DE69535240T2 - Zusammensetzungen und Verfahren für die gleichzeitige Detektion und Quantifizierung von einer Mehrheit spezifischer Nuklein Säure Sequenzen - Google Patents

Zusammensetzungen und Verfahren für die gleichzeitige Detektion und Quantifizierung von einer Mehrheit spezifischer Nuklein Säure Sequenzen Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zum gleichzeitigen Detektieren und Quantifizieren mehrerer Nukleinsäureanalyten in einer einzelnen Probe. Die vorliegende Erfindung umfasst besonders die Verwendung von zwei oder mehreren verschiedenen chemilumineszierenden Verbindungen, die mit einzelsträngigen Nukleinsäurehybridisierungssonden gekoppelt sind. Wenn jede Sonde mit seiner Ziel-Nukleinsäure selektiv hybridisiert ist, kann die chemilumineszierende Verbindung oder der "Marker", der daran gekoppelt ist, vom Marker, der mit einer nicht hybridisierten Sonde gekoppelt ist und von einem anderen Marker, der mit einer anderen Ziel-Nukleinsäure hybridisiert ist, unterschieden werden. Nach dem Auslösen einer Chemilumineszenzreaktion ist das emittierte Licht ein Hinweis auf das Vorhandensein oder die Menge jeder hybridisierten Sonde und daher auch für das Vorhandensein oder die Menge jeder Ziel-Nukleinsäure. Die vorliegende Erfindung offenbart auch Verfahren zum separaten Detektieren und/oder Messen des Lichtes, das von jedem Chemilumineszenzmarker in einem einzelnen Röhrchen als ein Hinweis auf das Vorhandensein und/oder die Menge von zwei oder mehr Nukleinsäureanalyten emittiert wird.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Lichtemission als Ergebnis einer chemischen Reaktion ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Chemie bekannt. Siehe Schuster und Schmidt, Chemiluminescence of Organic Compounds, in Advances in Physical Organic Chemistry 18:187–238 (V. Gold & D. Bethel Hrsg., Academic Press 1982). Zusätzlich hat man das Absorbieren oder die Diffusion von Licht bei einer oder mehreren Wellenlängen zum Quantifizieren von bakteriellen Zellen in Suspensionen (Siehe Manual of Methods for General Bacteriology 191 (American Society for Microbiology 1981) für das Messen der Nukleinsäure- und Proteinkonzentration in Lösung (id. bei 456 bzw. 359) und als ein Mittel zum Nachverfolgen der Reinigung verschiedener Verbindungen durch Chromatographie und andere Reinigungs- und Trennungstechniken angewendet. Jedoch sind diese zuletzt genannten Techniken im Allgemeinen nicht spezifisch im Bezug auf die Identifizierung einer bestimmten Verbindung, wie zum Beispiel einer Protein- oder Nukleinsäurespezies.
  • Die Verwendung von chemilumineszierenden Reagenzien als Markerreagenzien in Analyt spezifischen Immunologischen Assays ist im Stand der Technik bekannt. Siehe z.B., W. Rudolf Seitz, Immunoassay Labels based on Chemiluminescence and Bioluminescence, Clin. Chem. 17:120–126 (1984). Die Verwendung von Acridinium-Derivaten als spezifische Markerreagenzien in solchen Assays ist beschrieben worden in Weeks et al., Acridinium Esters as High Specific Activity Labels in Immunoassays, Clin. Chem. 29:1474–1478 (1983).
  • Assays, die chemilumineszierende Marker oder "Reportergruppen" verwenden, verfahren gemäß einem verallgemeinerten Mechanismus. Bei diesem Mechanismus reagiert die Licht emittierende Verbindung mit einer zweiten Verbindung, was dazu führt, dass die Licht emittierende Verbindung in einen kurzlebigen hochenergenen Status übergeht. Wenn das angeregte Molekül schrittweise in einen niedrigenergenen Status zurückkehrt, wird ein Photon emittiert. Die Reaktion kann oder kann nicht zusätzliche Co-Faktoren oder Katalysatoren einschließen, um die Reaktion zu fördern oder zu beschleunigen. In einer Population solcher Moleküle kann das emittierte Licht in einer lichtmessenden Vorrichtung, die Luminometer genannt wird, gemessen werden. Die Menge des gemessenen Lichts ist proportional zur Konzentration der reagierenden lumineszierenden Verbindungen in der Testprobe.
  • Wenn daher die Verbindung physikalisch mit einem Analyten assoziiert ist, ist die Menge des erzeugten Lichts ebenfalls proportional zur Menge des Analyten in der Probe, so lange wie jeglicher Überschuss oder nicht assoziiertes chemilumineszierendes Reagenz vor der Reaktion und Messung aus der Probe entfernt worden ist. Die Verbindung kann direkt an den Analyten gebunden sein oder kann an eine Verbindung geknüpft oder gebunden sein, die selber dazu in der Lage ist, mit dem Analyten physikalisch zu assoziieren. Ein Beispiel für das Letztgenannte wäre, wenn das chemilumineszierende Reagenz an einen Antikörper, der für den entsprechenden Analyten spezifisch ist oder an eine einzelsträngige Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure, deren Vorhandensein in der Testprobe vermutet wird, komplementär ist, gebunden ist.
  • Verschiedene Assaysysteme für das Messen von mehr als einem spezifischen Analyten in einer einzelnen Testprobe sind beschrieben worden. In Gorski et al., J. Histochem. and Cytochem. 25:881–887 (1977) wurde ein einzelner Marker, Acridinorange, als wesentlicher fluoreszierender Farbstoff in gemischten Lymphozytenkulturen verwendet. Nach dem Anfärben wurden die Kulturen bei zwei verschiedenen Wellenlängen beobachtet. Da der Farbstoff, der zwischen die Basen der Nukleinsäuren interkaliert, Licht im grünen Bereich emittiert, wenn er mit DNA assoziiert ist, und im roten Bereich, wenn er mit RNA assoziiert ist, ist es möglich, gleichzeitig die gesamte zelluläre DNA und RNA durch Beobachten dieser beiden Wellenlängebereiche zu messen.
  • Verschiedene Assaysysteme sind entworfen worden, die zwei oder mehrere Radioisotope verwenden, von denen jedes in ein Bindungspaar, wie zum Beispiel ein Mitglied eines Antikörper-Antigenpaares, eines Rezeptor-Substratpaares oder einem von zwei komplementären Nukleinsäuresträngen, inkorporiert ist. Durch das Verwenden von Radionukliden, die verschiedene Arten von Energie emittieren (wie zum Beispiel γ-Strahlung und β-Partikelemission) oder Energien verschiedener Intensitäten, ist es möglich, zwischen den zwei Radionukliden zu unterscheiden und dadurch zwischen den Verbindungen, in die sie eingebaut sind. Szintillation und Gammazähler sind kommerziell erhältlich und können den radioaktiven Zerfall auf mehr als einen Kanal gleichzeitig messen.
  • Daher werden in einem Radioimmunoassay (RIA) mit mehreren konkurrierenden Analyten zwei oder mehrere Populationen von Analytmolekülen mit verschiedenen Radioisotopen einer bekannten spezifischen Aktivität (mCi Radioisotop/mmol Analyt) markiert. Wenn eine Testprobe mit den markierten Analyten vermischt wird, wird der unmarkierte Analyt in der Testprobe mit dem markierten Analyten um die Bindung an einen unmarkierten spezifischen Bindungspartner konkurrieren. Die Menge des unmarkierten Analyten in der Testprobe ist im Vergleich zur Menge, die ohne die Zugabe der Testprobe gemessen wird, proportional zur Abnahme des Signals.
  • Radioaktive Assays haben offensichtlich Nachteile. Nichtradioaktive Verfahren zum Detektieren und Messen eines Analyten in der Testprobe sind im Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel sind enzymgebundene Immunoassays, die Biotin und Avidin, Kohlenwasserstoffe und Lectine verwenden, beschrieben worden, wie auch Assaysysteme, die Fluoreszenzreportergruppen, wie zum Beispiel Fluoreszein und Rhodamin sowie chemilumineszierende Reportergruppen verwenden. Einige dieser Systeme sind in der Sensitivität mit der sie den entsprechenden Analyten detektieren können, aufgrund der inhärenten Empfindlichkeit des Markers und/oder durch die spektralen oder kinetischen Charakteristika der bestimmten oder chemilumineszierenden Verbindung inhärent begrenzt.
  • Gleichzeitig ablaufende Assays für mehrere Analyten unter Verwendung von Fluoreszenzreportergruppen mit hoher Quantenausbeute werden aufgrund des relativ breiten Spektrums und der hohen Hintergründe, die diese Reagenzien mit sich bringen, schwieriger.
  • Nichtradioaktive Mehrfachmarkersysteme für das Messen von Proteinen sind beschrieben worden; Vuori et al., Clin. Chem. 37:2087–2092 (1991), und Nukleinsäuren; Iitia et al., Mol. and Cell. Probes 6:505–512 (1992), in denen Chelate von fluoreszierenden Lanthaniden (z.B. Europium, Samarium und Terbium) mit einem spezifischen Bindungspaar gekoppelt sind. Die unbekannten Komponenten werden entweder durch ein kompetetives Immunoassay oder durch Nukleinsäurehybridisierung untersucht, und es wird die Fluoreszenz gemessen. Die fluoreszierenden Lanthanide weisen enge Emissionssignale auf und die Komponenten der Paare Eu3+/Sm3+ und Eu3+/Tb3+ weisen Emissionsmaxima auf, die ausreichend voneinander entfernt liegen, so dass sie voneinander unterschieden werden können. Darüber hinaus ist der Fluoreszenzzerfall von Eu nach der Anregung relativ langlebig, während der von Sm und Tb sehr kurz ist, was einen anderen Weg zur Unterscheidung der Signale ergibt: Durch das Messen der Fluoreszenz jedes Chelats zu verschiedenen Zeiten.
  • Ein verallgemeinertes Mehrfachanalyt-Assaysystem unter Verwendung von Acridiniumesterderivaten als Reportergruppe wurde beschrieben von Woodhead et al., PCT Anmeldung WO 91/00511, wobei sie nicht als Stand der Technik anzusehen ist und gemeinsame Eigentümerschaft mit der vorliegenden Anmeldung genießt. Khalil et al., PCT Anmeldung WO 92/12255 beschreibt ein Festphasen-Dualanalyt-Immunoassaysystem, das ein Acridinium- oder Phenanthridiniumderivat als erstes chemilumineszierendes Reagenz und ein 1,2-Dioxethan, das durch die Alkaline Phosphatase oder β-Galaktosidase in ein Zwischenprodukt der Chemilumineszenzreaktion umgewandelt wird, als ein zweites chemilumineszierendes Reagenz verwendet. Das Acridiniumderivat ergibt ein kurzlebiges Photonensignal nach der Reaktion mit einer Auslöser-Lösung, wie zum Beispiel H2O2. Das Dioxethan ergibt ein langlebigeres Signal, wenn es durch Zugabe des geeigneten Enzyms ausgelöst wird. Jedes dieser Reagenzien kann mit einem spezifischen Bindungspaar verbunden werden und wird in einem Festphasen-Sandwich-Immunoassay verwendet. Jedes Signal wird über einen anderen Zeitraum gemessen.
  • WO-A-89/02476 offenbart Marker, dessen Stabilität sich nachweisbar verändert, wenn die Sonde, mit der sie verknüpft sind, hybridisiert ist, vorausgesetzt, dass ein homogenes Assay bereitgestellt wird.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt die gleichzeitige Detektion und Quantifizierung von mehr als einer spezifischen Nukleinsäuresequenz in einer Probe. Jedes der Markerreagenzien der vorliegenden Erfindung wird speziell mit einer spezifischen Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonde verknüpft, die markierten Sonden werden vermischt und man lässt sie mit irgendeiner in der Testprobe vorhandenen. Nukleinsäure, die eine Sequenz aufweist, die im Wesentlichen komplementär zur Sondensequenz ist, hybridisieren, um eine Hybridisierung unter geeigneten selektiven Mitteln zu ermöglichen. Ein Reagenz kann dann zur Lösung zugegeben werden, das das Markerreagenz, das mit der unhybridisierten markierten Sonde assoziiert ist, spezifisch verändert, während das Markerreagenz, das mit den hybridisierten Sonden assoziiert ist, im Wesentlichen unverändert bleibt. Dadurch wird jedem Markerreagenz eine unterschiedliche Resistenz gegenüber dem Verlust des Chemilumineszenzpotentials verliehen, abhängig davon ob der Marker mit einer hybridisierten oder unhybridisierten Sonde assoziiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der hybridisierte mit der Sonde assoziierte Marker auf diese Weise geschützt.
  • Für gewöhnlich jedoch nicht notwendigerweise, wird die Reaktion von wenigstens zwei chemilumineszierenden Reagenzien gleichzeitig ausgelöst und das sich dabei ergebende Licht, das von jedem Chemilumineszenzreagenz emittiert wird, wird im Wesentlichen gleichzeitig detektiert und gemessen. Jedoch ist bei einigen Arten der vorliegenden Erfindung, zum Beispiel im mehrfach pH-Modus, der weiter unten diskutiert wird, die Detektion und Messung von einem oder mehreren chemilumineszierenden Reagenzien ein separates zeitliches Ereignis zur Detektion und Messung eines oder mehrerer anderer chemilumineszierender Reagenzien.
  • Das emittierte Licht kann abhängig vom gewünschten Mehrfachanalytdetektionsmodus unterschiedlich gemessen. werden. Demnach kann das Licht detektiert und gemessen werden: 1) bei zwei oder mehreren verschiedenen Wellenlängen, 2) während eines vorbestimmten Zeitraums, 3) bei mehr als einer Reaktionsbedingung (wie zum Beispiel verschiedene Konzentrationen an Wasserstoffionen) oder 4) in einer Kombination dieser Verfahren. Abhängig vom Modus und den spezifischen ausgewählten Chemilumineszenzreagenzien ermöglichen die Daten, die von diesen Lichtmessungen erhalten werden, das getrennte Detektieren und Messen jedes Chemilumineszenzmarkers in der Testprobe als ein Hinweis auf die Menge jedes der darin vorhandenen Analyten.
  • Ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung ist daher das Design und die Auswahl von Paaren oder chemilumineszierenden Reagenzien, die Signale emittieren können, die sich ausreichend voneinander unterscheiden oder unter ausreichend verschiedenen Bedingungen separat detektiert werden können und nach dem Auftreten eines oder mehrerer die Reaktion auslösender Ereignisse gemessen werden können.
  • Genauso wichtig ist es, dass die Mitglieder jedes Paares oder Reagenzes der vorliegenden Erfindung vergleichbar empfänglich gegenüber einem Verlust ihrer Chemiluminsezenzreaktivität sind und vergleichbar resistent gegenüber diesem Verlust, abhängig davon, ob sie mit einer hybridisierten oder unhybridisierten Sonde gekoppelt sind. Aufgrund dieser zuletzt genannten Eigenschaften sind die Markerreagenzien der vorliegenden Erfindung besonders gut, obwohl sie darauf nicht begrenzt sind, in einem homogenen Assaysystem verwendbar, in dem das Vorhandensein und die Quantifizierung der entsprechenden Analyten, ohne die Notwendigkeit für den an den Analyten gebundenen Marker physikalisch von dem ungebundenen Marker vor der Detektion getrennt zu sein, detektiert und gemessen werden kann.
  • Der Anmelder zieht jedoch in Betracht, dass die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung auch in heterogenen Systemen oder in Kombinationen von homogenen und heterogenen Assaysystemen verwendet werden können. Nur als Beispiel und nicht zur Begrenzung des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung, kann solch ein System das Durchführen einer anderen Hydrolyse einer unhybridisierten Sonde, die bevorzugt das markierte Hybrid (eine markierte einzelsträngige Oligonukleotidsonde und eine unmarkierte Ziel-Nukleinsäure umfassend) und nicht die unhybridisierte markierte Oligonukleotidsonde an einen festen Träger, wie zum Beispiel eine polykationische Mikrosphäre, bindet, das Abtrennen einer hybridisierten von einer unhybridisierten Sonde und dann das Messen der Chemilumineszenz des mit dem Hybrid assoziierten Markers, entweder während dieser immer noch an den Träger gebunden ist oder nach der Elution vom Träger, einschließen. Verfahren zum differentiellen hydrolisieren von Acridiniumestermarkern, die mit einer unhybridisierten Sonde gekoppelt sind, gegenüber der gleichen Verbindung, die mit einer hybridisierten Sonde gekoppelt ist, werden von Arnold et al., US Patent Nr. 5,283,174, die eine gemeinsame Eigentümerschaft mit der vorliegenden Erfindung genießt, beschrieben.
  • Demnach machen die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung Verwendung von der Kombination der beiden oben genannten Eigenschaften: die Fähigkeit jedes Mitglieds eines Satzes von Markerverbindungen ein separat unterscheidbares Signal (Unterscheidbarkeit) zu emittieren und die Fähigkeit jedes Mitglieds eines Satzes einem Verlust der Chemilumineszenzaktivität gegenüber empfänglich zu sein oder vor dem Verlust geschützt zu sein, abhängig davon, ob der Marker mit einer hybridisierten oder unhybridisierten Sonde (Selektivität) gekoppelt ist. Diese beiden Eigenschaften hängen nicht nur von der Struktur der Markerverbindungen selbst ab, sondern auch von der molekularen Umgebung in der sie während des Verlaufs des Assays angeordnet sind. Zusätzliche Faktoren können daher, ohne Begrenzung, die Art und Anordnung der Anbindung des Markers an die Nukleinsäuresonde, die Zusammensetzung der Assaylösung, die Natur und die Reaktivität von nahe gelegenen chemischen Resten, die sterischen Eigenschaften der markierenden Verbindung und jede Veränderung in der molekularen Konfiguration oder Konformation des gebundenen Markers relativ zur Nukleinsäuresonde nach der Hybridisierung der Sonde mit seiner Ziel-Nukleinsäure, einschließen.
  • Die hierin beschriebenen beispielhaften Markerreagenzien sind Acridiniumderivate, die Licht emittieren können, wenn man sie mit einem auslösenden Reagenz, zum Beispiel einer alkalischen Lösung oder Wasserstoffperoxid, reagieren lässt. Jedoch erwägt der Anmelder, dass andere chemilumineszierende Marker oder Verfahren (z.B. Elektrochemilumineszenz) und auslösende Reagenzien im Mehrfachanalytassay der vorliegenden Offenbarung verwendet werden können, wobei solche Verbindungen und Verfahren für den Fachmann im Lichte der Offenbarung dieser Anmeldung offensichtlich sein werden. Dementsprechend werden die folgenden Beispiele beigebracht, um vollständig und klar das beste Verfahren der vorliegenden Erfindung zu beschreiben, das dem Anmelder zu diesem Zeitpunkt bekannt ist, und dienen nicht dazu den Schutzumfang der Erfindung auf irgendeine Art und Weise zu beschränken.
  • Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein schnelles kosteneffektives und einfaches Verfahren zum gleichzeitigen Detektieren zweier oder mehrerer verschiedener Nukleinsäuresequenzen in einer Testprobe bereit zu stellen, wobei das Assay in einem einzelnen Assayröhrchen durchgeführt werden kann.
  • Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ein schnelles, nichtradioaktives Assay für das gleichzeitige Quantifizieren von mehr als einer verschiedenen Nukleinsäuresequenz in einer Testprobe bereit zu stellen, wobei wenigstens zwei chemilumineszierende Markerverbindungen an unterschiedliche Oligonukleotid-Hybridisierungssonden gekoppelt sind, wobei jede mit wenigstens einer dieser Sequenzen hybridisieren kann. Nach dem Hybridisieren reagieren die gebundenen chemilumineszierenden Marker, was zum Emittieren von Licht führt, das in einem Luminometer gemessen wird. Die Wellenlängen und Reaktionskinetiken der Lichtemission für jede Markerverbindung sind ausreichend einzigartig, um das getrennte Messen der Menge jedes Markerreagenzes in der Testprobe zu erlauben. Ein Luminometer kann emittiertes Licht über einen Bereich von Wellenlängen als ein einzelnes Ereignis messen oder kann jeden der zahlreichen engen Wellenlängenbereiche gleichzeitig unabhängig voneinander messen. Beispiele für das zuletzt genannte sind im Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel kann man zwei oder mehrere Photomultiplierröhren (PMTs) verwenden, wobei jede eine andere Wellenlänge oder Bereich von Wellenlängen misst, um gleichzeitig die gleiche Probe zu messen, oder einen Diodenarraydetektor, der mehr als eine Wellenlänge emittierten Lichts gleichzeitig messen kann.
  • Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Auswählen von verschiedenen Markerverbindungen bereitzustellen, die mit Oligonukleotidsonden gekoppelt werden können, wobei jede Verbindung vergleichbar empfänglich gegenüber dem Verlust des Chemiluminszenzpotentials ist, abhängig davon, ob sie mit einer hybridisierten oder unhybridisierten Sonde assoziiert ist.
  • Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ein schnelles Assayverfahren bereitzustellen, um zu Detektieren ob mehr als eine Spezies eines Organismus in einer Testprobe vorhanden ist.
  • Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ein empfindliches Assaysystem zum Detektieren oder Quantifizieren des Vorhandenseins von mehr als einer Art einer Nukleinsäure in einer Probe, die eine kleine Anzahl von jedem Typ des Nukleinsäuremoleküls enthält, bereitzustellen.
  • Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung chemilumineszierende Markerreagenzien bereitzustellen, die für die Verwendung in einem Mehrfachanalyt-Nukleinsäurehybridisierungsassaysystem geeignet sind, wobei jedes Reagenz bis zur Reaktion mit einem auslösenden Reagenz ausreichend stabil ist, um in einem quantitativen Assay für das Vorhandensein mehrerer Analyten verwendet werden zu können.
  • Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung chemilumineszierende Markerreagenzien mit ausreichend verschiedenen Reaktionskinetiken bereitzustellen, um die Differenzierung der Signale für jede Reaktion und die separate Messung dieser Signale zu ermöglichen. Beispielsweise können die "Licht Aus" Eigenschaften eines Mitglieds eines Satzes von zwei Mitgliedern dazu führen, dass die gesamte Chemilumineszenz sehr schnell nach dem Vermischen des auslösenden Reagenzes mit dem gebundenen Marker emittiert wird. Das andere Mitglied des Satzes kann "Licht Aus" Eigenschaften aufweisen, die einen relativ langen Zeitraum für die Lichtemission nach Zugabe des auslösenden Reagenzes einschließt. Durch Messen der Chemilumineszenz zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Zugabe des auslösenden Reagenzes und Durchführen einer Analyse des Lichts, das während dieses Zeitraums emittiert worden ist, können die Signale wirksam differenziert und getrennt gemessen werden.
  • Es ist ein anderes Ziel des vorliegenden Erfindung chemilumineszierende Markerreagenzien bereitzustellen, die nach einem "Licht Aus" Licht in ausreichend engen und bei verschiedenen Wellenlängen emittieren, und durch Auswählen der geeigneten Wellenlängenbereiche zur Messung können die Signale ausreichend unterschieden werden, um ein gebundenes Markerreagenz von einem oder mehreren anderen gebundenen Markerreagenzen, sogar wenn sie gleichzeitig gemessen werden, zu unterscheiden.
  • Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung chemilumineszierende Reagenzien bereitzustellen, die für die Verwendung als Reportergruppen entworfen worden sind, wobei jedes dieser Reagenzien, das an eine andere Oligonukleotid-Hybridisierungssonde gebunden ist, spezifisch mit einer Ziel-Nukleinsäure mit einer Sequenz, die ausreichend komplementär dazu ist, hybridisieren kann, um die Detektion der Ziel-Nukleinsäure unter Hybridisierungsbedingungen zu ermöglichen. Ein Merkmal der bevorzugten chemilumineszierenden Reagenzien und des Assayverfahrens ist, das, wenn die Oligonukleotid-Hybridisierungssonde, an die jedes dieser Reagenze gebunden ist, mit seiner Ziel-Nukleinsäure hybridisiert, jedes der Reagenzien der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, die diese Population der Reagenzien, die an die unhybridisierte Oligonukleotidsonde gebunden ist, abbauen wird, auf vergleichbare Weise vor dem Abbau geschützt wird. Ein zusätzliches Merkmal der chemilumineszierenden Reagenzien der vorliegenden Erfindung ist, dass sie für den Abbau vergleichbar empfänglich sind, wenn sie mit unhybridisierten Sonden gekoppelt sind. Ein noch anderes Merkmal des bevorzugten Verfahrens ist, dass, obwohl die Marker vor dem Abbau geschützt sind, wenn sie mit einem doppelsträngigen Nukleinsäurebereich assoziiert sind, jeder dieser Marker vergleichbar empfänglich ist für die Reaktion mit einem geeigneten auslösenden Reagenz, das das Auslösen einer Chemilumineszenzreaktion zur Folge hat.
  • Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Detektieren und Quantifizieren von mehr als einem Analyten in einer Probe in einem einzelnen Analysegefäß durch Durchführen der Chemilumineszenzreaktion bei verschiedenen pH-Werten durch Verwenden von Acridiniumesterderivaten, die verschiedene pH-Optima für die Chemilumineszenzreaktion aufweisen, bereitzustellen. Dies wird durch Markieren eines Mitglieds eines Analyt:Sonden-Bindungspaares mit einem ersten Acridiniumester und dem Markieren von Mitgliedern von einem oder mehreren anderer Analyt:Sonden-Bindungspaaren mit einem oder mehreren anderen Acridiniumestern bewerkstelligt. Nachdem es den betreffenden Mitgliedern ermöglicht wurde, mit ihrem Analytpaar, falls vorhanden, zu binden, werden die ungebundenen Marker selektiv hydrolisiert, um das Chemilumineszenzpotential des daran gebundenen Acridiniumesters zu zerstören. Der verbleibende Acridiniumester, der mit den Sonden:Analyt-Komplexen gekoppelt ist, wird dann bei einem ersten pH "ausgeschaltet" (lighted off) und die Lichtemissionscharakteristika der sich daraus ergebenden Reaktion werden über die Zeit gemessen. Der pH wird auf einen anderen pH-Wert eingestellt und die Lichtemissionscharakteristika werden wiederum über die Zeit gemessen. Dieses Verfahren ist nicht auf die Verwendung von zwei pH-Werten begrenzt: Es wird ohne weiteres ersichtlich, dass drei oder mehr chemilumineszierende Verbindungen verwendet werden können, die verschiedene pH-Optima für die Chemilumineszenzreaktion aufweisen. Darüber hinaus kann dieses Verfahren in Kombination mit anderen Diskriminierungsverfahren, die hierin beschrieben werden, wie zum Beispiel durch Messen des emittierten Lichts bei verschiedenen Wellenlängen oder Beobachten der Reaktionskinetiken, das Ausnutzen von Unterschieden in den Wellenlängen oder den Reaktionskinetiken, um das Vorhandensein von mehr als einen Analyten bei jeder pH-Erhöhung zu messen oder zu detektieren, verwendet werden.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt die Strukturen repräsentativer Acridiniumesterderivate, die als bevorzugte Ausführungsformen der Markerreagenze in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Innerhalb der Struktur von 1- oder 3-me-AE, 1- oder 3-me-o-F-AE und 1- oder 3-me-m-diF-AE wird einer Methylgruppe nahe der 2 Position des Acridiniumrings dargestellt; das zeigt, dass die Methylgruppe entweder in der 1 oder 3 Position angebunden sein kann.
  • 2 ist ein Diagramm, das vorhergesagte Paare von Acridiniumesterderivaten darstellt, die zusammen im Mehrfachanalytassay der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Ein "Y" zeigt an, dass man bei zwei Reagenzien vorhersagt, dass sie kompatible Paare in der Erfindung sind, und ein "N" zeigt an, dass man bei den zwei Verbindungen vorhersagt, dass sie in diesem Assay inkompatibel sind. Die Nummern 1 bis 3 in der Säule auf der linken Seite des Diagramms zeigen den Typ des Assaysystems an: 1 steht für ein homogenes einzelphasiges Assaysystem, 2 steht für eine differentielle Hydrolyse in der wässrigen Phase und die physikalische Trennung von hybridisierten Oligonukleotidsonde:Ziel-Komplexen, 3 steht für ein Assaysystem, in dem keine differentielle Hydrolyse stattfindet, und in dem hybridisierte Sonde:Ziel-Komplexe physikalisch getrennt werden. Die durch einen Schrägstrich unter jedem genannten Acridiniumesterderivat voneinander getrennten Nummern stehen für die Zeit bis zum Scheitelpunkt des Signals beziehungsweise die Reaktionsdauer. Die Nummern unterhalb dieser Linie stehen für die Halbwertszeit der Hydrolyse jedes Markerreagenzes während es an eine unhybridisierte Oligonukleotidsonde gekoppelt ist. Das Auswahlkriterium, auf dem dieses Diagramm basiert, steht letztlich am oberen Ende der Figur.
  • 3 ist eine graphische Darstellung eines Beispiels, in dem zwei Markerreagenzien in einem Mehrfach-pH-Modus der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In jeder der 3A–C wurde ein Reagenz zum Auslösen in etwa 5 Intervallen zur Lösung gegeben und die Reaktionsmischungen wurden etwa beim Zeitintervall 90, was auf der X-Achse des Graphen dargestellt wird, von etwa pH 12,1 auf etwa pH 13,0 verschoben. 3A zeigt das emittierte Licht einer solchen Reaktionsmischung, die nur Standard-AE enthält. 3B zeigt das emittierte Licht in einer Reaktion, die nur o-F-AE enthält. 3C zeigt das emittierte Licht in einer Reaktionsmischung, die sowohl Standard-AE als auch o-F-AE enthält.
  • 4 ist eine graphische Darstellung der überlappenden charakteristischen Lichtemissionsprofile von fünf verschiedenen Kombinationen von chemilumineszierender Markerreagenzien über die Zeit. Ein Reagenz zum Auslösen wurde zum Zeitpunkt Null jeder Reaktionsmischung zugegeben. Die in dieser Figur verwendeten Markerreagenzien waren: o-diBr-AE, 2,7-diMe-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE, o-Me-AE und o-diMe-AE.
  • 5 ist eine graphische Darstellung der überlappenden charakteristischen Lichtemissionsprofile von fünf verschiedenen Kombinationen chemilumineszierender Markerreagenzien über die Zeit. Ein Reagenz zur Auslösung wurde zum Zeitpunkt Null jeder Reaktionsmischung zugegeben. Die in dieser Figur verwendeten Markerreagenzien waren: o-diBr-AE, eine Mischung aus 1- und 3-Me-AE, o-AE, o-Me-AE und o-diMe-AE.
  • 6 ist eine graphische Darstellung der überlappenden charakteristischen Lichtemissionsprofile von sieben verschiedenen chemilumineszierenden Markerreagenzien über die Zeit. Ein Reagenz zum Auslösen wurde zum Zeitpunkt Null jeder Reaktionsmischung zugegeben. Die in dieser Figur verwendeten Markerreagenzien waren: o-diBr-AE, 2,7-diMe-AE, eine Mischung aus 1- und 3-Me-AE, o-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE, o-Me-AE, und o-diMe-AE.
  • 7 zeigt die überlagerten charakteristischen Lichtemissionsprofile von vier chemilumineszierenden Markerreagenzien in einem Mehrfach-pH-Assaymodus über die Zeit. Die Figur demonstriert die Fähigkeit des vorliegenden Assays, vier Analyten in einem Mehrfachmodus-Assaysystem zu detektieren.
  • 8A bis 8I verdeutlichen graphisch die Korrelation zwischen den erwarteten Lichtemissionsprofilen von kombinierten chemilumineszierenden Markerreagenzien gegenüber den tatsächlichen Lichtemissionsprofilen, die man erhalten hat. Die verwendeten chemilumineszierenden Markerreagenzien waren: o-diBr-AE, o-F-AE, Standard-AE und o-MeO-AE. Die Chemilumineszenzenreaktionen wurden in einem Mehrfach-pH-Assaysystem unter identischen Bedingungen durchgeführt.
  • 9A bis 9D sind Chemiluminszenzspektren von zwei Acridiniumesterderivaten; 9A und 9B zeigen die separaten Spektren von 2,7-o-diMe-AE beziehungsweise Standard-AE. 9C zeigt eine computergenerierte Überlagerung von jedem Spektrum in einem einzelnen Diagramm. 9D zeigt die computergenerierte Simulation der zwei Spektren.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Zusammensetzungen und Verfahren für die spezifische Detektion von mehreren verschiedenen Analyten, bevorzugt Nukleinsäuren, in einer einzelnen Testprobe. Daher kann in einer bevorzugten Ausführungsform die Erfindung verwendet werden, um das Vorhandensein von mehr als einer einzelnen Nukleinsäuresequenz in einer Test- oder klinischen Probe zu detektieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann eine solche Nukleinsäuresequenz auf einen bestimmten Erkrankungszustand oder eine Infektion hinweisen.
  • Definition
  • Soweit es nicht explizit anders angegeben wird, haben die folgenden Begriffe die folgende Bedeutung in der vorliegenden Anmeldung.
  • Mit einem "Nukleinsäureanalyten" ist wenigstens eine Nukleinsäure oder ein Nukleotidsequenzbereich gemeint, dessen Vorhandensein und/oder Menge mit einem einzelnen Markerreagenz durch die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bestimmt werden soll, wenn sie/er in der Probe vorhanden ist. Der Analyt kann ein einzelnes Nukleinsäuremolekül mit einem oder mehreren bestimmten Ziel-Bereichen, oder mehr als ein anderes Molekül, von dem jedes einen oder mehrere bestimmte Ziel-Bereiche aufweist, sein. Als Alternative dazu kann ein Analyt eine bestimmte Nukleotidsequenz sein, die innerhalb einer einzelnen Nukleinsäure enthalten ist; demzufolge kann eine einzelne Nukleinsäure mehr als einen Nukleinsäureanalyten enthalten. Jedoch erwägt der Anmelder, dass es manchmal wünschenswert sein kann, dass mehr als ein Ziel-Bereich, ob nun auf dem gleichen oder verschiedenen Nukleinsäuremolekülen oder beides, mittels des gleichen Sondenmarkers detektiert wird. Dies würde es zum Beispiel ermöglichen sowohl chromosomale r-DNA als auch ribosomale RNA eines ersten Organismus mit einer oder mehreren Sonden, die einen Marker tragen, anzusteuern, und die chromosomale r-DNA und ribosomale RNA eines zweiten Organismus mit einer oder mehreren Sonden, die einen anderen Marker tragen, anzusteuern. In solch einem Fall besteht der erste Analyt aus allen angesteuerten Nukleotidsequenzbereichen der Nukleinsäure(n) des ersten Organismus und der zweite Analyt besteht aus allen angesteuerten Nukleotidsequenzbereichen der Nukleinsäure(n) des zweiten Organismus.
  • Mit "Ziel-Bereich" oder "Ziel-Nukleotidsequenz" ist der Abschnitt eines Analytmoleküls gemeint, der an eine vorgegebene Sonde oder Klasse von Sonden bindet. Wenn der Analyt ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle ist, weist der Ziel-Bereich eine Nukleotidsequenz in einem Bereich von wenigstens einer der Nukleinsäuren, die eine Oligonukleotid-Hybridisierungssonde unter Hybridisierungsbedingungen, die die Hybridisierung der Sonden mit nicht angesteuerten Nukleinsäuren oder Nukleotidsequenzbereichen begünstigen, binden, auf. Ein bestimmter Ziel-Bereich kann vollständig abgetrennt von anderen Ziel-Bereichen sein, egal ob er auf den gleichen oder verschiedenen Nukleinsäuremolekülen vorhanden ist. Alternativ dazu kann ein gegebener Ziel-Bereich, ohne Begrenzung, auf dem gleichen Nukleinsäuremolekül wie ein anderer Ziel-Bereich enthalten sein und den anderen Ziel-Bereich durch ein oder mehrere Nukleotide überlappen, durch den anderen Ziel-Bereich durch ein oder mehrere Nukleotide überlappt werden oder vollständig innerhalb einer anderen Ziel-Nukleotidsequenz enthalten sein.
  • Mit "Sonde", "Nukleinsäuresonde", "Hybridisierungssonde" oder "Oligonukleotidsonde" ist ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz gemeint, die ausreichend komplementär mit einer Ziel-Nukleotidsequenz, die von einem Nukleisäureanalyten umfasst wird, ist, damit es dem Oligonukleotid ermöglicht wird unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen mit ihm zu hybridisieren. Wenn das Wort "Sonde" verwendet wird, wird für den Durchschnittsfachmann deutlich werden, dass der Begriff auf einen oder mehrere Oligonukleotidmoleküle Anwendung findet, entweder identische oder nicht-identische, die entworfen, ausgewählt worden sind und/oder ansonsten in der Lage sind, spezifisch mit einem Ziel-Nukleinsäurebereich zu hybridisieren. Zusätzlich kann eine Sonde, wie sie hierin definiert wird, eine Sammlung von verschiedenen Oligonukleotidmolekülen umfassen, die gegen einen oder mehrere Ziel-Bereiche des gleichen Nukleinsäureanalyten gerichtet sind. Demnach kann der Begriff "Sonde", wie er hierin verwendet wird, entweder den Singular oder Plural meinen, wobei die Bedeutung durch den Kontext der Verwendung in der vorliegenden Beschreibung deutlich wird. Per Definition ist dieser Begriff bevorzugt auf Oligonukleotide zwischen 10 und 100 Nukleotiden in der Länge anwendbar.
  • Mit "nicht angesteuerten Nukleinsäuren" sind Nukleinsäuren gemeint, die in einem vorgegebenen Assay mittels der Verfahren oder Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung nicht detektiert werden sollen.
  • Mit "Probe" oder "Testprobe" ist jede wässrige oder wassermischbare Lösung, Suspension oder Emulsion gemeint, die vermutlich einen oder mehrere Nukleinsäureanalyten enthält. Solch eine Probe kann enthalten, ohne Begrenzung, gereinigte oder ungereinigte Nukleinsäuren, Viruspartikel und/oder Pflanzen, Tiere, Protozen oder bakterielle Zellen und kann abgeleitet werden, ohne Begrenzung, von Labor-, Umwelt-, Agrikultur-, Lebensmittel-, menschlichen, tierischen, exkretorischen oder sekretorischen Quellen. Eine Testprobe kann als Ergebnis einer Vorbehandlung einer früheren Probe, wie zum Beispiel, ohne Begrenzung, durch Homogenisieren, Konzentrieren, Suspensieren, Extrahieren, Solubilisieren, Verdauen, Lysieren, Verdünnen oder Zermmahlen der früheren Probe hergestellt werden, um den verdächtigen Nukleinsäureanalyten, falls vorhanden, in eine Wasser enthaltende Umgebung zu bringen.
  • Mit "Chemilumineszenzmarker" ist jede chemische Entität oder Verbindung gemeint, die an eine andere chemische Entität oder Verbindung gekoppelt werden kann, die an einer chemisch vermittelten Reaktion teilnehmen kann, die zur Emission von Licht aufgrund einer hochenergetischen chemischen Zwischenstufe führt. Die bevorzugten Chemilumineszenzmarker der vorliegenden Erfindung sind Acridiniumderivate, am meisten bevorzugt Acridiniumesterderivate.
  • Mit "gekoppelt" ist gemeint, dass zwei oder mehr chemische Entitäten oder Verbindungen über eine chemische Bindung oder Assoziation miteinander verbunden werden. Demnach bedeutet der Begriff, dass kovalente Bindungen als auch starke nicht-kovalente Bindungen, wie zum Beispiel solche, die zwischen Avidin und Biotin oder einem chelatierenden Agens oder einem oder mehreren komplexierten Ionen gebildet werden, umfasst werden.
  • Mit "angesteuert" ist gemeint, dass man versucht eine spezifische chemische, physikalische oder biologische Entität zu identifizieren. So definiert, kann eine chemische Entität ein Abschnitt einer größeren Entität einschließen, wie zum Beispiel eines Nukleotidsequenzbereiches einer Nukleinsäure. Eine biologische Entität unter dieser Definition kann eine Gruppe von Organismen, wie zum Beispiel eine oder mehrere Spezies, Genus, Klasse, Familie und so weiter, einschließen.
  • Mit einer "lichtemittierenden Reaktion" ist eine auslösbare chemische Reaktion gemeint, die zur detektierbaren Erzeugung von Licht durch einen oder mehrere Reaktanten führt. Auslösbar soll bedeuten, dass die chemische Reaktion durch die Zugabe eines Reaktanten oder durch Energie (wie zum Beispiel einer elektrischen Ladung) zur Reaktionsmischung initiiert wird, oder das die Reaktionskinetiken durch Anpassen einer oder mehrerer Reaktionsbedingungen, wie zum Beispiel der Temperatur oder des pHs, begünstigt werden.
  • Mit "ausreichend verschieden" ist gemeint, dass die Wellenlänge(n) der Lichtemission, die Zeit bis zum Scheitelpunkt des Signals, die Reaktionsdauer oder die Reaktionscharakteristika von zwei oder mehreren verschiedenen chemilumineszierenden Markern unterschieden werden können, wenn sie in einer Reaktionsmischung kombiniert werden und dazu veranlasst werden, Licht in einer auslösbaren lichtemittierenden Reaktion zu emittieren.
  • Mit "spezifisch hybridisiert" ist gemeint, dass eine einzelsträngige Nukleinsäure eine stabile Wasserstoff gebundene Duplex mit einer Ziel-Nukleinsäure oder einem Nukleotidsequenzbereich unter Hybridisierungsbedingungen bilden kann, die nicht die Bildung von stabilen doppelsträngigen Duplexen zwischen der gleichen einzelsträngigen Nukleinsäure und den nicht angesteuerten Nukleinsäuren oder Nukleotidsequenzbereichen begünstigt.
  • Mit "vergleichbar geschützt" ist gemeint, dass die Verlustrate des Chemilumineszenzpotentials von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, die mit Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden gekoppelt sind, abhängig davon, ob die Sonde mit einer Ziel-Nukleinsäure- oder einem Nukleotidsequenzbereich hybridisiert ist, verringert sind, und dass die Verlustraten unter den gleichen Bedingungen bevorzugt um einen Faktor von bis zu etwa 250 zueinader liegen.
  • Mit "vergleichbar empfänglich" ist gemeint, dass die Verlustraten des Chemilumineszenzpotentials verschiedener chemilumineszierender Marker, die mit Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden gekoppelt sind, beim Aussetzen gegenüber einem destabilisierenden Agens unter identischen Bedingungen bei einem Faktor von etwa 50 zueinander liegen.
  • Mit "Chemilumineszenzpotential" ist die Fähigkeit eines vorgegebenen chemilumineszierenden Markers gemeint in einer auslösbaren lichtemittierenden Reaktion zu reagieren. Der Verlust des Chemilumineszenzpotentials findet statt, wenn ein solcher chemilumineszierender Marker chemisch abgebaut wird oder in eine nicht-chemilumineszierende Verbindung umgewandelt wird.
  • Mit "Reaktions-pH-Optimum" ist der pH-Wert gemeint, bei dem eine Chemilumineszenzreaktion, bei der ein vorgegebener chemilumineszierenden Marker beteiligt ist, unter definierten Bedingungen mit der höchsten Lichtemission ablaufen wird. Wenn mehr als eine chemilumineszierende Verbindung in der gleichen Reaktionsmischung vorhanden ist, kann es zwei oder mehr pH-Optima für die Chemilumineszenzreaktionsmischung geben. Die Lichtemissionsausbeute (als eine Funktion des pH) kann schrittweise ansteigen, wenn das pH-Optimum erreicht wird, so dass ein vorgegebener Chemilumineszenzmarker weniger Licht bei einem ersten pH emittieren kann, während der gleiche Marker viel mehr Licht bei einem pH-Wert emittiert, der sich um 1,0 bis 0,5 pH Einheiten vom ersten unterscheidet.
  • Mit "Initiierer" ist die Zugabe von Energie, eines Katalysators oder eines oder mehrerer Reaktanten zu einer Reaktionsmischung gemeint, die chemilumineszierende Reagenzien enthält, die den Beginn einer lichtemittierenden Reaktion verursachen wird/werden.
  • Mit "Acridiniumderivat" ist irgendeines aus der Familie der chemilumineszierenden Verbindungen, die auf dem Acridiniumring aufgebaut sind, gemeint.
  • Mit "Acridiniumesterderivat" ist irgendeines aus der Familie der chemilumineszierenden Verbindungen gemeint, die auf dem Acridiniumring aufgebaut sind und eine Esterverknüpfung an der C-9-Position aufweisen.
  • Mit "Reaktionskinetiken" ist die Rate der lichtemittierenden Reaktion gemeint, die durch die Menge des durch die Chemilumineszenzverbindung oder Verbindungen, die daran in einem vorgegebenen Zeitintervall teilnehmen, als eine Funktion der Zeit, emittierten Lichtes bestimmt wird. Der Begriff "Reaktionskinetiken" soll demnach den Bezug zur Menge der Zeit zwischen dem Auslösen einer Chemilumineszenzreaktion und dem maximalen Ausmaß der Lichtemission (Zeit bis zum Scheitelpunkt des Signals) als auch die Dauer der Lichtemission nach dem Auslösen in einer bestimmten Reaktionsmischung einschließen. Die Reaktionskinetiken einer Reaktionsmischung, die einem bestimmten chemilumineszierenden Marker enthalten, kann als die Menge von Licht, das in einem bestimmten Zeitraum emittiert wird, gegen die Zeit dargestellt werden, und die Kurve, die dabei erhalten wird, ist reproduzierbar und charakteristisch für einen bestimmten chemilumineszierenden Reaktanten unter den gleichen Reaktionsbedingungen.
  • Die in den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendeten Reagenzien sind Acridiniumderivate, bevorzugt Acridiniumphenylesterderivate. 1 zeigt Beispiele von repräsentativen Acridiniumphenylesterderivaten. Es versteht sich, das andere geeignete chemilumineszierende Reagenzien und Acridiniumesterderivate, die andere Acridiniumderivate einschließen als für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung im Lichte der vorliegenden Offenbarung durch Routineuntersuchungen als geeignet erachtet werden können. Acridiniumphenylesterverbindungen sind Derivate von Akridin, die ein quarternäres Stickstoffzentrum enthalten und in der 9-Position derivatisiert werden, um einen Phenylesterrest zu bekommen. Acridiniumderivate, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, egal ob Phenylester oder nicht, teilen die Eigenschaft, dass sie mit Wasserstoffperoxid reagieren, um einen kurzlebigen Dioxetanring zu bilden, der den C-9 Kohlenstoff des Acridiniumrings einschließt, gefolgt von der Bildung eines angeregten Akridons. Die Strahlungsrelaxation des angeregten Akridons führt zur Erzeugung von Licht. Die Synthese von Acridiniumestern als auch eine allgemeine Beschreibung ihrer Verwendung als chemilumineszierende Markerreagenzien wird beschrieben in Weeks et al., Acridinium Esters as High Specific Activity Labels in Immunoassays, Clin. Chem. 29:1474–1478 (1984), wie zuvor bereits zitiert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können Acridiniumester mittels standardchemischer Techniken an eine nicht-Nukleotid monomere Einheit mit einem primären Amin "linker Arm", der für die Bindung mit dem Acridiniumesterrest verfügbar ist, der zwischen benachbarten Sequenzen von Nukleotiden während der chemischen Synthese der Oligonukleotide inseriert wird oder an einer terminalen Position des Oligonukleotids angeordnet wird, gebunden. Siehe, Arnold, et al., Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes, EPO Veröffentlichungs Nr. EPO 313219, die gemeinsame Eigentümreschaft mit der vorliegenden Erfindung genießt. Demnach wird der linker Arm-Rest, an dem der Marker angebunden wird, an einer vorbestimmten Position innerhalb des Oligonukleotids angeordnet. Er kann als Insertion zwischen oder als eine Substitution für ein oder mehrere Nukleotide, die eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die ausreichend komplementär zu wenigstens einem Abschnitt einer Ziel-Nukleinsäure ist, um damit unter strengenden Hybridisierungsbedinungen hybridisieren zu können, angeordnet sein. Die Festphasensynthese von Oligonukleotiden ist im Stand der Technik gut bekannt und wird beschrieben von Brown & Brown, Modern Machine-Aided Methods of Oligodeoxyribonucleotide Synthesis in Oligonucleotides and Analogues-A Practiced Approach (1991).
