型を共増幅して、デュプレックス増幅が、ユニプレックスアッセイにおいて以前に本発明者らが観察した(実施例2〜5)感度および精度における同じ改善をもたらすかどうか、また、標準単相フォーマットにおいて観察されることが多い分析物間の干渉の低下を生じるかどうかを決定した。
PCA3、PSAおよびT2−ERGの二重相共増幅
本実施例において、二重相フォワードTMAプロトコールを使用して、PCA3、PSAおよびT2−ERG標的鋳型を共増幅して、トリプレックス増幅が、ユニプレックスおよびデュプレックスアッセイにおいて以前に本発明者らが観察した(実施例2〜6)感度および精度の同じ改善をもたらすかどうかを決定した。
二重相リバースTMAフォーマットにおけるT2−ERGの増幅
本実施例において、本発明者らは、標的鋳型としてT2−ERGを使用して二重相リバースTMAプロトコールを検査した。これは、様々なフォワードTMAプロトコールが用いられる先行する実行された全実施例とは対照的であった。リバースTMAの概要は、単一プライマー増幅に関連して上に表記されている。
二重相リバースTMAフォーマットにおけるT2−ERG、PCA3、PSAおよびCAPの共増幅
本実施例において、2種の異なる二重相リバースTMAプロトコールを使用して、T2−ERG、PCA3、PSAおよび内部対照(CAP)標的鋳型を共増幅して、クアドロプレックス増幅が、ユニプレックス、デュプレックスおよびトリプレックスアッセイにおいて以前に本発明者らが観察した(実施例2〜8)感度および精度における同じ改善をもたらすかどうかを決定した。
三重相リバースTMAフォーマットにおけるT2−ERG、PCA3、PSAおよびCAPの共増幅
本実施例において、二重相および三重相リバースTMAプロトコールを使用して、T2−ERG、PCA3、PSAおよび内部対照(CAP)標的鋳型を共増幅して、三重相増幅が、分析物濃度のローエンドにおいて感度および/または精度に追加的な改善を生じ得るかどうかを決定した。
Claims (12)
- 試料中の標的核酸配列を定量化する方法であって、前記方法は:
(a)前記標的核酸配列の第1の部分への第1の増幅オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記試料を、前記標的核酸配列の前記第1の部分に特異的な前記第1の増幅オリゴヌクレオチドと接触させ、これにより、前記第1の増幅オリゴヌクレオチドおよび前記標的核酸配列を含む増幅前ハイブリッドを生成するステップと、
(b)固体支持体上に標的捕捉し、続いて洗浄して、ステップ(a)において前記標的核酸配列の前記第1の部分にハイブリダイズしなかったあらゆる前記第1の増幅オリゴヌクレオチドを除去することにより、前記増幅前ハイブリッドを単離するステップと、
(c)第1相増幅反応混合物において、前記第1相増幅反応混合物が、前記第1の増幅オリゴヌクレオチドの伸長産物の部分と相補的である第2の増幅オリゴヌクレオチドと、前記増幅前ハイブリッドにのみ存在する前記第1の増幅オリゴヌクレオチドとを含むことに起因して、その線形増幅を支持するが、その指数関数的増幅を支持しない条件下で、第1相の、転写関連であって実質的に等温性の増幅反応で、ステップ(b)において単離された前記増幅前ハイブリッドの前記標的核酸配列の少なくとも一部分を増幅し、これにより、前記標的核酸配列を増幅することによって得られる第1の増幅産物を含む反応混合物をもたらすステップであって、ここで
前記第1の増幅産物が、前記標的核酸配列の配列を有し、かつ
前記第1の増幅産物が、前記第1相の、転写関連であって実質的に等温性の増幅反応中の核酸合成の鋳型ではない、ステップと、
(d)前記第1の増幅産物および前記第2の増幅オリゴヌクレオチドを含むステップ(c)からの前記反応混合物を、前記第1の増幅オリゴヌクレオチドを含む少なくとも1種の構成成分と組み合わせて、第2相増幅反応混合物を産生するステップであって、ここで
前記第2相増幅反応混合物が、配列特異的ハイブリダイゼーションプローブをさらに含む、ステップと、
(e)前記第2相増幅反応混合物において、第2相の、転写関連であって実質的に等温性の増幅反応で、前記第1の増幅産物の指数関数的増幅を行い、これにより、第2の増幅産物を合成するステップと、
(f)前記配列特異的ハイブリダイゼーションプローブを用いて、規則的な時間間隔で、前記第2相増幅反応混合物における前記第2の増幅産物の合成を検出するステップと、
(g)ステップ(f)の結果を使用して、前記試料中の前記標的核酸配列を定量化するステップと
を含む、方法。 - 前記第1の増幅オリゴヌクレオチドが、3’標的特異的配列と、RNAポリメラーゼの5’プロモーター配列とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記RNAポリメラーゼが、T7 RNAポリメラーゼである、請求項2に記載の方法。
- 前記第2の増幅オリゴヌクレオチドが、前記第1相の等温性の転写関連増幅反応で酵素的に伸長される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固体支持体が、固定化された捕捉プローブを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)が、前記試料を、前記標的核酸配列にハイブリダイズする標的捕捉オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含み、そして
前記増幅前ハイブリッドが、前記標的捕捉オリゴヌクレオチドおよび前記第1の増幅オリゴヌクレオチドのそれぞれにハイブリダイズした前記標的核酸配列を含む、
請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。 - 前記固体支持体が、磁気的に誘引できる粒子を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1相の等温性の転写関連増幅反応および前記第2相の等温性の転写関連増幅反応のそれぞれが、RNAポリメラーゼおよび逆転写酵素を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)における前記配列特異的ハイブリダイゼーションプローブが、前記第2の増幅産物にハイブリダイズすると検出可能なシグナルを産生するコンフォメーション感受性プローブである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)における前記配列特異的ハイブリダイゼーションプローブが、蛍光標識された配列特異的ハイブリダイゼーションプローブである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(g)が、線形較正曲線およびステップ(f)の結果を使用して、前記試料中の前記標的核酸配列を定量化するステップを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)が、前記第1相増幅反応混合物において10倍〜10,000倍増幅するステップを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
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