DE102011120550B4 - Zusammensetzungen, Verfahren und Kits zur Detektion von Adenovirusnukleinsäuren - Google Patents

Zusammensetzungen, Verfahren und Kits zur Detektion von Adenovirusnukleinsäuren Download PDF

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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Abstract

Verfahren zum spezifischen Detektieren einer Adenovirus-Targetnukleinsäure in einer Probe, umfassend die Schritte: (a) Kontaktieren einer Probe, von der vermutet wird, dass sie mindestens eine Adenovirus-Nukleinsäure enthält, mit mindestens zwei Amplifikationsoligomeren zur Erzeugung eines Amplikons, wobei jedes der mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine Länge von 10 bis etwa 50 Nukleotiden aufweist, und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils so gestaltet sind, dass sie speziell mit Bereichen innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisieren, die ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 1 bis 99 und aus Nukleotiden 83 bis 175 der Akzessionsnummer AB330090.1 (SEQ ID Nr. 47), (b) Bereitstellen von Bedingungen, die ausreichen, um ein Amplikon aus einer Adenovirus-Targetnukleinsäure, die in der Probe vorhanden ist, unter Verwendung der Amplifikationsoligomere aus Schritt (a) zu erzeugen, und (c) Bereitstellen von Bedingungen zum Detektieren des Amplikons und zum Feststellen, ob eine Adenovirus-Targetnukleinsäure in der Probe vorhanden ist.

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Detektion von Infektionserregern, insbesondere die Detektion von Adenovirus. Zusammensetzungen, Verfahren und Kits für die Detektion von Adenovirus unter Verwendung von Techniken zur In vitro-Amplifikation von Nukleinsäuren werden beschrieben.
  • EINFÜHRUNG
  • Adenovirus kann Infektionen in einer Reihe von verschiedenen Organen verursachen, einschließlich des Gastrointestinaltrakts, der oberen Atemwege und der Augen. Bei Personen mit einem gut funktionierenden Immunsystem sind Adenovirus-Infektionen in der Regel nicht mit lebensbedrohlicher Erkrankung verbunden. Allerdings kann Adenovirus zu schwerer Infektion bei immungeschwächten Patienten führen – wie beispielsweise bei HIV-positiven Personen und bei Patienten, die Knochenmarktransplantationen erhalten. Es wurden mehr als 50 verschiedene menschliche Adenovirus-Serotypen identifiziert. Auf der Grundlage verschiedener Eigenschaften von Adenovirus wurden sie in sechs wesentliche Untergruppen (Untergattungen oder Arten A–F) unterteilt, wobei die aktuellere Literatur in Richtung des Vorhandenseins eines siebten Serotyps deutet.
  • In frühen Ansätzen zum Detektieren von Adenovirus stützte sich die Detektion im Wesentlichen auf serologische Tests und Zellkultur. Bei immunsupprimierten Patienten ist jedoch die Verwendung von serologischen Tests durch die gestörte Immunreaktion begrenzt, und die Auswertung von positiven Kulturen ist ein verhältnismäßig langsames Verfahren. Die Einführung von PCR-basierten Assays hat neue Methoden für die schnelle, spezifische und empfindliche Detektion von Adenovirus bereitgestellt. Viele dieser diagnostischen Ansätze decken jedoch nicht wirksam alle Adenovirus-Serotypen ab oder verwenden Bedingungen niedriger Stringenz, um die Detektion der genetisch sehr unterschiedlichen Adenoviren zu ermöglichen.
  • Die Homologie von DNA-Sequenzen von Adenovirus zwischen verschiedenen Arten ist gering. Selbst konservierte Bereiche innerhalb des Adenovirus-Genoms zeigen nur eine begrenzte Homologie zwischen verschiedenen Arten von Adenoviren. In vielen Fällen bestehen erhebliche Unterschiede in der DNA-Sequenz sogar zwischen Serotypen, die derselben Art angehören. Diese Fakten unterstreichen die Schwierigkeit, molekulare Tests zu entwickeln, die ein zuverlässiges Screening auf Adenovirus-Infektionen mit der erforderlichen breiten Spezifität erleichtern.
  • Ein Assay auf molekularer Basis ist erforderlich, um die empfindliche und spezifische Detektion von mehreren Serotypen zu ermöglichen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren, Zusammensetzungen und Kits bereitzustellen, die eingesetzt werden können, um gezielt mit hoher Empfindlichkeit Adenovirus-Nukleinsäuren zu detektieren. Die Verfahren, Zusammensetzungen und Kits können vorteilhaft eingesetzt werden, um gezielt mit hoher Empfindlichkeit viele (z. B. 5 oder mehr, 10 oder mehr, 20 oder mehr, 30 oder mehr, 40 oder mehr oder 50 oder mehr) oder alle bekannten Serotypen von Adenovirus zu detektieren.
  • In einem Aspekt wird ein Verfahren zum spezifischen Detektieren einer Adenovirus-Targetnukleinsäure in einer Probe bereitgestellt, umfassend die Schritte: (a) Kontaktieren einer Probe, von der vermutet wird, dass sie mindestens eine Adenovirus-Nukleinsäure enthält, mit mindestens zwei Amplifikationsoligomeren zur Erzeugung eines Amplikons, wobei jedes der mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine Länge von 10 bis etwa 50 Nukleotiden aufweist, und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils so gestaltet sind, dass sie spezifisch mit Bereichen innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisieren, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 1 bis 99 und aus den Nukleotiden 83 bis 175 der Akzessionsnummer AB330090.1 (SEQ ID Nr. 47), (b) Bereitstellen von Bedingungen, die ausreichen, um ein Amplikon aus einer Adenovirus-Targetnukleinsäure, die in der Probe vorhanden ist, unter Verwendung der Amplifikationsoligomere aus Schritt (a) zu erzeugen, und (c) Bereitstellen von Bedingungen zum Detektieren des Amplikons und zum Feststellen, ob eine Adenovirus-Targetnukleinsäure in der Probe vorhanden ist.
  • In einer Ausführungsform umfasst mindestens eines der mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 1 bis 9, 11 bis 16, 25 bis 28, 31 bis 35, 38 und 42 bis 46 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.
  • In einer Ausführungsform umfasst mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 1, 5, 11, 12, 25, 26, 31, 32, 33, 34, 35 oder 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.
  • In einer Ausführungsform umfasst mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 2, 3, 6, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 42, 43, 44, 45 oder 46 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.
  • In einer Ausführungsform umfasst ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 1 dargelegte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus, und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer umfasst SEQ ID NR: 2 und/oder SEQ ID NR: 3, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.
  • In einer Ausführungsform umfasst ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 5 dargelegte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus, und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer umfasst eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 6 bis 9 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.
  • In einer Ausführungsform umfasst mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 11 und/oder 12 dargelegte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus, und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer umfasst eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 13 bis 16 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.
  • In einer Ausführungsform umfasst mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 31 bis 35 oder 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus, und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer umfasst eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und/oder 28 dargelegte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.
  • In einer Ausführungsform umfasst mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 und/oder 26 dargelegte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus, und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer umfasst eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und/oder 28 dargelegte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.
  • In einer Ausführungsform umfassen mindestens zwei erste Amplifikationsoligomere jeweils eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 und 26 dargelegte Sequenz, bestehen daraus oder bestehen im Wesentlichen daraus, und mindestens zwei zweite Amplifikationsoligomere umfassen eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und 28 dargelegte Sequenz, bestehen daraus oder bestehen im Wesentlichen daraus.
  • In einer Ausführungsform ist die Kombination der Amplifikationsoligomere SEQ ID Nrn. 25, 26, 27 und 28 oder SEQ ID Nrn. 26, 27 und 28 oder SEQ ID Nrn. 25, 26 und 28 oder SEQ ID Nrn. 25, 26 und 27 oder SEQ ID Nrn. 25, 27 und 28 oder SEQ ID Nrn. 25 und 27 oder SEQ ID Nrn. 25 und 28 oder SEQ ID Nrn. 26 und 27 oder SEQ ID Nrn. 26 und 28.
  • In einer Ausführungsform umfasst der Detektionsschritt Kontaktieren des Amplifikationsprodukts mit mindestens einer Detektionssonde, die gestaltet ist, um mit einem Teil des Amplifikationsprodukts zu hybridisieren.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Detektionssonde eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 10, 17 bis 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Detektionssonde eine wie in SEQ ID Nr. 36 und/oder SEQ ID Nr. 37 dargelegte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.
  • In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zum Detektieren einer Adenovirus-Nukleinsäure bereitgestellt, umfassend die Schritte: (a) Kontaktieren einer Testprobe, die Nukleinsäure enthält, mit mindestens einer Hybridisierungsassaysonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, und (b) ermitteln, ob sich eine Sonde:Target-Duplex unter stringenten Hybridisierungsbedingungen in der Probe gebildet hat, wobei das Vorhandensein der Sonde:Target-Duplex ein Hinweis auf das Vorhandensein von Adenovirus-Nukleinsäure in der Probe ist.
  • In einem weiteren Aspekt wird eine Zusammensetzung zur Verwendung in einem Adenovirus-Targetnukleinsäure-Amplifikationsassay bereitgestellt, der mindestens zwei Amplifikationsoligomere umfasst, die in der Lage sind, mit Adenovirus-Targetnukleinsäure stabil zu hybridisieren, wobei jeder der mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine Länge von 10 bis etwa 50 Nukleotide aufweist und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils so gestaltet sind, dass sie spezifisch mit Bereichen innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisieren, die aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 1 bis 99 und aus den Nukleotiden 83 bis 175 von Akzessionsnummer AB330090.1 (SEQ ID Nr. 47) ausgewählt werden.
  • Mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer umfasst eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 und/oder SEQ ID NR: 26 dargelegte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer umfasst eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und/oder SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.
  • In einer Ausführungsform werden die ersten und zweiten Amplifikationsoligomere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 25, 26, 27 und 28; SEQ ID Nrn. 26, 27 und 28; SEQ ID Nrn. 25, 26 und 28; SEQ ID Nrn. 25, 26 und 27; SEQ ID Nrn. 25, 27 und 28; SEQ ID Nrn. 25 und 27; SEQ ID Nrn. 25 und 28; SEQ ID Nrn. 26 und 27 und SEQ ID Nrn. 26 und 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung ferner eine Detektionssonde.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Detektionssonde eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 10, 17 bis 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Detektionssonde eine wie in SEQ ID Nr. 36 und/oder SEQ ID Nr. 37 dargelegte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.
  • In einem weiteren Aspekt wird ein Kit bereitgestellt, umfassend die erfindungsgemäße Zusammensetzung und optionale Anweisungen zum Ausführen desselben.
  • In einem weiteren Aspekt wird eine isolierte DNA-Sequenz bereitgestellt, die im Wesentlichen der Sequenz, wie in einer der SEQ ID Nrn. 1 bis 46 dargelegten oder der entsprechenden isolierter RNA-Sequenz entspricht.
  • In einer Ausführungsform ist die Sequenz das Komplement oder das reverse Komplement davon.
  • In einem weiteren Aspekt wird die Verwendung der isolierten DNA-Sequenz zum Amplifizieren und/oder zum Detektieren von Adenovirus-Nukleinsäure bereitgestellt.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
  • Es werden Nukleinsäureoligomersequenzen offenbart, die als Primer und/oder Detektionssonden zur Amplifikation und/oder Detektion von Adenovirus-Nukleinsäuren dienen können. Die Adenovirus-Nukleinsäuren können in einer Probe detektiert werden, indem Verfahren der In-vitro-Nukleinsäure-Amplifikation eingesetzt werden, wie beispielsweise PCR (z. B. TaqMan-PCR) – oder transkriptionsvermittelte Amplifikation – wie beispielsweise TMA oder NASBA. Sonden für die Detektion der amplifizierten Nukleinsäuresequenzen werden ebenfalls beschrieben. Detektionssonden hybridisieren spezifisch mit mindestens einem Teil der amplifizierten Sequenz, entweder nach Abschluss oder während des Amplifikationsprozesses. Einige Ausführungsformen detektieren die Amplifikationsprodukte durch Verwendung eines homogenen Detektionsverfahrens, das in einer Mischung eine markierte Sonde detektiert, die spezifisch an eine amplifizierte Sequenz gebunden ist (z. B. siehe Arnold et al., 1989, Clin. Chem. 35: 1588–1594; US-Patent Nr. US 5 658 737 A , Nelson et al. und US-Patente Nrn. US 5 118 801 A und US 5 312 728 A , Lizardi et al.). Die Verfahren können Oligonukleotidsequenzen einsetzen, die als Fängersonden zum Bearbeiten einer Probe dienen, um die Adenovirus-Targetnukleinsäure zu fangen und sie von anderen Bestandteilen der Probe abzutrennen (z. B. siehe US-Patente Nrn. US 6 110 678 A , US 6 280 952 B1 und US 6 534 273 B2 ).
  • Die hier offenbarten Verfahren können eingesetzt werden, um Adenovirus-Nukleinsäuren in Proben, die von Tieren und Menschen stammen oder von diesen abgeleitet wurden, zu detektieren.
  • Die hier offenbarten Zusammensetzungen umfassen Amplifikationsoligomere, die eingesetzt werden können, um ausgewählte Nukleinsäuresequenzen, die in genomischen Adenovirus-Sequenzen vorhanden sind, spezifisch zu amplifizieren, und wahlweise Nukleinsäuresonden zum Detektieren der amplifizierten Sequenzen.
  • Die offenbarten Nukleinsäuresequenzen und Verfahren sind zum Amplifizieren und Detektieren von Adenovirus-Nukleinsäuren, die aus Viruspartikeln stammen oder davon abgeleitet wurden, die in einer Probe vorhanden sind, in einer relativ kurzen Zeit brauchbar, so dass die Diagnose schnell erstellt werden kann und so eine wirksame Behandlung eingeleitet und die Ausbreitung des Virus begrenzt werden kann. Die Verfahren sind für das Screening nach Personen, die Adenovirus-Infektionen haben, allerdings keine definitive Symptome zeigen, brauchbar und sind besonders für das Screening von Patienten, die ein erhöhtes Risiko für Tod oder für schwere Komplikationen von Adenovirus-Infektionen haben, z. B. junge, ältere oder immungeschwächte Personen, brauchbar. Die Verfahren sind auch für ein schnelles Screening einer großen Anzahl von Proben brauchbar. Die Verfahren sind brauchbar, weil sie das Risiko der Exposition von Laborpersonal gegenüber infektiösen Adenovirus-Agentien minimieren, wodurch der Gefahr einer Infektion und Ausbreitung des Virus Einhalt geboten wird. Somit gehen die hier offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen auf das Bedürfnis nach einer schnellen, empfindlichen und spezifischen Prüfung von klinischen Proben, die Adenovirus enthalten können, ein.
  • Die offenbarten Sondensequenzen können als Primer eingesetzt werden, und die offenbarten Primer können als Sonden eingesetzt werden. Das gleiche gilt für die offenbarten Sondendomänen und Primerdomänen. Somit können die hier offenbarten Sondendomänen als Primerdomänen eingesetzt werden. Ebenso können die hier offenbarten Primerdomänen als Sondendomänen eingesetzt werden.
  • Die hier offenbarten Amplifikationsoligomere sind weiter als Komponenten von Multiplex-Amplifikationsreaktionen denkbar, wobei mehrere Amplikonarten, die aus einer Mischung (z. B. zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr, fünf oder mehr, sechs oder mehr oder sogar zehn oder mehr) von targetspezifischen Primern hergestellt werden können. Zum Beispiel ist es denkbar, dass mehr als eines der hier offenbarten Amplifikationsysteme kombiniert werden können, um einen Multiplex-Assay zu ergeben, der sowohl robust als auch breit gefächert in seiner Fähigkeit zur Detektion des Targets ist – wie beispielsweise die Fähigkeit, 5 oder mehr, 10 oder mehr, 20 oder mehr, 30 oder mehr, 40 oder mehr oder 50 oder mehr oder alle bekannten Serotypen des Adenovirus zu detektieren.
  • Als Beitrag zu einem besseren Verständnis der Aspekte der Offenbarung werden einige der hier verwendeten Begriffe näher erläutert. Alle anderen hier verwendeten wissenschaftlichen und technischen Begriffe haben die gleiche Bedeutung, wie sie von den Fachleuten auf dem betreffenden Gebiet verstanden und wie sie beispielsweise im Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2. Auf. (Singleton et al., 1994, John Wiley & Sons, New York, NY), The Harper Collins Dictionary of Biology (Hale & Marham, 1991, Harper Perennial, New York, NY), und darin zitierten Literaturstellen gegeben wird. Falls nicht anders angegeben sind die hier angewandten oder in Betracht gezogenen Techniken Standardverfahren, die einem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie wohl bekannt sind.
  • Man beachte, dass der Begriff „eine” Einheit sich auf eine oder mehrere dieser Einheit beziehet, zum Beispiel steht „eine Nukleinsäure” für eine oder mehrere Nukleinsäuren. Daher können die Begriffe „ein”, „ein oder mehrere” und „mindestens ein” hier synonym eingesetzt werden.
  • Probe. Eine „Probe” oder ein „Prüfkörper”, darunter „biologische” oder „klinische” Proben, können Adenovirus oder Bestandteile davon enthalten oder im Verdacht stehen, diese zu enthalten, wie beispielsweise Nukleinsäuren oder Fragmente von Nukleinsäuren. Eine Probe kann eine komplexe Mischung von Bestandteilen sein. Proben umfassen „biologische Proben”, die Gewebe oder Material, das von einem lebenden oder toten Säuger oder Organismus abgeleitet wurde, enthalten, einschließlich beispielsweise Blut, Plasma, Serum, Blutzellen, Speichel, Schleim und Liquor. Die Proben können auch Proben von In-vitro-Zellkulturbestandteilen enthalten, wie beispielsweise konditionierte Medien, die sich aus dem Wachstum von Zellen und Geweben in Kulturmedium ergeben. Die Probe kann behandelt werden, um physisch oder mechanisch Gewebe oder Zellstruktur zu spalten, um intrazelluläre Nukleinsäuren in eine Lösung, die Enzyme, Puffer, Salze, Tenside und dergleichen enthalten kann, freizusetzen, um die Probe für die Analyse vorzubereiten. In einem Schritt der hier beschriebenen Verfahren ist eine Probe vorgesehen, von der vermutet wird, mindestens eine Adenovirus-Targetnukleinsäure zu enthaften. Dementsprechend vermeidet dieser Schritt den physischen Schritt des Gewinnens der Probe von einem Probanden.