  • Acridiniumesterderivate können an das Linker-Arm:Hybridisierungssondenkonjugat mittels im Stand der Technik gut bekannter Techniken angebunden werden. Bevorzugt verwendet der Anmelder die Verfahren, die von Nelson et al., Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence in Non-Isotopic Probe Techniques (Academic Press 1992) und Arnold et al., Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes, EPO Veröffentlichungs Nr. EPO 313219 beschrieben werden.
  • Daher wird in einem solchen bevorzugten Verfahren ein N-Hydroxysuccinimid (NHS)-ester des Acridiniums (z.B. 4-(2-Succinimidyloxycarbonylethyl)phenyl-10-methylacridinium-9-carboxylatfluorsulfonat) synthetisiert, wie es von Weeks et al., siehe oben, beschrieben wird. Die Reaktion des primären Amins des Linker-Arm:Hybridisierungssondenkonjugates mit dem ausgewählten NHS-Acridiniumester wird wie folgt durchgeführt. Das Oligonukleotid-Hybridisierungssonde:Linker-Arm-Konjugat, das wie weiter oben beschrieben hergestellt wird, wird in einem Savant Speed-VacTMTrockenapparat vakuumgetrocknet, dann in 8 μl 0,125 M HEPES-Puffer (pH 8,0) in 50% (v/v) DMSO aufgelöst. Zu dieser Lösung werden 2 μl 25 mM des gewünschten NHS-Acridiniumesters gegeben. Die Lösung wird gemischt und bei 37°C für 20 Minuten inkubiert.
  • Zusätzliche 3 μl 25 mM NHS-Acridiniumester in DMSO werden zur Lösung gegeben und langsam vermischt, dann werden 2 μl 0,1 M HEPES-Puffer (pH 8,0) zugegeben, gemischt und dann lässt man das Röhrchen für zusätzliche 20 Minuten bei 37°C inkubieren. Die Reaktion wird durch Zugabe von 5 μl 0,125 M Lysin in 0,1 M HEPES-Puffer (pH 8,0) in DMSO, die langsam zur die Lösung gemischt wird, gestoppt.
  • Das markierte Oligonukleotid wird durch die Zugabe von 30 μl 3 M Natriumacetatpuffer (pH 5,0), 245 μl Wasser und 5 μl 40 mg/ml Glycogen aus der Lösung zurückgewonnen. Sechshundertvierzig Mikroliter eisgekühlten 100 Ethanols werden in das Röhrchen gegeben und das Röhrchen wird für 5 bis 10 Minuten auf Trockeneis aufbewahrt. Die präzipitierten markierten Nukleinsäuren werden in einer gekühlten Mikrozentrifuge bei 15000 rpm mittels eines Standardrotorkopfes absedimentiert. Der Überstand wird abgenommen und das Pellet in 20 μl 0,1 M Natriumacetat (pH 5,0), das 0,1 % (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) enthält, wieder aufgelöst.
  • Das markierte Oligomer kann dann nach Bedarf und wie gewünscht gereinigt werden; Verfahren zur Reinigung von markierten Oligonukleotiden sind im Stand der Technik gut bekannt. In einem bevorzugten Verfahren, dass von Arnold, et al., Acridinium Ester Labeling and Purification of Nucleotide Probes, U.S. Patent Nr. 5,185,439 (das gemeinsame Eigentümerschaft mit der vorliegenden Erfindung genießt) beschrieben worden ist, wird das Oligomer mittels Umkehrhochdruckflüssigchromatographie (RP-HPLC) gereinigt. Die Probe wird auf eine Vydac C4 Umkehrphasen HPLC-Säule aufgebracht und mit einem linearen Gradienten von 10 % bis 15 % Puffer B innerhalb von 25 Minuten eluiert, wobei Puffer A aus 0,1 % (w/v) Triethylammoniumacetat (pH 7,0) in Wasser mit HPLC-Qualität besteht und Puffer B aus 100 % Acetonitril besteht. Das Absorptionsvermögen der sich ergebenden abfließenden Lösung wird bei 260 nm überwacht und 0,5 ml Fraktionen werden gesammelt. Die Fraktionen werden dann auf ihre Chemilumineszenz hin untersucht, wobei die Fraktionen, die mit dem aktiven Hauptsignal übereinstimmen, mit Ethanol präzipitiert werden, und die markierten Sonden werden dann in 0,1 M Natriumacetat (pH 5,0), das 0,1 % SDS enthält, resuspendiert.
  • Die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt in Verbindung mit dem Hybridisierungsschutzassay (HPA) verwendet, das beschrieben wird von Nelson et al., Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence in Non-Isotopic Probe Techniques (Academic Press 1992) und von Arnold et al., U.S. Patent Nr. 5,283,174. In diesem Assayformat sind die Acridiniumester Markerreagenzien für die Hydrolyse empfänglich, wenn sie an die unhybridisierte Sonde gebunden sind, sind jedoch vor der Hydrolyse geschützt, wenn sie an die hybridisierte Sonde gebunden sind. Die unterschiedlichen Hydrolysecharakteristika dieses Systems ermöglichen ein homogenes einzelphasiges Assay, wobei die Hybridisierung der Sonde mit dem Ziel, die Unterscheidung zwischen hybridisierter und unhybridisierter Sonde und die Detektion und/oder Quantifizierung der markierten hybridisierten Sonde in einem einzelnen Teströhrchen durchgeführt werden kann. Jedoch ist die unterschiedliche Hydrolyse nicht das einzige Verfahren durch das die hybridisierte von der unhybridisierten Sonde unterschieden werden kann; andere chemische Modifikationen des chemilumineszierenden Markers, wie zum Beispiel die Adduktbildung, können oder könnten dazu in der Lage sein einen chemilumineszierenden Marker, der mit einer hybridisierten Sonde gekoppelt ist, von einer nichthybridisierten Sonde zu unterscheiden. Das hierin beschriebene Assayformat ist auch zugänglich für Assayformatmischelemente eines homogenenen und eines heterogenen Assays.
  • Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Illustration und begrenzen auf keine Weise den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, die durch die diese Beschreibung abschließenden Ansprüche definiert ist.
  • Beispiel 1: Anfängliches Testen und Untersuchen verschiedener Acridiniumesterderivate
  • Synthese von AE-Markerreagenzien
  • N-Hydroxysuccinimid (NHS)-ester Markerreagenzien von Acridiniumester (AE)-derivaten wurden so synthetisiert wie allgemein von Weeks et al., siehe oben, beschrieben. Für diese Synthesen wurden Materialien und Reagenzien von höchster Reinheit, die kommerziell erhältlich sind, bei Aldrich, Lancaster Synthesis und Fisher Scientific bezogen. 9-Acridincarboxylsäure (ACA) oder ein Methyl oder Dimethyl substituiertes Derivat, das, wie weiter unten beschrieben, hergestellt wurde, wurde durch vierstündiges Refluxieren in Thionylchlorid in die entsprechenden Acridinsäurechloride umgewandelt. Kommerziell erhältliche Hydroxyphenyl- oder Hydroxynaphthylsäuren – nämlich, 3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure, 3-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)propionsäure, 4-Hydroxy-3-methoxyzimtsäure und 6-Hydroxy-2-naphtoesäure – wurden durch Behandeln ihrer Kaliumsalze mit Benzylbromid in 95 % Ethanol (EtOH) Lösung unter refluxierenden Bedinungen für etwa 3 Stunden in Benzyl (Bz)-ester umgewandelt. Die Benzylester ließ man dann mit den Acridinsäurechloriden in wasserfreiem Pyridin für etwa 4 Stunden bei Raumtemperatur reagieren, um die Acridinester zu erhalten. Die Benzylesterschutzgruppen wurden durch Behandeln der Acridinester mit 30 wt.% Wasserstoffbromid (HBr) in Essigsäure (HOAc) für etwa 4 Stunden bei 60°C hydrolysiert. Die sich daraus ergebende Säure wurde in das N-Hydroxysuccinimid (NHS)-esterreagenz mittels der Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)-Katalyse in wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) umgewandelt. Schließlich wurde die Umwandlung in das Methylacridinium-Markerreagenz durch Methylierung des Acridins durch Behandlung mit einem Überschuss an Methyltrifluormethansulfonat (Methyltriflat) in wasserfreiem Methylenchlorid für 5 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die NHS-Ester-Markerreagenzien, die für das Standard-AE, Naphthyl-AE, o-MeO-AE und o-MeO(cinnamyl)-AE verwendet wurden, wurden auf diese Weise hergestellt. Die NHS-Ester-Markerreagenzien, die für 4,5-diMe-AE, 2,7-diMe-AE und die Mischung aus 1- und 3-Me-AE verwendet wurden, erforderten die Synthese von Methyl und die Methyl substituierten ACAs, wie weiter unten beschrieben.
  • Die 4,5- und 2,7-Dimethyl substiuierten Derivate der 9-Acridincarboxylsäure (ACA) wurden durch die Reaktionen von Oxalylchlorid mit Dimethyl substituierten Diphenylaminen hergestellt, um Isatin Zwischenprodukte bereitzustellen und dann folgte die Neuordnung, um die entsprechend substituierten Acridine zu erzeugen, wie es im Wesentlichen für die 4,5-Dimethylacridin-9-carboxylsäure von M.S. Newman and und W.H. Powell, J.Org. Chem., 26 (1961):812–815 beschrieben worden ist. Als erste wurden 2,2'-Dimethyldiphenylamin und 4,4'-Dimethyldiphenylamin durch Reagieren von 2- oder 4-Methylformanilit mit einem leichten Überschuss an 2- bzw. 4-Bromtoluen in Gegenwart von wasserfreiem Natriumcarbonat und Spuren von Kupfer in Nitrobenzen bei 200°C für 24 Stunden hergestellt. Die Hydrolyse der sich daraus ergebenden N,N-Diphenylformamide wurde durch deren refluxieren in einer 1:1 (v/v) Mischung aus konzentrierter HCl in Essigsäure (HOAc) für 5 Stunden durchgeführt, um die Dimethyldiphenylamine mit guter Ausbeute nach der Reinigung über Silica bereitzustellen. Die Herstellung von Dimethyl substituierten Acridincarboxylsäuren über Isatine wurde dann forstgesetzt durch die Reaktion mit dem oben hergestellten 2,2'-Dimethyldiphenylamin oder 4,4'-Dimethyldiphenylamin, die weiter oben mit Oxalylchlorid hergestellt wurden, in refluxierendem Kohlenstoffdisulfid für etwa 3 Stunden. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels und des überschüssigen Reagenzien wurde der gelbe Rückstand in frischem Kohlenstoffdisulfid aufgenommen und mit Aluminiumchlorid über einen Zeitraum von etwa 30 Minuten behandelt, für 4 Stunden refluxiert und bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand auf Methylenchlorid und kalter 10 % (v/v) konzentrierter HCl aufgeteilt. Die orangenen Isatine wurden in der organischen Schicht wiedergewonnen. Am Ende führte die Behandlung der Isatine mit 10 % (w/v) Kaliumhydroxid (KOH) für 12 Stunden unter Refluxieren zur Bildung von 4,5-Dimethylacridin-9-carboxylsäure (4,5-diMe-ACA) bzw. 2,7-Dimethylacridin-9-carboxylsäure (2,7-diMe-ACA). Auf vergleichbare Weise wurde 3-Methyldiphenylamin mit Oxalylchlorid und Aluminiumchlorid behandelt, um eine Mischung aus Methylphenylisatinen zu erzeugen, die, nach Neuordnung durch Behandlung mit KOH, wie weiter oben beschrieben, eine Mischung aus 1- und 3-Methylacridin-9-carboxylsäure (1- und 3-Me-ACA) ergab. Die Veresterung von 4,5-diMe-ACA, 2,7-diMe-ACA oder der Mischung aus 1- und 3-Me-ACA mit dem Benzylester von 3-(4-Hydroxylphenyl)propionat und den nachfolgenden Reaktionen, die weiter oben beschrieben wurden, ergaben die NHS-Markerreagenzien, die für 4,5-diMe-AE, 2,7-diMe-AE oder der Mischung aus 1- bzw. 3-Me-AE verwendet wurden.
  • Mehrere substituierte Hydroxyphenylpropionsäurederivate, die nicht kommerziell erhältlich sind, wurden durch konventionelle Verfahren hergestellt. 3-(4-Hydroxy-3,5-dibromphenyl)-propionsäure wurde durch Bromierung von 3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure mit Brom in Eisessigsäure (HOAc) hergestellt. 3-(2-Hydroxyphenyl)propionsäure wurde durch Hydrierung von 2-Hydroxyzimtsäure über Palladium-Kohle in absolutem Ethanol (EtOH) hergestellt. Die Acridiniumester (AE) Herstellung konnte dann durch Koppeln von ACR mit den Benzylestern dieser Säuren, wie weiter oben angegeben, fortgesetzt werden, um die NHS-Ester-Markerreagenzien bereitzustellen, die für o-diBr-AE bzw. ortho-AE verwendet wurden.
  • Zusätzlich wurden die Propionitrilderivate verschiedener substituierter Phenole – nämlich 2-Methylphenol, 2,6-Dimethylphenol, 3,5-Dimethylphenol, 2-Fluorphenol und 3,5-Difluorphenol – durch Cyanoethylierung mittels durch Aluminiumchlorid katalysierter Kondensation von Acrylnitril mit dem Phenol und Isolieren des entsprechend substituierten 4-Hydroxyphenylpropionitrils hergestellt. Diese Hydroxyphenylpropionitrilderivate ließ man dann mit den Acridinsäurechloriden reagieren und die sich daraus ergebenden Esterverbindungen wurden mit Chlorwasserstoff behandelt, um die Nitrile zu den entsprechenden Propionsäurederivaten zu hydrolysieren, die, wie weiter oben beschrieben, weiter verarbeitet werden konnten, um die entsprechenden AE-NHS-Ester-Markerreagenzien zu erhalten. Alternativ dazu konnten die Propionnitrile als Erstes zu dem entsprechenden Propionsäurederivat hydrolysiert werden und die Synthese konnte dann über den Benzylester fortgesetzt werden. Die letzten Schritte zum Herstellen der AE-NHS-Reagenzien waren die gleichen, wie weiter oben angegeben. Die NHS-Ester-Markerreagenzien, die für o-diMe-AE, m-diMe-AE, o-Me-AE, o-F-AE, 1- oder 3-Me-o-F-AE und 1- oder 3-Me-m-diF-AE verwendet wurden, wurden auf die gleiche Art und Weise hergestellt.
  • Dem Durchschnittsfachmann wird klar sein, dass diese Syntheseschemata allgemein verwendet werden können, um zusätzliche und verschiedene Acridiniumderivate für die Charakterisierung und die Untersuchungen, wie weiter unten beschrieben, herzustellen.
  • Charakterisierung und Untersuchung von AE-Derivaten
  • Die Chemilumineszenz und Hydrolysecharakteristika dieser Derivate wurden mit denen von Standard-AE (4-(2-Succinimidyloxycarbonylethyl)phenyl-10-methylacridinium-9-carboxylatfluorsulfonat) verglichen.
  • Beispielhafte AE-Derivate, die zur Darstellung der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, waren Naphthyl-AE, o-diBr-AE, eine Mischung aus 1- und 3-Me-AE, 4,5-diMe-AE, 2,7- diMe-AE, o-diMe-AE, o-Me-AE, m-diMe-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE, o-MeO-AE, o-AE (ein Acridiniumesterderivat mit dem Nukleinsäure-Kopplungslinkerarm, der mit dem Phenylring in der ortho-Position verbunden ist), o-F-AE, eine Mischung aus 1- und 3-Me-o-F-AE, Standard-AE und einer Mischung aus 1- und 3-Me-m-diF-AE (siehe 1). 1-Me-AE, 1-Me-o-F-AE und 1-Me-m-diF-AE waren nur in einer Mischung mit ihren 3-Methylisomeren vorhanden; gemäß der Verwendung in dieser Anmeldung wird diese Nomenklatur so verstanden, dass sie eine Mischung der entsprechenden 1- und 3-Methylderivate kennzeichnen. Wie in 1 dargestellt, wurden diese Verbindungen verwendet, um verschiedene Oligonukleotide, die als Hybridisierungssonden verwendet werden, zu markieren. Der Durchschnittsfachmann wird verstehen, dass die vorliegende Erfindung nicht von der Verwendung einer bestimmten Sonde-Ziel-Kombination abhängt. Demnach wäre die Auswahl von zwei oder mehreren sich gegenseitig ausschließenden Sonde-Ziel-Kombinationen für die Verwendung mit dem derzeit offenbarten Assay im Lichte der vorliegenden Offenbarung reine Routine.
  • Die Oligonukleotide wurden so synthetisiert, dass sie Phosphordiesterverbindungen enthalten, wobei Standardfestphasenphosphoramididchemie unter Verwendung von Biosearch 8750 oder ABI 380A DNA Synthetisierern verwendet wurde, und unter Verwendung von Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt; Oligonukleotidsynthese und Gelreinigungstechniken sind im Stand der Technik gut bekannt. (siehe z.B., Sambrook et al., siehe oben). Verschiedene nicht natürlich auftretende Oligonukleotide, wie zum Beispiel solche mit modifizierten Internukleotidverknüpfungen, wie zum Beispiel Phosphorthioatverknüpfungen oder solche mit Zucker- oder Basenmodifikationen, sind im Stand der Technik auch bekannt und können Vorteile haben, wie zum Beispiel die erhöhte Stabilität in bestimmten Anwendungen; diese Nukleinsäureanaloga werden auch für die Verwendung als Teil der Erfindung der vorliegenden Anmeldung umfasst.
  • Wie zuvor bereits beschrieben, wurde ein Linker-Arm, der in einem primären Amin endet, in jede Oligonukleotidstruktur an einer vorbestimmten Position in der Nukleotidsequenz des Oligonukleotids eingebaut, wodurch eine Insertion zwischen Nukleotiden in der Sequenz erzeugt wurde. Siehe z.B., Arnold et al., Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes, siehe oben. Die AE-Derivate waren mit dem Oligonukleotid über das primäre Amin des Linker-Arms, wie weiter oben detaillierter beschrieben, verknüpft. Die markierten Sonden wurden charakterisiert und im Bezug auf ihre Chemilumineszenz, Hybridisation und differentiellen Hydrolyseeigenschaften charakterisiert.
  • Zehn Mikroliter Aliquots der markierten Sonden wurden in 12 × 75 Polysterenröhrchen übertragen und die Chemilumineszenz wurde in einem LEADER® 50 Luminometer (Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA) durch die automatische Injektion einer Lösung aus 200 μl 0,1 % H2O2 und 0,4 N HCl, einer 0,1 bis 2 sekündigen Verzögerung, automatischer Injektion von 200 μl 1 N NaOH und der Messung der Chemilumineszenz für 5 Sekunden gemessen. Der pH liegt am Ende etwa bei 13.
  • Der hierin beschriebene jeweilige Luminometer misst Licht zwischen den Wellenlängen 300 bis 650 nm; es wird deutlich geworden sein, dass ein Luminometer emittiertes Licht in diesen Wellenlängenbereichen detektieren muss, um in den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung nützlich zu sein. Tatsächlich kann es in bestimmten Modi der vorliegenden Erfindung zum Beispiel in einem Mehrfachwellenlängenmodus für einen Luminometer nützlich oder notwendig sein, das emittierte Licht über breitere oder engere Wellenlängenbereiche zu messen, als es hierin beschrieben wird, oder über mehr als eine engere Wellenlänge unabhängig oder gleichzeitig zu messen. Daher sollte der Umfang der Wellenlängen, die im hierin beschriebenen Beispiel überwacht wurden, als exemplarisch verstanden werden und keine Begrenzung für den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung sein.
  • Die Chemilumineszenzreaktionscharakteristika wurden durch das Messen des Lichts, das durch die reagierenden Acridiniumesterderivate emittiert wurde, bestimmt. Das emittierte Licht wurde durch den Luminometer unter Verwendung von relativen Lichteinheiten (RLU), eine Maßeinheit, die die relative Anzahl von Photonen angibt, die von der Probe bei einer bestimmten Wellenlänge oder einem Bereich von Wellenlängen emittiert werden, quantifiziert. Das Licht wurde zu mehreren Zeitpunkten während der 5 sekündigen Messperiode detektiert. Von diesen Daten ausgehend wurde der erforderliche Zeitraum für jedes markierte Oligonukleotid bis zum Erreichen des Scheitelpunkts der Emission ("Zeit bis zum Scheitelpunkt des Signals") und der Dauer der Lichtemission bestimmt. Die "Dauer" wurde beliebig so definiert, dass sie die Zeit meint, die für die RLU erforderlich ist, um 10% der Grundlinie zu erreichen nachdem die Emission am Scheitelpunkt aufgetreten ist. Diese Daten werden in Tabelle 1 weiter unten dargestellt.
  • TABELLE 1
    Figure 00340001
  • Zusätzlich wurde auch der pH, der für jede markierte Sonde erforderlich ist, um die maximale Menge an Licht zu emittieren, bestimmt und als "optimaler pH" definiert. Bei dieser Bestimmung wurde die Reaktion initiiert, wie weiter oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass die erste Reaktionslösung 0,1 N HCl anstelle von 0,4 N HCl enthielt und anstatt NaOH zu verwenden, enthielt die zweite Reaktionslösung 0,24 M Natriumboratpuffer, der für verschiedene pH-Werte titriert wurde. Die "Zeit bis zum Scheitelpunkt des Signals" und die Dauer wurden für jede markierte Sonde beim optimalen pH berechnet. Diese Daten kann man auch in Tabelle 1 finden.
  • Nach dem Bestimmen der Chemilumineszenzreaktionskinetiken der markierten Oligonukleotide wurden die Hybridisierungs- und Hydrolysecharakteristika jedes Oligonukleotids untersucht. Die AE-Hydrolysecharakteristika für jedes hybridisierte und unhybridisierte markierte Oligonukleotid wurden in einem Bereich von Temperaturen und pH-Werten bestimmt, wie es in Nelson et al., siehe oben, beschrieben worden ist und in den folgenden Beispielen hier kurz zusammengefasst wird.
  • Beispiel 2: Bestimmen der Hydrolysecharakteristika von Acridiniumesterderivaten
  • Dieses Beispiel verdeutlicht ein bevorzugtes Verfahren zum Untersuchen individueller chemilumineszierender Marker, um ihre Hydrolysecharakteristika, wie zum Beispiel die Hydrolyserate, zu bestimmen wenn sie mit Hybridisierungsassaysonden gekoppelt sind. Das Verfahren ist besonders gut verwendbar für eine vorläufige Bestimmung der Eignung eines oder mehrer Acridiniumesterderivate für die Verwendung in einem Mehrfachanalytassaysystem. Obwohl dieses Verfahren ein bevorzugtes Verfahren zum chemischen Unterscheiden hybridisierter von unhybridisierten markierte Oligonukleotidsonden darstellt, sind andere Verfahren der chemischen oder physikalischen Trennung einzelsträngiger von vollständig oder teilweise doppelsträngigen Nukleinsäuren, wie z.B. die Hydroxyapatitadsorption, Gelfiltration oder die Umkehrchromatographie, dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt.