  • Nukleinsäure. Dies bezeichnet eine multimere Verbindung, die zwei oder mehr kovalent gebundene Nukleoside oder Nukleosidanaloga umfasst, die stickstoffhaltige heterocyclische Basen oder Basenanaloga aufweisen, in der die Nukleoside mit Phosphodiesterbindungen oder anderen Verknüpfungen verbunden sind, um ein Polynukleotid zu bilden. Zu Nukleinsäuren zählen RNA, DNA oder chimäre DNA-RNA-Polymere oder Oligonukleotide und deren Analoga. Ein „Rückgrat” einer Nukleinsäure kann aus einer Vielzahl von Verknüpfungen hergestellt werden, einschließlich einer oder mehrerer Zucker-Phosphodiester-Verknüpfungen, Peptid-Nukleinsaure-Bindungen (in „Peptid-Nukleinsäuren” oder PNA, siehe PCT Nr. WO 95/32305 A1 ), Phosphorothioat-Verknüpfungen, Methylphosphonat-Verknüpfungen oder Kombinationen davon. Die Zuckerreste der Nukleinsäure können entweder Ribose oder Desoxyribose oder ähnliche Verbindungen mit bekannten Substitutionen sein, z. B. 2'-Methoxy-Substitutionen und 2'-Halogen-Substitutionen (z. B. 2'-F). Die stickstoffhaltigen Basen können die herkömmlichen Basen (A, G, C, T, U), Analoga davon (z. B. Inosin, 5-Methylisocytosin, Isoguanin, The Biochemistry of the Nucleic Acids 5–36, Adams et al., Hrsg., 11. Auflage, 1992, Abraham et al., 2007, BioTechniques 43: 617–24), die Derivate von Purin- oder Pyrimidin-Basen umfassen (z. B. N4-Methyldeoxyguanosin, Deaza- oder Aza-Purine, Deaza- oder Aza-Pyrimidine, Pyrimidin-Basen mit Substituentengruppen an der 5- oder 6-Position, Purin-Basen mit veränderten oder Ersatzsubstituenten an der 2, 6 und/oder 8-Position wie beispielsweise 2-Amino-6-methylaminopurin, O6-Methylguanin, 4-Thiopyrimidine, 4-Aminopyrimidine, 4-Dimethylhydrazinpyrimidine und O4-Alkylpyrimidine und Pyrazol-Verbindungen, wie beispielsweise unsubstituiertes oder 3-substituiertes Pyrazol[3,4-d]pyrimidin, US-Patente Nrn. US 5 378 825 A , US 6 949 367 B1 und PCT Nr. WO 93/13121 A1 ). Nukleinsäuren können „abasische” Reste enthalten, bei denen das Rückgrat keine stickstoffhaltige Base an einem oder mehreren Resten aufweist (US-Patent Nr. US 5 585 481 A ). Eine Nukleinsäure kann nur herkömmliche Zucker, Basen und Verknüpfungen umfassen, wie sie in RNA und DNA vorkommen, oder kann herkömmliche Bestandteile und Substitutionen (z. B. herkömmliche Basen, die über ein 2'-Methoxy-Rückgrat verknüpft sind, oder eine Nukleinsäure bestehend aus einer Mischung aus herkömmlichen Basen zusammen mit einem oder mehreren Basenanaloga) enthalten. Nukleinsäuren können „verschlossene Nukleinsäuren” (Locked Nucleic Acids, LNA) sein, bei denen ein oder mehrere Nukleotidmonomere eine bicyclische Furanose-Einheit in einer verschlossenen, RNA-imitierenden Zuckerkonformation aufweisen, die die Hybridisierungsaffinität gegenüber komplementären Sequenzen in einzelsträngiger RNA (ssRNA), einzelsträngiger DNA (ssDNA) oder doppelsträngiger DNA (dsDNA) verbessern (Vester et al., 2004, Biochemistry 43(42): 13233–41). Nukleinsäuren können modifizierte Basen beinhalten, um die Funktion oder das Verhalten der Nukleinsäure zu ändern, beispielsweise die Addition eines 3'-terminalen Didesoxynukleotids, um zu verhindern, dass zusätzliche Nukleotide an die Nukleinsäure addiert werden. Synthetische Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren in vitro sind im Stand der Technik wohl bekannt, wenngleich Nukleinsäuren aus natürlichen Quellen unter Verwendung von Routinetechniken aufgereinigt werden können.
  • Polynukleotid. Der Begriff bezeichnet eine Nukleinsäurekette. In dieser Anmeldung werden Nukleinsäuren vom 5'-Ende hin zu dem 3'-Terminus bezeichnet. Normale Nukleinsäuren, beispielsweise DNA und RNA, werden in der Regel „3'-nach-5'” hergestellt, d. h. durch die Addition von Nukleotiden an das 5'-Ende einer wachsenden Nukleinsäure.
  • Nukleotid. Dies ist eine Untereinheit einer Nukleinsäure, bestehend aus einer Phosphatgruppe, einem 5-Kohlenstoff-Zucker und einer stickstoffhaltigen Base. Der in RNA vorkommende 5-Kohlenstoff-Zucker ist die Ribose. In DNA ist der 5-Kohlenstoff-Zucker die 2'-Desoxyribose. Der Begriff umfasst auch Analoga dieser Untereinheiten, wie beispielsweise eine Methoxygruppe an der 2'-Position der Ribose (2'-O-Me oder 2'-Methoxy). Wie hier verwendet enthalten Methoxy-Oligonukleotide mit „T”-Resten eine Methoxygruppe an der 2'-Position der Ribose-Einheit und ein Uracil an der Position der Base des Nukleotids.
  • Nicht-Nukleotid-Einheit. Dies ist eine Einheit, die nicht wesentlich an der Hybridisierung eines Polymers beteiligt ist. Derartige Einheiten dürfen zum Beispiel nicht in nennenswertem Ausmaß an Wasserstoffbrücken mit einem Nukleotid beteiligt sein und würde Einheiten ausschließen, die eine der fünf Nukleotidbasen oder Analoga davon als Bestandteil aufweisen.
  • Targetnukleinsäure. Dies ist eine Nukleinsäure, die eine „Targetsequenz” enthält, die amplifiziert werden soll. Targetnukleinsäuren können DNA oder RNA sein und können entweder einzel- oder doppelsträngig sein. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Targetnukleinsäure DNA. Die Targetnukleinsäuren können neben der Targetsequenz auch andere Sequenzen umfassen, die amplifiziert werden können. Typische Targetnukleinsäuren stammen aus dem Adenovirus-Genom oder sind davon abgeleitet.
  • Targetsequenz. Dieser Begriff bezieht sich auf die konkrete Nukleotidsequenz der Targetnukleinsäure, die amplifiziert werden soll. Wenn die Targetnukleinsäure ursprünglich einzelsträngig ist, bezieht sich der Begriff „Targetsequenz” auch auf die komplementäre Sequenz der Targetsequenz, die in der Targetnukleinsäure vorhanden ist. Wenn die Targetnukleinsäure ursprünglich doppelsträngig ist, bezieht sich der Begriff „Targetsequenz” sowohl auf die Sense-(+) als auch die Antisense-(–)-Stränge. Bei der Wahl einer Targetsequenz ist dem Fachmann offensichtlich, dass eine Sequenz derart gewählt werden sollte, um zwischen nicht verwandten oder eng verwandten Targetnukleinsäuren zu unterscheiden. Die Begriffe „zielt auf eine Sequenz ab” oder „zielt auf eine Targetnukleinsäure ab”, wie hier in Bezug auf einen Nukleinsäurebereich von Adenovirus verwendet, bezieht sich auf einen Prozess, wobei ein Oligonukleotid stabil mit der Targetsequenz in einer Weise hybridisiert, wodurch die Amplifikation und/oder die Detektion wie hier beschrieben ermöglicht wird. In einer Ausführungsform ist das Oligonukleotid komplementär zur abgezielten Adenovirus-Nukleinsäuresequenz und enthält keine Fehlpaarungen. In einer weiteren Ausführungsform ist das Oligonukleotid komplementär, enthält jedoch 1 oder 2 oder 3 oder 4 oder 5 oder mehr Fehlpaarungen hinsichtlich der abgezielten Adenovirus-Nukleinsäuresequenz. Vorzugsweise enthält das Oligonukleotid, das stabil mit der Adenovirus-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, mindestens 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 zusammenhängende Nukleotide, die komplementär zu der Targetsequenz sind. Es ist selbstverständlich, dass mindestens 10 und bis zu 50 ein inklusiver Bereich ist, so dass 10, 50 und jede ganze Zahl dazwischen, enthalten sind. Der Begriff „gestaltet, um auf eine Sequenz abzuzielen” bedeutet hier, dass der hybridisierende Targetbereich eines Amplifikationsoligonukleotids gestaltet ist, eine Polynukleotidsequenz aufzuweisen, die auf eine Sequenz des bezuggenommenen Adenovirus-Bereichs abzielen könnte. Ein solches Amplifikationsoligonukleotid ist nicht auf das Abzielen auf diese Sequenz beschränkt, sondern eignet sich als eine Zusammensetzung, in einem Kit oder in einem Verfahren für das Abzielen auf eine Adenovirus-Targetnukleinsäure wie hier beschrieben. Der Begriff „gestaltet um zu” bezeichnet eine tatsächliche Anordnung der Polynukleotidsequenzkonfiguration der das Target hybridisierenden Sequenz des Amplifikationsoligonukleotids.
  • Isoliert. Dies bedeutet, dass eine Nukleinsäure aus ihrer natürlichen Umgebung entfernt wird, die Bedeutung des Begriffs umfasst jedoch keine Aufreinigung irgendwelcher Art.
  • Fragment. Wie hier in Bezug auf die abgezielte Adenovirus-Nukleinsäuresequenz eingesetzt bezieht sich dieser Begriff auf ein Stück zusammenhängende Nukleinsäure. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Fragment zusammenhängende Nukleotide aus der Adenovirus-Targetnukleinsäure, wobei die Anzahl der zusammenhängenden Nukleotide in dem Fragment geringer ist als diejenige des gesamten Adenovirus-Genoms oder eines Gens davon.
  • Bereich. Dieser Begriff bezieht sich auf einen Teil einer Nukleinsäure, wobei dieser Abschnitt kleiner als die gesamte Nukleinsäure ist. Wenn beispielsweise die besagte Nukleinsäuresequenz ein Oligonukleotidpromotor-Provider ist, kann der Begriff „Bereich” verwendet werden, um sich auf den kleineren Promotor-Abschnitt des gesamten Oligonukleotids zu beziehen. Ebenso und ebenfalls nur beispielhaft kann, wenn die Nukleinsäure eine Targetnukleinsäure ist, der Begriff „Bereich” eingesetzt werden, um sich auf einen kleineren Bereich der Nukleinsäure zu beziehen.
  • Oligonukleotid. Dieser Begriff kann synonym mit „Oligomer” und „Oligo” eingesetzt werden und bezeichnet eine Nukleinsäure, die in der Regel weniger als 1.000 Nukleotid(nt)-Reste aufweist, einschließlich Polymere im Bereich von etwa 5 nt-Resten bis etwa 900 nt-Resten, von etwa 10 nt-Resten bis etwa 800 nt-Resten mit einer Untergrenze von etwa 12 bis 15 nt und einer Obergrenze von etwa 40 bis 600 nt, und andere Ausführungsformen liegen in einem Bereich mit einer Untergrenze von etwa 15 bis 20 nt und einer Obergrenze von etwa 22 bis 100 nt. Es ist selbstverständlich, dass diese Bereiche nur beispielhafter Natur sind, und dass ein Oligonukleotid jede ganze Zahl in dem Bereich enthalten kann. Oligonukleotide können aus natürlich vorkommenden Quellen aufgereinigt werden, können aber auch unter Verwendung einer Vielzahl von bekannten enzymatischen oder chemischen Verfahren synthetisiert werden. Der Begriff Oligonukleotid bezieht keine bestimmte Funktion des Reagenzes ein, sondern er bezieht sich allgemein auf sämtliche derartige Reagenzien, die hier beschrieben werden. Ein Oligonukleotid kann verschiedene Funktionen ausüben. Zum Beispiel kann es als Primer dienen, wenn es spezifisch für einen komplementären Strang ist und in der Lage ist, mit diesem zu hybridisieren, und weiterhin in Gegenwart einer Nukleinsäure-Polymerase verlängert werden kann, es kann einen Promotor bereitstellen, wenn es eine Sequenz enthält, die von einer RNA-Polymerase erkannt wird und die Transkription (z. B. Bereitstellen von T7) ermöglicht, und es kann dazu dienen, die Hybridisierung zu verhindern oder die Primerextension zu behindern, wenn es entsprechend angeordnet und/oder modifiziert wird.
  • Wie hier eingesetzt bedeutet ein Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz, die eine aus einer Gruppe von konkreten Oligonukleotidsequenzen ausgewählte Sequenz „umfasst” oder „daraus besteht” oder „im Wesentlichen daraus besteht”, dass das Oligonukleotid als grundlegende und neuartige Eigenschaft in der Lage ist, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen stabil mit einer Nukleinsäure zu hybridisieren, die das genaue Komplement einer der aufgeführten Nukleinsäuresequenzen der Gruppe aufweist. Ein genaues Komplement umfasst die entsprechende DNA- oder RNA-Sequenz.
  • Entspricht. Wie hier eingesetzt „entspricht” eine Nukleinsäure einer konkreten Nukleinsäure, wenn die Nukleinsäure 100% identisch oder komplementär zu der konkreten Nukleinsäure ist.
  • Im Wesentlichen entsprechend. Wie hier eingesetzt bedeutet eine Nukleinsäure „entspricht im Wesentlichen” einer konkreten Nukleinsäuresequenz, dass das betreffende Oligonukleotid der Referenznukleinsäuresequenz ausreichend ähnlich ist, so dass das Oligonukleotide ähnliche Hybridisierungseigenschaften wie die Referenznukleinsäuresequenz aufweist, so dass es unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit der gleichen Targetnukleinsäuresequenz hybridisieren würde. Im Wesentlichen entsprechende Nukleinsäuren unterscheiden sich durch mindestens ein Nukleotid von der konkreten Nukleinsäure. Diese Änderung kann in Bezug auf einen prozentualen Anteil Identität oder Komplementarität zwischen der Nukleinsäure und der konkreten Nukleinsäure angegeben werden. Somit entspricht eine Nukleinsäure im Wesentlichen einer Referenznukleinsäuresequenz, falls diese prozentualen Anteile an Basenidentität oder -komplementarität von weniger als 100% bis etwa 80% betragen. In bevorzugten Ausführungsformen beträgt dieser prozentuale Anteil mindestens 85%. In besonders bevorzugten Ausführungsformen beträgt dieser prozentuale Anteil mindestens etwa 90%, in anderen bevorzugten Ausführungsformen beträgt dieser prozentuale Anteil mindestens etwa 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%. Für den Fachmann ist offensichtlich, dass die genannten Bereiche alle ganzen und rationalen Zahlen in dem Bereich umfassen (z. B. 92% oder 92,377%).
  • Helferoligonukleotid. Ein „Helferoligonukleotid” oder „Helfer” bezeichnet ein Oligonukleotid, das entworfen wurde, um eine Targetnukleinsäure zu binden, und dem Target eine andere Sekundär- und/oder Tertiärstruktur aufzuerlegen, um die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Hybridisierung einer Detektionssonde oder eines anderen Oligonukleotids mit der abgezielten Nukleinsäure zu erhöhen, beispielsweise wie in US-Patent Nr. US 5 030 557 A beschrieben. Helfer können ebenfalls eingesetzt werden, um die Hybridisierung mit Targetnukleinsäuresequenzen und die Funktion als Primer, Targetfänger und andere Oligonukleotide zu unterstützen. Helferoligonukleotide können in den hier beschriebenen Verfahren eingesetzt werden und können einen Teil der hier beschriebenen Zusammensetzungen und Kits bilden.
  • Blockierungseinheit. Wie hier verwendet ist eine Blockierungseinheit eine Substanz, die eingesetzt wird, um das 3'-Ende eines Oligonukleotids oder einer anderen Nukleinsäure zu „blockieren”, so dass es durch eine Nukleinsäure-Polymerase nicht mehr wirksam verlängert werden kann.
  • Amplifikationsoligomer. Ein „Amplifikationsoligomer”, das auch als ein „Amplifikationsoligonukleotid” bezeichnet werden kann, ist ein Oligomer, bei dem mindestens das 3'-Ende komplementär zu einer Targetnukleinsäure („mit dem Target hybridisierende Sequenz”) ist, und das mit einer Targetnukleinsäure oder seinem Komplement hybridisiert und sich an einer Nukleinsäureamplifikationsreaktion beteiligt. Ein Beispiel für ein Amplifikationsoligomer ist ein „Primer”, der mit einer Targetnukleinsäure hybridisiert und ein 3'-OH-Ende enthält, das durch eine Polymerase in einem Amplifikationsprozess verlängert wird. Ein weiteres Beispiel für ein Amplifikationsoligomer ist ein „Promotor-basiertes Amplifikationsoligomer”, das eine hybridisierende Targetsequenz und eine Promotorsequenz für die Transkriptionsinitiation durch eine entsprechende Polymerase umfasst. Promotor-basierte Amplifikationsoligomere können durch eine Polymerase gegebenenfalls in einer Primer-basierten Extension verlängert werden, je nachdem, ob das 3'-Ende der hybridisierenden Targetsequenz modifiziert wurde, um Primer-basierte Extension zu verhindern (z. B. ein 3'-blockiertes Ende) oder nicht. Ein Promotor-basiertes Amplifikationsoligonukleotid, das einen hybridisierenden Targetbereich umfasst, der nicht modifiziert wurde, um eine Primer-basierte Extension zu verhindern, wird als „Promotor-Primer” bezeichnet. Ein Promotor-basiertes Amplifikationsoligonukleotid, das einen hybridisierenden Targetbereich umfasst, der modifiziert wurde, um eine Primer-basierte Extension zu verhindern, wird als „Promotor-Provider” bezeichnet. Zu den Größenbereichen für Amplifikationsoligonukleotide gehören diejenigen, die hybridisierende Targetbereiche umfassen, die etwa 10 bis etwa 70 nt lang sind – wie beispielsweise etwa 10 bis 60 nt lang, etwa 10 bis etwa 50 nt lang, etwa 10 bis etwa 40 nt lang, etwa 10 bis etwa 30 nt lang oder etwa 10 bis etwa 25 nt lang oder etwa 15 bis 25 nt lang. Zu bevorzugten Größen von Amplifikationsoligomeren gehören diejenigen, die hybridisierende Targetbereiche umfassen, die etwa 18, 19, 20, 21, 22 oder 23 nt lang sind. Ein Amplifikationsoligomer kann wahlweise modifizierte Nukleotide oder Analoga enthalten, die nicht komplementär zu einer Targetnukleinsäure im strengen Sinne A:T/U, G:C sind. Solche modifizierten Nukleotide oder Analoga werden hier als Fehlpaarung mit ihren entsprechenden Targetsequenzen betrachtet.
  • Oligomere, die nicht für Primer-basierte Extension durch eine Nukleinsäurepolymerase vorgesehen sind, können eine Blockierungsgruppe enthalten, die die 3'-OH-Gruppe ersetzt, um die enzymvermittelte Verlängerung des Oligomers in einer Amplifikationsreaktion zu verhindern. Zum Beispiel können blockierte Amplifikationsoligomere und/oder Detektionssonden, die während der Amplifikation vorhanden sind, keine funktionalen 3'-OH aufweisen und stattdessen eine oder mehrere Blockierungsgruppen an oder nahe dem 3'-Ende enthalten. In einigen Ausführungsformen kann die Blockierungsgruppe in der Nähe des 3'-Endes innerhalb von fünf Resten des 3'-Endes sein und ist groß genug, um die Bindung der Polymerase an das Oligomer einzuschränken. In anderen Ausführungsformen ist eine Blockierungsgruppe kovalent an dem 3'-Ende angebracht. Viele verschiedene chemische Gruppen können eingesetzt werden, um das 3'-Ende zu blockieren, beispielsweise Alkylgruppen, Nicht-Nukleotid-Linker, Alkandioldidesoxynukleotid-Reste und Cordycepin.
  • Promotor. Dies bezeichnet eine konkrete Nukleinsäuresequenz, die von einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase („Transkriptase”) als elf Signal erkannt wird, die Nukleinsäure zu binden und die Transkription von RNA an einer konkreten Stelle zu beginnen.
  • Promotor-Provider. Wie hier eingesetzt bezeichnet ein „Promotor-Provider” oder „Provider” ein Oligonukleotid bestehend aus ersten und zweiten Bereichen, und das modifiziert wurde, um die Einleitung der DNA-Synthese von seinem 3'-Terminus zu verhindern. Der „erste Bereich” eines Promotor-Provider-Oligonukleotids umfasst eine Basensequenz, die mit einem DNA-Templat hybridisiert, wobei die hybridisierende Sequenz 3' liegt, aber nicht notwendigerweise angrenzend an einen Promotorbereich. Der mit dem Target hybridisierende Teil eines Promotoroligonukleotids weist typischerweise eine Länge von mindestens 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40 oder 45 Nukleotiden auf und kann bis zu 50 oder mehr Nukleotide lang sein. Der „zweite Bereich” umfasst eine Promotorsequenz für eine RNA-Polymerase. Ein Promotor-Provider-Oligonukleotid ist so gestaltet, dass es nicht befähigt ist, von einer RNA- oder DNA-abhängigen DNA-Polymerase (z. B. reverse Transkriptase) verlängert werden zu können, vorzugsweise durch das Vorhandensein einer Blockierungseinheit an seinem 3'-Ende, wie oben beschrieben. Diese Modifikation unterscheidet Promotor-Provider von Promotor-Primern. Vorzugsweise ist der Promotorteil eines Promotor-Primers oder Providers ein Promotor für eine DNA-abhängige RNA-Polymerase aus E. coli und Bakteriophagen T7, T3 und SP6, wenngleich andere Promotoren oder modifizierte Version davon auch eingesetzt werden können.