  • Allgemeines Verfahren zum Messen der Hydrolyse freier Sonden
  • Im Allgemeinen ist jeder geeignete Acridiniumester mit einer einzelsträngigen Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonde und dem gereinigten Sonde:AE-Ester gekoppelt, wie weiter oben beschrieben. Zehn Mikroliter jeder mit einem Acridiniumester markierten Sonde, die in PSB (10 mM Lithiumsuccinat (pH 5,2), 0,1 % Lithiumlaurylsulfat) gelöst wurden, wurden in ein 12 × 75 mm Polysterenteströhrchen gegeben. Mehrere Röhrchen zur Wiederholung werden für jede markierte Sonde, die getestet werden soll, erstellt; der Anmelder verwendet für gewöhnlich 13 Röhrchen zur Wiederholung für jedes markierte Röhrchen, wovon drei als "Zeitpunkt" Null (T0)-Kontrollen verwendet werden. Die T0-Kontrollen werden in einem Teströhrchenhalter bei Raumtemperatur aufbewahrt. Zu jedem dieser Röhrchen werden 200 μl 0,4 N HCl und 0,1 % (v/v) H2O2 gegeben, gefolgt von der Zugabe von 100 μl Hydrolysepuffer (0,13–0,19 M Na2B4O7 (pH 7,6–9,5)) und 2–5 % (v/v) Polyoxyethylenether (verkauft unter dem Handelsnamen TRITON® X-100 durch Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Die Anmelder haben herausgefunden, dass die Reihenfolge bei diesem Schritt von Bedeutung ist. Reagenzienleerwerte (Negativkontrolle) enthalten 10 μl PSB alleine und werden dann so behandelt wie die T0-Kontrollen.
  • Einhundert Mikroliter des Hydrolysepuffers werden in jedes der 10 verbleibenden Teströhrchen für Wiederholungsversuche im Teströhrchenhalter gegeben und der Halter wird zum Mischen geschüttelt. Der Teströhrchenhalter wird sofort in einem zirkulierenden Wasserbad bei 60°C (oder jeder anderen gewünschten Testtemperatur) angeordnet und die Zeitaufnahme wird gestartet.
  • Zu gewünschten Zeitpunkten (zum Beispiel 1, 2, 4, 7, 10, 20, 30, 40 und 50 Minuten) werden 200 μl einer Lösung aus 0,4 N HCl 0,1 % (v/v) H2O2 zu einem Röhrchen aus jedem Set zugegeben und das Röhrchen wird sofort aus dem Wasserbad bei Raumtemperatur entfernt und gemischt. Man lässt das Röhrchen für wenigstens 1 Minute bei Raumtemperatur stehen.
  • Die Chemilumineszenz jeder Probe wird in einem Luminometer durch eine einzelne Injektion einer Lösung, die 1 N NaOH enthält, und Messen der Chemilumineszenz für 5 Sekunden gemessen. Die durchschnittlichen RLUs der Negativkontrollen werden von den experimentellen RLUs abgezogen. Die Netto-RLUs für jede Probe können dann durch die durchschnittlichen T0-RLUs geteilt werden und mit 100 multipliziert werden; dies ergibt die %T0-werte; die Daten können mit log (%T0) als γ-Achse und der Zeit als x-Achse aufgetragen werden.
  • Differentielle Hydrolyse (DH) Verhältnisbestimmung
  • Im Folgenden wird ein allgemeines Verfahren zum Messen des Hydrolyseverhältnisses des chemilumineszierenden Markers, der mit einer hybridisierten Oligonukleotidsonde gekoppelt ist, im Vergleich zur Hydrolyse des gleichen Markers, der auf die gleiche Weise mit der gleichen nicht mit ihrer Ziel-Nukleinsäure hybridisierten Sonde gekoppelt ist, dargestellt. Die Hybridisierung der markierten einzelsträngigen Oligonukleotidsonde wird wie folgt durchgeführt. Die folgenden Reagenzien werden in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für jede mit einem Acridiniumester markierte Sonde, die getestet werden soll, kombiniert: 15 μl einer Lösung aus PSB, die 0,05–0,1 pmol der AE-markierten Sonde (ein errechnetes Gesamt RLU-Potential von etwa 4–5 × 106), 0,5–1,0 pmol Äquivalente der Ziel-Nukleotidsequenz (z.B., 0,25–0,5 pmol einer Nukleinsäure mit zwei Kopien der Ziel-Nukleotidsequenz) und jeweils 5–10 pmol jeder gewünschten Helfersonde enthält, um die Hybridisierung der Sonde mit der Ziel-Nukleinsäure zu erleichtern. Helfersonden, die auch Helfer-Oligonukleotide genannt werden, sind unmarkierte Oligonukleotide, die zur Erhöhung der Hybridisierungsrate durch Zerstören der Sekundärstruktur der Ziel-Nukleinsäure im Bereich der Ziel-Nukleotidsequenz verwendet werden, (siehe Hogan et al., U.S. Patent Nr. 5,030,557, die gemeinsame Eigentümerschaft mit der vorliegenden Anmeldung genießt). Jedoch ist die Verwendung von Helfersonden nicht essentiell für die Durchführbarkeit der vorliegenden Erfindung.
  • Dem Mikrozentrifugenröhrchen werden auch 15 μl an 2 × Hybridisierungspuffer (200 mM Lithiumsuccinat (pH 5,2), 17 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 3 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) und 3 mM EGTA ([Ethylenbis(oxyethylennitrilo)]-tetraessigsäure)) zugesetzt. Das Röhrchen wird bei einer Temperatur von wenigstens etwa 5 °C unter dem Tm der Sonde:Zielduplex für wenigstens 30 Minuten inkubiert und dann werden 270 μl 1 × Hybridisierungspuffer zugegeben. Getrennte Röhrchen sollten für jede chemilumineszierende Markersondenkombination verwendet werden; ein Röhrchen aus jedem Satz (gekennzeichnet mit "Hybrid") sollte die markierte Sonde, die Ziel-Nukleinsäure und die Reagenzien enthalten, ein anderes Röhrchen (gekennzeichnet mit "Kontrolle") sollte bei Verwendung der gleichen Sonde und Reagenzien jedoch ohne die Ziel-Nukleinsäure verwendet werden. Am Ende sollte für jedes Experiment eine Reihe von identischen Röhrchen für den "Leerwert" unter Verwendung der Hybridisierungsreagenzien ohne markierte Sonde oder Ziel-Nukleinsäure erstellt werden.
  • Zehn Mikroliter Aliquots für jedes Röhrchen werden in 12 × 75 mm Polysterenröhrchen pipettiert; die Anzahl dieser Röhrchen ist gleich der Anzahl der zu analysierenden Zeitpunkte plus drei Röhrchen für die T0-Bestimmungen, wie weiter oben beschrieben.
  • In die drei T0-Röhrchen für den Wiederholungsversuch werden 200 μl 0,4 N HCl, 0,1 % (v/v) H2O2 gefolgt von 100 μl Hydrolysepuffer zugegeben. Die Röhrchen werden dann in einem Luminometer mittels einer einzelnen Injektion von 1 N NaOH über einen Zeitraum von 5 Sekunden ausgelesen. Die Reagenzien "Leerwert"-Kontrollen, die 10 μl PSB alleine enthalten, werden in einem Satz von 3–6 Röhrchen angesetzt und auf die gleiche Weise behandelt wie die T0-Kontrollen.
  • Die "Hybrid"- und "Kontroll"-Röhrchen werden mit 100 μl Hydrolysepuffer versetzt, gemischt und in einem zirkulierenden Wasserbad bei der gewünschten Temperatur, z.B., 60°C, angeordnet. Der Zeitnehmer wird gestartet.
  • Zu den gewünschten Zeitpunkten wird zu einem Röhrchen aus jedem Satz 200 μl 0,4 N HCl, 0,1 % (v/v) H2O2 gegeben, dann wird es aus dem Wasserbad entfernt und gemischt. Man lässt die Röhrchen bei Raumtemperatur für wenigstens 1 Minute stehen.
  • Die Chemilumineszenz der Zeitpunkt-Proben aus jedem Röhrchensatz wird in einem Luminometer mittels einer Injektion von 1 N NaOH gemessen. Das emittierte Licht wird für 5 Sekunden gemessen.
  • Die Daten werden, wie weiter oben beschrieben, analysiert. Die Hybrid-Hydrolyserate, die als Habwertszeit (T1/2) in Minuten ausgedrückt wird, wird durch die Hydrolyserate der Kontrollen geteilt, um das differentielle Hydrolyse (DH)-Verhältnis zu erhalten. Diese Ergebnisse werden weiter unten in Tabelle 2 zusammengefasst.
  • TABELLE 2
    Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Von den in Tabelle 1 dargestellten Daten ausgehend, fand man, dass Sätze von Verbindungen ausgewählt werden konnten, dessen Mitglieder ausreichend unterschiedliche Chemilumineszenzeigenschaften aufweisen, die als Markerreagenzien für das gleichzeitige Detektieren von mehr als einem Analyten im gleichen Röhrchen verwendet werden können. Wie in Tabelle 2 dargestellt, fanden die Anmelder überraschend heraus, dass einige dieser Sätze auch Verbindungsmitglieder mit vergleichbaren Hydrolysecharakteristika enthielten; d.h., der hybridisierte AE-Marker war nicht nur bevorzugt geschützt vor der Hydrolyse im Vergleich zum unhybridisierten Marker, sondern die Hydrolyseraten dieser Mitglieder innerhalb bestimmter potentieller Sätze waren im Wesentlichen ähnlich. 2 zeigt eine Liste mit Beispielen von Sätzen, die Paare solcher Verbindungsmitglieder auflisten. Die darin zitierten Beispiele sollen die vorliegende Erfindung auf keinen Fall auf diese Ausführungsformen beschränken. Auch wenn diese Figur die mögliche Anwendbarkeit der AE-Derivate als kombinierte Paare von Markerreagenzien darstellt, so sollte deutlich geworden sein, dass Sätze mit mehr als zwei Verbindungsmitgliedern unter Verwendung der Auswahlkriterien, die in dieser Figur und Offenbarung aufgelistet werden, entworfen werden können. Darüber hinaus sollte die Tatsache, dass bestimmte Verbindungsmitglieder zusammen in einer Gruppe zusammengefasst werden, auf keinen Fall so verstanden werden, dass dieses die optimalen oder einzigen Gruppierungen dieser bestimmten Verbindungen sind oder dass andere Verbindungen nicht ebenfalls wie angegeben funktionieren würden. Die vorliegende Erfindung wird lediglich durch die Ansprüche definiert. Die in 2 aufgelisteten Acridiniumestersätze sind Kandidaten für die Verwendung in wenigstens einem Modus der vorliegenden Erfindung.
  • Beispiel 3: Modus 1: Konstanter pH, gleichzeitige Reaktionsinitiierung
  • Es gibt verschiedene Modi, in denen die chemilumineszierenden Signale der Markerreagenzien verwendet werden können, um mehr als einen Nukleinsäureanalyten in einem einzelnen Probenröhrchen gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden. Dieses und die folgenden Beispiele sind Illustrationen solcher Modi. Jedoch beabsichtigt der Anmelder durch diese Beispiele nicht, die Anzahl oder Beschreibung von möglichen Assaymodi oder der Zusammensetzung oder Kombination von Markerreagenzien für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung zu begrenzen.
  • Ein erstes Experiment testete die Chemilumineszenzcharakteristika der AE-Markerreagenzien, die an einzelsträngige Oligonukleotide in Abwesenheit einer Ziel-Nukleinsäure gekoppelt sind. Einzelsträngige Oligonukleotide wurden entworfen, damit sie komplementär zu RNA-Zielen sind, die von Escherichia coli oder Chlamydia trachomatis abstammen. Die Oligonukleotide wurden, wie weiter oben beschrieben, gekennzeichnet: Das o-diBr-Derivat war mit einem Oligonukleotid gekoppelt, das spezifisch komplementär zur E. coli Ziel-RNA war, während eine Mischung der 1- und 3-Me- Derivate verwendet wurde, um ein Oligonukleotid zu markieren, das spezifisch komplementär mit der C. trachomatis Ziel-RNA ist. Die markierten Oligonukleotide wurden in 10 mM Lithiumsuccinat (pH 5,0) und 0,1 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat verdünnt, so dass 10 μl der sich daraus ergebenden Lösung etwa 200.000 RLU (etwa 0,002 pmol) jedes Oligonukleotides enthielt. Zehn Mikroliter jedes Oligonukleotids wurden mit 10 μl des gleichen Verdünnungspuffers in getrennten Röhrchen kombiniert; zusätzlich wurden 10 μl jedes markierten Oligonukleotids in einem einzelnen Röhrchen kombiniert. Zweihundert Mikroliter einer Lösung die 0,1 N HCl und 0,1 % H2O2 enthielten, wurden in das Röhrchen gegeben, gefolgt von 100 μl einer Lösung, die 0,19 M Na2B4O7 (pH 7, 6) und 5 % (v/v) TRITON® X-100 enthielt. Die sich daraus ergebende Lösung wurde in einem LEADER® 50 Luminometer angeordnet und die Chemilumineszenz wurde bei verschiedenen Intervallen nach der Injektion von 200 μl 1 N NaOH in die Probenlösung gemessen. Der Luminometer wurde im "Kinetikanalyse"-Modus während des Experiments angeordnet; dies erlaubte das Sammeln von RLU-Datenpunkten zu vorbestimmten Zeitintervallen nach der Initiation der Chemilumineszenzreaktion.
  • In einem anderen Experiment wurden die gleichen markierten Oligonukleotide jeweils mit einem Überschuss ihrer entsprechenden Ziel-RNA hybridisiert, wie es in Nelson et al., siehe oben, beschrieben worden ist. Die Hybridisierung wurde in einem 50 μl Reaktionsvolumen durchgeführt und für 60 Minuten bei 55°C inkubiert. Die letztendliche Lösung für die Hybridisierung enthielt 100 mM Lithiumsuccinat (pH 5,2), 8,5 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 1,5 mM EDTA und 1,5 mM EGTA. Röhrchen, die 50 μl jeder individuellen Sonde:Ziel-Hybridisierungsmischung alleine oder eine Kombination von beiden Hybridisierungsmischungen enthielten, wurden 150 μl 0,19 M Natriumtetraborat (pH 7,6) in 5,0 % (v/v) TRITON® X-100 zugesetzt. Die letztendliche Menge jedes markierten Oligonukleotids lag bei etwa 0,002 pmol für jedes experimentelle Röhrchen. Die Proben wurden in einem LEADER® 50 Luminometer eingesetzt und die Chemilumineszenz wurde mit der Zugabe von 200 μl 0,1 % (v/v) H2O2 in 1 mM HNO3 und nach einer 0,1 bis 2 sekündigen Verzögerung einer automatischen Injektion von 200 μl 1 N NaOH initiiert. Die Chemilumineszenz wurde zu verschiedenen Zeiten gemessen. Der Luminometer wurde während des Experimentes wiederum im "Kinetik-Analyse"-Modus gehalten; dies erlaubte das Sammeln von RLU-Datenpunkten zu vorbestimmten Zeitintervallen nach dem Initiieren der Chemilumineszenzreaktion.
  • Die gesammelten Daten für die unhybridisierten markierten Oligonukleotide werden weiter unten in Tabelle 3 dargestellt.
  • TABELLE 3
    Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • In diesem Experiment wurde die Chemilumineszenz für insgesamt 2 Sekunden mit Auslesungen in Intervallen von 0,04 Sekunden gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass der o-diBr-AE-Marker ein starkes Scheitelpunktsignal bei der Lichtemission aufweist, das sehr schnell nach der Initiierung der Chemilumineszenzreaktion auftritt. Das Scheitelpunktsignal der Lichtemission unter diesen Bedingungen tritt im Intervall 4 auf; etwa 0,16 Sekunden nach der Initiierung, und dann zerfällt das Signal sehr schnell. Im Gegensatz dazu erreicht das Licht, das bei der Mischung aus 1- und 3-Me-AE-Derivaten emittiert wird, seinen Scheitelpunkt etwa beim Intervall 8 (0,32 Sekunden nach der Initiierung) und zerfällt danach sehr langsam. Darüber hinaus liegt das Signal vom o-diBr-AE-Derivat in den späteren Intervallen (Intervalle 14 bis 50 und besonders die Intervalle 41–50) bei nahezu Null, während das Signal aus der 1- und 3-Me-Mischung immer noch wesentlich größer ist als der Hintergrund. Die Daten aus der Probe, die beide Marker enthält, nähert sich der Summer der zwei individuellen Datensätze an jedem Punkt an.
  • Die Daten, die aus den Experimenten erhalten werden, die die hybridisierten Proben der zwei markierten Oligonukleotide einschließen, werden weiter unten in Tabelle 4 dargestellt.
  • TABELLE 4
    Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Die Zeitintervalle waren die gleichen wie in Tabelle 3. In diesem Fall war der Unterschied bei den Emissionscharakteristika der zwei Marker noch deutlicher unterscheidbar als im vorherigen Experiment: Der Scheitelpunkt des Signals von mit E. coli hybridisiertem o-diBr-AE tritt wiederum etwa im Intervall 4 auf; jedoch tritt der Scheitelpunkt des Signals für mit C. trachomatis hybridisiertem 1-Me-AE etwa beim Intervall 14 auf. Wiederum geht während der späteren Intervalle (besonders den Intervallen 41–50) das vom o-diBr-AE-Derivat erhaltene Signal fast verloren, während das Signal vom 1-Me-AE-Derivat immer noch deutlich ist. Und wieder nähert sich das Profil der Probe, die eine Mischung der zwei hybridisierten markierten Oligonukleotide enthält, der Summe der zwei individuellen Probenprofile an jedem Punkt an.
  • Diese Daten verdeutlichen die Anwendbarkeit und Nutzbarkeit eines Modus des Verfahrens und der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung. Das in einem einzelnen Teströhrchen erhaltene Signal, das zwei verschiedene Oligonukleotide enthält, die mit spezifischen AE-Derivaten, wie im vorliegenden Beispiel dargestellt wird, markiert sind, setzt sich eindeutig aus zwei Komponenten zusammen, eine steuert eine schnell reagierende, schnell zerfallende Spezies (zum Beispiel das o-diBr-AE) bei und die andere eine Spezies, die langsamer reagiert und zerfällt (zum Beispiel die 1- und 3-Me-AE-Mischung). Durch das Entwerfen von zwei Detektionszeiträumen für die Analyse, eine Früher (zum Beispiel in den Intervallen 1–6; 0,04–0,24 Sekunden) für die Detektion des Analyten, der mit der schnell reagierenden Spezies assoziiert ist, und ein Später (zum Beispiel für die Intervalle 41–50; 1,64–2,0 Sekunden) für die Detektion des Analyten, der mit der langsam reagierenden Spezies assoziiert ist, ermöglichen die Verfahren und Reagenzien der vorliegenden Erfindung die nahezu gleichzeitige Detektion verschiedener Nukleinsäuresequenzen in einer einzelnen Probe.
  • Die aus diesem Experiment erhaltenen Rohdaten wurden weiterhin mittels eines sich wiederholenden Datenanalyseverfahrens wie folgt behandelt. Proben, die nur eine markierte Sonde enthielten, wurden als Standard für die Datenanalyse verwendet. Für jeden Standard wurde das Verhältnis zwischen der Summe der RLU-Werte, die in den Intervallen 1–10 erhalten wurden, und die Summe der RLU-Werte, die in den Intervallen 41–50 erhalten wurden, bestimmt (Σ RLU 41–50/Σ RLU 1–10); für o-diBr-AE lag dieses Verhältnis bei 0,00267 und für 1-Me-AE lag das Verhältnis bei 0,645. Die Chemilumineszenzsignale, die in den Intervallen 41–50 (in RLU) gemessen wurden, wurden zusammengerechnet und dann durch 0,645 geteilt, das für den 1- und 3-Me-Standard erhaltene Verhältnis. Die sich daraus ergebende Figur zeigt die Menge an RLU, die in den Intervallen 1–10 durch die 1- und 3-Me-AE-markierte Sonde beigetragen werden. Diese Menge, subtrahiert von der Gesamt-RLU in den Intervallen 1–10, ergibt die Menge an RLU, die in diesen Intervallen durch o-diBr-AE beigetragen wurden. Die zuletzt genannte Zahl, wenn man sie mit 0,00267 multipliziert (das Verhältnis für o-diBr-AE) ergibt die RLU innerhalb der Intervalle 41–50, die durch die o-diBr-AE-markierte Sonde beigetragen wurden. Wenn diese Zahl von der Gesamt-RLU in den Intervallen 41–50 abgezogen wird, ergibt sich ein korrigierter Wert für die RLU, die durch 1-Me-AE in diesem Intervall beigetragen wurden. Diese Zahl wurde verwendet, um die oben beschriebene Berechnung zu wiederholen, bis der RLU-Beitrag durch o-diBr-AE in den Intervallen 41–50 sich innerhalb der ausgewählten Zahlen der wichtigen Figuren nicht veränderte. Eine Illustration des Verfahrens, so wie es auf die Rohdaten der Tabelle 5 angewendet wurde, wird weiter unten wiedergegeben.
  • TABELLE 5
    Figure 00490001
  • Ein Personalcomputer wurde programmiert, um diese Berechnungen durchzuführen. Die Rohdaten wurden direkt vom Luminometer mittels der maschinellen RS-232-Schnittstelle in den Computer eingespeist und die Daten verarbeitet, so wie es weiter oben beschrieben worden ist. Die Intervalle, die in der obigen Analyse verwendet wurden, können sich abhängig vom ausgewählten Markerreagenz unterscheiden und es ist nicht notwendig, dass die spezifischen Intervalle, die weiter oben oder in den folgenden Beispielen dargestellt wurden, verwendet werden. Darüber hinaus wird, während das Datenanalyseverfahren, das in diesem Beispiel offenbart wurde, mittels Daten durchgeführt wurde, die in Experimenten erhalten wurden, die zwei chemilumineszierende Verbindungen enthalten, dem Fachmann auf diesem Gebiet klar sein, dass die gleichen Verfahren verwendet werden können, um Daten zu verarbeiten, die von mehr als zwei solcher Verbindungen erhalten wurden, vorausgesetzt, dass die Reaktionscharakteristika jeder Verbindung ausreichend unterschiedlich von den anderen sind.
  • Beispiel 4: Modus 2: Sequenzielle Reaktion bei verschiedenen pH-Werten
  • In einem anderen Modus können die Reagenzien und das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um mehr als einen Analyten in einer Probe durch Initiieren der Chemilumineszenzreaktion bei verschiedenen pH-Werten zu detektieren und zu messen. Beim ersten pH kann die Chemilumineszenzreaktion initiiert werden, zum Beispiel durch die Zugabe von Natriumperoxid und einer Base in einem geeigneten Puffer, was dazu führt, dass ein oder mehrere Markerreagenzien messbares Licht emittieren während ein oder mehrere zusätzliche Markerreagenzien nicht in einem nennenswerten Ausmaß bei dem pH reagieren werden. Die beim ersten pH emittierte Lichtmenge kann in einem Luminometer gemessen werden. Zusätzlich kann das emittierte Licht über einen Zeitraum gemessen werden und der Zeitraum kann in Intervalle aufgeteilt werden, die weiter oben für eine kinetische Analyse der Reaktion genau beschrieben worden ist. Nach dem Messen bei einem bestimmte pH kann der pH der Testlösung auf einen Wert eingestellt werden, bei dem ein oder mehrere andere chemilumineszierende Markerreagenzien reagieren können.
  • Während die hierin vorgestellten Daten diesen Modus der Erfindung, der zwei AE-Derivate verwendet, darstellen, wird dem Fachmann auf diesem Gebiet im Lichte dieser Offenbarung klar sein, dass mehr als zwei pH-Werte im Verfahren dieser Erfindung verwendet werden können. Darüber hinaus wird im Lichte dieser Offenbarung für einen Fachmann auch klar sein, dass Aspekte der hierin beschriebenen verschiedenen Modi in einem einzelnen Assaysystem kombiniert werden können. Zum Beispiel kann bei jedem pH-Wert des "Mehrfach"-Modus, der in diesem Beispiel beschrieben wird, ein Satz von kinetisch unterschiedlichen Markern auf eine dem vorherigen Beispiel entsprechende Art und Weise detektiert werden. Ein solches System würde daher die Detektion von drei oder mehr Analyten in dem gleichen Probenröhrchen erlauben. Andere nicht ausdrücklich erwähnte Kombinationen werden dem Fachmann auf diesem Gebiet ebenfalls deutlich werden. Alle derartigen Kombinationen, egal ob ausdrücklich hierin erwähnt oder nicht, sollen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegen.
  • Zwei Oligonukleotide, jedes markiert mit einem AE-Derivat mit einem anderen pH-Optimum für die Chemilumineszenzreaktion, wurden jeweils einzeln in einer Lösung verdünnt, die 10 mM Lithiumsuccinat (pH 5,0) und 0,1 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat enthält. Das erste Oligonukleotid, das für die Chlamydia trachomatis 16 S-rRNA spezifisch ist, wurde über einen Linker-Arm an Standard-AE gekoppelt. Das zweite Oligonukleotid, das für die Chlamydia trachomatis 23 S-rRNA spezifisch ist, wurde über einen Linker Arm mit o-F-AE gekoppelt. Zehn Mikroliter (etwa 0,002 pmol) jedes Oligonukleotids wurden mit 10 μl des gleichen Verdünnungspuffers in separaten Röhrchen kombiniert; zusätzlich wurden 10 μl jedes markierten Oligonukleotids in einem einzelnen Röhrchen kombiniert. Zu jedem Röhrchen wurden 40 μl 0,4 N HCl, 60 μl Wasser und 200 μl einer Lösung, die 1 mM HNO3 und 0,1 % H2O2 enthält, gegeben. Die Röhrchen wurden in einem LEADER® 50 Luminometer (Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA) angeordnet und die Chemilumineszenz wurde mit der automatischen Injektion von 200 μl 0,24 M Borsäure (mit NaOH auf den pH 12,9 eingestellt) gemessen. Der ungefähre pH der Lösung an diesem Punkt lag bei 12,1. Die Chemilumineszenz wurde für 8 Sekunden gemessen, gefolgt von einer anderen automatischen Injektion von 200 μl 0,75 N NaOH bis zu einem ungefähren End-pH von 13,0. Die sich daraus ergebende Chemilumineszenz wurde für 10 Sekunden gemessen. Während der Messung der Chemilumineszenz wurden Daten in 0,1 Sekundenintervallen gesammelt und sofort in einen IBM-kompatiblen PC-Computer geladen. Die Daten wurden dann als RLU gegen die Zeit (Intervallnummer) aufgetragen.
  • Die Ergebnisse werden in 3 dargestellt. Diese Daten zeigen, dass mehr als ein Chemilumineszenzmarkerreagenz, das mit einem Oligonukleotid gekoppelt ist, als ein Mitglied eines Satzes solcher Markerreagenzien, die auf Basis ihres optimalen pH für die Reaktion ausgewählt wurden, detektiert werden kann.
  • Beispiel 5: Gleichzeitige Detektion von Chlamydia trachomatis und Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäuren in einem homogenen Assayformat
  • Das Verfahren und die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wurden verwendet, um das Vorhandensein der Nukleinsäuren, die von Chlamydia trachomatis (Ctr) und Neisseria gonorrhoeae (Ngo) abstammen, in einem einzelnen Teströhrchen, das mit bekannten Mengen der Zielnukleinsäuren versehen ist, zu detektieren. In diesem Beispiel wurde die Bildung, Auswahl und Detektion von markierten Analyt/Sondenkonjugaten nur in der flüssigen Phase durchgeführt.
  • Der Einfachheit halber waren die Ctr- und Ngo-spezifischen Sonden die, die im PACE® 2 Assay (Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA), dass bei Gen-Probe kommerziell erhältlich ist, verwendet wurden. Im kommerziell erhältlichen Assay sind die Ctr- und Ngo-Sonden jeweils mit Standard-AE (siehe 1) markiert und werden getrennt untersucht. Im Gegensatz dazu wurden im hierin beschriebenen Beispiel die kommerziell erhältlichen Ctr-Sonden durch die identischen Sonden, die mit 1- und 3-Me-AE markiert sind, ersetzt und die Standard Ngo-Sonden wurden durch die identischen Sonden, die mit einer Mischung aus 1- und 3-Me-m-diF-AE markiert sind, ersetzt. Darüber hinaus wurden im kommerziell erhältlichen PACE® 2 Assay die markierten Sonden zusammen in einer "Probenmischung" mit anderen nicht markierten Helfersonden, die entworfen worden sind, um die Hybridisierungsrate und die Stabilisierung der gebildeten Hybridnukleinsäure zu verbessern, verwendet. Die Verwendung von Helfersonden wird weiter oben und im U.S. Patent Nr. 5,030,557 beschrieben. Wie weiter oben dargelegt, sind Helfersonden für das Ausführen der vorliegenden Erfindung nicht notwendig, auch wenn Helfersonden in Verbindung mit der Verwendung von bestimmten markierten Hybridisierungssonden notwendig sein können. Wie ebenfalls weiter oben erwähnt, hängt die vorliegende Erfindung auch nicht von bestimmten Nukleotidsequenzen des Nukleinsäureanalyten oder der Hybridisierungsassaysonde ab; demnach sind die in diesen Beispielen verwendeten spezifischen Oligonukleotidsonden kein wesentliches Merkmal für die vorliegende Erfindung. Die vorliegenden Verfahren und Zusammensetzungen können mit irgendeinem Satz von zwei oder mehr Nukleinsäureanalyten/Hybridisierungssondenpaaren, die sich gegenseitig ausschließende stabile doppelsträngige Hybride bilden, verwendet werden.
  • Die Proben wurden für das Assay durch das Hinzufügen verschiedener Mengen ribosomaler RNA-Ziele von Ctr und Ngo in einer Lösung, die 3 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 30 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,8), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA bis auf ein Endvolumen von 50 μl enthält, hergestellt. Das Sondenreagenz wurde durch Kombinieren der 1-Me-AE-markierten Ctr-Sonde mit der 1-Me-m-diF-AE-markierten Ngo-Sonde in einer Lösung, die 200 mM Lithiumsuccinat (pH 5,1), 17 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 3 mM EDTA und 3 mM EGTA enthält, hergestellt. Die Gesamtmenge der Sonden, die mit jedem der AE-Derivate markiert waren, lag bei 0,2 pmol.
  • Jede Hybridisierungsreaktionsmischung enthielt 50 μl der Ziel-Nukleinsäuren (oder in Kontrollexperimenten, kein Ziel) und 50 μl des Sondenreagenzes. Jede Reaktionsmischung wurde bei 55°C für eine Stunde inkubiert. Dreihundert Mikroliter 0,15 M Tetraborat (pH 8,5) und 2 % (v/v) TRITON® X-100 wurden zu jeder Probe zugegeben und die Proben für 20 Minuten bei 55°C inkubiert. Die Chemilumineszenz jeder Probe wurde in einem LEADER® 50 Luminometer mit der automatischen Injektion von 200 μl einer Lösung, die 0,1 % H2O2 und 1 mM HNO3 enthält, nach einer 2 sekündigen Verzögerung gefolgt von einer anderen Injektion von 1 N NaOH, 2 % (w/v) Zwittergent® 3-14(N-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat gemessen; Zwittergent® ist eine registrierte Marke von CalBiochem, La Jolla, CA). Die Chemilumineszenz jeder Probe wurde für 2 Sekunden mittels des kinetischen Modus des Luminometers und in Intervallen von 0,04 Sekunden beobachtet. Die Daten wurden direkt vom Luminometer in einen Personalcomputer übertragen und mittels Rechenverfahren, die denen im weiter oben beschriebenen Beispiel 3 ähneln, analysiert. Die für diese Berechnungen verwendeten Zeitintervalle waren die Intervalle 1–6 und 41–50. Zwei Standards für jeden unterschiedlichen Marker wurden gemittelt, genau wie zwei Leerproben, die keine Sonde oder Ziel-Nukleinsäuren enthielten. Der in jedem Zeitintervall erhaltene RLU-Wert für die gemittelten Leerwert-Standards wurde von den RLU-Werten für das entsprechende Intervall für alle anderen Proben vor der Berechnung subtrahiert. Jede Probe wurde zweimal wiederholt; die dargestellten Werte stellen das Mittel der doppelt durchgeführten Reaktionsmischungen dar. Die Ergebnisse werden weiter unten in Tabelle 6 dargestellt.
  • TABELLE 6
    Figure 00550001
  • Diese Daten zeigen, dass wenigstens zwei Analyten (Ctr- und Ngo-ribosomale RNA in diesem Beispiel) entweder allein oder in einer Probe zusammen mittels des Mehrfachanalytverfahrens und der Reagenzien der vorliegenden Erfindung identifiziert werden können.
  • Beispiel 6: Gleichzeitige Detektion von Chlamydia trachomatis- und Neisseria gonorrhoeae-Nukleinsäuren in einem gemischten homogenen/heterogenen Assayformat
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde wiederum verwendet, um das Vorhandensein von Ctr und Ngo in einem "reinen System" (d.h. es war keine klinische Probe vorhanden) gleichzeitig zu detektieren; dieses Mal in einem homogenen/heterogenen Assaysystem. Das für dieses Beispiel verwendete Assay war das PACE® 2 Format (kommerziell erhältlich von Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA), das, wie hierin beschrieben, modifiziert worden ist. Die in diesem Assay verwendeten Sonden waren identisch mit denen, die im Beispiel 5 verwendet wurden, und wurden in einer Sondenmischung mit Helfersonden verwendet.
  • Für das Assay wurden verschiedene Mengen entweder von der Ngo- oder Ctr-ribosomalen RNA oder beides in jedem Röhrchen kombiniert; die Mengen des Ziels variierten zwischen 0 und 12,5 fmol. Das Endvolumen jeder Ziel-Nukleinsäureverdünnung lag bei 100 μl; der Unterschied im Volumen wurde mit einer Lösung aus 30 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 3 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 1 mM EDTA und 1 mM EGTR ausgeglichen. Das Sondenreagenz wurde durch Mischen der 1-Me-AE-Sondenmischung und der 1-Me-m-diF-AE-Sondenmischung in gleichen Volumina hergestellt; wie im vorherigen Experiment enthielten die Sondenreagenze auch Helfersonden. Die Sondenmischung enthielt 190 mM Lithiumsuccinat (pH 5,1), 17 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 3 mM EDTA, 3 mM EGTA und die Sonden; einhundert Mikroliter davon wurden zu den Ziel-Nukleinsäureverdünnungen gegeben, um ein Endvolumen von 200 μl zu erzielen. Die Röhrchen wurden geschüttelt, um sie zu mischen, und für 90 Minuten bei 60°C inkubiert. Die Röhrchen wurden aus dem Wasserbad entfernt und es wurden 1 ml einer Lösung aus 190 mM Natriumtetraborat (pH 7,6), 6,89 % (w/v) TRITON® X-102 und 0,01 % (w/v) Gelantine, die 50 μl einer 1,25 % (w/v) Suspension von BiomagTM4100 magnetischen Partikeln (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA) in 0,02 % (w/v) Natriumazid und 1 mM EDTA enthielt, zugegeben. Die Röhrchen wurden weiter für 10 Minuten bei 60°C inkubiert, und dann aus dem Wasserbad entfernt und der Halter wurde sofort in einer Station zur magnetischen Abtrennung angeordnet und für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann wurde die ungebundene Sonde von den mit magnetischen Kügelchen gebundenen hybridisierten Sonde durch Dekantieren der Lösung abgetrennt. Siehe Arnold, et al., Europäische Veröffentlichungsnr. EPO 281390, die gemeinsame Eigentümerschaft mit der vorliegenden Erfindung genießt. Die Kügelchen und die absorbierte hybridisierte Sonde wurden einmal in einer Lösung aus 20 mM Natriumtetraborat (pH 10,4), 0,1 % (w/v) Zwittergent® 3–14 gewaschen, dann in 300 μl 5 % (v/v) TRITION® X-100 resuspendiert.
  • Jede Probe wurde dann in einen LEADER® 50 Luminometer eingestellt. Die Chemilumineszenzreaktion wurde durch die automatische Injektion von 200 μl einer Lösung, die 0,1 % (v/v) H2O2 und 1 mM HNO3 enthält, nach einer 2 sekündigen Verzögerung gefolgt von einer anderen Injektion von 200 μl einer Lösung, die 0,7 N NaOH und 0,5 % (v/v) Zwittergent® 3–14 enthält, initiiert. Die Chemilumineszenz jeder Probe wurde für 2 Sekunden mittels des kinetischen Modus des Luminometers und Intervallen von 0,04 Sekunden überwacht. Die Daten wurden direkt vom Luminometer in einen Arbeitsplatzrechner übertragen und mittels Berechnungsverfahren, die denen im weiter oben beschriebenen Beispiel 3 ähneln, analysiert. Die für diese Berechnungen verwendeten Zeitfenster stammen von den Intervallen 1–7 und 34–50. Zwei Standards für jeden unterschiedlichen Marker wurden gemittelt (unter Verwendung von 5 fmol ribosomaler RNA für die Ngo-Kontrolle und 1,5 fmol ribosomaler RNA für die Ctr-Kontrolle) sowie zwei Leerwertproben, die keine Sonde oder Ziel-Nukleinsäuren enthielten. Der RLU-Wert, der für die gemittelten Leerwertstandards in jedem Zeitintervall erhalten wurde, wurde von den RLU-Werten für alle anderen Proben für das entsprechende Intervall vor der Berechnung substrahiert. Jede Probe wurde zweifach durchgeführt; die dargestellten Werte stellen das Mittel der doppelt vorhandenen Reaktionsmischungen dar. Die Ergebnisse werden weiter unten in Tabelle 7 dargestellt.
  • TABELLE 7
    Figure 00580001
  • Diese Daten zeigen, dass durch die Verwendung der Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung mehr als ein Analyt (in diesem Fall Ctr- und Ngo-ribosomale RNA) alleine oder in Kombination im gleichen Probenröhrchen eindeutig identifiziert werden können. Wenn darüber hinaus die Sonden, die die Markerreagenzien der vorliegenden Erfindung enthalten, im gleichen Probenröhrchen kombiniert werden, ist das gleiche Probenvolumen für die nahezu gleichzeitige Identifikation von mehr als einem Analyten mittels der vorliegenden Erfindung ausreichend. Dies erlaubt das Zurückhalten irgendwelcher verbleibenden Proben für andere Zwecke (wie zum Beispiel andere Assays), wodurch die Anzahl von Assays, die unter Verwendung von Proben eines vorgegebenen Volumens durchgeführt werden können, erhöht wird.
  • Zusätzlich zeigen die oben aufgelisteten Daten, dass ein Assay, das in Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung durchgeführt worden ist, eine hohe Empfindlichkeit aufweist, mit einer Empfindlichkeitsgrenze in diesem Experiment von wenigstens 0,125 fmol für Ngo und 0,035 fmol für Ctr. Durch das Darstellen der Daten in diesem Beispiel beabsichtigt der Anmelder jedoch nicht zu implizieren, dass dies die untere Grenze der Empfindlichkeit ist, die bei irgendeinem Satz von experimentellen Bedingungen erhältlich ist.
  • Beispiel 7: Gleichzeitiges Detektieren ribosomaler RNA von Chlamydia trachomatis und Neisseria gonorrhoeae in einer klinischen Probe
  • Das Verfahren und die Reagenzien der vorliegenden Erfindung wurden verwendet, um das Vorhandensein ribosomaler RNA von Ctr und Ngo in einer klinischen Probe gleichzeitig zu detektieren. Das Assayformat war das gleiche, wie es im Beispiel 6 verwendet worden ist, jedoch mit den folgenden Unterschieden.
  • Jede Probe wurde durch Zugabe der gewünschten Menge an ribosomaler RNA zu 100 μl eines Pools endocervikaler Abstriche klinischer Proben hergestellt; jeder Abstrich wurde ursprünglich in einem Volumen von 1 ml des Gen-Probe PACE® 2 Transportmediums (erhältlich als eine Komponente des STD Transportkits von Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA) suspendiert. Diese Proben sind zuvor auf Ctr und Ngo negativ getestet worden. Hätten die ursprünglichen klinischen Proben Ctr- oder Ngo-Zellen enthalten, wären diese Zellen lysiert worden und ihre Nukleinsäuren (einschließlich der ribosomalen RNA) durch die Wirkung von Komponenten des Transportmediums in Lösung freigesetzt worden.
  • Die Hybridisierung wurde wie in Beispiel 5 durchgeführt, wurde jedoch auf 2,5 Stunden verlängert. Nach der Hybridisierung wurde die Chemilumineszenz, wie in Beispiel 6 beschrieben, gemessen, mit der Ausnahme bezüglich der folgenden Änderungen. Eine Lösung aus 0,5 N NaOH und 0,5 % Zwittergent® wurde ersetzt durch 0,7 N NaOH und 0,5 % Zwittergent®; die Ngo- und Ctr-ribosomalen RNA-Standards lagen bei 1,25 fmol bzw. 0,35 fmol; und die ausgewählten Intervalle für die Zeitfenster waren die Intervalle 1–5 und 41–50. Die Assayergebnisse werden weiter unten in Tabelle 8 dargstellt.
  • TABELLE 8
    Figure 00610001
  • Diese Daten zeigen, dass die Fähigkeit des Verfahrens und der Reagenzien der vorliegenden Erfindung die Detektion und Quantifizierung von mehr als einem Analyten in einer einzelnen Probe zu ermöglichen durch Substanzen, die in einem Pool aus klinischen Proben vorhanden sind, nicht beeinträchtigt wird.
  • Beispiel 8: Detektion der gag- und pol-Bereiche von HIV-DNA
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde verwendet, um gleichzeitig die gag- und pol-Bereiche des Humanen Immunodefizienzvirus (HIV)-Genoms zu detektieren. Ein Vorteil des Mehrfachanalytdetektionsmerkmals der vorliegenden Erfindung für die Identifikation von HIV ist, dass die Detektion des Vorhandenseins des zweiten Bereiches (entweder gag oder pol) des HIV-Genoms verwendet werden kann, um das Vorhandensein des Virus in einem diagnostischen Assay aufgrund der verringerten Wahrscheinlichkeit von zwei gleichzeitig falsch positiven Assayindikationen im gleichen Assay zu bestätigen. Darüber hinaus kann die Detektion von mehr als einer bestimmten Nukleotidsequenz des gleichen Nukleinsäureanalyten helfen, die Detektion eines Virus oder einer Zelle in Fällen in denen eine Ziel-Nukleinsäure sich geändert hat oder mutiert ist, zu gewährleisten.
  • Im vorliegenden Beispiel wurde ein Bereich des HIV-Genoms, das sowohl die gag- als auch die pol-Bereiche enthält, als erstes, wie weiter unten beschrieben, amplifiziert. Die gag- und pol-Nukleotidsequenzbereiche wurden dann gleichzeitig mittels des Verfahrens und der Reagenzien der vorliegenden Erfindung in einem Hybridisierungsschutzassay (HPA)-format detektiert.
  • Sonden, die mit den gag- und pol-Bereichen des HIV-1-Genoms komplementär sind, wurden synthetisiert. Die gag-spezifische Sonde (SEQ ID NO: 11) wurde mit einer Mischung aus 1- und 3-Me-AE markiert und die pol-spezifische Sonde (SEQ ID NO: 5) wurde mit o-diBr-AE markiert, wie ebenfalls weiter oben beschrieben wurde, unter Verwendung eines Nicht-Nukleotid Linker-Arms, der als Teil des Oligonukleotids während der Synthese eingebaut wurde, um den Marker mit der Sonde zu verbinden. Ein geklontes HIV-1-DNA-Fragment, das beide Ziel-Sequenzbereiche enthält, wurde in einem 100 μl Volumen amplifiziert, wie es von Kacian, et al., PCT Veröffentlichungsnr. WO 91/01384, die gemeinsame Eigentümerschaft mit der vorliegenden Anmeldung genießt, beschrieben wurde. Die Amplifikationsprimer, die zum Amplifizieren des pol-Bereiches verwendet wurden, wiesen die Nukleotidsequenzen der SEQ ID NO: 1 bis 4 auf. Sonden und Primer, die zum Amplifizieren des gag-Bereichs verwendet wurden, wiesen die Nukleotidsequenzen SEQ ID NO: 5 bis 10 auf.
  • Nach der Amplifikation der HIV-1-DNA wurden die Sonden mit den gag- und pol-Ziel-Nukleinsäurebereichen durch Zugabe von 100 μl einer Lösung, die 5,5 fmol der 1-Me-AE-markierten gag-Sonde und 16 fmol der o-diBr-AE-markierten pol-Sonde in 0,2 M Lithiumsuccinat (pH 5,0), 17 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 3 mM EDTA und 3 mM EGTA enthält, zur Amlifikationsreaktionsmischung hybridisiert. Ein unmarkiertes Helfer-Oligonukleotid der SEQ ID NO: 6 wurde ebenfalls verwendet, um bei der Amplifikation des pol-Zielbereichs zu helfen. Die Reaktionsmischung wurde dann für 30 Minuten bei 60°C inkubiert. Die Hydrolyse der Acridiniumderivate an der unhybridisierten Sonde wurde durch Zugabe von 300 μl einer Lösung aus 0,13 M Na2B4O7 (pH 9,3), 2 % (v/v) TRITON® X-100 und 13 mM Iodessigsäure und Inkubieren der Mischung für 20 Minuten bei 60°C durchgeführt. Bei diesem pH wird die Iodessigsäure zur Reaktionsmischung gegeben, um die Bildung des Acridiniumesteradduktes, die im Chemilumineszenzassay nicht reaktiv sind, zu verhindern.
  • Die Chemilumineszenz wurde in einem LEADER® 50 Luminometer gemessen. Jede Probe wurde im Luminometer angeordnet und die Chemilumineszenzreaktion durch die automatische Injektion von 200 μl 0,1 % (v/v) H2O2 in 1 mM HNO3, gefolgt von einer 2 sekündigen Verzögerung und automatischen Injektion von 1,5 N NaOH, initiiert. Die Chemilumineszenz wurde für 2 Sekunden unter Verwendung des Kinetikmodus des Luminometers und Intervallen von 0,04 Sekunden gemessen. Die Daten wurden mittels eines Arbeitsplatzrechners gesammelt und die Rohdaten wurden mittels der in Beispiel 3 beschriebenen Berechnungsverfahren analysiert. Die für die Berechnungen verwendeten Zeitfenster entsprachen den Intervallen 1–10 und 41–50. In diesem Fall wurden sowohl 2 Standards für jeden Marker (diese bestanden aus gereinigten Nukleinsäuren, die Nukleotidsequenz jedes Ziels enthielten; entweder gag allein oder pol alleine) als auch 2 Negativkontrollen, die genauso behandelt worden sind wie die anderen Proben, jedoch keine Ziel-Nukleinsäuren oder Sonde enthielten, verwendet. Die Daten, die von Doppelstandardproben erhalten wurden, wurden gemittelt und alle Proben wurden wie weiter oben beschrieben um den Hintergrund korrigiert. Die Ergebnisse werden weiter unten in Tabelle 9 dargestellt. In diesem Experiment ergibt ein negatives Assayergebnis einen RLU-Wert von weniger als 10.000. In allen Experimenten, in denen gag- und pol-Ziel-Nukleinsäuresequenzen (mit Ausnahme der oben erwähnten Kontrollen) verwendet wurden, waren die gag- und pol-Ziele einmal in jedem Ziel-Nukleinsäuremolekül enthalten.
  • TABELLE 9
    Figure 00640001
  • Figure 00650001
  • Die Daten zeigen, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung das Vorhandensein der Nukleinsäuren mit Sequenzen, die den gag- und pol- Bereichen von HIV-1 entsprechen, gleichzeitig detektiert werden kann. Die aufgelistete Anzahl von Kopien der Matrizen-Nukleinsäuren ist eine Durchschnittszahl; die Zahl der Input-Kopien der Matrize sind offensichtlich ganzzahlig und kein Anteil. Tatsächlich weisen die Daten darauf hin, dass einige Proben keine Kopien der Matrize enthielten, wie man anhand der RLU-Werte unter 10.000 erkennen kann, die sowohl in Reaktionsansätzen, die 2,5 als auch denen die 1,25 Kopien der Matrize entsprechen, auftreten. Die Empfindlichkeit dieses Assays, das die Nukleinsäureamplifikation mit den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung kombiniert, liegt bei etwa 1 bis 2 Kopien für jede Ziel-Nukleinsäuresequenz.