  • Abbruchsoligonukleotid. Wie hier verwendet ist ein „Abbruchsoligonukleotid” oder „Blockeroligonukleotid” eine Oligonukleotidsequenz, die eine Basensequenz enthält, die zu einem Bereich der Targetnukleinsäure in der Nähe des 5'-Endes der Targetnukleinsäure komplementär ist, um so die Primerextension einer naszierenden Nukleinsäure, die ein als Primer dienendes Oligonukleotid enthält, „abzubrechen”, wodurch ein definiertes 3'-Ende des neu entstehenden Nukleinsäurestranges erhalten wird.
  • Amplifikation. Dies bezieht sich auf alle bekannten Vorschriften zum Erzeugen von mehreren Kopien einer Targetnukleinsäuresequenz oder von Fragmenten davon. Die mehrfachen Kopien können als Amplikone oder Amplifikationsprodukte bezeichnet werden. Die Amplifikation von „Fragmenten” bezieht sich auf die Herstellung einer amplifizierten Nukleinsäure, die weniger als die komplette Targetnukleinsäure oder ihr Komplement enthält, z. B. hergestellt unter Verwendung eines Amplifikationsoligonukleotids, das mit einer internen Stelle der Targetnukleinsäure hybridisiert und von dort aus eine Polymerisation initiiert. Bekannte Amplifikationsverfahren umfassen sowohl thermische als auch isotherme Amplifikationsverfahren. Für einige Ausführungsformen sind isotherme Amplifikationsverfahren bevorzugt. Replikasevermittelte Amplifikation, Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR), Strangverschiebungsamplifikation (SDA) und transkriptionsvermittelte oder transkriptionsassoziierte Amplifikation sind nicht einschränkende Beispiele für Nukleinsäureamplifikationsverfahren. Replikasevermittelte Amplifikation verwendet selbstreplizierende RNA-Moleküle und eine Replikase, wie beispielsweise QB-Replikase (z. B. US-Patent Nr. US 4 786 600 A ). PCR-Amplifikation verwendet DNA-Polymerase, Primerpaare und Temperaturzyklen, um mehrere Kopien von zwei komplementären Stränge von dsDNA oder von einer cDNA zu synthetisieren (z. B. US-Patente Nrn. US 4 683 195 A , US 4 683 202 A und US 4 800 159 A ). LCR-Amplifikation verwendet vier oder mehr verschiedene Oligonukleotide, um ein Target und seinen komplementären Strang unter Verwendung mehrerer Zyklen der Hybridisierung, Ligation und Denaturierung zu amplifizieren (z. B. US-Patente Nrn. US 5 427 930 A und US 5 516 663 A ). SDA verwendet einen Primer, der eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuklease enthält und eine Endonuklease, die einen Strang einer halbmodifizierten DNA-Duplex schneidet („nicked”), der die Targetsequenz enthält, wobei Amplifikation in einer Reihe von Primerextensions- und Strangverschiebungsschritten erfolgt (z. B. US-Patente Nrn. US 5 422 252 A , US 5 547 861 A und US 5 648 211 A ).
  • Transkriptionsassoziierte Amplifikation. Dieses Verfahren der Amplifikation, hier auch als „transkriptionsvermittelte Amplifikation” (TMA) bezeichnet, bezeichnet eine Nukleinsäureamplifikation, bei der RNA-Polymerase eingesetzt wird, um mehrere RNA-Transkripte von einem Nukleinsäuretemplat herzustellen. Diese Verfahren nutzen in der Regel eine RNA-Polymerase, eine DNA-Polymerase, Desoxyribonukleosidtriphosphate, Ribonukleosidtriphosphate und ein templatkomplementäres Oligonukleotid, das eine Promotorsequenz enthält und wahlweise ein oder mehrere andere Oligonukleotide enthalten kann. TMA-Verfahren sind Ausführungsformen von Amplifikationsverfahren, die zum Amplifizieren und Detektieren von Adenovirus-Targetsequenzen wie hier beschrieben eingesetzt werden. Variationen von transkriptionsassoziierter Amplifikation sind im Stand der Technik wohl bekannt, wie bereits im Detail offenbart wurde (z. B. US-Patente Nrn. US 4 868 105 A , US 5 124 246 A , US 5 130 238 A , US 5 399 491 A , US 5 437 990 A , US 5 554 516 A , und US 7 374 885 B2 und PCT Pub.-Nrn. WO 88/01302 A1 , WO 88/10315 A1 und WO 95/03430 A1 ). Dem Fachrnann auf dem Gebiet ist offensichtlich, dass die offenbarten Zusammensetzungen, die in Amplifikationsverfahren, die auf Extension von Oligomersequenzen durch eine Polymerase basieren, eingesetzt werden können.
  • Echtzeitamplifikation. Wie hier verwendet bezeichnet der Begriff „Echtzeitamplifikation” die Amplifikation von Targetnukleinsäure, die mit Echtzeitdetektionsmitteln verfolgt wird.
  • Amplikon. Dieser Begriff, der synonym mit „Amplifikationsprodukt” verwendet wird, bezieht sich auf das Nukleinsäuremolekül, das im Rahmen einer Amplifikationsvorschrift erzeugt wird, das komplementär oder homolog zu einer Sequenz ist, die innerhalb der Targetsequenz enthalten ist. Diese Begriffe können in Bezug auf ein einzelsträngiges Amplifikationsprodukt, ein doppelsträngiges Amplifikationsprodukt oder einen der Stränge eines doppelsträngigen Amplifikationsprodukts eingesetzt werden.
  • Sonde. Eine Sonde, auch als „Detektionssonde” oder „Detektionsoligonukleotid” bekannt, umfasst Begriffe, die sich auf ein Nukleinsäureoligomer beziehen, das spezifisch mit einer Targetsequenz in einer Nukleinsäure oder in einer amplifizierten Nukleinsäure hybridisiert und zwar unter Bedingungen, die die Hybridisierung fördern, um die Detektion der Targetsequenz oder der amplifizierten Nukleinsäure zu ermöglichen. Detektion kann entweder direkt erfolgen (z. B. eine Sonde, die direkt mit ihrer Targetsequenz hybridisiert ist) oder indirekt (z. B. eine Sonde, die mit ihrem Target über eine molekulare Zwischenstruktur verknüpft ist). Sonden können DNA, RNA, Analoga davon oder Kombinationen davon sein, und sie können markiert oder nicht markiert sein. Die „Targetsequenz” einer Sonde bezeichnet in der Regel eine kleinere Nukleinsäuresequenz in einer größeren Nukleinsäuresequenz, die spezifisch mit zumindest einem Teil eines Sondenoligomers durch normale Basenpaarung hybridisiert. Eine Sonde kann zielspezifische Sequenzen und andere Sequenzen, die zur dreidimensionalen Konformation der Sonde beitragen, enthalten (z. B. US-Patente Nrn. US 5 118 801 A , US 5 312 728 A , US 6 849 412 B2 , US 6 835 542 B2 , US 6 534 274 B2 und US 6 361 945 B1 und US-Pub. Nr. US 2006/0068417 A1 ). In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Detektionssonde ein 2'-Methoxy-Rückgrat, was bewirken kann, dass ein größeres Signal erhalten wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Sonde ein Fluorophor, das kovalent am 5'-Ende der Sonde angebracht ist, sowie einen Quencher am 3'-Ende. Solche Sonden sind als TaqMan-Sonden bekannt.
  • Stabil. Mit „stabil” oder „stabil für die Detektion” ist gemeint, dass die Temperatur einer Reaktionsmischung mindestens 2 Grad C unterhalb der Schmelztemperatur einer Nukleinsäureduplex liegt.
  • Markierung. Wie hier verwendet bezeichnet eine „Markierung” eine Einheit oder Verbindung, die direkt oder indirekt mit einer Sonde verbunden ist, die detektiert wird oder die zu einem detektierbaren Signal führt. Direktes Markieren kann durch Bindungen oder Wechselwirkungen erfolgen, die die Markierung mit der Sonde verknüpfen, einschließlich kovalenten Bindungen oder nicht-kovalenten Wechselwirkungen, beispielsweise Wasserstoffbrücken, hydrophobe und ionische Wechselwirkungen oder die Bildung von Chelat- oder Koordinationskomplexen. Indirekte Markierung kann durch den Einsatz einer verbrückenden Einheit oder eines „Linkers” erfolgen, wie beispielsweise eines Bindungspaarglieds, eines Antikörpers oder eines zusätzlichen Oligomers, das bzw. der entweder direkt oder indirekt markiert ist, und das bzw. der möglicherweise das detektierbare Signal verstärkt. Markierungen umfassen jede detektierbare Einheit, wie beispielsweise ein Radionuklid, einen Liganden (z. B. Biotin, Avidin), ein Enzym oder ein Enzymsubstrat, eine reaktive Gruppe oder ein Chromophor (z. B. einen Farbstoff, ein Teilchen, ein Kügelchen, der bzw. das detektierbare Farbe verleiht), eine lumineszierende Verbindung (z. B. biolumineszierende, phosphoreszierende oder chemilumineszierende Markierungen) oder ein Fluorophor. Markierungen können in einem homogenen Assay detektierbar sein, wobei eine gebundene markierte Sonde in einem Gemisch eine detektierbare Veränderung aufweist, die sich von der einer ungebundenen markierten Sonde unterscheidet, wie beispielsweise Instabilität oder differentielle Zersetzungseigenschaften. Eine „homogen detektierbare Markierung” ist ohne physisches Entfernen von gebundenen von ungebundenen Formen der Markierung detektierbar (z. B. US-Patente Nrn. US 5 283 174 A , US 5 656 207 A und US 5 658 737 A ). Markierungen umfassen chemilumineszierende Verbindungen, wie beispielsweise Acridiniumester(„AE”)-Verbindungen die normales AE und Derivate beinhalten (z. B. US-Patente Nrn. US 5 656 207 A, US 5 658 737 A und US 5 639 604 A ). Die Synthese und Verfahren zum Anbringen der Markierungen an Nukleinsäuren sind wohl bekannt (z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Kapitel 10, US-Patente Nrn. US 5 658 737 A, US 5 656 207 A, US 5 547 842 A , US 5 283 174 A und US 4 581 333 A ). Auf einer konkreten Sonde können mehr als eine Markierung und mehr als eine Art von Markierung vorhanden sein, wobei die Detektion eine Mischung von Sonden verwenden kann, in der jede Sonde mit einer Verbindung markiert ist, die ein anders detektierbares Signal erzeugt (z. B. US-Patente Nrn. US 6 180 340 B1 und US 6 350 579 B1 ).
  • Molekulare Fackeln. Wie hier verwendet sind Strukturen, die als „molekulare Fackeln” bezeichnet werden, konzipiert, bestimmte Bereiche von Selbstkomplementarität aufzuweisen („die Schließdomäne”), die von einem Verbindungsbereich („die das Target bindende Domäne”) verbunden werden und die unter vorgegebenen Hybridisierungsassaybedingungen miteinander hybridisieren. Alle oder ein Teil der Nukleotidsequenzen, die das Target schließende Domänen umfassen, können auch als das Target bindende Domänen fungieren. Somit können die das Target schließenden Sequenzen das Target bindende Sequenzen, das Target nicht bindende Sequenzen und Kombinationen davon umfassen.
  • Fängeroligonukleotid. Wie hier verwendet bezeichnet ein „Fängeroligonukleotid”, „Targetfänger-oligonukleotid” oder „Fängersonde” ein Nukleinsäureoligomer, das spezifisch mit einer Targetsequenz in einer Targetnukleinsäure durch normale Basenpaarung hybridisiert, und sich mit einem Bindungspartner auf einer immobilisierten Sonde verbindet, um die Targetnukleinsäure an einem Träger zu fangen. Ein Beispiel für ein Fängeroligomer umfasst ein Oligonukleotid mit zwei bindenden Bereichen: einem mit der das Target hybridisierenden Sequenz und einem mit dem die immobilisierte Sonde bindenden Bereich. In einer Variation dieses Beispiel können die beiden Bereiche auf zwei verschiedenen Oligomeren, die durch einen oder mehrere Linker verbunden sind, vorhanden sein. In einer weiteren Ausführungsform eines Fängeroligomers ist die das Target hybridisierende Sequenz eine Sequenz, die zufällige oder nicht zufällige Poly-GU, Poly-GT oder Poly U-Sequenzen enthält, um unspezifisch an eine Targetnukleinsäure zu binden und diese mit einer immobilisierten Sonde auf einem Träger zu verknüpfen. (PCT Pub.-Nr. WO 2008/016988 A1 ). Der die immobilisierte Sonde bindende Bereich kann eine Nukleinsäuresequenz sein, die als Schwanz bezeichnet wird. Schwänze umfassen einen im Wesentlichen homopolymeren Schwanz von etwa 10 bis 40 Nukleotiden (z. B. A10 bis A40) oder von etwa 14 bis 33 nt (z. B. T3A14 bis T3A30), der an eine komplementäre immobilisierte Sequenz bindet, die an dem Trägerteilchen oder an der Trägermatrix angebracht ist. Somit kann ein nicht einschränkendes Beispiel von bevorzugten Nukleinsäureschwänzen in einigen Ausführungsformen T0-4A10-36-Sequenzen umfassen. Ein weiteres Beispiel für ein Fängeroligomer enthält zwei Bereiche, eine mit dem Target hybridisierende Sequenz und ein Bindungspaarteil, das keine Nukleinsäuresequenz ist.
  • Immobilisiertes Oligonukleotid. Wie hier verwendet bezeichnet ein „immobilisiertes Oligonukleotid”, eine „immobilisierte Sonde” oder eine „immobilisierte Nukleinsäure” einen Nukleinsäurebindungspartner, der ein Fängeroligomer direkt oder indirekt mit einem Träger verbindet. Eine immobilisierte Sonde, die mit einem Träger verbunden ist, erleichtert die Trennung eines an die Fängersonde gebundenen Targets von ungebundenem Material in einer Probe. Eine Ausführungsform einer immobilisierten Sonde ist ein Oligomer, des mit einem Träger verbunden, das die Trennung von gebundener Targetsequenz von ungebundenem Material in einer Probe erleichtert. Träger können bekannte Materialien umfassen, wie beispielsweise Matrizen und Teilchen, die frei in Lösung sind, die aus Nitrocellulose, Nylon, Glas, Polyacrylat, Mischpolymerisaten, Polystyrol, Silan, Polypropylen, Metall oder anderen Zusammensetzungen hergestellt sein können, von denen eine Ausführungsform magnetisch anziehbare Teilchen umfasst. Träger können monodisperse magnetische Kugeln sein (z. B. einheitliche Größe von ±5%), mit denen eine immobilisierte Sonde direkt (über kovalente Verknüpfung, Chelatisierung oder ionische Wechselwirkung) oder indirekt (über einen oder mehrere Linker) verbunden ist, wobei die Verknüpfung oder Wechselwirkung zwischen der Sonde und dem Träger unter den Hybridisierungsbedingungen stabil ist.
  • Komplementär. Unter „komplementär” wird verstanden, dass die Nukleotidsequenzen von ähnlichen Bereichen von zwei einzelsträngigen Nukleinsäuren oder an unterschiedlichen Bereichen derselben einzelsträngigen Nukleinsäure eine Nukleotidbasenkomposition aufweisen, die es den einzelsträngigen Bereichen ermöglicht, unter stringenten Hybridisierungs- oder Amplifikationsbedingungen in einem stabilen, doppelsträngigen, über Wasserstoffbrücken gebundenen Bereich zu hybridisieren. Sequenzen, die miteinander hybridisieren, können gemäß normaler Nukleinsäurebasenpaarung (z. B. G:C-, A:T- oder A:U-Paarung) vollständig komplementär oder teilweise komplementär zu der Targetsequenz sein. Unter „ausreichend komplementär” wird eine zusammenhängende Sequenz verstanden, die in der Lage ist, mit einer anderen Sequenz über Wasserstoffbrücken zwischen einer Reihe von komplementären Basen zu hybridisieren, die an jeder Position in der Sequenz gemäß normaler Basenpaarung komplementär sein können oder die einen oder mehrere Reste enthalten können, der bzw. die gemäß normaler A:T- und G:G-Paarung nicht komplementär sind, oder die modifizierte Nukleotide, wie beispielsweise abasische Reste, modifizierte Nukleotide oder Nukleotidanaloga, sind. In der Regel sind ausreichend komplementäre zusammenhängende Sequenzen mindestens 80% oder mindestens 90% zu einer Sequenz komplementär, mit der ein Oligomer spezifisch hybridisieren soll (ein in Prozent angegebener Komplementaritätsbereich umfasst alle ganzen und rationalen Zahlen des Bereichs). Sequenzen, die „ausreichend komplementär” sind ermöglichen stabile Hybridisierung eines Nukleinsäureoligomers mit seiner Targetsequenz unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen, auch wenn die Sequenzen nicht vollständig komplementär sind. Wenn eine zusammenhängende Sequenz von Nukleotiden eines einzelsträngigen Bereichs in der Lage ist, eine Reihe von „kanonischen” über Wasserstoffbrücken gebundene Basenpaare mit einer analogen Sequenz von Nukleotiden des anderen einzelsträngigen Bereichs zu bilden, so dass A mit U oder T gepaart ist oder C mit G gepaart ist, sind die Nukleotidsequenzen „vollständig” komplementär.
  • Bevorzugt hybridisieren. Unter „bevorzugt hybridisieren” wird verstanden, dass unter stringenten Hybridisierungsassaybedingungen ein Oligonukleotid mit seiner Targetsequenz oder Replikaten davon unter Bildung eines stabilen Oligonukleotid:Targetsequenz-Hybrids hybridisiert, während gleichzeitig die Bildung eines stabilen Oligonukleotid:Targetsequenz-Hybrids minimiert wird. Beispielsweise hybridisiert ein Sondenoligonukleotid bevorzugt mit einer Targetsequenz oder Replikat davon in einem ausreichend größeren Ausmaß als mit einer Nicht-Targetsequenz, um einem Fachmann zu ermöglichen, die RNA-Replikate oder die komplementäre DNA (cDNA) der Targetsequenz, die während der Amplifikation gebildet werden, genau zu detektieren. Geeignete Hybridisierungsbedingungen sind im Stand der Technik für Sonden-, Amplifikations-, Targetfänger-, Blockierungs- und andere Oligonukleotide wohl bekannt, können aufgrund der Sequenzkomposition vorhergesagt werden oder können durch routinemäßige Testverfahren bestimmt werden (z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) in §§ 1.90–1.91, 7.37–7.57, 9.47–9.51 und 11.47–11.57, insbesondere §§ 9.50–9.51, 11.12–11.13, 11.45–11.47 und 11.55–11.57).
  • Nukleinsäurehybrid. Unter „Nukleinsäurehybrid” oder „Hybrid” oder „Duplex” wird eine Nukleinsäure verstanden, die einen doppelsträngigen, über Wasserstoffbrücken gebunden Bereich enthält, wobei jeder Strang zu dem anderen komplementär ist, und wobei der Bereich unter stringenten Hybridisierungsbedingungen stabil ist, um durch Mittel detektiert zu werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Detektion mit chemilumineszierendem oder fluoreszierendem Licht, Autoradiographie oder Gelelektrophorese. Solche Hybride können RNA:RNA-, RNA:DNA- oder DNA:DNA-Duplexmoleküle umfassen.
  • Probenvorbereitung. Dies bezieht sich auf Schritte oder Verfahren, in denen oder womit eine Probe für spätere Amplifikation und/oder Detektion von Adenovirus-Nukleinsäuren, die in der Probe vorhanden sind, behandelt wird. Die Targetnukleinsäure kann eine Minderheitskomponente in der Probe sein. Die Probenvorbereitung kann jedes bekannte Verfahren zum Isolieren und Konzentrieren von Bestandteilen, wie beispielsweise Viren oder Nukleinsäuren, unter Verwendung von normalen Verfahren der Molekularbiologie beinhalten.