  • Beispiel 9: Detektion der gag- und pol-Bereiche von HIV-DNA in einer Probe, die ein klinisches Probenstück enthält.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde verwendet, um sowohl die gag- als auch die pol-Bereiche des Humanen Immunodefizienz Virus (HIV) in einem menschlichen Blutlysat zu detektieren. Gesamtblut, das zuvor negativ auf HIV getestet wurde, wurde lysiert und die weißen Blutzellen wurden gesammelt, gewaschen und lysiert, wie es von Ryder, in PCT Veröffentlichungsnr. WO 93/25710, die gemeinsame Eigentümerschaft mit der vorliegenden Anmeldung genießt, beschrieben worden ist. Fünfzig Mikroliter des Leukozytenlysats wurden für jedes experimentelle Röhrchen verwendet. Eine Plasmid-DNA, die die gag- und pol-Bereiche von HIV enthält (siehe Beispiel 8 weiter oben) wurde zum Lysat hinzugegeben und die zugegebene Nukleinsäure wurde amplifiziert, hybridisiert und einer differenziellen Hydrolyse, wie im Beispiel 8 beschrieben, unterzogen. Die Ergebnisse werden weiter unten in Tabelle 10 dargestellt.
  • TABELLE 10
    Figure 00660001
  • Diese Daten zeigen, dass die gag- und pol-Ziele gleichzeitig detektiert werden können, wenn die Ziel-Nukleinsäure in Gegenwart eines Zelllysates aus mononukleären Zellen aus dem Blut amplifiziert wird. In einem solchen Detektionssystem ist das Mehrfachanalytassay in der Lage weniger als 2,5 Kopien von mehr als einer unterschiedlichen Ziel-Nukleinsäure, die eine vorgegebene Nukleinsäuresequenz trägt, zu detektieren.
  • Beispiel 10: Polymerasekettenreaktion (PCR)
  • Die PCR ist eine Nukleinsäureamplifikationstechnik, die vom Fachmann auf diesem Gebiet regelmäßig verwendet wird und gut bekannt ist (siehe z.B., American Society for Microbiology, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications 56–70 (1993)) und sie stellt eine patentierte Technologie dar, die in Besitz ist und lizensiert wird durch Hoffman-LaRoche, Inc., Nutley, NJ.
  • Ein allgemeines Verfahren zur PCR-Amplifikation von Nukleinsäuren wird von Sambrook et al., siehe oben auf den Seiten 14.18, gelehrt. In dem so bereitgestellten Verfahren werden die folgenden Bestandteile in einem sterilen 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für jede Reaktion gemischt: 30 μl steriles Wasser, 10 μl eines 10X Amplifikationspuffers (10X Amplifikationspuffer = 500 mM KCl, 100 mM TRIS-Cl (pH 8,3), 15 mM MgCl und 0,1 % (w/v) Gelantine), 1,25 mM von jedem dNTP, 100 pmol von jedem Primer, und bis zu 2 μg Matrizen-DNA und Wasser bis zu einem Endvolumen von 100 μl. Die Reaktionsmischung wird für 5 Minuten auf 94°C erhitzt. 5 μl einer 5 Einheiten/μl Zubereitung der Taq-DNA-Polymerase (Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, CT) werden zur Reaktionsmischung zugegeben. Die Reaktionsmischung wird dann mit 100 μl leichtem Mineralöl versetzt und die Reaktionsmischung für 5 Minuten bei 94°C inkubiert, um über Wasserstoffbrücken gebundene Nukleinsäuren zu denaturieren, dann wird sie für 2 Minuten bei 50°C inkubiert, um das Anbinden der Primer an die einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäuren zu ermöglichen, und dann 3 Minuten bei 72°C, um die Primerverlängerung zu ermöglichen. Die Reaktionsmischung wird dann sequenziell für eine Minute bei 94°C, 2 Minuten bei 50°C und 3 Minuten bei 72°C in dieser Reihenfolge über 20 Zyklen inkubiert. Die Probe wird für 10 Minuten bei 72°C im letzten Schritt des letzten Zyklus inkubiert, und dann bei –20°C für die Verwendung gelagert.
  • Beispiel 11: Detektion der gag- und pol-Bereiche der HIV-DNA nach der PCR-Amplifikation
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde verwendet, um das Vorhandensein sowohl der gag- als auch der pol-Bereiche der HIV-DNA gleichzeitig zu detektieren. In diesem Experiment wurde die virale DNA mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) vor der Detektion amplifiziert.
  • Die verwendeten Sonden waren die gleichen wie die, die im Beispiel 8 verwendet wurden. Die HIV-1-DNA wurde mittels PCR amplifiziert; die Primerpaare, die zum Amplifizieren des pol-Bereichs durch PCR verwendet wurden, wiesen Nukleotidsequenzen der SEQ ID NO: 2 und 4 auf, und die Primer, die zum Amplifizieren des gag-Bereichs verwendet wurden, wiesen Nukleotidsequenzen der SEQ ID NO: 7 und 10 auf.
  • Nach der Amplifikation wurde die Nukleinsäurehybridisierung durch Mischen von 20 μl der PCR-Reaktionsmischung mit 80 μl Wasser und anschließender Zugabe von 100 μl der Sondenmischung, wie in Beispiel 8 beschrieben, durchgeführt. Die Sonden- und Ziel-Nukleinsäuren wurden zusammen für 30 Minuten bei 60°C inkubiert. Die differenzielle Hydrolyse, die Messung der Chemilumineszenz und die Berechnung der Ergebnisse wurden, wie in Beispiel 8 beschrieben, durchgeführt. Die Assayergebnisse werden weiter unten in Tabelle 11 dargestellt.
  • TABELLE 11
    Figure 00690001
  • Diese Daten zeigen, dass das Mehrfachanalytassayverfahren der vorliegenden Erfindung das Vorhandensein verschiedener Nukleinsäuremoleküle, die Sequenzen aufweisen, die den gag- und pol- Bereichen von HIV-1 entsprechen, gleichzeitig detektieren kann, wenn die HIV-1-Sequenzen mittels der Polymerasekettenreaktion amplifiziert worden sind.
  • Beispiel 12: Gleichzeitiges Detektieren von mehr als zwei Analyten in einer einzelnen Testprobe
  • Als ein Beispiel für die Ausführbarkeit der Detektion von mehr als zwei Analyten in einer einzelnen Probe sind die folgenden Experimente durchgeführt worden.
  • Die folgenden AE-Derivate wurden individuell an getrennte Oligonukleotidsonden gekoppelt, wie weiter oben offenbart: diBr-AE; 2,7-diME-AE; o-MeO-(cinnamyl)-AE, o-Me-AE, und o-diMe-AE. Etwa 0,003 pmol jedes angegebenen gekoppelten Chemilumineszenzmarkers in einem Volumen von 1,5 μl pro Marker wurden zu einem Röhrchen gegeben, wie es weiter unten in Tabelle 12 angegeben wird, dann wurden 200 μl einer Lösung zugegeben, die 0,4 N HCl und 0,1 % H2O2 enthielt. Jedes Röhrchen wurde in einen LEADER® 50 Luminometer eingesetzt, eine automatische Injektion von 1 N NaOH wurde zugesetzt und das sich daraus ergebende emittierte Licht über einen Zeitraum von 10 Sekunden in Intervallen von 0,1 Sekunden gemessen.
  • TABELLE 12
    Figure 00700001
  • Diagramme, die die sich ergebenden Lichtemissionsprofile, die aus diesen Experimenten erhalten worden sind, darstellen, werden in 4 dargestellt. Die Einheiten der X-Achse werden in Intervallnummern angegeben und die Einheiten der Y-Achse werden in RLU angegeben; die Emissionsprofile werden in einem einzelnen Überlagerungsdiagramm dargestellt. Dieses Diagramm zeigt deutlich, dass sich der Zerfall jeder reagierenden Chemilumineszenzverbindung in den Proben von jeder anderen reagierenden chemilumineszierenden Verbindung hinreichend unterscheiden lässt und dass jede Verbindung von den anderen unterschieden werden kann. Zum Beispiel erreicht die Lichtemission im Röhrchen 1 (o-diBr-AE und 2,7-diME-AE) die Grundlinie etwa beim Intervall 50 (5,0 Sekunden). Demnach kann bei dem Licht, das in den Intervallen 46 – 100 emittiert worden ist, davon ausgegangen werden, dass es die Summe des durch die Röhrchen 2, 3 und 4 emittierten ist. (Röhrchen 1 enthielt sowohl o-diBr-AE als auch 2,7-diME-AE; der Fachmann wird erkennen, dass o-diBr-AE deutlich von den anderen AE-Derivaten, die in diesem Experiment verwendet wurden, unterschieden werden kann und von 2,7-diMe-AE insbesondere in einer Mischung, die alle diese Verbindungen enthielt, da seine Lichtemission die Grundlinie etwa beim Intervall 10 erreicht). Ebenso erreicht das Licht, das durch die chemilumineszierenden Verbindungen, die in Röhrchen 2 enthalten sind (o-diBr-AE, 2,7-diME-AE und o-MeO-(cinnamyl)-AE), die Grundlinie etwa beim Intervall 80 (8,0 Sekunden); bei dem Licht, das in den Intervallen 69 bis 100 emittiert worden ist, kann davon ausgegangen werden, dass es die Summe des Lichtes ist, das durch die chemilumineszierenden Verbindungen, die in den Röhrchen 3 und 4 enthalten sind, emittiert wird. Letztendlich erreicht das Licht, das durch die Verbindungen im Röhrchen 3 (o-diBr-AE, 2,7-diMe-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE und o-Me-AE) emittiert worden ist, die Grundlinien an einem Punkt nach dem Intervall 100. Auch wenn es in der Figur nicht dargestellt wird, werden zu diesem letztgenannten Zeitpunkt die Komponenten aus Röhrchen 4 immer noch messbares Licht emittieren.
  • Daher kann man durch Auswählen der Zeiträume, während derer das durch die Verbindungen in jedem Röhrchen emittierte Licht gemessen wird, zwischen dem Licht unterscheiden, das durch jede Verbindung mittels eines sich ständig wiederholenden Mittelungsverfahren, ähnlich dem in Beispiel 3 weiter oben verwendeten für die Unterscheidung zweier verschiedener chemilumineszierender Marker, emittiert wird. Unter Verwendung der Offenbarung des vorliegenden Beispiels als Richtlinie würde der Fachmann vernünftigerweise erwarten, dass o-diBr-AE, 2,7-diMe-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE, o-Me-AE und o-diMe-AE, die an Oligonukleotidsonden gekoppelt sind, unter diesen Reaktionsbedingungen unterschieden werden können. Darüber hinaus würde der Fachmann vernünftigerweise auch erwarten, dass diese Fähigkeit nicht beeinträchtigt würde, wenn die Sonden mit einer Ziel-Nukleinsäure hybridisiert sind.
  • Beispiel 13: Evaluieren von zusätzlichen chemilumineszierenden Reagenzien für die Verwendung in einem Mehrfachanalytassay
  • Die Evaluierung der folgenden sondengekoppelten, chemilumineszierenden Reagenzien wurde, wie im vorherigen Beispiel beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, dass das emittierte Licht für insgesamt 10 Sekunden in Zeitintervallen von 0,1 Sekunden gemessen wurde und dass jedes chemilumineszierende Reagenz eher getrennt evaluiert wurde als in einer Mischung wie in Beispiel 12. 5 zeigt ein Überlagerungsdiagramm der getrennt untersuchten Lichtemissionen von 1) einer Kombination aus o-diBr-AE und einer Mischung aus 1- und 3-Me-AE, 2) genauso wie 1) plus ortho-AE, 3) genauso wie 2) plus o-Me-AE, und 4) genauso wie 3) plus o-diMe-AE. Wie anhand des Diagramms zu sehen ist, reagiert die o-diBr-AE/1- und 3-Me-AE-Mischung schnell und emittiert Licht etwa nach dem Intervall 40, wobei zu diesem Zeitpunkt die anderen AE-Derivate immer noch Licht emittieren. Die ortho-AE emittieren wenig Licht nach etwa dem Intervall 80. Auch wenn diese Figur nicht die Grundlinienauflösung des o-Me-AE-Derivates zeigt, haben zusätzliche Experimente bestätigt, dass der Lichtemissionszerfall dieser Derivate gleich bleibend und schneller voranschreitet als die Reaktion des verbleibenden AE-Derivates o-diMe-AE. Die Extrapolation der Geraden für diese letztgenannten zwei Verbindungen zeigt, dass die kinetischen Profile dieser Derivate zu späteren Zeitintervallen als den in dieser Figur gezeigten, unterscheidbar wären.
  • Obwohl die gekoppelten o-diBr-AE und 1- und 3-Me-AE-Marker in diesem Experiment kombiniert wurden, ist bereits gezeigt worden, dass o-diBr-AE und eine Mischung aus 1- und 3-Me-AE auf der Basis ihrer charakteristischen Reaktionskinetiken (siehe z.B. Beispiel 3) unterschieden werden können.
  • Diese Daten zeigen, dass bei Verwendung des gleichen, sich ständig wiederholenden Mittelungsverfahrens, das in Beispiel 3 weiter oben zum Unterscheiden zweier chemilumineszierender Marker verwendet wurde, die Signale für jedes Verbindungsmitglied in diesem Satz von gekoppelten chemilumineszierenden Markern in einer einzelnen Probe unterschieden werden können, wenn eine Licht emittierende Reaktion, die alle Verbindungsmitglieder einschließt, gleichzeitig ausgelöst wird und das emittierte Licht über einen geeigneten Zeitraum detektiert wird.
  • Beispiel 14: Evaluierung von sieben chemilumineszierenden Markern für die gleichzeitige Verwendung in einem Mehrfachanalytassay
  • Die Reaktionskinetiken von sieben verschiedenen chemilumineszierenden Markern (o-diBr-AE, 2,7-diMe, eine Mischung aus 1- und 3-Me-AE, o-Linker-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE, o-Me-AE und o-diMe-AE) wurden durch getrenntes Messen des Lichts, das dem Auslösen der Chemilumineszenzreaktion folgt, evaluiert. Jeder chemilumineszierende Marker war mit einem anderen Oligonukleotid gekoppelt. Die experimentellen Bedingungen waren die gleichen wie im Beispiel 12, mit den hierin beschriebenen Ausnahmen. Das emittierte Licht wurde über eine Gesamtzeit von sieben Sekunden in 0,1 Sekundenintervallen gemessen, und detektiert und mittels eines Luminometers gemessen.
  • 6 zeigt die sich ergebenden Lichtemissionscharakteristika dieser Verbindungen als eine computererzeugte einzelne Darstellung, die die überlagerten einzelnen Diagramme für jede chemilumineszierende Verbindung umfasst. Wie diese Figur eindeutig zeigt, ist der Zerfall des emittierten Lichts durch jede reagierende Verbindung ausreichend verschieden und deutlich von der jeder anderen chemilumineszierenden Verbindung; jede kann getrennt detektiert werden und in einer einzelnen Testprobe gemessen werden, wenn die Reaktion gleichzeitig initiiert wird. Der Fachmann wird im Lichte der vorliegenden Offenbarung erkennen, dass, obwohl dieses Beispiel Daten darstellt, die getrennt für jedes Verbindungsmitglied gesammelt wurden, sich die Reaktionskinetiken und der Zerfall des emittierten Lichts nicht wesentlich unterscheiden würden, wenn diese Verbindungen in einer einzelnen Probe kombiniert würden. Demnach würde der Fachmann feststellen, dass das vorliegende Beispiel einen Satz von sieben chemilumineszierenden Reagenzien bereitstellt, die gleichzeitig in einem einzelnen Assay für die Detektion von sieben Nukleinsäureanalyten in Übereinstimmung mit den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
  • Beispiel 15: Evaluation von chemilumineszierenden Reagenzien für Mehrfachmodus und Mehrfachanalytassaysystem
  • Die folgenden chemilumineszierenden Reagenzien wurden für die Verwendung in einem vier Analyten-, zwei pHs-Assaysystem evaluiert: o-diBr-AE, o-F-AE, Standard-AE und o-MeO(cinnamyl)-AE. Wie im vorherigen Beispiel wurde jedes chemilumineszierende Reagenz mit einem anderen Oligonukleotid gekoppelt. Die experimentellen Bedingungen waren die gleichen wie im Beispiel 4, mit der Ausnahme, dass den Oligonukleotiden 74 μl 0,1 N HCl + 26 μl H2O vor der Zugabe von H2O2 zugegeben wurden. Jedes chemilumineszierende Reagenz wurde getrennt evaluiert.
  • 7 zeigt die Ergebnisse dieses Experiments in einem computergenerierten einzelnen Diagramm zusammengefasst, wobei die für jede Chemilumineszenzreaktion erhaltenen Daten zur besseren Darstellung überlagert wurden. Wie man sehen kann, nehmen o-diBr-AE und o-F-AE an einer Chemilumineszenzreaktion beim ersten pH teil. Darüber hinaus sind diese zwei Reagenzien eindeutig voneinander unterscheidbar, wobei das Licht, das durch o-diBr-AE emittiert wird, etwa beim Intervall 25 bis auf die Grundlinie zerfallen ist. Das Licht, das zwischen den Intervallen 25 und 75 emittiert wird, repräsentiert den Beitrag des o-F-AE-Reagenzes. Man kann auch sehen, dass Standard-AE und o-MeO(cinnamyl)-AE relativ resistent gegenüber Reaktionen bei diesem pH sind, wobei nur eine kleine Lichtmenge durch jede Verbindung zwischen den Intervall 0 und etwa 85 emittiert wird.
  • Der pH der Reaktionsmischungen wurde zu einem Zeitpunkt, der etwa dem Intervall 85 entspricht, auf 13 eingestellt. Wie man sehen kann, ermöglicht diese pH-Veränderung es dem bisher noch nicht reagierten Standard-AE und o-MeO(cinnamyl)-AE Licht zu einem Zeitpunkt zu emittieren, zu dem nahezu alle der o-diBr- und o-F-AE-Derivate beim vorherigen pH reagiert hatten. Die zwei Reagenzien, die beim neuen pH-Wert reagieren, können auf Grundlage der Zeit, die für jede Verbindung bis zur vollständigen Reaktion erforderlich ist, eindeutig unterschieden werden; Standard-AE hat beim Intervall 120 fast vollständig reagiert, während o-MeO(cinnamyl)-AE zwischen den Intervallen 120 und etwa 175 immer noch Licht emittiert.
  • Dieses Beispiel zeigt die Vielseitigkeit der Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung. Wie hierin dargestellt, kann mehr als ein Modus der vorliegenden Erfindung kombiniert werden, um die Detektion von zwei oder mehr Nukleinsäureanalyten zu ermöglichen. Dem Fachmann auf dem Gebiet wird deutlich werden, dass, obwohl die hierin dargestellten Daten von Verbindungen gesammelt wurden, die in separaten Reaktionsmischungen evaluiert wurden, man von diesen Verbindungen vernünftigerweise erwarten kann, dass sie im Wesentlichen ähnliche Reaktionscharakteristika aufweisen, wenn sie in einer einzelnen Reaktionsmischung miteinander kombiniert werden; siehe z.B., Beispiel 16. Solch eine Person würde auch verstehen, dass die Reaktionscharakteristika dieser Verbindungen nicht grundlegend verändert würden, wenn das Oligonukleotid, an das sie gekoppelt sind, mit einem komplementären Nukleinsäurestrang hybdridisiert ist.
  • Beispiel 16: Korrelation zwischen vorher gesagtem und tatsächlichen Reaktionscharakteristika von kombinierten chemilumineszierenden Reagenzien
  • Um zu demonstrieren, dass die Reaktionscharakteristika der bevorzugten Acridiniumesterderivate, die in den vorherigen Beispielen exemplarisch dargestellt worden sind, durch eine computergenerierte überlagerte Darstellung, die von individuell untersuchten chemilumineszierenden Reagenzien erhalten wurde, vorhergesagt worden sind, wurden die folgenden Experimente durchgeführt. Individuelle Reaktionsmischungen wurden gemäß dem Protokoll des Beispiels 15 hergestellt. Jedes Röhrchen enthielt einen der folgenden Acridiniumester: o-diBr-AE, Standard-AE, und o-MeO(cinnamyl)-AE. Zusätzlich wurden individuelle Röhrchen hergestellt, die die gleichen Mengen jeder Verbindung kombiniert in einem einzelnen Röhrchen, wie folgt, verwendeten: o-diBr und o-F-AE, Standard-AE und o-MeO-AE, und o-diBr-AE, o-F-AE, Standard-AE, und o-MeO-AE. Alle chemilumineszierenden Reagenzien wurden mit separaten Oligonukleotiden gekoppelt, wie in den vorherigen Beispielen. Die Reaktion wurde wie in Beispiel 15 ausgelöst und gemessen. Die Ergebnisse werden in der 8(A–I) dargestellt.
  • 8A zeigt ein computergeneriertes überlagertes Diagramm des Lichts, das durch o-diBr-AE und o-F-AE, das separat untersucht worden ist, emittiert wurde. 8B zeigt ein computergeneriertes Diagramm des kombinierten Lichts, das durch beide Reagenzien emittiert wurde; dieses Diagramm ist die Summe der individuellen Diagramme aus 8A und repräsentiert eine Vorhersage der Reaktionscharakteristika einer einzelnen Reaktionsmischung, die beide Reagenzien enthält. 8C zeigt die tatsächlichen Reaktionscharakteristika einer Mischung dieser zwei Verbindungen ein einem einzelnen Röhrchen. Diese Daten zeigen eindeutig, dass nicht nur der Zerfall der Lichtemission der gleiche ist wie für 8B (vorhergesagte Kurve) und 8C (tatsächliche Kurve), sondern das auch die kinetischen kurven im Wesentlichen identisch sind.
  • 8D zeigt vergleichsweise ein computergeneriertes überlagertes Diagramm des Lichts, das durch Standard-AE und o-MeO(cinnamyl)-AE, das separat untersucht worden ist, emittiert wurde. 8E stellt die computergenerierte Summierung dieser überlagerten Diagramme dar und 8F zeigt das tatsächliche Licht, das durch eine Mischung dieser zwei Verbindungen nach dem Initiieren einer Chemilumineszenzreaktion emittiert wurde. Ein Vergleich zwischen den Figuren E und F zeigt, dass die Reaktionscharakteristika einer Mischung aus Standard-AE und o-MeO(cinnamyl)-AE durch Hinzufügen der Kurven, die von den zwei individuell untersuchten AE-Derivaten erhalten wurden, korrekt vorher gesagt wurden.
  • Letztlich zeigt 8G überlagerte Diagramme des Lichts, das von allen vier dieser individuell untersuchten Acridiniumesterderivate emittiert wurde. 8H ist eine computergenerierte Summierung dieser Darstellungen aus 8G, und 8I zeigt die Lichtemissionscharakteristika einer Mischung von allen vier dieser Verbindungen über die Zeit. Daher zeigt 8H die vorhergesagten Lichtemissionscharakteristika der vier Verbindungen, und 8I die tatsächlichen Ergebnisse. Wiederum zeigt sich eine nahezu exakte Korrelation zwischen dem "vorhergesagten" Diagramm der 8H und dem "tatsächlichen" Diagramm der 8I.
  • Dieses Experiment verdeutlicht, dass die charakteristischen Reaktionskinetiken jedes AE-Markers nicht signifikant unterschiedlich sind, wenn sie mit anderen AE-Markern in einer einzelnen Reaktionsmischung gemischt werden. Demnach sind die AE-Marker, die für die Verwendung in den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung offenbart werden, nachweislich in einem Mehrfachanalytassaysystem geeignet.
  • Beispiel 17: Modus Drei: Mehrere Wellenlängen, gleichzeitiges Auslösen
  • In einer zusätzlichen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können mehrere Analyten gleichzeitig in einer einzelnen Probe durch Verwendung verschiedener Oligonukleotidsonden, die mit einem anderen Chemilumineszenzmarker markiert sind, der Licht bei einer anderen Wellenlänge als jeder andere Marker emittiert, detektiert werden.
  • Als Beispiel für diesen Modus der Erfindung könnte das Assay im Wesentlichen wie in Beispiel 6 mit den folgenden Modifikationen durchgeführt werden. Nach der Hybridisierung wird jedem Röhrchen 1 ml einer Lösung aus 60 mM Natriumtetraborat (pH 8,9), 6,89 % (v/v) TRITON® X-102 und 0,1 % (w/v) Gelatine, die 50 μl einer 1,25 % (w/v) Suspension von BIOMAGTM 4100 magnetischen Partikeln in 0,02 % (w/v) Natriumazid und 1 mM EDTA enthält, zugegeben. Die Inkubations- und Waschschritte entsprechen denen im Beispiel 6.
  • Ein Luminometer ist mit 4 Fotovervielfacherröhrchen (PMT's) ausgestattet, einer überwacht das emittierte Licht bei der Wellenlänge im Bereich von 300 nm bis 700 nm, einer hat einen 375 bis 415 nm Sperrfilter, einer hat einen 400 nm bis 435 nm Sperrfilter und einer hat einen 500 nm bis 575 nm Sperrfilter. Die Standards für jeden Marker werden in den Luminometer eingebracht, zur Lichtemission angeregt und das emittierte Licht durch jeden PMT überwacht. Die Verhältnisse der Chemilumineszenz in jedem Wellenlängenfenster werden für jeden Marker, wie im Berechnungsverfahren aus Beispiel 3 illustriert, bestimmt. 9A und 9B zeigen das Chemilumineszenzspektrum von 2,7-di-Me-AE und Standard-AE; die schattierten Abschnitte dieses Spektrums repräsentieren die Wellenlängenfenster, auf die oben Bezug genommen wird. 9C ist eine computergenerierte Überlagerung des Spektrums von 9A und 9B. Wie man sehen kann, unterscheidet sich die Maximalwellenlängenemission für jeden Marker und jeder Marker kann in einer Mischung der zwei voneinander unterschieden werden. 9D ist eine computergenerierte Summierung der zwei individuellen Wellenlängenemissionsprofile.
  • Nach Bestimmen der Standardverhältnisse der Wellenlängenemission für die zu verwendenden spezifischen chemilumineszierenden Marker wird jede experimentelle Probe in den Luminometer eingebracht, eine Licht emittierende Reaktion wird ausgelöst und das sich daraus ergebende emittierte Licht wird auf exakt die gleiche Weise wie für die Standards überwacht. Die Ergebnisse können dann mittels des sich ständig wiederholenden (reiterativen) Berechnungsverfahrens bestimmt werden.
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00800001
  • Figure 00810001
  • Figure 00820001

Claims (48)

  1. Eine Zusammensetzung für die Untersuchung einer Vielzahl von Nukleinsäureanalyten in einer einzelnen Probe umfassend: (a) eine Vielzahl von verschiedenen Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden, wobei jede der Sonden eine Nukleotidsequenz besitzt, die zu einer spezifischen unterschiedlichen Ziel-Nukleotidsequenz von einem oder mehreren Nukleinsäureanalyt(en), von dem/denen vermutet wird, dass er/sie in der Testprobe vorhanden ist/sind, komplementär ist, (b) eine Vielzahl von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, wobei jeder der Marker über einen Linker an eine oder mehrere der Hybridisierungssonden gekoppelt ist, so dass zwei oder mehr Nukleinsäureanalyten jeweils von Hybridisierungsassaysonden, die an verschiedene Chemilumineszenzmarker gekoppelt sind, angesteuert werden, wobei jede der Hybridisierungssonden unter Bedingungen, die die Hybridisierung der Sonden an nicht angesteuerte Nukleinsäuren nicht begünstigen, spezifisch mit einem oder mehreren Analyt(e), wenn er/sie in der Probe vorhanden ist/sind, hybridisiert, wobei die Chemilumineszenzmarker, wenn sie an eine Hybridisierungssonde gekoppelt sind, die mit einer Ziel-Nukleinsäure hybridisiert ist, gleichermaßen vor dem Verlust an Chemilumineszenzpotential geschützt sind, wobei die Verlustraten an Chemilumineszenzpotential von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, die an Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden gekoppelt sind, abhängig davon, ob die Probe mit einer Ziel-Nukleinsäure oder – Nukleotidsequenzbereich hybridisiert ist, verringert werden und wobei unter denselben Bedingungen die Verlustraten innerhalb eines Faktors von bis zu 250 zueinander liegen; und wobei die Chemilumineszenzmarker, wenn sie an eine nicht hybridisierte Sonde gekoppelt sind, gleichermaßen gegenüber einem Verlust ihres Chemilumineszenzpotentials empfänglich sind, wobei unter identischen Bedingungen die Verlustraten an Chemilumineszenzpotential von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, die an Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden gekoppelt sind, durch die Aussetzung gegenüber einem destabilisierenden Mittel innerhalb eines Faktors von ungefähr 50 zueinander liegen; und wobei nach dem Auslösen einer lichtemittierenden Reaktion und dem selektiven Nachweis markierter hybridisierter Sonden, jeder der Chemilumineszenzmarker Licht einer oder mehrerer Wellenlängen emittiert, die ausreichend unterschiedlich von einer Wellenlänge einer Lichtemission von jedem anderen Chemilumineszenzmarker ist, so dass die Chemilumineszenzmarker unabhängig voneinander nachweisbar sind, wenn das emittierte Licht bei den Wellenlängen als Hinweis auf das Vorhandensein von jedem der Nukleinsäureanalyten in der Testprobe gleichzeitig nachgewiesen wird.
  2. Eine Zusammensetzung für die Untersuchung einer Vielzahl von Nukleinsäureanalyten in einer einzelnen Probe umfassend: (a) eine Vielzahl von verschiedenen Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden, wobei jede Sonden eine Nukleotidsequenz besitzt, die zu einer spezifischen unterschiedlichen Ziel-Nukleotidsequenz von einem oder mehreren Nukleinsäureanalyt(en), von dem/denen vermutet wird, dass er/sie in der Testprobe vorhanden ist/sind, komplementär ist, (b) eine Vielzahl von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, wobei jeder der Marker über einen Linker an eine oder mehrere Hybridisierungssonden gekoppelt ist, so dass zwei oder mehr Nukleinsäureanalyten jeweils von Hybridisierungsassaysonden, die an verschiedene Chemilumineszenzmarker gekoppelt sind, angesteuert werden, wobei jede Hybridisierungssonde unter Bedingungen, die die Hybridisierung der Sonden an nicht angesteuerte Nukleinsäuren nicht begünstigen, spezifisch an einen oder mehrere Analyte(n), wenn er/sie in der Probe vorhanden ist/sind, hybridisiert, wobei die Chemilumineszenzmarker gleichermaßen vor dem Verlust ihres Chemilumineszenzpotentials geschützt sind, wenn sie an eine Hybridisierungssonde gekoppelt sind, die mit einer Ziel-Nukleinsäure hybridisiert ist und die Chemilumineszenzmarker gleichermaßen gegenüber einem Verlust ihres Chemilumineszenzpotentials empfänglich sind, wenn sie mit einer nicht hybridisierten Sonde gekoppelt sind und wobei bei der Auslösung einer auslösbaren lichtemittierenden Reaktion bei einem ersten pH-Wert mindestens einer der gekoppelten Chemilumineszenzmarker an der Reaktion bei dem pH-Wert teilnehmen wird und mindestens ein anderer der gekoppelten Chemilumineszenzmarker in einer lichtemittierenden Reaktion reagieren wird, wenn der pH der Reaktionsmischung auf einen oder mehrere andere(n) pH-Wert (e) verändert wird; wobei die Zusammensetzung dadurch die getrennte Identifizierung von zwei oder mehr Chemilumineszenzmarkern in einer einzelnen Testprobe als Hinweis auf das Vorhandensein der Nukleinsäureanalyten in der Testprobe erlaubt.
  3. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei die gekoppelten Chemilumineszenzmarker, die in der nachweisbaren lichtemittierenden Reaktion beim ersten pH-Wert reagieren, pH-Reaktionsoptima besitzen, die sich um mindestens ungefähr 0,5 pH-Einheiten von dem von anderen gekoppelten Chemilumineszenzmarkern, die bei einem oder mehreren anderen pH-Wert(en) reagieren, unterscheiden.
  4. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei die gekoppelten Chemilumineszenzmarker, die in der nachweisbaren lichtemittierenden Reaktion beim ersten pH-Wert reagieren, pH-Reaktionsoptima besitzen, die sich um mindestens ungefähr 0,7 pH-Einheiten von dem anderer gekoppelter Chemilumineszenzmarker, die bei dem einem oder mehreren anderen pH-Wert(en) reagieren, unterscheiden.
  5. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei die gekoppelten Chemilumineszenzmarker, die in der nachweisbaren lichtemittierenden Reaktion beim ersten pH-Wert reagieren, pH-Reaktionsoptima besitzen, die sich um mindestens ungefähr 1,0 pH-Einheiten von dem anderer gekoppelter Chemilumineszenzmarker, die bei dem einem oder mehreren anderen pH-Wert(en) reagieren, unterscheiden.
  6. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei die gekoppelten Chemilumineszenzmarker, die in der nachweisbaren lichtemittierenden Reaktion beim ersten pH-Wert reagieren, pH-Reaktionsoptima besitzen, die sich um mindestens ungefähr 1,5 pH-Einheiten von dem anderer gekoppelter Chemilumineszenzmarker, die bei dem einem oder mehreren anderen pH-Wert(en) reagieren, unterscheiden.
  7. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei die gekoppelten Chemilumineszenzmarker, die in der nachweisbaren lichtemittierenden Reaktion beim ersten pH-Wert reagieren, pH-Reaktionsoptima besitzen, die sich um mindestens ungefähr 2,0 pH-Einheiten von dem anderer gekoppelter Chemilumineszenzmarker, die bei dem einem oder mehreren anderen pH-Wert(en) reagieren, unterscheiden.
  8. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, in der mindestens zwei der Chemilumineszenzmarker Acridiniumester sind.
  9. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, in der einer der Acridiniumester ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend Standard-AE, Naphthyl-AE, o-diBr-AE, 1- oder 3-Me-AE, 4,5-diMe-AE, 2,7-diMe-AE, o-Me-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE, o-MeO-AE, o-diMe-AE, m-diMe-AE, ortho-AE, o-F-AE, 1- und 3-Me-o-F-AE und 1- oder 3-Me-m-diF-AE, dargestellt durch die folgenden Formeln:
    Figure 00870001
    Figure 00880001
  10. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 9, wobei ein erster Acridiniumester ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus o-diBr-AE und o-F-AE und ein zweiter Acridiniumester ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Standard-AE und o-MeO-AE.
  11. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei mindestens einer der gekoppelten Chemilumineszenzmarker, die in der lichtemittierenden Reaktion bei einem ersten pH-Wert reagieren, o-F-AE umfasst und mindestens einer der anderen gekoppelten Chemilumineszenzmarker, die bei einem oder mehreren anderen pH-Werten reagieren, ein Chemilumineszenzreagenz umfasst, das aus der Gruppe bestehend aus 1-Me-AE, 3-Me-AE, einer Mischung von 1- und 3-ME-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE und Standard-AE ausgewählt wird.
  12. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei mindestens einer der gekoppelten Chemilumineszenzmarker, die in der lichtemittierenden Reaktion bei einem ersten pH-Wert reagieren, eine Mischung aus 1- und 3-Me-m-diF-AE umfasst und mindestens einer der anderen gekoppelten Chemilumineszenzmarker, die bei dem einem oder mehreren anderen pH-Werten reagieren, ein Chemilumineszenzreagenz umfasst, das aus der Gruppe bestehend aus 1-Me-AE, 3-Me-AE, einer Mischung von 1- und 3-Me-AE und o-Meo(cinnamyl)-AE ausgewählt wird.
  13. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei mindestens einer der gekoppelten Chemilumineszenzmarker, die in der lichtemittierenden Reaktion bei einem ersten pH-Wert reagieren, 2,7-diMe-AE umfasst und mindestens einer der anderen gekoppelten Chemilumineszenzmarker, die bei dem einem oder mehreren anderen pH-Werten reagieren, o-Me-AE umfasst.
  14. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei mindestens einer der gekoppelten Chemilumineszenzmarker, die in der lichtemittierenden Reaktion bei einem ersten pH-Wert reagieren, Naphthyl-AE umfasst und mindestens einer der anderen gekoppelten Chemilumineszenzmarker, die bei dem einem oder mehreren anderen pH-Werten reagieren, Standard-AE umfasst.
  15. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei mindestens einer der gekoppelten Chemilumineszenzmarker, die in der lichtemittierenden Reaktion bei dem ersten pH-Wert reagieren, o-diBr-AE umfasst und mindestens einer der anderen gekoppelten Chemilumineszenzmarker, die bei dem einem oder mehreren unterschiedlichen pH-Werten reagieren, ein Chemilumineszenzreagenz umfasst, das aus der Gruppe bestehend aus 1-Me-AE, 3-Me-AE, einer Mischung von 1- und 3-ME-AE und o-MeO(cinnamyl)-AE ausgewählt wird.
  16. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei mindestens einer der gekoppelten Chemilumineszenzmarker, die in der lichtemittierenden Reaktion bei dem ersten pH-Wert reagieren, ein erstes Chemilumineszenzreagenz umfasst, das aus der Gruppe bestehend aus o-F-AE, 1-Me-m-diF-AE, 3-Me-m-diF-AE, einer Mischung aus 1-Me-m-diF-AE und 3-Me-m-diF-AE, 2,7-diMe-AE, Naphthyl-AE und o-diBr-AE ausgewählt wird und mindestens einer der anderen gekoppelten Chemilumineszenzmarker, die bei dem einen oder mehreren unterschiedlichen pH-Werten reagieren, ein zweites Chemilumineszenzreagenz umfasst, das aus der Gruppe bestehend aus 1-Me-AE, 3-Me-AE, einer Mischung aus 1- und 3-Me-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE, Standard-AE und o-Me-AE ausgewählt wird.
  17. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 16, umfassend mindestens drei unterschiedliche gekoppelte Chemilumineszenzmarker.
  18. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, die mindestens drei Chemilumineszenzmarker umfasst, wobei mindestens einer der gekoppelten Chemilumineszenzmarker, die in der lichtemittierenden Reaktion bei einem ersten pH-Wert reagieren, ein erstes Chemilumineszenzreagenz umfasst, das aus der Gruppe bestehend aus o-F-AE, 1-Me-m-diF-AE, 3-Me-m-diF-AE, einer Mischung aus 1-Me-m-diF-AE und 3-Me-m-diF-AE, 2,7-diMe-AE, Naphthyl-AE und o-diBr-AE ausgewählt wird und mindestens einer der anderen gekoppelten Chemilumineszenzmarker, die bei dem einen oder mehreren unterschiedlichen pH-Werten reagieren, ein zweites Chemiumineszenzreagenz umfasst, das aus der Gruppe bestehend aus 1-Me-AE, 3-Me-AE, einer Mischung aus 1- und 3-Me-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE, Standard-AE und o-Me-AE ausgewählt wird.
  19. Eine Zusammensetzung für die Untersuchung einer Vielzahl von Nukleinsäureanalyten in einer einzelnen Probe umfassend: (a) eine Vielzahl von verschiedenen Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden, wobei jede der Sonden eine Nukleotidsequenz besitzt, die zu einer spezifischen unterschiedlichen Ziel-Nukleotidsequenz von einem oder mehreren Nukleinsäureanalyt(en), von dem/denen vermutet wird, dass er/sie in der Testprobe vorhanden ist/sind, komplementär ist, (b) eine Vielzahl von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, wobei jeder der Marker über einen Linker an eine oder mehrere der Hybridisierungssonden gekoppelt ist, so dass zwei oder mehr Nukleinsäureanalyten jeweils von Hybridisierungsassaysonden, die an verschiedene der Chemilumineszenzmarker gekoppelt sind, angesteuert werden, wobei jede der Hybridisierungssonden unter Bedingungen, die die Hybridisierung der Sonden mit nicht angesteuerten Nukleinsäuren nicht begünstigen, spezifisch mit einem oder mehreren Nukleinsäureanalyt(en), wenn er/sie in besagter Probe vorhanden ist/sind, hybridisiert, wobei der Chemilumineszenzmarker, wenn sie an eine Hybridisierungssonde gekoppelt sind, die an eine Ziel-Nukleinsäure hybridisiert ist, gleichermaßen vor dem Verlust an Chemilumineszenzpotential geschützt sind, wobei die Verlustraten an Chemilumineszenzpotential von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, die an Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden gekoppelt sind, abhängig davon, ob die Probe mit einer Ziel-Nukleinsäure oder – Nukleotidsequenzregion hybridisiert ist, verringert werden und wobei unter denselben Bedingungen die Verlustraten innerhalb eines Faktors von bis zu 250 zueinander liegen; und wobei die Chemilumineszenzmarker, wenn sie an eine nicht hybridisierte Sonde gekoppelt sind, gleichermaßen gegenüber einem Verlust ihres Chemilumineszenzpotentials empfänglich sind, wobei unter identischen Bedingungen die Verlustraten an Chemilumineszenzpotential von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, die an Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden gekoppelt sind, durch die Aussetzung gegenüber einem destabilisierenden Mittel innerhalb eines Faktors von ungefähr 50 zueinander liegen; und wobei bei der Auslösung einer lichtemittierenden Reaktion die Werte der Zeit bis zum Scheitelpunkt des Signals und/oder der Dauer der Reaktion von mindestens einem reagierenden Chemilumineszenzmarker ausreichend unterschiedlich von denen von mindestens einem anderen reagierenden Chemilumineszenzmarker sind, um, wenn die Lichtemission über vorher festgelegte Zeitintervalle nach dem Auslösungsereignis als Nachweis für jeden der Analyten nachgewiesen oder gemessen wird, den getrennten Nachweis der reagierenden Chemilumineszenzmarker in derselben Testprobe zu erlauben.
  20. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 19, in der mindestens einer der Chemilumineszenzmarker ein Acridiniumester ist.
  21. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 19, in der mindestens zwei der Chemilumineszenzmarker Acridiniumester sind.
  22. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 19, in der alle Chemilumineszenzmarker Acridiniumester sind.
  23. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 20 oder Anspruch 21, in der mindestens ein Acridiniumester ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Standard-AE, Naphthyl-AE, o-diBr-AE, 1- oder 3-Me-AE, 4,5-diMe-AE, 2,7-diMe-AE, o-Me-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE, o-MeO-AE, o-diMe-AE, m-diMe-AE, ortho-AE, o-F-AE, 1 oder 3-Me-o-F-AE und 1- oder 3-Me-m-diF-AE.
  24. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 20 oder Anspruch 21, in der ein erster Acridiniumester Standard-AE ist und ein zweiter Acridiniumester ausgewählt wird aus der Gruppe: Naphthyl-AE, o-diBr-AE, o-diMe-AE, o-Me-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE, o-MeO-AE, o-AE, o-F-AE, 1-Me-o-F-AE und 1-Me-m-diF-AE.
  25. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 20 oder Anspruch 21, in der ein erster Acridiniumester Naphthyl-AE ist und ein zweiter Acridiniumester ausgewählt wird aus der Gruppe: 1-Me-AE, 4,5-diMe-AE, 2,7-diMe-AE, o-Me-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE und o-AE.
  26. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 20 oder Anspruch 21, in der ein erster Acridiniumester o-diBr-AE ist und ein zweiter Acridiniumester ausgewählt wird aus der Gruppe: 1-Meoder 3-Me-AE, 3-Me-AE, 4,5-diMe-AE, 2,7-diMe-AE, o-diMe-AE, o-Me-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE und o-AE.
  27. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 20 oder Anspruch 21, in der ein erster Acridiniumester 1-Me- oder 3-Me-AE ist und ein zweiter Acridiniumester ausgewählt wird aus der Gruppe: o-diMe-AE, o-Me-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE, o-MeO-AE, o-F-AE, 1-Me-o-F-AE und 1-Me-m-diF-AE.
  28. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 20 oder Anspruch 21, in der ein erster Acridiniumester 4,5-diMe-AE ist und ein zweiter Acridiniumester ausgewählt wird aus der Gruppe: o-diMe-AE, o-Me-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE, o-MeO-AE, o-AE, o-F-AE, 1-Me-o-F-AE und 1-Me-m-diF-AE.
  29. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 20 oder Anspruch 21, in der ein erster Acridiniumester 2,7-diMe-AE ist und ein zweiter Acridiniumester ausgewählt wird aus der Gruppe: o-diMe-AE, oMe-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE, o-MeO-AE, o-AE, o-F-AE, 1-Me-o-F-AE und 1-Me-m-diF-AE.
  30. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 20 oder Anspruch 21, in der ein erster Acridiniumester o-diMe-AE ist und ein zweiter Acridiniumester ausgewählt wird aus der Gruppe: o-Me-AE, o-MeO(cinnamyl)-AE, o-MeO-AE, o-AE, o-F-AE, 1-Me-o-F-AE und 1-Me-m-diF-AE.
  31. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 20 oder Anspruch 21, in der ein erster Acridiniumester o-Me-AE ist und ein zweiter Acridiniumester ausgewählt wird aus der Gruppe: o-MeO(cinnamyl)-AE, o-MeO-AE, o-AE, o-F-AE, 1-Me-o-F-AE und 1-Me-m-diF-AE.
  32. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 20 oder Anspruch 21, in der ein erster Acridiniumester o-MeO(cinnamyl)-AE ist und ein zweiter Acridiniumester ausgewählt wird aus der Gruppe: o-MeO-AE, o-F-AE, 1-Me-o-F-AE und 1-Me-m-diF-AE.
  33. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 20 oder Anspruch 21, in der ein erster Acridiniumester o-MeO-AE und ein zweiter Acridiniumester o-AE ist.
  34. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 20 oder Anspruch 21, in der ein erster Acridiniumester o-AE ist und ein zweiter Acridiniumester ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus o-F-AE, 1-Me-o-F-AE und 1-Me-m-diF-AE.
  35. Eine Zusammensetzung für die Untersuchung einer Vielzahl von Nukleinsäureanalyten in einer einzelnen Testprobe umfassend mindestens zwei Chemilumineszenzmarker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) o-diBr-AE, (b) 2,7-diMe-AE, (c) einer Mischung aus 1- und 3-Me-AE, (d) o-AE, (e) o-MeO(cinnamyl)-AE, (f) o-Me-AE und (g) o-diMe-AE, wobei jeder Chemilumineszenzmarker an mindestens eine unterschiedliche Hybridisierungsassaysonde gekoppelt ist, wobei jede Sonden eine Nukleotidsequenz besitzt, die zu einem Ziel-Bereich, der in einem oder mehreren Nukleinsäureanalyten enthalten ist, ausreichend komplementär ist, um unter Hybridisierungsbedingungen, die die Hybridisierung zwischen der Sonde und Nicht-Ziel-Bereichen nicht begünstigen, daran zu binden, und wobei nach der Auslösung einer auslösbaren lichtemittierenden Reaktion, die Reaktionskinetiken, die Wellenlänge der Lichtemission und/oder die optimalen pH-Eigenschaften von jedem Chemilumineszenzmarker von denen von anderen Markern ausreichend unterschiedlich ist, so dass jeder Marker einzeln als Hinweis auf das Vorhandensein von jedem Nukleinsäureanalyten in der Probe nachweisbar ist.