  • Die Probenvorbereitung kann physisches Spalten und/oder chemische Lyse von zellulären Bestandteilen zur Freisetzung intrazellulärer Bestandteile in eine im Wesentlichen wässrige oder organische Phase und Entfernung von Trümmermaterialien, wie beispielsweise unter Verwendung von Filtration, Zentrifugation oder Adsorption beinhalten. Die Probenvorbereitung kann die Verwendung eines Nukleinsäureoligonukleotids, das selektiv oder unspezifisch eine Targetnukleinsäure fängt und sie von anderen Bestandteilen der Probe trennt, beinhalten (z. B. wie in US-Patent Nr. US 6 110 678 A und PCT Pub.-Nr. WO 2008/016988 A1 beschrieben).
  • Trennen, Reinigen. Diese Begriffe bedeuten, dass eine oder mehrere Bestandteile einer Probe von anderen Bestandteilen der Probe entfernt oder getrennt werden. Beispielbestandteile umfassen Targetnukleinsäuren, normalerweise in einer in der Regel wässrigen Phase, und können auch Zellfragmente, Proteine, Kohlenhydrate, Lipide und andere Nukleinsäuren beinhalten. Trennen oder Reinigen entfernt mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 95% der Targetnukleinsäure von anderen Bestandteilen der Probe. Bereiche der in Prozent angegebenen Reinheit enthalten alle ganzen und rationalen Zahlen des Bereichs.
  • DNA-abhängige DNA-Polymerase. Wie hier verwendet ist eine „DNA-abhängige DNA-Polymerase” ein Enzym, das eine komplementäre DNA-Kopie von einem DNA-Templat synthetisiert. Beispiele dafür sind DNA-Polymerase I aus E. coli, Bakteriophage T7 DNA-Polymerase oder DNA-Polymerase aus Bakteriophagen T4, Phi-29, M2 oder T5. DNA-abhängige DNA-Polymerasen können die natürlich vorkommenden Enzyme, die aus Bakterien oder Bakteriophagen isoliert werden, oder die rekombinant exprimiert werden, sein oder können modifizierte oder „entwickelte” Formen sein, die gestaltet wurden, um bestimmte wünschenswerte Eigenschaften aufzuweisen, wie beispielsweise Thermostabilität oder die Fähigkeit, einen DNA-Strang aus verschiedenen modifizierten Templaten zu erkennen oder zu synthetisieren. Alle bekannten DNA-abhängigen DNA-Polymerasen erfordern einen komplementären Primer, um die Synthese einzuleiten. Es ist bekannt, dass unter geeigneten Bedingungen eine DNA-abhängige DNA-Polymerase eine komplementäre DNA-Kopie aus einem RNA-Templat synthetisieren kann. RNA-abhängige DNA-Polymerasen besitzen typischerweise auch DNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität.
  • DNA-abhängige RNA-Polymerase. Wie hier verwendet ist eine „DNA-abhängige RNA-Polymerase” oder „Transkriptase” ein Enzym, das mehrere RNA-Kopien von einem doppelsträngigen oder teilweise doppelsträngigen DNA-Molekül mit einer Promotorsequenz, die in der Regel doppelsträngig ist, synthetisiert. Die RNA-Moleküle („Transkripte”) werden in der 5'-nach-3'-Richtung beginnend an einer bestimmten Position, die dem Promotor nachgelagert ist, synthetisiert. Beispiele von Transkriptasen sind die DNA-abhängige RNA-Polymerase aus E. coli und Bakteriophagen T7, T3 und SP6.
  • RNA-abhängige DNA-Polymerase. Wie hier verwendet ist eine „RNA-abhängige DNA-Polymerase” oder „reverse Transkriptase” („RT”) ein Enzym, das eine komplementäre DNA-Kopie von einem RNA-Templat synthetisiert. Alle bekannten reversen Transkriptasen haben auch die Fähigkeit eine komplementäre eine DNA-Kopie von einem DNA-Templat zu machen, somit sind sie sowohl RNA- als auch DNA-abhängige DNA-Polymerasen. RT können auch eine RNAse H Aktivität besitzen. Zum Einleiten der Synthese ist sowohl für RNA- als auch DNA-Template ein Primer erforderlich.
  • Selektive RNAse. Wie hier verwendet ist eine „selektive RNAse” ein Enzym, das den RNA-Bereich einer RNA:DNA-Duplex, aber nicht einer einzelsträngigen RNA, doppelsträngigen RNA oder DNA abbaut. Eine beispielhafte selektive RNAse ist RNAse H. Enzyme, die die gleiche oder ähnliche Aktivität wie RNAse H besitzen, können ebenfalls eingesetzt werden. Selektive RNAsen können Endonukleasen oder Exonukleasen sein. Die meisten reverse-Transkriptase-Enzyme enthalten eine RNAse H-Aktivität zusätzlich zu ihren Polymeraseaktivitäten. Andere Quellen der RNAse H ohne verbundene Polymeraseaktivität stehen zur Verfügung. Der Abbau kann zur Trennung von RNA aus einem RNA:DNA-Komplex führen. Alternativ kann eine selektive RNAse einfach die RNA an verschiedenen Stellen schneiden, so dass diese Teile der RNA wegschmelzen oder es Enzymen ermöglichen, Teile der RNA abzuwickeln. Andere Enzyme, die selektiv RNA-Targetsequenzen oder erfindungsgemäße RNA-Produkte abbauen, sind einem Fachmann ohne Weiteres offensichtlich.
  • Spezifität. Der Begriff „Spezifität” im Rahmen eines Amplifikationssystems wird hier verwendet, um die Charakteristik eines Amplifikationssystems zu bezeichnen, die dessen Fähigkeit, zwischen Target- und Nicht-Targetsequenzen abhängig von Sequenz und Assaybedingungen zu unterscheiden, beschreibt. In Bezug auf die Nukleinsäureamplifikation bezieht sich Spezifität auf das Verhältnis der Anzahl der konkreten Amplikone, die erzeugt wurden, zur Anzahl der Nebenprodukte (z. B. das Signal-Rausch-Verhältnis).
  • Empfindlichkeit. Der Begriff „Empfindlichkeit” wird hier verwendet, um die Genauigkeit, mit der eine Nukleinsäureamplifikationsreaktion detektiert oder quantifiziert werden kann, zu bezeichnen. Die Empfindlichkeit einer Amplifikationsreaktion ist in der Regel ein Maß für die kleinste Kopienanzahl der Targetnukleinsäure, die zuverlässig in dem Amplifikationssystem detektiert werden kann, und hängt beispielsweise davon ab, welcher Detektionsassay verwendet wird, sowie von der Spezifität der Amplifikationsreaktion, beispielsweise das Verhältnis der konkreten Amplikone zu Nebenprodukten.
  • Relative Fluoreszenzeinheit. Wie hier eingesetzt ist der Begriff „relative Fluoreszenzeinheit” („RFE”) eine willkürliche Maßeinheit der Fluoreszenzintensität. RFE variiert mit den Eigenschaften des für die Messung verwendeten Detektionsmittels.
  • Oligonukleotide für die Amplifikation von Adenovirus
  • Oligonukleotide zum Amplifizieren eines Adenovirus-Targets umfassen typischerweise mindestens zwei Amplifikationsoligomere. Einige Ausführungsformen der Erfindung nutzen möglicherweise drei, vier, fünf oder sechs oder zehn oder noch mehr Amplifikationsoligomere in beispielsweise Multiplex-Amplifikations-Assays. Somit können beispielsweise Oligonukleotide zur Amplifikation des Adenovirus-Targets einen, zwei, drei, vier oder fünf oder mehr Vorwärtsprimer für die Amplifikation umfassen und ein, zwei, drei, vier oder fünf oder mehr Rückwärtsprimer für die Amplifikation umfassen. In einer Ausführungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, dass es spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisiert, der den Nukleotiden 1 bis 99 der SEQ ID Nr. 47 entspricht. In einer weiteren Ausführungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, dass es spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisiert, der den Nukleotiden 83 bis 175 der SEQ ID Nr. 47 entspricht. In einer Ausführungsform werden mindestens zwei Amplifikationsoligomere eingesetzt, wobei jedes der mindestens Amplifikationsoligomere eine Länge von 10 bis etwa 50 Nukleotiden aufweist und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils gestaltet sind, spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus zu hybridisieren, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden von 1 bis 99 der SEQ ID Nr. 47 und aus den Nukleotiden 83 bis 175 der SEQ ID Nr. 47, um ein Amplikon zu erzeugen, das anschließend detektiert werden kann. Zweckmäßigerweise ist das Amplikon mit einer Detektionssonde detektierbar.
  • Zweckmäßigerweise weist das Amplikon mindestens eine Länge von 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70 oder 80 Nukleotiden auf.
  • In einer Ausführungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, dass es spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisiert, der den Nukleotiden 52 bis 99 und/oder 40 bis 87 und/oder 1 bis 23 und/oder 7 bis 23 und/oder 7 bis 45 der SEQ ID Nr. 47 entspricht. In einer Ausführungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, dass es spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisiert, der den Nukleotiden 139 bis 155 und/oder 103 bis 175 und/oder 83 bis 99 und/oder 83 bis 98 der SEQ ID Nr. 47 entspricht. In einer weiteren Ausführungsform werden mindestens zwei Amplifikationsoligomere eingesetzt, wobei jedes der mindestens Amplifikationsoligomere eine Länge von 10 bis etwa 50 Nukleotiden aufweist und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils gestaltet sind, dass sie spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisieren, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 52 bis 99 und/oder 40 bis 87 und/oder 1 bis 23 und/oder 7 bis 23 und/oder 7 bis 45 der SEQ ID Nr. 47 und aus den Nukleotiden 139 bis 155 und/oder 103 bis 175 und/oder 83 bis 99 und/oder 83 bis 98 der SEQ ID Nr. 47, um ein Amplikon zu erzeugen, das anschließend detektiert werden kann.
  • In einer Ausführungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, dass es spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisiert, der den Nukleotiden 52 bis 74 und/oder 76 bis 99 und/oder 40 bis 56 und/oder 65 bis 87 und/oder 1 bis 18 und/oder von 7 bis 23 und/oder 28 bis 45 und/oder 27 bis 45 und/oder 26 bis 45 der SEQ ID Nr. 47 entspricht. In einer Ausführungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, dass es spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisiert, der den Nukleotiden 139 bis 155 und/oder 103 bis 123 und/oder 159 bis 175 und/oder 83 bis 99 und/oder 83 bis 98 der SEQ ID Nr. 47 entspricht. In einer weiteren Ausführungsform werden mindestens zwei Amplifikationsoligomere eingesetzt, wobei jedes der mindestens Amplifikationsoligomere eine Länge von 10 bis etwa 50 Nukleotiden aufweist und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils gestaltet sind, dass sie spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisieren, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 52 bis 74 und/oder 76 bis 99 und/oder 40 bis 56 und/oder 65 bis 87 und/oder 1 bis 18 und/oder von 7 bis 23 und/oder 28 bis 45 und/oder 27 bis 45 und/oder 26 bis 45 der SEQ ID Nr. 47 und aus den Nukleotiden 139 bis 155 und/oder 103 bis 123 und/oder 159 bis 175 und/oder 83 bis 99 und/oder 83 bis 98 der SEQ ID Nr. 47, um ein Amplikon zu erzeugen, das anschließend detektiert werden kann.
  • Oligonukleotide zum Amplifizieren und/oder Detektieren des Adenovirus-Targets umfassen Oligonukleotidsequenzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 1 bis 46. Wenngleich diese Sequenzen als DNA-Sequenzen dargestellt werden, umfassen die Sequenzen ihre entsprechenden RNA-Sequenzen und ihre komplementären (z. B. vollständig komplementären) DNA- oder RNA-Sequenzen einschließlich des reversen Komplements davon.
  • Targetfängeroligomere können eine targetspezifische Sequenz, die spezifisch die Adenvirus-Targetnukleinsäure bindet, und eine kovalent verknüpfte „Schwanz”-Sequenz (z. B. T0-4A10-36), die verwendet wird, um den Hybridisierungskomplex, der die Targetnukleinsäure enthält, an einer immobilisierten Sequenz auf einem festen Träger zu fangen, enthalten. Fängeroligomere können mindestens eine 2'-Methoxy-Verknüpfung enthalten. Fängeroligomere können die targetspezifische Sequenz enthalten, die Adenovirus-Nukleinsäure bindet, die an einer anderen bindenden Einheit angebracht ist, beispielsweise eine biotinylierte Sequenz, die spezifisch an immobilisiertes Avidin oder Streptavidin bindet. Die Schwanzsequenz oder Bindungseinheit bindet an eine immobilisierte Sonde (z. B. komplementäre Sequenz oder Avidin), um das hybridisierte Target zu fangen und von anderen Bestandteilen der Probe durch Abtrennen des festen Trägers von dem Gemisch abzutrennen.
  • Primersequenzen, einschließlich Promotor-Primersequenzen, binden spezifisch an die Targetnukleinsäure oder an ihre komplementäre Sequenz oder können zusätzliche Sequenzen enthalten, die nicht targetspezifisch sind, beispielsweise die Promotorsequenz in einem Promotor-Primer. Eine zielspezifische Sequenz mit oder ohne einer angebrachten Promotorsequenz kann als Amplifikationsoligomer in einer Vielzahl von In-vitro-Amplifikationsprozessen dienen. Ausführungsbeispiele der Adenovirus-Assays können Amplifikationsverfahren einsetzen, die mehrere zyklische Reaktionstemperaturen erfordern, wie beispielsweise PCR (US-Patente Nrn. US 4 683 195 A , US 4 683 202 A und US 4 800 159 A ), oder die im Wesentlichen isotherm sind, wie bei beispielsweise transkriptionsassoziierten Amplifikationsverfahren, wie beispielsweise TMA oder NASBA (z. B. US-Patente Nrn. US 5 399 491 A , US 5 480 784 A , US 5 824 518 A , US 5 888 779 A , US 5 786 183 A , US 5 437 990 A , US 5 130 238 A , US 4 868 105 A , US 5 124 246 A und PCT Nrn. WO 88/01302 A1 und WO 88/10315 A1 ). Die Adenovirus-Assays können Amplifikationssysteme einsetzen, die während des Amplifikationsprozesses detektiert werden (z. B. Echtzeitdetektion), indem Sonden einbezogen werden, die unterscheidbare fluoreszierende Signale aussenden, wenn die Sonde an die vorgesehene Targetsequenz gebunden ist, die während des Amplifikationsprozesses hergestellt wurde. Zu den Sonden für Echtzeitdetektion zählen diejenigen, die als „molekularer Beacon”- oder „molekulare Schalter”-Sonden bezeichnet werden (z. B. US-Patente Nrn. US 5 118 801 A und US 5 312 728 A , Lizardi et al., US-Patente Nrn. US 5 925 517 A und US 6 150 097 A , Tyagi et al., Giesendorf et al., 1998, Clin. Chem. 44(3): 482–6) und „molekulare Fackel”-Sonden (z. B. US-Patente Nrn. US 6 835 542 B2 und US 6 849 412 B2 , Becker et al.). Im Allgemeinen umfassen derartige Sonden einen Reporterfarbstoff, der an einem Ende des Sondenoligomers angebracht ist (z. B. FAMTM, TETTM, JOETM, VICTM) und eine Quencher-Verbindung (z. B. TAMRATM, BHQ1 oder einen nicht-fluoreszierenden Quencher), die am anderen Ende des Sondenoligomers angebracht ist, wobei die Signalerzeugung davon abhängt, ob die beiden Enden mit ihren angebrachten Verbindungen in unmittelbarer Nähe zueinander oder entfernt voneinander vorliegen.
  • Der Assay zum Detektieren von Adenovirus in einer Probe umfasst die Schritte des Amplifizierens eines Targetbereichs in der Adenvirus-Targetnukleinsäure, die in einer Probe enthalten ist, unter Verwendung von Amplifikationsoligomeren oder Primern, die spezifisch für den vorgesehenen Targetbereich sind, und Detektieren der amplifizierten Nukleinsäure, indem diese mit einer Sondensequenz hybridisiert. Bevorzugte Assays verwenden eine PCR- oder transkriptionsassoziierte Amplifikationsreaktion, wobei die Detektion am Ende der Amplifikationsreaktion erfolgt. Zur Detektion kann die amplifizierte Nukleinsäure markiert sein und an eine unmarkierte Sonde gebunden werden, bevorzugte Ausführungsformen allerdings binden eine markierte Sonde an die amplifizierte Nukleinsäure. Für Echtzeitdetektion kann eine markierte Sonde eingesetzt werden, die in einem homogenen System detektiert werden kann.
  • Ausführungsformen von Amplifikationsoligomeren, die spezifisch für Adenovirus-Nukleinsäure sind, beinhalten die Amplifikationsoligomere, die eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 1 bis 9, 11 bis 16, 25 bis 28, 31 bis 35, 38 und 42 bis 46 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfassen, daraus bestehen oder im Wesentlichen daraus bestehen. Gemäß einer Ausführungsform umfasst mindestens ein Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 1, 5, 11, 12, 25, 26, 31, 32, 33, 34, 35 oder 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählten Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus. Gemäß einer Ausführungsform umfasst mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 2, 3, 6, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 42, 43, 44, 45 oder 46 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.
  • Kombinationen von Amplifikationsoligomeren, die spezifisch für Adenovirus-Nukleinsäure sind, sind daher denkbar.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 1 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 3 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 5 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8 und SEQ ID NR: 9 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 11 und/oder SEQ ID NR: 12 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15 und SEQ ID NR: 16 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 und/oder SEQ ID NR: 26 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifkationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und/oder SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt. Gemäß einer Ausführungsform werden mindestens zwei erste Amplifikationsoligomere, die eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 und SEQ ID NR: 26 dargelegte Sequenz umfassen, daraus bestehen oder im Wesentlichen daraus bestehen, in Kombination mit mindestens zwei zweiten Amplifikationsoligomeren, die eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz umfassen, daraus bestehen oder im Wesentlichen daraus bestehen, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplfikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und/oder SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 1 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 5 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 5 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 11 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 12 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 26 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 31 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 32 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 2 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 3 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 6 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 7 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 8 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 9 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 13 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 14 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 15 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 16 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ 10 NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Die Verfahren zum Detektieren von Adenovirus-Nukleinsäure enthalten wahlweise einen Detektionsschritt, in dem mindestens eine Sonde eingesetzt wird, die spezifisch an das amplifizierte Adenovirus-Produkt (RNA- oder DNA-Amplikon, vorzugsweise DNA-Amplikon) bindet. Vorzugsweise ist die Sonde markiert und erzeugt ein Signal, das in einem homogenen System detektiert wird, d. h. ohne Trennung von gebundener Sonde und nicht gebundener Sonde. Andere Beispiele von Sonden können mit einer fluoreszierenden Verbindung markiert sein, die nur dann ein detektierbares Signal emittieren, wenn die Sonde an ihr Target gebunden ist, beispielsweise molekulare Schalter-, Beacon-, Taqman- oder Fackel-Sonden, wie weiterhin beschrieben wird.
  • Sonden umfassen Polynukleotide oder Polynukleotidanaloga und können wahlweise eine detektierbare Markierung tragen, die daran kovalent gebunden ist. Nukleoside oder Nukleosidanaloga der Sonde können stickstoffhaltige heterocyclische Basen oder Basenanaloga, in denen die Nukleoside beispielsweise durch Phosphodiesterbindungen unter Bildung eines Polynukleotids miteinander verknüpft sind, umfassen. Dementsprechend kann eine Sonde herkömmliche Ribonukleinsäure (RNA) und/oder Desoxyribonukleinsäure (DNA) umfassen, sie kann aber auch chemische Analoga dieser Moleküle umfassen. Das „Rückgrat” einer Sonde kann aus einer Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verknüpfungen aufgebaut sein, einschließlich einer oder mehrere Zucker-Phosphodiesterverknüpfungen, Peptid-Nukleinsäure-Bindungen (manchmal auch als „Peptid-Nukleinsäuren” bezeichnet, wie von Hyldig-Nielsen et al. beschrieben, PCT Internationale Pub. Nr. WO 95/32305 A1 ), Phosphorothioatverknüpfungen, Methylphosphonatverknüpfungen oder Kombinationen davon. Zuckerreste der Sonde können entweder Ribose oder Desoxyribose oder ähnliche Verbindungen mit bekannten Substitutionen, wie beispielsweise 2'-O-Methylribose und 2'-Halogensubstitutionen (z. B. 2'-F) sein. Die stickstoffhaltigen Basen können herkömmliche Basen (A, G, C, T, U), bekannte Analoga davon (z. B. Inosin oder „I”, siehe The Biochemistry of the Nucleic Acids 5–36, Adams et al., Hrsg., 11. Auflage, 1992), bekannte Derivate von Purin- oder Pyrimidinbasen (z. B. N4-Methyldeoxyguanasin, Deaza- oder Azapurine und Deaza- oder Azapyrimidine, Pyrimidinbasen mit Substituentengruppen an der 5- oder 6-Position, Purinbasen mit einem geänderten oder Ersatzsubstituenten an den 2-, 6- oder 8-Positionen, 2-Amino-6-methylaminopurin, O6-Methylguanin, 4-Thiopyrimidine, 4-Aminopyrimidine, 4-Dimethylhydrazinpyrimidine und O4-Alkylpyrimidine (siehe Cook, PCT Internationale Pub. Nr. WO 93/13121 A1 ) und „abasische” Reste, an denen das Rückgrat keine stickstoffhaltige Base an einem oder mehreren Resten des Polymers enthält (siehe Arnold et al., US-Patent Nr. US 5 585 481 A ) sein. Eine Sonde kann nur herkömmliche Zucker, Basen und Verknüpfungen, die in RNA und DNA vorkommen, enthalten, oder kann sowohl herkömmliche Bestandteile als auch Substitutionen (z. B. herkömmliche Basen, die über ein Methoxy-Rückgrat verbunden sind, oder eine Nukleinsäure, herkömmliche Basen und ein oder mehrere Basenanaloga enthält) enthalten. Wenngleich Oligonukleotidsonden unterschiedlicher Längen und Hasenkomposition zum Detektieren von Adenovirus-Nukleinsäuren eingesetzt werden können, weisen bevorzugte erfindungsgemäße Sonden Längen von bis zu 100 Nukleotiden auf, und mehr bevorzugt weisen sie Längen bis zu 60 Nukleotiden auf. Bevorzugte Längenbereiche der erfindungsgemäßen Oligonukleotide liegen im Bereich von Längen von 10 bis 100 Basen, mehr bevorzugt sind Längen zwischen 15 und 50 Basen, noch mehr bevorzugt sind Längen zwischen 15 und 40 Basen oder noch mehr bevorzugt sind Längen zwischen 15 und 30 Basen. Allerdings kann die konkrete Sondensequenz, die hier beschrieben wird, auch in einem Nukleinsäureklonierungsvektor oder -transkript oder einer anderen längeren Nukleinsäure bereitgestellt werden und kann dennoch zum Detektieren von Adenovirus-Nukleinsäuren eingesetzt werden.
  • In einer Ausführungsform werden eine oder mehrere Detektionssonden gestaltet, um eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 74 bis 139 der SEQ ID NR: 47 und/oder den Nukleotiden 56 bis 103 der SEQ ID NR: 47 und/oder den Nukleotiden 18 bis 83 der SEQ ID NR: 47 und/oder den Nukleotiden 23 bis 83 der SEQ ID NR: 47 und/oder den Nukleotiden 23 bis 83 der SEQ ID NR: 47 und/oder den Nukleotiden 23 bis 83 der SEQ ID NR: 47 und/oder den Nukleotiden 52 bis 99 der SEQ ID NR: 47 entspricht, zu detektieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden eine oder mehrere Detektionssonden gestaltet, um auf eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 76 bis 99 und/oder den Nukleotiden 65 bis 87 und/oder den Nukleotiden 53 bis 76 und/oder den Nukleotiden 53 und/oder 74 oder Nukleotiden 53 und/oder 72 oder den Nukleotiden 52 bis 71 entspricht, abzuzielen.
  • Sonden für die spezifische Detektion von Adenovirus-Sequenzen umfassen Oligomere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon.
  • Wenngleich auch diese Sequenzen als DNA-Sequenzen gezeigt werden, umfassen die Sequenzen auch ihre entsprechenden RNA-Sequenzen und ihre komplementären (z. B. vollständig komplementären) DNA- oder RNA-Sequenzen einschließlich der reversen Komplemente davon.
  • Assays für die Detektion von Adenovirus-Nukleinsäure können in den gleichen Reaktionsmischungen, die zur Amplifikation und Detektion der Adenovirus-Nukleinsäure eingesetzt werden, eine Nukleinsäure als interne Kontrolle (IC) enthalten, die durch Verwendung von IC-spezifischen Primern und Sonden amplifiziert und detektiert wird. Amplifikation und Detektion der IC-spezifischen Sequenz dient zum Nachweis, dass die Assay-Reagenzien und -Bedingungen in Ordnung waren, selbst wenn kein Adenovirus-spezifisches Signal für eine untersuchte Probe detektiert wird (d. h. negative Proben). Die IC kann als interner Kalibrator für den Assay, der ein quantitatives Ergebnis liefert, eingesetzt werden. Die IC kann eine randomisierte Sequenz sein, die aus einer natürlich vorkommenden Quelle, die nicht Adenovirus ist, gewonnen wird.
  • Kombinationen und Zusammensetzungen von Oligonukleotiden für die Amplifikation und die Detektion von Adenovirus
  • Es werden auch Kombinationen von Oligomeren und Sonden, die für die Amplifikation und die Detektion von Adenovirus eingesetzt werden können, offenbart.
  • Oligonukleotide zum Amplifizieren und Detektieren des Adenovirus-Targets umfassen in der Regel mindestens zwei Amplifikationsoligomere und mindestens eine Sonde. Einige erfindungsgemäße Ausführungsformen können drei, vier, fünf oder sechs oder mehr Amplifikationsoligomere und zwei, drei, vier, fünf oder sechs oder mehr Sonden nutzen. Somit können beispielsweise Oligonukleotide zum Amplifizieren und Detektieren des Adenovirus-Targets einen, zwei oder drei oder mehr Vorwärtsamplifikationsprimer zusammen mit einem, zwei oder drei oder mehr Rückwärtsamplifikationsprimern zusammen mit einem, zwei, drei, vier, fünf oder selbst sechs oder mehr Sonden umfassen.
  • In einer Ausführungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, um spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus, die den Nukleotiden 1 bis 99 der SEQ ID Nr. 47 entspricht, zu hybridisieren, und eine Sonde ist gestaltet, um eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 52 bis 99 der SEQ ID NR: 47 entspricht, zu detektieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, um spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus, die den Nukleotiden 83 bis 175 der SEQ ID Nr. 47 entspricht, zu hybridisieren, und eine Sonde ist gestaltet, um eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 52 bis 99 der SEQ ID NR: 47 entspricht, zu detektieren.
  • In einer Ausführungsform werden mindestens zwei Amplifikationsoligomere eingesetzt, wobei jeder der mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine Länge von 10 bis etwa 50 Nukleotiden aufweist, und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils gestaltet sind, um spezifisch mit Bereichen innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 1 bis 99 der SEQ ID Nr. 47 und den Nukleotiden 83 bis 175 der SEQ ID Nr. 47 zu hybridisieren, und eine Sonde ist gestaltet, um eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 52 bis 99 der SEQ ID NR ist 47 entspricht, zu detektieren.
  • In einer Ausführungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, um spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus, die den Nukleotiden 52 bis 99 und/oder 40 bis 87 und/oder 1 bis 23 und/oder 7 bis 23 und/oder 7 bis 45 der SEQ ID Nr. 47 entspricht, zu hybridisieren, und eine Sonde ist gestaltet, um eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 52 bis 99 der SEQ ID NR: 47 entspricht – wie beispielsweise den Nukleotiden 76 bis 99 oder den Nukleotiden 65 bis 87 oder den Nukleotiden 53 bis 76 oder den Nukleotiden 53 bis 74 oder den Nukleotiden 53 bis 72 oder den Nukleotiden 52 bis 71, zu detektieren.
  • In einer Ausführungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, um spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus, die den Nukleotiden 139 bis 155 und/oder 103 bis 175 und/oder 83 bis 99 und/oder 83 bis 98 der SEQ ID Nr. 47 entspricht, zu hybridisieren, und eine Sonde ist gestaltet, um eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 52 bis 99 der SEQ ID NR: 47 entspricht – wie beispielsweise den Nukleotiden 76 bis 99 oder den Nukleotiden 65 bis 87 oder den Nukleotiden 53 bis 76 oder den Nukleotiden 53 bis 74 oder den Nukleotiden 53 bis 72 oder den Nukleotiden 52 bis 71, zu detektieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden mindestens zwei Amplifikationsoligomere eingesetzt, wobei jeder der mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine Länge von 10 bis etwa 50 Nukleotiden aufweist, und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils gestaltet sind, um spezifisch mit Bereichen innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 52 bis 99 und/oder 40 bis 87 und/oder 1 bis 23 und/oder 7 bis 23 und/oder 7 bis 45 der SEQ ID Nr. 47 und den Nukleotiden 139 bis 155 und/oder 103 bis 175 und/oder 83 bis 99 und/oder 83 bis 98 der SEQ ID Nr. 47 zu hybridisieren, und eine Sonde ist gestaltet, um eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 52 bis 99 der SEQ ID NR: 47 entspricht – wie beispielsweise den Nukleotiden 76 bis 99 oder den Nukleotiden 65 bis 87 oder den Nukleotiden 53 bis 76 oder den Nukleotiden 53 bis 74 oder den Nukleotiden 53 bis 72 oder den Nukleotiden 52 bis 71, zu detektieren.
  • In einer Ausführungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, um spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus, die den Nukleotiden 52 bis 74 und/oder 76 bis 99 und/oder 40 bis 56 und/oder 65 bis 87 und/oder 1 bis 18 und/oder 7 bis 23 und/oder 28 bis 45 und/oder 27 bis 45 und/oder 26 bis 45 der SEQ ID Nr. 47 entspricht, zu hybridisieren, und eine Sonde ist gestaltet, um eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 52 bis 99 der SEQ ID NR: 47 entspricht – wie beispielsweise den Nukleotiden 76 bis 99 oder den Nukleotiden 65 bis 87 oder den Nukleotiden 53 bis 76 oder den Nukleotiden 53 bis 74 oder den Nukleotiden 53 bis 72 oder den Nukleotiden 52 bis 71, zu detektieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, um spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus, die den Nukleotiden 139 bis 155 und/oder 103 bis 123 und/oder 159 bis 175 und/oder 83 bis 99 und/oder 83 bis 98 der SEQ ID Nr. 47 entspricht, zu hybridisieren, und eine Sonde ist gestaltet, um eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 52 bis 99 der SEQ ID NR: 47 entspricht – wie beispielsweise den Nukleotiden 76 bis 99 oder den Nukleotiden 65 bis 87 oder den Nukleotiden 53 bis 76 oder den Nukleotiden 53 bis 74 oder den Nukleotiden 53 bis 72 oder den Nukleotiden 52 bis 71, zu detektieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden mindestens zwei Amplifikationsoligomere eingesetzt, wobei jeder der mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine Länge von 10 bis etwa 50 Nukleotiden aufweist, und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils gestaltet sind, um spezifisch mit Bereichen innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 52 bis 74 und/oder 76 bis 99 und/oder 40 bis 56 und/oder 65 bis 87 und/oder 1 bis 18 und/oder 7 bis 23 und/oder 28 bis 45 und/oder 27 bis 45 und/oder 26 bis 45 der SEQ ID Nr. 47 und den Nukleotiden 139 bis 155 und/oder 103 bis 123 und/oder 159 bis 175 und/oder 83 bis 99 und/oder 83 bis 98 der SEQ ID Nr. 47 zu hybridisieren, und eine Sonde ist gestaltet, um eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 52 bis 99 der SEQ ID NR: 47 entspricht – wie beispielsweise den Nukleotiden 76 bis 99 oder den Nukleotiden 65 bis 87 oder den Nukleotiden 53 bis 76 oder den Nukleotiden 53 bis 74 oder den Nukleotiden 53 bis 72 oder den Nukleotiden 52 bis 71, zu detektieren.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 1 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 2 und/oder SEQ ID NR: 3 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nr. 4, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 5 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 6 und/oder SEQ ID NR: 7 und/oder SEQ ID NR: 8 und/oder SEQ ID NR: 9 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nr. 10, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 11 und/oder SEQ ID NR: 12 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 13 und/oder SEQ ID NR: 14 und/oder SEQ ID NR: 15 und/oder SEQ ID NR: 16 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 17 bis 24 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 und/oder SEQ ID NR: 26 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und/oder SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nrn. 29 und/oder 30, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 31 und/oder SEQ ID NR: 32 und/oder SEQ ID NR: 33 und/oder SEQ ID NR: 34 und/oder SEQ ID NR: 35 und/oder SEQ ID NR: 38 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und/oder SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 1 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nr. 4, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 5 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nr. 10, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 11 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 17 bis 24 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 12 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 17 bis 24 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 29 und 30 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 26 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 29 und 30 oder einer Kombination davon, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 31 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifkationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 36, 37, 39 and 40 oder einer Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 32 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 33 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ 10 NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 2 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nr. 4, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 3 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nr. 4, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 6 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nr. 4, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 7 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nr. 4, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 8 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nr. 4, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 9 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nr. 4, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 13 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 17 bis 24 oder einer Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 14 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 17 bis 24 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 15 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 17 bis 24 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 16 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 17 bis 24 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die SEQ ID Nr. 29 oder 30 oder eine Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die SEQ ID Nr. 29 oder 30 oder einer Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • Bevorzugte Kombinationen und Zusammensetzungen für die Amplifikation und/oder Detektion von Adenovirus
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 5 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine dieser Kombinationen zusammen mit mindestens einer Sonde, die die in SEQ ID Nr. 10 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 11 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine dieser Kombinationen zusammen mit mindestens einer Sonde, die die in SEQ ID Nr. 19 oder SEQ ID Nr. 20 dargelegte Sequenz oder eine Kombination umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 12 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird irgendeine dieser Kombinationen zusammen mit mindestens einer Sonde, die die in SEQ ID Nr. 19 oder SEQ ID Nr. 20 dargelegte Sequenz oder eine Kombination umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 12 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 15 oder SEQ ID NR: 16 dargelegte Sequenz oder einer Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine dieser Kombinationen zusammen mit mindestens einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 21 oder SEQ ID Nr. 22, SEQ ID Nr. 23 und SEQ ID Nr. 24 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 oder SEQ ID NR: 26 dargelegte Sequenz oder eine Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz oder eine Kombination davon (z. B. SEQ ID Nrn. 25, 26, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 26, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 26 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 26 und 27) umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann irgendeine oder mehrere dieser Kombinationen zusammen mit mindestens einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 21, SEQ ID Nr. 22, SEQ ID Nr. 23, SEQ ID Nr. 24, SEQ ID Nr. 29 und SEQ ID Nr. 30 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt werden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 31 und SEQ ID NR: 26 oder einer Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz oder einer Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann eine oder mehrere dieser Kombinationen zusammen mit mindestens einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 21, SEQ ID Nr. 22, SEQ ID Nr. 23 und SEQ ID Nr. 24 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt werden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34 und SEQ ID NR: 35 oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon (z. B. SEQ ID Nrn. 33 und 35 oder 34 und 35) umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz oder eine Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann eine oder mehrere dieser Kombinationen zusammen mit mindestens einer Sonde, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 21, SEQ ID Nr. 22, SEQ ID Nr. 23 und SEQ ID Nr. 24 oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt werden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 oder SEQ ID NR: 26 dargelegte Sequenz oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder eine Kombination davon (z. B. SEQ ID Nrn. 25, 26, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 26, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 26 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 26 und 27, SEQ ID Nrn. 25, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 25 und 27, SEQ ID Nrn. 25 und 28, SEQ ID Nrn. 26 und Nr. 27 und SEQ ID Nrn. 26 und Nr. 28) umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann eine oder mehrere dieser Kombinationen zusammen mit mindestens einer Sonde, die eine wie in SEQ ID Nr. 36 und SEQ ID Nr. 37 dargelegte Sequenz oder eine Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt werden. Somit ist beispielweise eine bevorzugte Kombination eine der SEQ ID Nrn. 25, 26, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 26, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 26 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 26 und 27, SEQ ID Nrn. 25, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 25 und 27, SEQ ID Nrn. 25 und 28, SEQ ID Nrn. 26 und 27 und SEQ ID Nr. 26 und 28 in Kombination mit SEQ ID Nr. 36 und/oder SEQ ID Nr. 37.
  • Probenvorbereitung
  • Die Vorbereitung von Proben für die Amplifikation und die Detektion von Adenovirus-Sequenzen können Verfahren zur Abtrennung und/oder zur Konzentration von Viren, die in einer Probe enthalten sind, von anderen Bestandteilen der Probe beinhalten. Die Probenvorbereitung kann Routineverfahren zum Spalten oder zum Durchführen einer Lyse der Probe, um den intrazellulären Inhalt freizusetzen, einschließlich Adenovirus-Nukleinsäure oder genetische Sequenzen, die Adenovirus-Nukleinsäure umfassen, beinhalten. Die Probenvorbereitung vor der Amplifikation kann den optionalen Schritt des Target-Einfangens (Target Capture) beinhalten, um die Target-Nukleinsäuren spezifisch oder unspezifisch von anderen Bestandteilen der Probe abzutrennen. Verfahren zum unspezifischen Target-Einfangen können die selektive Fällung von Nukleinsäuren aus einer im Wesentlichen wässrigen Mischung, Anhaftung von Nukleinsäuren an einen Träger, der gewaschen wird, um andere Bestandteile der Probe zu entfernen, andere Verfahren zum physischen Abtrennen von Nukleinsäuren aus einer Mischung, die Adenovirus-Nukleinsäure und andere Probenbestandteile enthält, beinhalten.
  • Amplifikation des Targetbereichs von Adenovirus
  • Das Amplifizieren des Targetbereichs von Adenovirus unter Verwendung von zwei oder mehr Primern kann unter Verwendung einer Vielzahl von bekannten Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren erfolgen. Beispielsweise kann Amplifikation unter Verwendung von PCR-Amplifikation erreicht werden (US-Patente Nrn. US 4 683 195 A , US 4 683 202 A und US 4 800 159 A , Mullis et al.), wobei mehrere DNA-Stränge hergestellt werden, indem Thermocycling-Reaktionen eingesetzt werden, die dsDNA und Primer, die spezifisch für Teile der getrennten Stränge sind, trennen, um zusätzliche dsDNA-Moleküle unter Verwendung einer DNA-Polymerase herzustellen. Wohl bekannte Variationen des grundlegenden PCR-Verfahrens können auch eingesetzt werden, beispielsweise PCR in Verbindung mit Echtzeitdetektion – wie beispielsweise Taqman-PCR. Ein Nachteil der PCR ist die Notwendigkeit eines Thermocyclers zum Erwärmen und Kühlen der Amplifikationsmischung, um die DNA zu denaturieren. Wie PCR wurde eine Vielzahl von anderen Techniken zur Detektion und Amplifikation von spezifischen Sequenzen entwickelt. Ein Beispiel ist die Ligasekettenreaktion (LCR). Zusätzlich zu den herkömmlichen Verfahren der DNA-Amplifikation, die auf der thermischen Denaturierung des Targets während der Amplifikationsreaktion beruhen, wurde eine Reihe von Verfahren beschrieben, die keine Denaturierung des Templats während der Amplifikationsreaktion erfordern, und die daher als isotherme Amplifikationstechnologien bezeichnet werden. Beispiele für isotherme Amplifikation sind Strangverschiebungsamplifikation (SDA), transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA) und nukleinsäuresequenzbasierte Amplifikation (NASBA), bei denen eine RNA-Polymerase eingesetzt wird, um RNA-Sequenzen, aber nicht die entsprechende genomische DNA zu kopieren. Weitere DNA-basierte isotherme Techniken umfassen Rolling-Circle-Amplifikation (RCA), Ramifikationsamplifikation (RAM) und Helicase-abhängige isotherme DNA-Amplifikation (HDA).