  36. Ein Verfahren für die Untersuchung einer Vielzahl von Nukleinsäureanalyten in einer einzelnen Probe umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen in einem Medium (i) einer Vielzahl von verschiedenen Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden, wobei jede der Sonden eine Nukleotidsequenz besitzt, die zu einer Ziel-Nukleotidsequenz eines Nukleinsäureanalyten, für den vermutet wird, dass er sich in der Probe befindet, komplementär ist, (ii) einer Vielzahl von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, wobei jeder der Marker an eine oder mehrere der Hybridisierungssonden gekoppelt ist, so dass zwei oder mehr Nukleinsäureanalyte jeweils von mindestens einer Hybridisierungsassaysonde, die an einen unterschiedlichen Chemilumineszenzmarker gekoppelt ist, angesteuert werden und (iii) die Probe und (b) Herstellen von Hybridisierungsbedingungen, unter denen die verschiedenen Hybridisierungsassaysonden vorzugsweise mit den Nukleinsäureanalyten hybridisieren, um markierte Doppelstrangnukleinsäurehybride zu bilden, wobei die Bedingungen die Bildung von Doppelstrangnukleinsäure-hybriden zwischen den markierten Sonden und nicht angesteuerten Nukleinsäuren nicht begünstigen, (c) selektives Zerstören oder Hemmen des Chemilumineszenzpotentials der Chemilumineszenzmarker, die an nicht hybridisierte Sonden gekoppelt sind, wobei die Chemilumineszenzmarker gleichermaßen vor dem Verlust an Chemilumineszenzpotential geschützt sind, wenn sie an eine Hybridisierungssonde gekoppelt sind, die an eine Ziel-Nukleinsäure hybridisiert ist, wobei die Verlustraten an Chemilumineszenzpotential von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, die an Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden gekoppelt sind, abhängig davon, ob die Sonde mit einer angesteuerten Nukleinsäure oder einem Nukleotidsequenzbereich hybridisiert ist, abnehmen und wobei die Verlustraten unter denselben Bedingungen innerhalb eines Faktors von bis zu 250 zueinander liegen; und wobei die Chemilumineszenzmarker gleichermaßen gegenüber einem Verlust ihres Chemilumineszenzpotentials empfänglich sind, wenn sie an eine nicht hybridisierte Sonde gekoppelt sind, wobei unter identischen Bedingungen die Verlustraten an Chemilumineszenzpotential von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, die an Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden gekoppelt sind, durch die Aussetzung gegenüber einem destabilisierenden Mittel innerhalb eines Faktors von ungefähr 50 zueinander liegen; (d) Veranlassen der Chemilumineszenzmarker, die mit doppelsträngigen Nukleinsäurehybriden assoziiert sind, Licht zu emittieren und (e) Nachweis von jedem Nukleinsäureanalyten, wenn vorhanden, durch das Messen des Lichtes, das von dem gekoppelten Chemilumineszenzmarker, der damit hybridisiert ist, emittiert wird bei einer Lichtemissionswellenlänge, die von der Wellenlänge einer Lichtemission von jedem anderen Chemilumineszenzmarker ausreichend unterschiedlich ist, um so zu ermöglichen, besagte Analyten unabhängig voneinander in einer einzelnen Testprobe nachzuweisen.
  37. Ein Verfahren für die Untersuchung einer Vielzahl von Nukleinsäureanalyten in einer Einzelprobe umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen in einem Medium (i) einer Vielzahl von verschiedenen Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden, wobei jede Sonde eine Nukleotidsequenz besitzt, die zu einer Ziel-Nukleotidsequenz eines Nukleinsäureanalyten, von dem vermutet wird, dass er sich in der Probe befindet, komplementär ist, (ii) einer Vielzahl von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, wobei jeder der Marker an eine oder mehrere der Hybridisierungssonden gekoppelt ist, so dass zwei oder mehr Nukleinsäureanalyten jeweils von mindestens einer Hybridisierungsassaysonde, die an einen unterschiedlichen Chemilumineszenzmarker gekoppelt ist, angesteuert werden, und (iii) besagter Probe und (b) Herstellen von Hybridisierungsbedingungen, unter denen die verschiedenen Hybridisierungsassaysonden vorzugsweise mit den Nukleinsäureanalyten, wenn vorhanden, hybridisieren, um markierte Doppelstrangnukleinsäurehybride zu bilden, wobei die Bedingungen die Bildung von Doppelstrangnukleinsäurehybriden zwischen den markierten Sonden und nicht angesteuerten Nukleinsäuren nicht begünstigen, (c) selektives Zerstören oder Hemmen des Chemilumineszenzpotentials der Chemilumineszenzmarker, die an nicht hybridisierte Sonden gekoppelt sind, wobei die Chemilumineszenzmarker gleichermaßen vor dem Verlust an Chemilumineszenzpotential geschützt sind, wenn sie an eine Hybridisierungssonde gekoppelt sind, die an eine Ziel-Nukleinsäure hybridisiert ist, wobei die Verlustraten an Chemilumineszenzpotential von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, die an Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden gekoppelt sind, abhängig davon, ob die Sonde mit einer angesteuerten Nukleinsäure oder einem Nukleotidsequenzbereich hybridisiert ist, abnehmen und wobei die Verlustraten unter denselben Bedingungen innerhalb eines Faktors von bis zu 250 zueinander liegen; und wobei die Chemilumineszenzmarker gleichermaßen gegenüber einem Verlust ihres Chemilumineszenzpotentials empfänglich sind, wenn sie an eine nicht hybridisierte Sonde gekoppelt sind, wobei unter identischen Bedingungen die Verlustraten an Chemilumineszenzpotential von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, die an Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden gekoppelt sind, durch die Aussetzung gegenüber einem destabilisierenden Mittel innerhalb eines Faktors von ungefähr 50 zueinander liegen; (d) Veranlassen der Chemilumineszenzmarker, die mit doppelsträngigen Nukleinsäurehybriden assoziiert sind, Licht zu emittieren und (e) Nachweis von jedem hybridisierten Nukleinsäureanalyten bei Auslösung der lichtemittierenden Reaktion durch das Messen der Werte der Zeit bis zum Scheitelpunkt des Signals und/oder der Dauer der Reaktion der reagierenden Chemilumineszenzmarker über vorherbestimmte Zeitintervalle nach dem Auslösungsereignis.
  38. Ein Verfahren für die Untersuchung einer Vielzahl von Nukleinsäureanalyten in einer Einzelprobe umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen in einem Medium (i) einer Vielzahl von verschiedenen Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden, wobei jede Sonde eine Nukleotidsequenz besitzt, die zu einer Ziel-Nukleotidsequenz eines Nukleinsäureanalyten, von dem vermutet wird, dass er sich in der Probe befindet, komplementär ist, (ii) einer Vielzahl von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, wobei jeder Marker an eine oder mehrere der Hybridisierungssonden gekoppelt ist, so dass zwei oder mehr Nukleinsäureanalyten jeweils von mindestens einer Hybridisierungsassaysonde, die an einen unterschiedlichen Chemilumineszenzmarker gekoppelt ist, angesteuert werden, und (iii) der Probe, und (b) Herstellen von Hybridisierungsbedingungen, unter denen die verschiedenen Hybridisierungsassaysonden vorzugsweise mit den Nukleinsäureanalyten, wenn vorhanden, hybridisieren, um markierte Doppelstrang-nukleinsäurehybride zu bilden, wobei die Bedingungen die Bildung von Doppelstrangnukleinsäurehybriden zwischen den markierten Sonden und nicht angesteuerten Nukleinsäuren nicht begünstigen, (c) selektives Zerstören oder Hemmen des Chemilumineszenzpotentials der Chemilumineszenzmarker, die an nicht hybridisierte Sonden gekoppelt sind, wobei die Chemilumineszenzmarker gleichermaßen gegenüber einem Verlust ihres Chemilumineszenzpotentials empfänglich sind, wenn sie an die nicht hybridisierte Sonde gekoppelt sind, und die Chemilumineszenzmarker gleichermaßen vor dem Verlust ihres Chemilumineszenzpotential geschützt sind, wenn sie an die hybridisierte Sonde gekoppelt sind, (d) Veranlassen von mindestens einem der gekoppelten Chemilumineszenzmarker, die mit den Doppelstrangnukleinsäurehybriden assoziiert sind, an einer lichtemittierenden Reaktion bei einem ersten pH-Wert beteiligt zu sein und Messen des Lichts, das dadurch von dem Marker emittiert wird, (e) Einstellen der Assaylösung auf mindestens einen anderen pH-Wert, (f) Veranlassen von mindestens einem anderen gekoppelten Chemilumineszenzmarker, der mit einem oder mehreren verschiedenen Doppelstrangnukleinsäurehybriden assoziiert ist, an einer lichtemittierenden Reaktion bei dem anderen pH-Wert(en) beteiligt zu sein und (g) Messen des Lichts, das von den anderen Markern während eines vorherbestimmten Zeitraums emittiert wird, dadurch die getrennte Identifizierung von verschiedenen gekoppelten Chemilumineszenzmarkern als Messung von jedem von verschiedenen Nukleinsäureanalyten, die mit markierten Hybridisierungsassaysonden in einer Einzeltestprobe hybridisiert sind, erlaubend.
  39. Eine Zusammensetzung für den Nachweis von einem oder mehreren Organismen in einer einzelnen Probe umfassend: (a) eine Vielzahl von verschiedenen Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden, wobei jede Sonde eine Nukleotidsequenz besitzt, die zu der von einem oder mehreren Nukleinsäureanalyten, die für die Identifizierung von mindestens einem Ziel-Organismus, von dem vermutet wird, dass er sich in der Testprobe befindet, nützlich ist, komplementär ist, (b) eine Vielzahl von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, wobei jeder an eine oder mehrere der Hybridisierungssonden gekoppelt ist, so dass zwei oder mehr Nukleinsäureanalyten von verschiedenen der chemilumineszenzmarkierten Hybridisierungsassaysonden angesteuert werden, wobei jede der Hybridisierungssonden unter Bedingungen, die die Hybridisierung der Sonden mit Nicht-Ziel- Nukleinsäurebereiche nicht begünstigen, spezifisch mit den Nukleinsäureanalyten, falls diese in der Probe vorhanden sind, hybridisiert, wobei die Chemilumineszenzmarker gleichermaßen vor dem Verlust an Chemilumineszenzpotential geschützt sind, wenn sie an eine Hybridisierungssonde gekoppelt sind, die an eine Ziel-Nukleinsäure hybridisiert ist, wobei die Verlustraten an Chemilumineszenzpotential von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, die an Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden gekoppelt sind, abhängig davon, ob die Sonde mit einer Ziel-Nukleinsäure oder einem Nukleotidsequenzbereich hybridisiert ist, abnehmen und wobei die Verhältnisse des Verlustes unter denselben Bedingungen innerhalb eines Faktors von bis zu 250 zueinander liegen; und wobei die Chemilumineszenzmarker gleichermaßen gegenüber einem Verlust ihres Chemilumineszenzpotentials empfänglich sind, wenn sie an eine nicht hybridisierte Sonde gekoppelt sind, wobei unter identischen Bedingungen die Verlustraten an Chemilumineszenzpotential von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, die an Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden gekoppelt sind, bei Aussetzung gegenüber einem destabilisierenden Mittel innerhalb eines Faktors von ungefähr 50 zueinander liegen; und wobei bei Auslösung einer lichtemittierenden Reaktion jeder Chemilumineszenzmarker Licht einer oder mehrerer Wellenlängen, die von einer Wellenlänge der Lichtemission von jedem anderen der Chemilumineszenzmarker ausreichend unterschiedlich ist, emittiert, so dass die Chemilumineszenzmarker, wenn das emittierte Licht nachgewiesen wird, unabhängig voneinander nachweisbar sind und die Wellenlängen ein Hinweis auf das Vorhandensein von jedem Ziel-Organismus in der Testprobe sind.
  40. Eine Zusammensetzung für den Nachweis von einem oder mehreren Organismen in einer einzelnen Probe umfassend: (a) eine Vielzahl von verschiedenen Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden, wobei jede Sonde eine Nukleotidsequenz besitzt, die zu der von einem oder mehreren Nukleinsäureanalyten, die für die Identifizierung von mindestens einem Ziel-Organismus, von dem vermutet wird, dass er sich in der Testprobe befindet, nützlich ist, komplementär ist, (b) eine Vielzahl von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, wobei jeder an eine andere Hybridisierungssonde gekoppelt ist, so dass zwei oder mehr Nukleinsäureanalyten durch verschiedene chemilumineszenzmarkierte Hybridisierungsassaysonden angesteuert werden, wobei jede der Hybridisierungssonden unter Bedingungen, die die Hybridisierung der Sonden mit Nicht-Ziel-Nukleinsäurebereichen nicht begünstigen, spezifisch mit den Nukleinsäureanalyten, falls diese in der Probe vorhanden sind, hybridisiert, wobei die Chemilumineszenzmarker gleichermaßen resistent gegenüber einem Verlust an Chemilumineszenzpotential sind, wenn sie an eine Hybridisierungssonde gekoppelt sind, die mit einer Ziel-Nukleinsäure hybridisiert ist, und die Chemilumineszenzmarker gleichermaßen empfänglich gegenüber einem Verlust an Chemilumineszenzpotential sind, wenn sie an eine nicht hybridisierte Sonde gekoppelt sind, und wobei nach der Auslösung einer auslösbaren lichtemittierenden Reaktion bei einem ersten pH-Wert mindestens einer der Chemilumineszenzmarker in einer lichtemittierenden Reaktion bei dem pH-Wert reagiert und mindestens ein anderer der Chemilumineszenzmarker nicht in einer lichtemittierenden Reaktion reagiert, bis die Lösung auf mindestens einen anderen pH-Wert eingestellt wird, wobei die Zusammensetzung dadurch die getrennte Identifizierung von jedem Chemilumineszenzmarker in einer einzelnen Testprobe als Hinweis auf das Vorhandensein von jedem Ziel-Organismus in der Probe erlaubt.
  41. Eine Zusammensetzung für den Nachweis von einem oder mehreren Organismen in einer Einzelprobe umfassend: (a) eine Vielzahl von verschiedenen Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden, wobei jede der Sonden eine Nukleotidsequenz besitzt, die zu der von einem oder mehreren Nukleinsäureanalyten, die für die Identifizierung von mindestens einem Ziel-Organismus, von dem vermutet wird, dass er sich in der Testprobe befindet, nützlich ist, komplementär ist, (b) eine Vielzahl von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, wobei jeder an eine andere der Hybridisierungssonden gekoppelt ist, so dass zwei oder mehr Nukleinsäureanalyten durch verschiedene chemilumineszenzmarkierte Hybridisierungsassaysonden angesteuert werden, wobei jede der Hybridisierungssonden unter Bedingungen, die die Hybridisierung der Sonden mit Nicht-Ziel-Nukleinsäurebereichen nicht begünstigen, spezifisch mit den Nukleinsäureanalyten, falls diese der Probe vorhanden sind, hybridisiert, wobei die Chemilumineszenzmarker gleichermaßen vor dem Verlust an Chemilumineszenzpotential geschützt sind, wenn sie an eine Hybridisierungssonde gekoppelt sind, die mit einer Ziel-Nukleinsäure hybridisiert ist, wobei die Verlustraten an Chemilumineszenzpotential von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, die an Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden gekoppelt sind, abhängig davon, ob die Sonde mit einer Ziel-Nukleinsäure oder einem Nukleotidsequenzbereich hybridisiert ist, abnehmen und wobei die Verhältnisse des Verlustes unter denselben Bedingungen innerhalb eines Faktors von bis zu 250 zueinander liegen; und wobei die Chemilumineszenzmarker gleichermaßen gegenüber einem Verlust ihres Chemilumineszenzpotentials empfänglich sind, wenn sie an eine nicht hybridisierte Sonde gekoppelt sind, wobei unter identischen Bedingungen die Verlustraten an Chemilumineszenzpotential von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, die an Oligonukleotid- Hybridisierungsassaysonden gekoppelt sind, bei Aussetzung gegenüber einem destabilisierenden Mittel innerhalb eines Faktors von ungefähr 50 zueinander liegen; und wobei bei der Auslösung einer lichtemittierenden Reaktion die Werte der Zeit bis zum Gipfelpunkt des Signals und/oder der Dauer der Reaktion von jedem reagierenden Chemilumineszenzmarker ausreichend unterschiedlich von denen von jedem anderen der reagierenden Chemilumineszenzmarker sind, um, wenn die Lichtemission über einen vorher bestimmten Zeitraum nach dem Auslösungsereignis als Hinweis auf das Vorhandensein von jedem der Ziel-Organismen in der Probe nachgewiesen oder gemessen wird, in der Gegenwart von anderen Markern den getrennten Nachweis von jedem Chemilumineszenzmarker zu erlauben.
  42. Ein Verfahren für den gleichzeitigen Nachweis des Vorhandenseins oder der Menge von Chlamydia trachomatis und Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäuren in einer einzelnen Probe umfassend: (a) In-Kontakt-Bringen der Probe mit mindestens einer Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonde, die vorzugsweise eher mit Chlamydia trachomatis Nukleinsäuren als mit nicht-Chlamydia trachomatis Nukleinsäuren hybridisiert, und mindestens eine Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonde, die vorzugsweise eher mit Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäuren als mit nicht-Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäuren hybridisiert, wobei die Chlamydia trachomatis-spezifischen Hybridisierungsassaysonden an ein erstes chemilumineszenzmarkiertes Reagenz gekoppelt sind und die Neisseria gonorrhoeae-spezifischen Hybridisierungsassaysonden an ein zweites chemilumineszenz-markiertes Reagenz gekoppelt sind, (b) Herstellen von Hybridisierungsbedingungen, die ausreichend sind, um die Hybridisierung zwischen den Chlamydia trachomatis-spezifischen Hybridisierungsassaysonden und, falls vorhanden, Chlamydia trachomatis Nukleinsäuren und Neisseria gonorrhoeae-spezifischen Hybridisierungsassaysonden und, falls vorhanden, Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäuren zu erlauben, wobei die Hybridisierungsbedingungen die nicht-spezifische Hybridisierung der Hybridisierungsassaysonden mit Nicht-Ziel-Nukleinsäuren nicht fördern, (c) Selektives Zerstören oder Hemmen des Chemilumineszenzpotentials der Chemilumineszenzmarker, die an nicht-hybridisierte Sonden gekoppelt sind, wobei die Chemilumineszenzmarker gleichermaßen vor dem Verlust an Chemilumineszenzpotential geschützt sind, wenn sie an eine Hybridisierungssonde gekoppelt sind, die mit einer Ziel-Nukleinsäure hybridisiert ist, wobei die Verlustraten an Chemilumineszenzpotential von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, die an Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden gekoppelt sind, abhängig davon, ob die Sonde mit einer Ziel-Nukleinsäure oder einem Nukleotidsequenzbereich hybridisiert ist, abnehmen und wobei die Verlustraten unter denselben Bedingungen innerhalb eines Faktors von bis zu 250 zueinander liegen; und wobei die Chemilumineszenzmarker gleichermaßen gegenüber einem Verlust an ihrem Chemilumineszenzpotential empfänglich sind, wenn sie an eine nicht-hybridisierte Sonde gekoppelt sind, wobei unter identischen Bedingungen die Verlustraten an Chemilumineszenzpotential von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, die an Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden gekoppelt sind, bei Aussetzung gegenüber einem destabilisierenden Mittel innerhalb eines Faktors von ungefähr 50 zueinander liegen; (d) Nachweis vom ersten Chemilumineszenzreagenz, das an eine hybridisierte Chlamydia trachomatis-spezifische Sonden gekoppelt ist, als Hinweis auf das Vorhandensein von Chlamydia trachomatis Nukleinsäuren in der Probe und dem zweiten Chemilumineszenzreagenz, das an hybridisierte Neisseria gonorrhoeae-spezifische Sonden gekoppelt ist, als Hinweis auf das Vorhandensein von Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäuren in der Probe, wobei jeder der Chemilumineszenzmarker Licht einer oder mehrerer Wellenlängen, die von anderen der Chemilumineszenzmarker emittierten Wellenlängen der Lichtemission ausreichend unterschiedlich sind, emittiert, so dass, wenn das emittierte Licht bei den Wellenlängen als Hinweis auf das Vorhandensein von jedem der Nukleinsäureanalyten in besagter Testprobe gleichzeitig nachgewiesen wird, die Chemilumineszenzmarker unabhängig voneinander nachweisbar sind.
  43. Ein Verfahren für die Untersuchung einer Vielzahl von Analyten in einer Ziel-Nukleinsäure in einer Probe umfassend: (a) In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer Vielzahl von verschiedenen Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden, wobei jede der verschiedenen Sonden spezifisch mit einem anderen Ziel-Analytbereich der Nukleinsäure hybridisiert und wobei jede Sonde an einen anderen Chemilumineszenzmarker gekoppelt ist; (b) Herstellen von Hybridisierungsbedingungen in der Probe, die ausreichend sind, um die spezifische Hybridisierung zwischen jeder Hybridisierungsassaysonde und ihrem Analyten zu erlauben, wobei besagte Hybridisierungsbedingungen die Hybridisierung Hybridisierungsassaysonden an Nicht-Ziel-Nukleotidsequenzbereichen der Nukleinsäure nicht fördern, (c) Selektives Zerstören oder Hemmen des Chemilumineszenzpotentials der Chemilumineszenzmarker, die an nicht-hybridisierte Sonden gekoppelt sind, wobei die Chemilumineszenzmarker gleichermaßen vor dem Verlust an Chemilumineszenzpotential geschützt sind, wenn sie an eine Hybridisierungssonde gekoppelt sind, die mit einer Ziel-Nukleinsäure hybridisiert ist, wobei die Verlustraten an Chemilumineszenzpotential von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, die an Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden gekoppelt sind, abhängig davon, ob die Sonde mit einer Ziel-Nukleinsäure oder einem Nukleotidsequenzbereich hybridisiert ist, abnehmen und wobei unter denselben Bedingungen die Verhältnisse des Verlustes innerhalb eines Faktors von bis zu 250 zueinander liegen; und wobei die Chemilumineszenzmarker gleichermaßen gegenüber einem Verlust ihres Chemilumineszenzpotentials empfänglich sind, wenn sie an eine nicht hybridisierte Sonde gekoppelt sind, wobei unter identischen Bedingungen die Verlustraten an Chemilumineszenzpotential von verschiedenen Chemilumineszenzmarkern, die an Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden gekoppelt sind, bei Aussetzung gegenüber einem destabilisierenden Agens innerhalb eines Faktors von ungefähr 50 zueinander liegen; (d) Nachweis der Chemilumineszenzmarker, die an verschiedene Sonden gekoppelt sind, als Hinweis auf das Vorhandensein der Nukleinsäureanalyten in der Probe, wobei jeder der Chemilumineszenzmarker Licht einer oder mehrerer Wellenlängen emittiert, das von einer Wellenlänger der Lichtemission von jedem anderen Chemilumineszenzmarker ausreichend unterschiedlich ist, so dass, wenn das emittierte Licht bei den Wellenlängen als Hinweis auf das Vorhandensein von jedem der Nukleinsäureanalyten in der Testprobe gleichzeitig nachgewiesen wird, die Chemilumineszenzmarker unabhängig nachweisbar sind.
  44. Das Verfahren gemäß Anspruch 43, wobei die Nukleinsäure vom humanen Immunodefizienzvirus abgeleitet ist.
  45. Das Verfahren gemäß Anspruch 44, wobei die verschiedenen Analyten Ziel-Bereiche umfassen, die in Bereichen des Genoms des humanen Immunodefizienzvirus umfassend die gag und pol Regionen lokalisiert sind.
  46. Ein Kit, das eine der Zusammensetzungen gemäß Anspruch 1 bis 35, 39, 40 oder 41 enthält für den Nachweis von einem oder mehreren Nukleinsäureanalyten in einer Testprobe.
  47. Das Kit gemäß Anspruch 46, ferner umfassend ein Unterscheidungsreagenz, umfassend Mittel für die selektive Zerstörung oder Hemmung des Chemilumineszenzpotentials der Chemilumineszenzmarker, die an nicht-hybridisierte Sonden gekoppelt sind.
  48. Das Kit gemäß Anspruch 46 oder 47, ferner umfassend ein Nachweisreagenz, das Mittel umfasst, Chemilumineszenzreagenzien zu veranlassen, nachweisbares Licht zu emittieren.
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