  • In einer Ausführungsform ist das Amplifikationsverfahren TMA. Ein TMA-basierter Assay stellt viele RNA-Transkripte (Amplikone) von einer einzigen Kopie der Targetnukleinsäure her und die Amplikone werden detektiert, um auf das Vorhandensein des Adenovirus-Targets in der Probe hinzuweisen. Kurz gesagt hybridisiert in TMA-basierten Assays ein Promotor-Primer spezifisch mit der Targetsequenz und reverse Transkriptase (RT), die eine RNase H-Aktivität aufweist, erzeugt einen ersten Strang cDNA durch Extension ausgehend vom 3'-Ende des Promotor-Primers und verdaut den Templatstrang. Die cDNA wird dann von einem zweiten Primer gebunden, und es wird ein neuer DNA-Strang ausgehend vom Ende des zweiten Primers unter Verwendung von RT synthetisiert, um eine doppelsträngige DNA (dsDNA), die eine funktionelle Promotorsequenz enthält, zu erzeugen. RNA-Polymerase, die spezifisch für diesen Promotor ist, bindet an die Promotorsequenz und es werden mehrere RNA-Transkripte hergestellt, die jeweils als Templat für weitere Sequenzreplikation unter Verwendung der gleichen Schritte, die für das erste Templat verwendet wurden, dienen können. Somit werden große Mengen einzelsträngiger amplifizierter Produkte unter Verwendung im Wesentlichen isothermer Reaktionsbedingungen hergestellt.
  • Amplifikationsverfahren, die TMA-Amplifikation einsetzen, können folgende Schritte beinhalten. Kurz gesagt wird eine Targetnukleinsäure bereitgestellt, die die zu amplifizierende Targetsequenz enthält. Ein erstes Amplifikationsoligomer wird mit dieser Targetnukleinsäure in Kontakt gebracht, indem es mit der Targetsequenz hybridisiert. Das erste Amplifikationsoligomer kann ein Primer oder ein Promotor-Primer sein. Eine geeignete Nukleinsäurepolymerase erzeugt dann ein Nukleinsäurestrangamplifikationsprodukt, das komplementär zu der Targetnukleinsäuretargetsequenz ist. Wenn zunächst ein Primer als das erste Amplifikationsoligomer eingesetzt wird, dann ist das zweite Amplifikationsoligomer ein Promotor-Primer oder Promotor-Provider. Eine geeignete Nukleinsäurepolymerase verwendet das neu erzeugte Amplifikationsprodukt, mit dem das Promotor-basierte Oligomer hybridisiert ist, als Primer zur Herstellung eines komplementären Strangs der nicht hybridisierten Promotorsequenz. Wenn das zweite Amplifikationsoligomer ein Promotor-Primer ist, dann wird auch eine komplementäre Kopie des Amplifikationsprodukts, das mit dem zweiten Amplifikationsoligomer hybridisiert ist, erzeugt. Die nun doppelsträngige Promotorsequenz der promotorbasierten Amplifikation wird von einer geeigneten RNA-Polymerase verwendet, um die Transkription einzuleiten und RNA-Transkript-Amplifikationsprodukte herzustellen. Der erste Amplifikationsoligomer-Primer kann dann mit den transkribierten Amplifikationsprodukten hybridisieren, und die Schritte können sich wiederholen. Wenn die Targetnukleinsäure DNA ist, dann ist das erste Amplifikationsoligomer ein Promotor-Primer und das zweite Amplifikationsoligomer ist ein Primer. Die Amplifikation erfolgt in der Regel wie oben beschrieben und wie im Stand der Technik beschrieben. Siehe beispielsweise US-Patente Nrn. US 4 868 105 A , US 5 124 246 A , US 5 130 238 A , US 5 399 491 A , US 5 437 990 A , US 5 554 516 A und US 7 374 885 B2 und PCT Pub.-Nr. WO 88/01302 A1 , WO 88/10315 A1 und WO 95/03430 A1 , die TMA und andere Variationen der transkriptionsassoziierten Amplifikation beschreiben. Die amplifizierten Produkte können in Echtzeit während der Amplifikation oder am Ende der Amplifikationsreaktion detektiert werden. Die Detektion kann durch eine Reihe von Verfahren erfolgen. Sondenbasierte Detektionsverfahren verwenden eine Oligonukleotidsonde, die eine mit dem Target hybridisierende Sequenz enthält, die spezifisch an eine Targetsequenz, die in den Amplifikationsprodukten enthalten ist, bindet. Die Detektion eines Signals, das aufgrund der gebundenen Sonden erhalten wird, weist auf das Vorhandensein der Targetnukleinsäure in der Probe hin.
  • Nukleinsäuredetektion
  • Die Detektion der Nukleinsäuren kann durch eine Vielzahl von Verfahren erreicht werden. In den Detektionsverfahren können Nukleinsäuresonden, die eine mit dem Target hybridisierende Sequenz enthalten, die komplementär zu einem Teil des amplifizierten Produkts ist, und Detektieren des Vorhandenseins des Sonde:Produkt-Komplexes eingesetzt werden, oder durch Verwenden eines Komplexes von Sonden, der das detektierbare Signal, das mit den amplifizierten Produkten verbunden ist, verstärken kann (z. B. US-Patente Nrn. US 5 424 413 A , US 5 451 503 A und US 5 849 481 A ). Direkt oder indirekt markierte Sonden, die spezifisch mit dem amplifizierten Produkt assoziieren, liefern ein detektierbares Signal, das auf das Vorhandensein der Targetnukleinsäure in der Probe hinweist. Wenn beispielsweise die Targetnukleinsäure Adenovirus-DNA ist, enthält das amplifizierte Produkt eine Sequenz in einer Adenovirus-Targetsequenz oder eine, die komplementär dazu ist. Eine Sonde wird gestaltet, um direkt oder indirekt an einen Teil des Amplifikationsprodukts zu binden, um auf das Vorhandensein von Adenovirus in der untersuchten Probe hinzuweisen.
  • Amplifizierte Produkte können in Echtzeit während der Amplifikation oder am Ende der Amplifikationsreaktion detektiert werden. Die Detektion kann mit einer Reihe von Verfahren durchgeführt werden. Sondenbasierte Detektionsverfahren verwenden eine Oligonukleotidsonde, die eine mit dem Target hybridisierende Sequenz umfasst, die spezifisch an eine Targetsequenz bindet, die in den Amplifikationsprodukten enthalten ist. Die Detektion eines Signals, das aufgrund der gebundenen Sonden erhalten wird, weist auf das Vorhandensein der Targetnukleinsäure in der Probe hin.
  • Im Wesentlichen kann jedes Markierungs- und Detektionssystem, das zur Verfolgung konkreter Nukleinsäurehybridisierung eingesetzt werden kann, in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Zu der Palette nützlicher Markierungen zählen Radiomarkierungen, Enzyme, Haptene, verknüpfte Oligonukleotide, chemilumineszierende Moleküle, fluoreszierende Einheiten (entweder allein oder in Kombination mit „Quencher”-Einheiten) und redoxaktive Einheiten, die elektronischen Detektionsverfahren zugänglich sind. Bevorzugte chemilumineszierende Moleküle umfassen Acridiniumester der Art, wie sie von Arnold et al. in US-Patent Nr. US 5 283 174 A für den Einsatz in Verbindung mit homogenen Protektions-Assays offenbart wurden und der Art, wie sie von Woodhead et al. in US-Patent Nr. US 5 656 207 A für den Einsatz in Verbindung mit Assays, die mehrere Targets in einer einzigen Reaktion quantifizieren, offenbart wurden. Ansätze mit elektronischer Markierung und Detektion werden in US-Patenten Nrn. US 5 591 578 A und US 5 770 369 A und der veröffentlichten Patentanmeldung WO 98/57158 A1 offenbart.
  • Redoxaktive Einheiten, die als Markierungen brauchbar sind, umfassen Übergangsmetalle wie beispielsweise Cd, Mg, Cu, Co, Pd, Zn, Fe und Ru. Besonders bevorzugte detektierbare Markierungen für Sonden in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung sind in homogenen Assaysystemen detektierbar (d. h. wenn in einer Mischung eine gebundene markierte Sonde eine detektierbare Veränderung im Vergleich zu einer ungebundenen markierten Sonde aufweist, wie beispielsweise Stabilität oder differenziellen Abbau). Während andere homogen detektierbare Markierungen, wie beispielsweise fluoreszierende Markierungen und elektronisch detektierbare Markierungen, für den praktischen Einsatz der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind, ist eine bevorzugte Markierung für den Einsatz in homogenen Assays eine chemilumineszierende Verbindung (z. B. wie von Woodhead et al. in US-Patent Nr. US 5 656 207 A ; von Nelson et al. in US-Patent Nr. US 5 658 737 A oder von Arnold et al. in US-Patent Nr. US 5 639 604 A beschrieben). Chemilumineszierende Markierungen können Acridiniumester(„AE”)-Verbindungen umfassen, wie beispielsweise normaler AE oder Derivate davon, wie beispielsweise Naphthyl-AE, ortho-AE, 1- oder 3-Methyl-AE, 2,7-Dimethyl-AE, 4,5-Dimethyl-AE, ortho-Dibrom-AE, ortho-Dimethyl-AE, meta-Dimethyl-AE, ortho-Methoxy-AE, ortho-Methoxy(cinnamyl)-AE, ortho-Methyl-AE, ortho-Fluor-AE, 1- oder 3-Methyl-ortho-fluor-AE, 1- oder 3-Methyl-meta-difluor-AE und 2-Methyl-AE.
  • Ein weiteres Beispiel einer Hybridisierungsassaysonde, die in Verbindung mit der Erfindung eingesetzt werden kann, ist eine Struktur, die gemeinhin als „Molekularer Beacon” bezeichnet wird. Molekulare Beacons umfassen Nukleinsäuremoleküle mit einer komplementären Targetsequenz, ein Affinitätspaar (oder Nukleinsäurearme), die in Abwesenheit einer Targetnukleinsäuresequenz die Sonde in einer geschlossenen Konformation halten und ein Markierungspaar, das wechselwirkt, wenn die Sonde in einer geschlossenen Konformation vorliegt. Die Hybridisierung der Targetnukleinsäuresequenz und der komplementären Targetsequenz trennt die Teile des Affinitätspaares, wobei die Sonde in eine offene Konformation gebracht wird. Das Bringen in die offene Konformation ist aufgrund der verminderten Wechselwirkung des Markierungspaares, das beispielsweise ein Fluorophor und ein Quencher sein kann (z. B. DABCYL und EDANS), detektierbar. Molekulare Beacons werden ausführlich in US-Patent Nr. US 5 925 517 A beschrieben. Molekulare Beacons, die brauchbar zum Detektieren von Adenovirus-spezifischen Nukleinsäuresequenzen sind, können erzeugt werden, indem ein erster Nukleinsäurearm, der ein Fluorophor umfasst, und ein zweiter Nukleinsäurearm, der eine Quencher-Einheit umfasst, an eines der Enden der hier offenbarten Sondensequenzen angehängt wird. In dieser Konfiguration dient die hier offenbarte Adenovirus-spezifische Sondensequenz als der targetkomplementäre „Schleifen”-Teil des erhaltenen molekularen Beacons.
  • Vorzugsweise werden molekulare Beacons mit einem wechselwirkenden Paar von detektierbaren Markierungen markiert. Beispiele für detektierbare Markierungen, die als Teile eines wechselwirkenden Markierungspaares bevorzugt sind, wechselwirken miteinander durch FRET- oder Nicht-FRET-Energietransfermechanismen. Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) beinhaltet die strahlungslose Übertragung von Energiequanten vom Absorptionsort zum Ort der Nutzung in dem Molekül oder in dem Molekülsystem durch Resonanzwechselwirkung zwischen Chromophoren über Entfernungen hinweg, die erheblich größer sind als Atomabstände, ohne Umwandlung in thermische Energie und ohne dass Donor und Akzeptor kinetisch kollidieren. Der „Donor” ist die Einheit, die ursprünglich die Energie absorbiert, und der „Akzeptor” ist die Einheit, auf die die Energie anschließend übertragen wird. Außer FRET gibt es mindestens drei weitere „Nicht-FRET”-Energietransferprozesse, durch die Anregungsenergie von einem Donor- auf ein Akzeptormolekül übertragen werden kann.
  • Wenn zwei Markierungen ausreichend nahe beieinander gehalten werden, so dass die Energie, die von einer Markierung emittiert wird, von der zweiten Markierung empfangen oder absorbiert werden kann, ob durch einen FRET- oder Nicht-FRET-Mechanismus, dann sagt man, dass die beiden Markierungen in einer „Energietransferbeziehung” zueinander stehen. Dies ist beispielsweise der Fall, wenn ein molekularer Beacon durch die Bildung einer Stammduplex in einem geschlossenen Zustand gehalten wird und die Fluoreszenzemission von einem Fluorophor, das an einem Arm der Sonde angebracht ist, von einer Quencher-Einheit am anderen Arm gequencht wird.
  • Besonders bevorzugte Markierungseinheiten für die molekularen Beacons umfassen ein Fluorophor und eine zweite Einheit mit fluoreszenzquenchenden Eigenschaften (d. h. ein „Quencher”). In dieser Ausführungsform ist das charakteristische Signal wahrscheinlich eine Fluoreszenz einer bestimmten Wellenlänge, könnte aber alternativ auch ein Lichtsignal im sichtbaren Bereich sein. Im Falle, dass eine Fluoreszenz beteiligt ist, erfolgen Änderungen in der Emission vorzugsweise durch FRET oder Strahlungsenergietransfer oder Nicht-FRET-Modi. Wenn ein molekularer Beacon mit einem Paar von wechselwirkenden Markierungen im geschlossenen Zustand durch eine geeignete Lichtfrequenz angeregt wird, wird ein Fluoreszenzsignal auf einem ersten Niveau erzeugt, das sehr niedrig sein kann. Wenn dieselbe Sonde im offenen Zustand vorliegt und von einer geeigneten Lichtfrequenz angeregt wird, sind das Fluorophor und die Quenchereinheiten ausreichend voneinander getrennt, so dass ein Energietransfer zwischen ihnen im Wesentlichen ausgeschlossen ist. Unter dieser Bedingung ist die Quenchereinheit nicht in der Lage, die Fluoreszenz von der Fluorophoreinheit zu quenchen. Wenn das Fluorophor durch Lichtenergie einer geeigneten Wellenlänge angeregt wird, wird ein Fluoreszenzsignal auf einem zweiten Niveau, das höher liegt als das erste Niveau, erzeugt. Der Unterschied zwischen den beiden Fluoreszenzniveaus ist detektierbar und messbar. Bei Verwendung von Fluorophor- und Quenchereinheiten in dieser Weise ist der molekulare Beacon nur in der „offenen” Konformation „an” und weist durch das Ausstrahlen eines in einfacher Weise detektierbaren Signals an, dass die Sonde an das Target gebunden ist. Der konformationelle Zustand der Sonde ändert das von der Sonde erzeugte Signal durch die Regelung der Wechselwirkung zwischen den Markierungseinheiten. Beispiele für Donor/Akzeptor-Markierungspaare, die im Zusammenhang mit der Erfindung eingesetzt werden können, umfassen Fluoreszein/Tetramethylrhodamin, IAEDANS/Fluoreszein, EDANS/D ABCYL, Cumarin/D ABCYL, Fluoreszein/Fluoreszein, BODIPY FL/BODIPY FL, Fluoreszein/D ABCYL, Luzifer-Gelb/D ABCYL, BODIPY/D ABCYL, Eosin/D ABCYL, Erythrosin/D ABCYL, Tetramethylrhodamin/D ABCYL, Texas-Rot/DABCYL, CY5/BH1, CY5/BH2, CY3/BH1, CY3/BH2, Fluoreszein/QSY7, FAM/BHQ1 und Quasar/BHQ1. Einem Fachmann auf diesem Gebiet ist offensichtlich, dass, wenn Donor- und Akzeptorfarbstoffe verschieden sind, ein Energietransfer durch das Erscheinen einer sensibilisierten Fluoreszenz des Akzeptors oder durch Quenchen der Donorfluoreszenz detektiert werden kann. Wenn die Donor- und Akzeptorspezies gleich sind, kann Energie durch die erhaltene Fluoreszenzdepolarisation detektiert werden. Nicht-fluoreszierende Akzeptoren wie beispielsweise DABCYL und die QSY 7-Farbstoffe eliminieren in vorteilhafter Weise das potentielle Problem der Hintergrundfluoreszenz aus der direkten (d. h. nicht-sensibilisierten) Akzeptoranregung. Bevorzugte Fluorophoreinheiten, die als ein Teil eines Donor-Akzeptor-Paares eingesetzt werden können, umfassen Fluoreszein, ROX und die CY-Farbstoffe (z. B. Cy5).
  • Synthesetechniken und -verfahren zum Anbringen von Markierungen an Nukleinsäuren und zum Detektieren von Markierungen sind im Stand der Technik wohl bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2. Aufl. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Kapitel 10, Nelson et al., US-Patent Nr. US 5 658 737 A , Woodhead et al., US-Patent Nr. US 5 656 207 A , Hogan et al., US-Patent Nr. US 5 547 842 A , Arnold et al., US-Patent Nr. US 5 283 174 A ; Kourilsky et al., US-Patent Nr. US 4 581 333 A ) und Becker et al., europäische Patentanmeldung Nr. EP 0 747 706 A1 .
  • Sonden, die mit amplifizierten Sequenzen hybridisieren, umfassen Haarnadeloligonukleotide, wie beispielsweise molekulare Fackeln und lineare Oligonukleotide, die im Wesentlichen keine durch intramolekulare Bindungen zusammengehaltenen Konformationen bilden. Vorzugsweise enthalten die Sonden Markierungen. Ausführungsformen einer linearen Sonde können eine chemilumineszierende Verbindung als Markierung enthalten, beispielsweise eine chemilumineszierende AE-Verbindung, die an der Sondensequenz über einen Linker angebracht ist (im Wesentlichen wie in US-Patenten Nrn. 5,585,481 und 5,639,604 insbesondere in Spalte 10, Zeile 6 bis Spalte 11, Zeile 3 und in Beispiel 8 darin beschrieben). Beispiele für die Positionen von Markierungen sind der zentrale Bereich des Sondenoligomers und in der Nähe eines Bereichs mit A:T-Basenpaarung am 3'- oder 5'-Ende des Oligomers und an oder nahe einer Fehlpaarungsstelle mit einer bekannten Sequenz, die nicht die gewünschte Targetsequenz ist. Haarnadel- oder lineare Sonden können mit jeder einer Vielzahl von verschiedenen Arten von wechselwirkenden Markierungen markiert werden, wobei ein wechselwirkender Teil in der Regel am 5'-Ende der Sonde angebracht wird und der andere wechselwirkende Teil am 3'-Ende der Sonde angebracht wird. Mit Farbstoff markierte Sonden, einschließlich dual markierten Sonden, einzelmarkierten Sonden, AE-markierten Sonden und dergleichen sind allgemein bekannt. Dual markierte Sonden können an einem Ende mit einer Fluoreszenzmarkierung („F”), die Licht einer bestimmten Wellenlänge oder eines bestimmten Bereichs absorbiert und Licht einer anderen Emissionswellenlänge oder eines anderen Bereichs emittiert und am anderen Ende mit einem Quencher („Q”), der teilweise oder vollständig das Signal abschwächt, das von dem angeregten F emittiert wird, wenn Q in der Nähe des Fluorophors ist, markiert werden. Eine derartige Sonde kann als mit einem fluoreszierenden/Quencher(F/Q)-Paar markiert bezeichnet werden. Eine Ausführungsform einer Haarnadelsonde ist eine „molekulare Fackel”, die ein amplifiziertes Produkt detektiert, um anzudeuten, ob eine Targetsequenz nach dem Amplifikationsschritt in der Probe vorhanden ist. Eine molekulare Fackelsonde enthält eine Targetbindungsdomäne und eine schließende Domäne wie oben beschrieben. Diese Domänen ermöglichen es der molekularen Fackel in offenen und geschlossenen Konformationen zu existieren, je nachdem, ob die Fackel an ein Target gebunden ist. (Siehe auch US-Patente Nrn. US 6 849 412 B2 , US 6 835 542 B2 , US 6 534 274 B2 und US 6 361 945 B1 ). Eine weitere Ausführungsform der Haarnadelsonde ist ein „molekularer Beacon”, der allgemein in Tyagi et al., 1998, Nature Biotechnol. 16: 49–53 und in US-Patenten Nrn. US 5 118 801 A und US 5 312 728 A beschrieben wird. Verfahren für den Einsatz solcher Haarnadelsonden zum Detektieren des Vorhandenseins einer Targetsequenz sind im Stand der Technik wohl bekannt.
  • Die Verfahren zum Amplifizieren einer Targetnukleinsäuresequenz, die in der Nukleinsäure von Adenovirus vorhanden ist, kann daher einen optionalen weiteren Schritt des Detektierens von Amplikonen beinhalten. Diese Vorschrift beinhaltet vorzugsweise einen Schritt des Kontaktierens einer Testprobe mit einer Hybridisierungsassaysonde, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen bevorzugt mit der Targetnukleinsäuresequenz oder dem Komplement davon hybridisiert, wodurch eine Sonde:Target-Duplex gebildet wird, die für die Detektion stabil ist. Als nächstes folgt ein Schritt zum Feststellen, ob das Hybrid in der Testprobe vorhanden ist, was auf das Vorhandensein oder Fehlen von Adenovirus-Nukleinsäuren in der Probe hinweist. Dies kann Detektieren der Sonde:Target-Duplex umfassen und umfasst vorzugsweise homogene Assaysysteme.
  • Hybridisierungsassaysonden, die zum Detektieren von Adenovirus-Nukleinsäuresequenzen brauchbar sind, umfassen eine Basensequenz, die im Wesentlichen komplementär zu einer Adenvirus-Targetnukleinsäuresequenz ist. Somit hybridisieren erfindungsgemäße Sonden mit einem Strang einer Adenovirus-Targetnukleinsäuresequenz oder dem Komplement davon. Diese Sonden können wahlweise zusätzliche Basen außerhalb des Targetnukleinsäurebereichs aufweisen, die gegebenenfalls komplementär zu Adenovirus-Nukleinsäure sind.
  • Bevorzugte Sonden sind ausreichend homolog zu der Targetnukleinsäure, um unter stringenten Hybridisierungsbedingungen entsprechend etwa 42°C, oder mehr bevorzugt etwa 60°C, bei einer Salzkonzentration im Bereich von 0,6 bis 0,9 M zu hybridisieren. Bevorzugte Salze umfassen Lithiumchlorid, allerdings können auch andere Salze, wie beispielsweise Natriumchlorid und Natriumcitrat, ebenfalls in der Hybridisierungslösung eingesetzt werden. Beispielhafte Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz werden durch etwa 42°C, oder mehr bevorzugt etwa 60°C, und 0,48 M Natriumphosphatpuffer, 0,1% Natriumdodecylsulfat und jeweils 1 mM EDTA und EGTA, oder durch 0,6 M LiCl, 1% Lithiumlaurylsulfat, 60 mM Lithiumsuccinat und jeweils 10 mM EDTA und EGTA bereitgestellt. Erfindungsgemäße Sonden weisen Sequenzen auf, die komplementär zu verschiedenen Domänen des Adenovirus-Genoms sind oder diesen entsprechen. Bestimmte Sonden, die zum Detektieren von Adenovirus-Nukleinsäuresequenzen bevorzugt sind, weisen eine Sondensequenz im Längenbereich von 10–100 Nukleotiden auf, die die zum Target komplementäre Basensequenz enthält zusammen mit etwaigen Basensequenzen, die nicht komplementär zu der zu detektierenden Nukleinsäure sind. Sonden zum Detektieren von Adenovirus-Nukleinsäuresequenzen weisen zum Target komplementäre Sequenzen in einem Längenbereich von 15–30, von 16–24, 18–22 oder von 18–20 Nukleotiden auf. Natürlich können diese zum Target komplementären Sequenzen lineare Sequenzen sein oder können in der Struktur eines molekularen Beacons oder eines anderen Konstrukts enthalten sein, der bzw. das ein oder mehrere optionale Nukleinsäuresequenzen aufweist, die nicht komplementär zu der zu detektierenden Adenovirus-Targetsequenz sind. Wie oben angegeben können Sonden aus DNA, RNA, einer Kombination von DNA und RNA, einem Nukleinsäureanalog bestehen oder ein oder mehrere modifizierte Nukleoside enthalten (z. B. ein Ribonukleosid mit einer 2'-O-Methyl-Substitution an der Ribofuranosyl-Einheit).
  • Kits
  • Die Oligomere für die Verwendung in den hier beschriebenen Verfahren sind für die Herstellung von Kits geeignet. Ein derartiges Kit kann Behältnisse umfassen, die jeweils ein oder mehrere der verschiedenen Oligomeren wahlweise zusammen mit einem oder mehreren der Reagenzien (z. B. Enzyme), die erforderlich sind, um die hier beschriebenen Verfahren durchzuführen, enthalten. Die Bestandteile des Kits können in konzentrierter Form bereitgestellt werden. In der Regel sind auch Anweisungen für die Verwendung der Bestandteile des Kits enthalten. Wenn das Kit Kombinationen von Oligomeren enthält, dann können die einzelnen Oligomere einzeln mit entsprechenden Anweisungen zum Mischen derselben oder als Kombinationen davon, die bereits gebrauchsfertig gemischt sind, bereitgestellt werden.
  • In einem Aspekt wird ein Kit bereitgestellt, das die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung und wahlweise eine Reihe von Anweisungen zur Durchführung desselben umfasst. In einer Ausführungsform umfasst diese Zusammensetzung ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 oder SEQ ID NR: 26 dargelegte Sequenz oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder eine Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht. Dementsprechend kann die Zusammensetzung SEQ ID Nrn. 25, 26, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 26, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 26 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 26 und 27, SEQ ID Nrn. 25, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 25 und 27, SEQ ID Nrn. 25 und 28, SEQ ID Nrn. 26 und Nr. 27 und SEQ ID Nrn. 26 und 28 umfassen. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Zusammensetzung eine oder mehrere dieser Kombinationen zusammen mit mindestens einer Sonde mit einer wie in SEQ ID Nr. 36 oder SEQ ID Nr. 37 dargelegten Sequenz oder einer Kombination davon umfassen. So ist beispielsweise eine besonders bevorzugte Kombination eine der SEQ ID Nrn. 25, 26, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 26, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 26 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 26 und 27; SEQ ID Nr. 25, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 25 und 27, SEQ ID Nrn. 25 und 28, SEQ ID Nrn. 26 und 27 und SEQ ID Nrn. 26 und 28 in Kombination mit SEQ ID Nr. 36 und/oder SEQ ID Nr. 37.
  • Korrelation der Detektion einer Targetsequenz mit der Diagnose
  • Die Detektion von amplifizierten Targetsequenzen, die charakteristisch für Adenovirus sind, in einer biologischen Probe einer Person ist ein Hinweis auf eine Infektion mit Adenovirus.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Analyse von Amplifikationsprimern und -sonden
  • Materialien und Methoden
  • In einer ersten Amplifikationsreaktion wurde folgendes eingesetzt: Fast Start Master-Puffer (Roche) mit 1 × bis 2 × Konzentration, 2 Einheiten Fast Start Taq-DNA-Polymerase (Roche), 100 nM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 5) und 100 nM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 6 oder SEQ ID Nr. 8) und 100 nM Sonde (SEQ ID Nr. 10).
  • Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 Mikroliter, wobei 5 Mikroliter aus Adenovirus entnommene Templat-Nukleinsäure pro Reaktion zugegeben wurden. Kontrollreaktionen wurden durchgeführt, indem eine Reaktion wie oben beschrieben angesetzt wurde, allerdings keine Templat-Nukleinsäure zugegeben wurde. Die Amplifikationszyklen für beide Sätze von Amplifikationsreaktionen waren wie folgt: Halten für 600 Sekunden bei 95 Grad C mit Optik aus, 95 Grad C für 30 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C für 60 Sekunden mit Optik an (5 Zyklen), 95 Grad C für 10 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C für 60 Sekunden (40 Zyklen) mit Optik an.
  • Ergebnisse
  • Tabelle 1: Adenovirus-Amplifikation und Detektion mit Primer- und Sonden-Sets
    SEQ ID Nrn. 5, 6 und 10 SEQ ID Nrn. 5, 8 und 10
    CT RFE CT RFE
    Target/Probe 26,9 519 26,4 383
  • Die Ergebnisse werden als CT/RFE(Zyklusschwellenwert/relative Fluoreszenz-Einheit)-Werte angegeben und stellen den Mittelwert von 12 Versuchen unter Verwendung verschiedener Adenovirus-Serotypen dar. Amplifikation konnte in keiner der Kontrollreaktionen festgestellt werden.
  • Schlussfolgerung
  • Die verwendeten Primer und Sonden schienen empfindlich und spezifisch für Adenovirus-Nukleinsäure zu sein.
  • Beispiel 2: Analyse weiterer Amplifikationsprimer und -sonden
  • Materialien und Methoden
  • Die folgenden Reagenzien wurden eingesetzt: Fast Start Master-Puffer (Roche) mit 1 × bis 2 × Konzentration, 2 Einheiten Fast Start Taq-DNA-Polymerase (Roche), 200 nM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 11 oder SEQ ID Nr. 12) und 200 nM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 13 oder SEQ ID Nr. 15) und 200 nM Sonde (SEQ ID Nr. 17 oder SEQ ID Nr. 19).
  • Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 Mikroliter, wobei 5 Mikroliter aus Adenovirus entnommene Templat-Nukleinsäure pro Reaktion zugegeben wurden. Kontrollreaktionen wurden durchgeführt, indem eine Reaktion wie oben beschrieben angesetzt wurde, allerdings keine Templat-Nukleinsäure zugegeben wurde. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: Halten für 600 Sekunden bei 95 Grad C mit Optik aus, 95 Grad C für 30 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C für 60 Sekunden mit Optik an (5 Zyklen), 95 Grad C für 10 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C für 60 Sekunden (40 Zyklen) mit Optik an.
  • Ergebnisse
  • Tabelle 2: Adenovirus-Amplifikation und Detektion mit Primer- und Sonden-Sets
    SEQ ID Nrn. 11, 13 und 17 SEQ ID Nrn. 11, 13 und 19
    CT RFE CT RFE
    Target/Probe 8,7 29,8 32 460
    SEQ ID Nrn. 11, 15 und 17 SEQ ID Nrn. 11, 15 und 19
    CT RFE CT RFE
    Target/Probe 13,3 29,5 32,3 406,4
    SEQ ID Nrn. 12, 15 und 19 SEQ ID Nrn. 12, 15 und 17
    CT RFE CT RFE
    Target/Probe 29,6 620 12,6 32.8
    SEQ ID Nrn. 12, 13 und 19 SEQ ID Nrn. 12, 13 und 17
    CT RFE CT RFE
    Target/Probe 29,6 504 8,3 18,9
  • Die Ergebnisse werden als CT/RFE-Werte angegeben und stellen den Mittelwert von 8 Versuchen unter Verwendung verschiedener Adenovirus-Serotypen dar. Amplifikation konnte in keiner der Kontrollreaktionen festgestellt werden.
  • Schlussfolgerung
  • Kombinationen der SEQ ID Nrn. 11, 13 und 19, SEQ ID Nrn. 11, 15 und 19, SEQ ID Nrn. 12, 15 und 19 oder SEQ ID Nrn. 12, 13 und 19 waren empfindlich und spezifisch für Adenovirus-Nukleinsäure. Die Kombinationen, die den Vorwärtsprimer SEQ ID Nr. 12 umfassen, scheinen eine bessere Empfindlichkeit zu haben als die Kombination, die den Vorwärtsprimer SEQ ID Nr. 11 enthält. Die Kombination, die SEQ ID Nrn. 12, 15 und 19 enthält, schien die empfindlichste in diesen Versuchen zu sein.
  • Beispiel 3: Analyse von Adenovirus-Serotypen mit SEQ ID Nrn. 12, 15 und 19
  • Materialien und Methoden
  • Die folgenden Reagenzien wurden eingesetzt: Fast Start Master-Puffer (Roche) mit 1 × Konzentration, 2 Einheiten Fast Start Taq DNA-Polymerase (Roche), 400 nM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 12) und 400 nM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 15) wurde zusammen mit 400 nM Sonde (SEQ ID Nr. 19) eingesetzt. Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 Mikroliter, wobei 5 Mikroliter aus Adenovirus entnommene Templat-Nukleinsäure pro Reaktion zugegeben wurden. Kontrollreaktionen wurden angesetzt, allerdings wurde keine Templat-Nukleinsäure zugegeben. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: Halten für 600 Sekunden bei 95 Grad C mit Optik aus, 95 Grad C für 30 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C für 60 Sekunden mit Optik an (5 Zyklen), 95 Grad C für 10 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C für 60 Sekunden (40 Zyklen) mit Optik an.
  • Ergebnisse
  • Tabelle 3. Adenovirus-Serotyp-Analyse
    Serotyp CT RFE
    2-1 26 1203
    4-1 31 666
    6-1 29 926
    7-1 32 605
    9-1 26 1137
    10-1 28 1252
    11-1 28 630
    12-1 26 1119
    13-1 26 1100
    14-1 30 682
    15-1 26 1078
    16-1 29 723
    17-1 23 1100
    18-1 34 387
    19-1 27 1146
    20-1 23 996
    21-1 31 568
    22-1 25 1044
    23-1 23 1109
    24-1 25 1221
    25-1 32 836
    26-1 24 1107
    27-1 25 1070
    28-1 26 989
    29-1 27 1116
    30-1 22 1166
    31-1 21 1127
    33-1 28 941
    34-1 28 654
    35-1 29 542
    36-1 24 997
    37-1 24 1125
    38-1 26 1033
    39-1 23 1143
    40-1 27 1114
    41-1 25 994
    42-1 23 1125
    43-1 22 1149
    44-1 22 1141
    45-1 27 1071
    46-1 27 1047
    47-1 22 1144
    48-1 25 1174
    49-1 26 1068
    50-1 25 672
    51-1 26 1099
    1-1 29 956
    3-1 32 540
    5-1 29 791
    7A-1 26 632
    8-1 34 553
    32-2 24 974
  • Die Serotyp-Spalte gibt „Serotyp-Nummer-1 × 10x Anzahl TCID50/ml” an. Alle CT-Werte wurden abgerundet. Die Ergebnisse werden als CT/RFE-Werte angegeben.
  • Schlussfolgerung
  • Die Kombination der SEQ ID Nrn. 12, 15 und 19 waren in der Lage, alle untersuchten Adenovirus-Serotypen zu detektieren.
  • Beispiel 4: Analyse weiterer Sonden-Kombinationen zusammen mit Primern der SEQ ID Nrn. 12 und 15
  • Materialien und Methoden
  • Die folgenden Reagenzien wurden eingesetzt: Fast Start Master-Puffer (Roche) mit 1 × Konzentration, 2 Einheiten Fast Start Taq-DNA-Polymerase (Roche), 100 nM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 12) und 100 nM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 15) wurde eingesetzt zusammen mit entweder: 150 nM Sonde (SEQ ID Nr. 21) und 50 nM Sonde (SEQ ID Nr. 24), 100 nM Sonde (SEQ ID Nr. 21) und 100 nM Sonde (SEQ ID Nr. 24), 50 nM Sonde (SEQ ID Nr. 21) und 150 nM Sonde (SEQ ID Nr. 24). Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 Mikroliter, wobei 5 Mikroliter aus Adenovirus entnommene Templat-Nukleinsäure pro Reaktion zugegeben wurden. Kontrollreaktionen wurden angesetzt, allerdings wurde keine Templat-Nukleinsäure zugegeben. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: Halten für 600 Sekunden bei 95 Grad C mit Optik aus, 95 Grad C für 30 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C für 60 Sekunden mit Optik an (5 Zyklen), 95 Grad C für 10 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C für 60 Sekunden (40 Zyklen) mit Optik an.
  • Ergebnisse
  • Tabelle 4: Amplifikation und Detektion mit verschiedenen Konzentrationen von Sonden-Kombinationen
    150 nM SEQ ID Nr. 21 und 50 nM SEQ ID Nr. 24; 100 nM SEQ ID Nr. 21 und 100 nM SEQ ID Nr. 24;
    CT RFE CT RFE
    Target 34,8 291 26,9 318
    50 nM SEQ ID Nr. 21 und 150 nM SEQ ID Nr. 24
    CT RFE
    Target 26,8 339
  • Die Ergebnisse werden als CT/RFE-Werte angegeben und stellen den Mittelwert von 6 Versuchen unter Verwendung verschiedener Adenovirus-Serotypen dar.
  • Schlussfolgerung
  • Sonden der SEQ ID Nr. 21 und ID Nr. 24 in Kombination mit SEQ ID Nr. 12 und 15 waren in der Lage, Adenovirus bei den verschiedenen untersuchten Konzentrationen empfindlich und spezifisch zu detektieren.
  • Beispiel 5: Analyse weiterer Sonden- und Primer-Kombinationen zur Detektion von Adenovirus
  • Materialien und Methoden
  • Die folgenden Reagenzien wurden eingesetzt: Fast Start Master-Puffer (Roche) mit 1 × Konzentration, 2 Einheiten Fast Start Taq-DNA-Polymerase (Roche) und entweder: (1) 50 mM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 25), 50 mM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 26), 50 mM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27), 50 mM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 28) und 100 nM Sonden (SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 23), (ii) 50 mM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 26), 50 mM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27), 50 mM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 28) und 100 nM Sonden (SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 23), (iii) 50 mM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 25), 50 mM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27), 50 mM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 28) und 100 nM Sonden (SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 23), (iv) 50 mM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 25), 50 mM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 26), 50 mM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 28) und 100 nM Sonden (SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 23), (v) 50 mM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 25), 50 mM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 26), 50 mM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 28) und 100 nM Sonden (SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 23), (vi) 50 mM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 25), 50 mM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 26), 50 mM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27), 50 mM Rückwärtsamplifikationsprimers (SEQ ID Nr. 28) und 100 nM Sonde (SEQ ID Nr. 23), oder (vii) 50 mM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 25), 50 mM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 26), 50 mM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27), 50 mM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 28) und 100 nM Sonden (SEQ ID Nr. 21).
  • Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 Mikroliter, wobei 5 Mikroliter aus Adenovirus entnommene Templat-Nukleinsäure pro Reaktion zugegeben wurden. Zwei verschiedene Konzentrationen wurden untersucht
  • Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: Halten für 600 Sekunden bei 95 Grad C mit Optik aus, 95 Grad C für 30 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C für 60 Sekunden mit Optik an (5 Zyklen), 95 Grad C für 10 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C für 60 Sekunden (40 Zyklen) mit Optik an.
  • Ergebnisse
  • Tabellen 5a–5d. Amplifikation und Detektion mit verschiedenen Konzentrationen und Kombinationen von Primern und Sonden. Tabelle 5a.
    SEQ ID Nrn. 25, 26, 27, 28, 21 und 23 SEQ ID Nrn. 26, 27, 28, 21 und 23
    CT RFE CT RFE
    Target (101) 38,5 240 39,2 143
    Target (103) 29,8 373 30,8 227
    Tabelle 5b.
    SEQ ID Nrn. 25, 27, 28, 21 und 23 SEQ ID Nrn. 25, 26, 28, 21 und 23
    CT RFE CT RFE
    Target (101) 37,8 212 41,5 99
    Target (103) 30,2 275 32 258
    Tabelle 5c.
    SEQ ID Nrn. 25, 26, 27, 21 und 23 SEQ ID Nrn. 25, 26, 27, 28 und 23
    CT RFE CT RFE
    Target (101) 41,8 96 37,7 254
    Target (103) 31,8 320 30 360
    Tabelle 5d.
    SEQ ID Nrn. 25, 26, 27, 28 und 21
    CT RFE
    Target (101) 7,1 21
    Target (103) 0 3
  • Die Ergebnisse werden als RFE-Werte angegeben und stellen den Mittelwert von 6 Versuchen für jede Konzentration dar.
  • Schlussfolgerung
  • Das Weglassen von einem der Primer oder eine der Sonden aus dem Assay machte größtenteils kaum einen Unterschied. Weglassen der Sonde SEQ ID Nr. 23 führte zu geringerer Detektion in diesem konkreten Versuch.
  • Beispiel 6: Analyse von Primer- und Sondenkombinationen zum Detektieren von Adenovirus 18
  • Materialien und Methoden
  • Die folgenden Reagenzien werden eingesetzt: Fast Start Master-Puffer (Roche) mit 1 × Konzentration, 3 Einheiten Fast Start Taq-DNA-Polymerase (Roche), 150 nM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 25 und SEQ ID Nr. 26) und 150 nM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27 und SEQ ID Nr. 28) wurden zusammen mit 300 nM Sonde (SEQ ID Nr. 29) eingesetzt.
  • Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 Mikroliter, wobei 5 Mikroliter aus Adenovirus 18 entnommener Templat-Nukleinsäure pro Reaktion zugegeben wurden. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: Halten für 600 Sekunden bei 95 Grad C mit Optik aus, 95 Grad C für 30 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C für 60 Sekunden mit Optik an (5 Zyklen), 95 Grad C für 10 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C für 60 Sekunden (40 Zyklen) mit Optik an.
  • Ergebnisse
  • Tabelle 6. Amplifikation und Detektion von Adenovirus 18.
    Serotyp CT RFE
    18-6 17 1240
    18-5 20 975
    18-4 24 1242
    18-3 30 1023
    18-2 33 942
    18-1 35 747
    18-0 31 1215
  • Die Serotyp-Spalte gibt „Serotyp-Nummer-1 × 10x Anzahl TCID50/ml” an. CT-Werte wurden abgerundet. Die Ergebnisse werden als CT/RFE-Werte angegeben.
  • Schlussfolgerung
  • Diese Kombination von Primer und Sonden detektiert erfolgreich Adenovirus 18.
  • Beispiel 7: Analyse von weiteren Primer- und Sondenkombinationen zum Detektieren von Adenovirus
  • Materialien und Methoden
  • Die folgenden Reagenzien wurden eingesetzt: Fast Start Master-Puffer (Roche) mit 1 × Konzentration, 3 Einheiten Fast Start Taq-DNA-Polymerase (Roche), 150 nM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 31 und SEQ ID Nr. 26) und 150 nM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27 und SEQ ID Nr. 28) wurden zusammen mit 150 nM Sonde (SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 23) eingesetzt. Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 Mikroliter, wobei 5 Mikroliter aus Adenovirus entnommener Templat-Nukleinsäure pro Reaktion zugegeben wurden. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: Halten für 600 Sekunden bei 95 Grad C mit Optik aus, 95 Grad C für 30 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C für 60 Sekunden mit Optik an (5 Zyklen), 95 Grad C für 10 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C für 60 Sekunden (40 Zyklen) mit Optik an.
  • Ergebnisse
  • Tabelle 7. Primer und Sonden-Kombinationen zum Detektieren von Adenovirus-Serotypen.
    FAM Cy5
    Serotyp CT RFE CT RFE
    1 38,7 40 35,9 172
    3 37,4 59 35,5 208
    4 0 22 37,2 185
    7 32,2 711 32 209
    11 24,2 843 32,2 190
    14 28,8 737 31,9 196
    16 23,8 879 32,1 212
    21 31,9 671 31,4 219
    25 32,8 399 31,7 217
    34 29,3 645 31,7 205
    35 29,6 771 30,7 220
    50 24,6 786 30,9 210
  • Die Ergebnisse werden als CT/RFE-Werte angegeben. Die Fam-Spalte zeigt Detektionsergebnisse für die Templat-Nukleinsäuren. Die Cy5-Spalte zeigt Detektionsergebnisse für eine interne Kontrollnukleinsäure.
  • Schlussfolgerung
  • Mit Ausnahme von Serotyp 4 detektierte diese Kombination von Primer und Sonden erfolgreich alle untersuchten Serotypen.
  • Beispiel 8: Analyse von weiteren Primer- und Sondenkombinationen zum Detektieren von Adenovirus
  • Materialien und Methoden
  • Die folgenden Reagenzien wurden eingesetzt: Fast Start Master-Puffer (Roche) mit 1 × Konzentration, 3 Einheiten Fast Start Taq-DNA-Polymerase (Roche) und entweder: (i) 150 nM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 33 und 34) und 150 nM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27 und SEQ ID Nr. 28) wurden zusammen mit 150 nM Sonde (SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 23), (ii) 150 nM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 33 und 35) und 150 nM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27 und SEQ ID Nr. 28) wurden zusammen mit 150 nM Sonde (SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 23) eingesetzt, oder (iii) 150 nM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 34 und 35) und 150 nM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27 und SEQ ID Nr. 28) wurden zusammen mit 150 nM Sonde (SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 23) eingesetzt. Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 Mikroliter, wobei 5 Mikroliter aus verschiedenen Adenovirus-Serotypen entnommener Templat-Nukleinsäure pro Reaktion zugegeben wurden. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: Halten für 600 Sekunden bei 95 Grad C mit Optik aus, 95 Grad C für 30 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C für 60 Sekunden mit Optik an (5 Zyklen), 95 Grad C für 10 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C für 60 Sekunden (40 Zyklen) mit Optik an.
  • Ergebnisse
  • Tabellen 8a bis 8c. Amplifikation und Detektion von verschiedenen Adenovirus-Serotypen mit Kombinationen von Primern und Sonden. Tabelle 8a.
    SEQ ID Nrn. 33, 34, 27, 28, 21 und 23
    FAM Cy5
    Serotyp CT RFE CT RFE
    1 35,6 318 35,9 243
    3 37,3 87 35,8 210
    4 36,9 150 35,6 232
    19 38,1 95 35,2 217
    31 35,7 247 34,6 257
    41 36,7 244 35,9 285
    14 29,7 868 31,5 250
    Tabelle 8b.
    SEQ ID Nrn. 33, 35, 27, 28, 21 und 23
    FAM Cy5
    Serotyp CT RFE CT RFE
    1 0 12 35,7 248
    3 36,4 159 35,1 231
    4 36,8 171 35,6 249
    19 36,7 151 35,3 181
    31 35,8 170 34,6 197
    41 39,3 50 36 243
    14 29,2 1062 31,5 256
    Tabelle 8c
    SEQ ID Nrn. 34, 35, 27, 28, 21 und 23
    FAM Cy5
    Serotyp CT RFE CT RFE
    1 37,5 198 35,5 199
    3 0 5 35,5 213
    4 0 15 36,1 158
    19 0 12 35,1 224
    31 35,6 369 34,6 240
    41 36,6 284 35,7 263
    14 33,1 942 32,1 203
  • Die Ergebnisse werden als CT- und RFE-Werte angegeben. Die Fam-Spalte zeigt Detektionsergebnisse für die Templat-Nukleinsäuren. Die Cy5-Spalte zeigt Detektionsergebnisse für eine interne Kontrollnukleinsäure.
  • Schlussfolgerung
  • Tabelle 8a der Primer und Sonden detektierte erfolgreich alle untersuchten Serotypen. Tabellen 8b und 8c detektierten die meisten der untersuchten Serotypen.
  • Beispiel 9: Analyse von weiteren Primer- und Sondenkombinationen zum Detektieren von Adenovirus
  • Materialien und Methoden
  • Die folgenden Reagenzien wurden eingesetzt: Fast Start Master-Buffer (Roche) mit 1 × Konzentration, 3 Einheiten Fast Start Taq-DNA-Polymerase (Roche) und 150 nM Vorwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 25 und 26) und 150 nM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27 und SEQ ID Nr. 28) wurden zusammen mit 150 nM Sonde (SEQ ID Nr. 36 und SEQ ID Nr. 37) eingesetzt. Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 Mikroliter, wobei 5 Mikroliter aus dem Plasmid der positiven Kontrolle von Adenovirus-Serotyp 19 entnommener Templat-Nukleinsäure pro Reaktion zugegeben wurden. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: Halten für 600 Sekunden bei 95 Grad C mit Optik aus, 95 Grad C für 30 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C für 60 Sekunden mit Optik an (5 Zyklen), 95 Grad C für 10 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C für 60 Sekunden (40 Zyklen) mit Optik an.
  • Ergebnisse
  • Tabelle 9. Amplifikation und Detektion einer Verdünnungsreihe der Targetnukleinsäure
    Konzentration FAM
    CT RFE
    104 28,1 1127
    104 28,2 1040
    104 28 1196
    103 31,9 938
    103 32,1 922
    103 32,3 969
    102 35,3 865
    102 35,4 800
    102 35,2 800
    101 37,8 571
    101 33,6 59
    101 386 419
    100 0 10
    100 0 0
    100 0 0
    10–1 0 0
    10–1 0 0
    10–1 0 0
  • Die Ergebnisse werden als CT/RFE-Werte angegeben.
  • Schlussfolgerung
  • Diese Primer und Sonden detektierten erfolgreich den als Kontrolle untersuchten Adenovirus-Serotyp 19.
  • Beispiel 10: Weitere Analyse der Primer- und Sondenkombination aus Beispiel 9.
  • Materialien und Methoden
  • Die folgenden Reagenzien wurden eingesetzt: Fast Start Master-Puffer (Roche) mit 1 × Konzentration, 3 Einheiten Fast Start Taq-DNA-Polymerase (Roche) und 150 nM Vorwärtsamplifikationspuffer (SEQ ID Nrn. 25 und 26) und 150 nM Rückwärtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27 und SEQ ID Nr. 28) wurden zusammen mit 150 nM Sonde (SEQ ID Nr. 36 und SEQ ID Nr. 37) eingesetzt. Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 Mikroliter, wobei 5 Mikroliter aus verschiedenen Adenovirus-Serotypen entnommener Templat-Nukleinsäure pro Reaktion zugegeben wurden und wurde bei einer Konzentration von 3 × 100 untersucht. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: Halten für 600 Sekunden bei 95 Grad C mit Optik aus, 95 Grad C für 30 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C für 60 Sekunden mit Optik an (5 Zyklen), 95 Grad C für 10 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C für 60 Sekunden (40 Zyklen) mit Optik an.
  • Ergebnisse
  • Tabelle 10. Amplifikation und Detektion von Adenovirus-Targetnukleinsäuren
    Serotyp CT RFE
    2 31,6 1465
    5 33,9 903
    6 0 0
    7 39 366
    8 37,4 625
    9 32 1223
    10 36,3 837
    11 26,6 950
    12 31,8 1176
    13 29,7 1487
    14 34 671
    15 33,5 1018
    16 33,4 729
    17 30,2 1622
    18 40 175
    20 27,2 1217
    21 34,1 733
    22 31,2 1150
    23 30,1 1471
    24 33,2 1110
    25 37,3 661
    26 29,1 1814
    27 29,5 1637
    28 34,2 1032
    29 32,9 1159
    30 28,4 1496
    32 26,6 2079
    33 33,9 1017
    34 34,2 690
    35 33,1 702
    36 29,1 1312
    37 30,2 1393
    38 31,8 1202
    39 30 1650
    40 32,6 1290
    42 29,1 1261
    43 28,8 1832
    44 23,3 1218
    45 32,1 1289
    46 32,5 1183
    47 26,4 1209
    48 29,4 1565
    49 31,5 1264
    50 32 846
    51 31,4 1125
  • Die Ergebnisse sind als CT- und RFE-Werte angegeben.
  • Diskussion
  • Alle untersuchten Serotypen mit Ausnahme von Serotyp 6 wurden unter Verwendung dieser Primer- und Sondenkonzentration detektiert. Dieser Serotyp wurde erfolgreich bei 3 × 101 TCID50/ml und höher detektiert.
  • Beispiel 11. Beispielhafte Nukleinsäuresequenzen.
  • Das vorliegende Beispiel stellt beispielhafte Sequenzen bereit, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind. Diese Tabelle stellt keine Beschränkung des Schutzumfangs der Erfindung dar. Sequenzen werden nach dem Handbuch der Weltorganisation für geistiges Eigentum (WIPO) bezüglich Information und Dokumentation gewerblichen Eigentums, Norm ST.25 (1998), einschließlich der Tabellen 1 bis 6 der Anlage 2 dargestellt. Tabelle 11. Beispielhafte Nukleinsäuresequenzen
    Figure 00810001
    Figure 00820001
    Gen des menschlichen Adenvirus 9 für Hexon, vollständiges cds, Stamm: Hicks. GenBank Akzessionsnummer AB330090.1 und gi-Nummer GI:190356540. Zuerst gesehen bei NCBI am 13. Juni, 2008. (SEQ ID NR: 47)
    Figure 00820002
    Figure 00830001
  • Der Inhalt der Artikel, Patente und Patentanmeldungen, sowie alle sonstigen Dokumente und elektronisch verfügbaren Informationen, die hier erwähnt oder zitiert werden, werden hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit im gleichen Umfang aufgenommen, als wie wenn jede einzelne Veröffentlichung konkret und einzeln durch Bezugnahme aufgenommen worden wäre. Die Anmelder behalten sich das Recht vor, in diese Anmeldung auf technischem Wege jede und alle Materialien und Informationen aus einem derartigen Artikel, Patent oder einer derartigen Patentanmeldung oder andere fassbare und elektronische Dokumente zu integrieren.
  • Die hier für Zwecke der Illustration beschriebenen Verfahren können zweckmäßig in Ermangelung eines oder mehrerer Elemente, Einschränkung oder Einschränkungen, die hier nicht konkret offenbart wurden, praktiziert werden. So werden beispielsweise die Begriffe „umfassen”, „einschließen”, „enthalten” usw. allumfassend und ohne Einschränkung aufgefasst. Darüber hinaus wurden die hier verwendeten Begriffe und Ausdrücke als Begriffe zur Beschreibung und nicht zur Einschränkung eingesetzt, und es ist nicht vorgesehen, die Begriffe und Ausdrücke zu verwenden, um etwaige Äquivalente der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon auszuschließen. Es ist offensichtlich, dass verschiedene Modifikationen innerhalb des Schutzumfangs der beanspruchten Erfindung möglich sind. Somit ist es selbstverständlich, dass obwohl die vorliegende Erfindung konkret anhand von bevorzugten Ausführungsformen und wahlweisen Merkmalen offenbart wurde, es einem Fachmann hier enthaltene Modifikation und Variation der Erfindung offensichtlich ist, und dass solche Modifikationen und Variationen innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung liegen.
  • Die Erfindung wurde hier breit gefächert und generisch beschrieben. Jeder der eingeschränkteren Arten und Untergattungsgruppierungen, die innerhalb der generischen Offenbarung liegen, bilden ebenfalls einen Teil der Verfahren. Dazu gehört auch die generische Beschreibung der Verfahren mit einem Vorbehalt oder negativer Begrenzung, der bzw. die Gegenstand aus der Gattung entfernt, unabhängig davon, ob das herausgetrennte Material hier konkret erwähnt wird.
  • Andere Ausführungsformen liegen innerhalb der folgenden Ansprüche. Wenn darüber hinaus Merkmale oder Aspekte der Verfahren im Sinne von Markush-Gruppen beschrieben werden, ist es einem Fachmann offensichtlich, dass die Erfindung dadurch auch im Sinne jedes einzelnen Mitglieds oder jeder einzelnen Untergruppe von Mitgliedern der Markush-Gruppe beschrieben wird.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims (22)

  1. Verfahren zum spezifischen Detektieren einer Adenovirus-Targetnukleinsäure in einer Probe, umfassend die Schritte: (a) Kontaktieren einer Probe, von der vermutet wird, dass sie mindestens eine Adenovirus-Nukleinsäure enthält, mit mindestens zwei Amplifikationsoligomeren zur Erzeugung eines Amplikons, wobei jedes der mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine Länge von 10 bis etwa 50 Nukleotiden aufweist, und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils so gestaltet sind, dass sie speziell mit Bereichen innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisieren, die ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 1 bis 99 und aus Nukleotiden 83 bis 175 der Akzessionsnummer AB330090.1 (SEQ ID Nr. 47), (b) Bereitstellen von Bedingungen, die ausreichen, um ein Amplikon aus einer Adenovirus-Targetnukleinsäure, die in der Probe vorhanden ist, unter Verwendung der Amplifikationsoligomere aus Schritt (a) zu erzeugen, und (c) Bereitstellen von Bedingungen zum Detektieren des Amplikons und zum Feststellen, ob eine Adenovirus-Targetnukleinsäure in der Probe vorhanden ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei mindestens eines der mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 1 bis 9, 11 bis 16, 25 bis 28, 31 bis 35, 38 und 42 bis 46 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 1, 5, 11, 12, 25, 26, 31, 32, 33, 34, 35 oder 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.
  4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 2, 3, 6, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 42, 43, 44, 45 oder 46 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.
  5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 1 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer SEQ ID NR: 2 und/oder SEQ ID NR: 3 umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, in SEQ ID NR: 5 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, aus SEQ ID NRn: 6 bis 9 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, in SEQ ID NR: 11 und/oder 12 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, aus SEQ ID NRn: 13 bis 16 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 31 bis 35 oder 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, wie SEQ ID NR: 27 und/oder 28 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 und/oder 26 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und/oder 28 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei mindestens zwei erste Amplifikationsoligomere jeweils eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 und/oder 26 dargelegte Sequenz umfassen, daraus bestehen oder im Wesentlichen daraus bestehen und mindestens zwei zweite Amplifikationsoligomere jeweils eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und/oder 28 dargelegte Sequenz umfassen, daraus bestehen oder im Wesentlichen daraus bestehen.
  11. Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, wobei die Kombination von Amplifikationsoligomeren SEQ ID Nrn. 25, 26, 27 und 28 oder SEQ ID Nrn. 26, 27 und 28 oder SEQ ID Nr. 25, 26 und 28 oder SEQ ID Nrn. 25, 26 und 27 oder SEQ ID Nrn. 25, 27 und 28 oder SEQ ID Nrn. 25 und 27 oder SEQ ID Nrn. 25 und 28 oder SEQ ID Nrn. 26 und Nr. 27 oder SEQ ID Nrn. 26 und 28 ist.
  12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Detektionsschritt Kontaktieren des Amplifikationsprodukts mit mindestens einer Detektionssonde, die gestaltet ist, um mit einem Teil des Amplifikationsprodukts zu hybridisieren, umfasst.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Detektionssonde eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 10, 17 bis 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Detektionssonde eine wie in SEQ ID Nr. 36 und/oder SEQ ID Nr. 37 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.
  15. Verfahren zum Detektieren einer Adenovirus-Nukleinsäure umfassend die Schritte: (a) Kontaktieren einer Probe, die Nukleinsäure umfasst, mit mindestens einer Hybridisierungsassyssonde, die die Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht. (b) Bestimmen, ob sich eine Sonde:Target-Duplex unter stringenten Hybridisierungsbedingungen in der Probe gebildet hat, wobei das Vorhandensein der Sonde:Target-Duplex ein Hinweis auf des Vorhandensein von Adenovirus-Nukleinsäure in der Probe ist.
  16. Zusammensetzung zur Verwendung in einem Adenovirus-Targetnukleinsäure-Amplifikationsassay, der mindestens zwei Amplifikationsoligomere umfasst, die in der Lage sind, mit Adenovirus-Targetnukleinsäure stabil zu hybridisieren, wobei jedes der mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine Länge von 10 bis etwa 50 Nukleotiden aufweist und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils so gestaltet sind, um spezifisch mit Bereichen innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus zu hybridisieren, die aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 1 bis 99 und aus den Nukleotiden 83 bis 175 von Akzessionsnummer AB330090.1 (SEQ ID Nr. 47) ausgewählt sind.
  17. Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 und/oder SEQ ID NR: 26 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht und wobei mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und/oder SEQ ID NR. 28 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.
  18. Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei die ersten und zweiten Amplifikationsoligomere aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 25, 26, 27 und 28 oder SEQ ID Nrn. 26, 27 und 28 oder SEQ ID Nr. 25, 26 und 28 oder SEQ ID Nrn. 25, 26 und 27 oder SEQ ID Nrn. 25, 27 und 28 oder SEQ ID Nrn. 25 und 27 oder SEQ ID Nrn. 25 und 28 oder SEQ ID Nrn. 26 und Nr. 27 oder SEQ ID Nrn. 26 und 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgewählt werden.
  19. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, weiterhin umfassend eine Detektionssonde.
  20. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei die Detektionssonde eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 10, 17 bis 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.
  21. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei die Detektionssonde eine wie in SEQ ID Nr. 36 und/oder SEQ ID Nr. 37 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.
  22. Kit, das die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 16 bis 21 und wahlweise Anweisungen zum Ausführen desselben umfasst.
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