DE10250948A1

DE10250948A1 - Verfahren zur Detektion von Nukleinsäuresequenzen

Info

Publication number: DE10250948A1
Application number: DE2002150948
Authority: DE
Inventors: Jana Dr. Pappassotiriou; Wolfgang Dr. Hauser
Original assignee: GENESCAN ANALYTICS GmbH
Current assignee: GENESCAN ANALYTICS GmbH
Priority date: 2002-10-25
Filing date: 2002-10-25
Publication date: 2004-05-13

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Detektion einer Target-Nukleinsäuresequenz vorgeschlagen, wobei die Target-Nukleinsäuresequenz mit (i) einer Sonde, umfassend eine zu der Target-Nukleinsäuresequenz komplementäre Sequenz, die von zu einem Sonden-Quencher komplementären Sequenzen flankiert ist, und (ii) dem Sonden-Quencher, umfassend eine durch einen Spacer getrennte komplementäre Sequenz, zu der Sonde in Kontakt gebracht und die Sonde und/oder der Sonden-Quencher detektiert werden.

Description

Die Erfindung betrifft die spezifische Detektion von Nukleinsäuresequenzen, insbesondere von DNA-Molekülen, mittels einer Sonde bei einer Amplifikation, insbesondere einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Die PCR ist ein Verfahren, mit dem es gelingt, einige wenige Moleküle einer beliebigen, insbesondere genomischen DNA-Sequenz, in kürzester Zeit in vitro um Faktoren von 10⁶ biS 10⁸ zu vermehren. Das Verfahren läuft in drei – sich wiederholenden – Reaktionsschritten ab. Zunächst wird die Doppelstrang-Nukleinsäuresequenz der gewünschten Sequenz in einer Probe durch Erwärmen auf ca. 90 °C–105 °C denaturiert, so dass Einzelstränge der Nukleinsäuresequenzen entstehen. Anschließend kühlt man die Probe auf etwa 50 °C ab. Dabei hybridisieren – als Starthilfe für die PCR-Primer-Nucleotide mit den Enden der Einzelstränge und ver hindern dadurch die Wiedervereinigung der ursprünglichen Einzelstränge. Bei ca. 72 °C ergänzt eine Polymerase den Einzelstrang zwischen den beiden mit Primern besetzten Enden zu einem neuen Doppelstrang. Anschließend können die drei Schritte (Denaturierung-Primerannealing-Polymerisation) mehrfach wiederholt werden. Die wiederholte Serie von PCR-Reaktionsschritten führt zu einer exponentiellen Akkumulation eines spezifischen Nukleinsäuresequenz-Fragments, dessen Enden durch die 5'-Enden der Primer bestimmt sind. Im Stand der Technik sind verschiedene PCR-Techniken wie die RAcE-PCR, in-situ PCR, differential display PCR und andere beschrieben, die in ihrer Gesamtheit sehr leistungsfähige Verfahren zur Amplifizierung von Nukleinsäuresequenzen darstellen. Weniger leistungsfähig sind die bisherigen Methoden zum Nachweis des amplifizierten Materials, das heißt die Methoden, mit denen bestimmt werden kann, ob eine Target-Nukleinsäuresequenz anwesend ist bzw. synthetisiert wurde. Besonders PCR-Methoden zur quantitativen Bestimmung der Nukleinsäuresequenz sind noch nicht ausgereift, wie z. B. die kompetitive PCR oder die Realtime Fluoreszenz PCR.
Die EP 237362 offenbart ein Nachweisverfahren, bei dem eine markierte Sonde mit der amplifizierten DNA in einem Hybridisierungstest detektiert wird. Die PCR-amplifizierte DNA wird zunächst an einem Filter fixiert und dann mit Hilfe einer markierten Sonde hybridisiert, wobei die Markierung mit Biotin und/oder Meerrettich-Peroxidase der Sonde den Nachweis der erfolgten Hybridisierung erlaubt. Andere Nachweisverfahren umfassen die Verwendung von Fragmentlängen-Polymorphismen, der Hybridisierung an Allel spezifischen Oligonucleotidsonden oder eine direkte Sequenzierung mittels des Didesoxy-Verfahrens unter Verwendung von amplifizierter DNA statt klonierter DNA.
In nachteilhafter Weise erfordern diese Verfahren eine zusätzliche Manipulation und eine anschließende Bearbeitung der in der PCR gewonnenen Target-Nukleinsäuresequenzen. Es ist demgemäß nicht möglich, mit diesem Verfahren die Vervielfältigung in einer geschlossenen Reaktionskammer in Echtzeit zu beobachten. Dies bedingt beispielsweise, dass durch zusätzliche Verfahrensschritte Kreuzkontaminationen auftreten, deren Vermeidung insbesondere für diagnostische, klinische oder lebensmitteltechnische Proben wünschenswert ist. Es gab daher verschiedene Bestrebungen, die Amplifizierung und die Detektion von Nukleinsäuremolekülen in einem einzigen Reaktionsgemisch zusammenzuführen und zu kombinieren und in Echtzeit nachzuweisen. Die Beobachtung der Bildung des Amplifikationsproduktes in der Reaktion in Echtzeit erlaubt, bei Kenntnis der Amplifikationseffizienz, eine quantitative Bestimmung der spezifischen Nukleinsäuren in der Probe. Ein Verfahren, das die PCR-Reaktion und den Nachweis der durch sie entstehenden Produkte in einer einzigen Reaktion kombiniert und einen Nachweis in Echtzeit ermöglicht, ist das TagMan-Verfahren. Bei dem TagMan-Verfahren wird eine Oligonucleotid-Sonde in die PCR-Reaktion gegeben, die am 3'-Ende nicht verlängerbar und mit einem Quencherfarbstoff markiert, sowie am 5'-Ende mit einem Reporterfarbstoff markiert ist und so synthetisiert wurde, dass sie mit einer Targetsequenz der amplifizierten Nukleinsäuresequenz hybridisieren kann. Nicht hybridisiert kommt es durch die Faltung der Oligonukleotid-Sonde zu einem FRET (Fluorescence Resonance Energie Transfer) zwischen Reporter- und Quencherfarbstoff, der die Fluoreszenzstrahlung des Reporterfarbstoffes verringert. Die Hybridisierung des Sondenmoleküls an einem Strang des PCR-Reaktionsproduktes während der Amplifikation schafft ein für die Exonuclease-Aktivität der Polymerase geeignetes Substrat. Somit baut die 5'→3'-Exonuclease-Aktivität der Polymerase während der Amplifikation das Sondenmolekül in kleinere Fragmente ab, verhindert dadurch den FRET Prozess und ermöglicht durch die Fluoreszenzstrahlung des Reporterfarbstoffes die Unterscheidung zur intakten Sonde.
Ein weiteres homogenes Testsystem ist ein Verfahren unter Verwendung von Molecular-Beacons-Sonden. Wie die TagMan-Sonden sind auch die Molecular-Beacons-Sonden spezifische Hybridisierungssonden; sie stellen eine Weiterentwicklung der TagMan-Sonden dar. Die Molecular-Beacons-Sonden sind spezifische Hybridisierungssonden, die eine Haarnadelstruktur mit eigenkomplementären Enden – die jeweils mit einem Sonden-Farbstoff und einem Sonden-Quencher markiert sind – aufweisen, so dass Sonden-Farbstoff und der Sonden-Quencher des Farbstoffs direkt benachbart zu liegen kommen. TagMan-Proben bilden unter Umständen ungünstige Strukturen, so dass der Abstand zwischen Sonden-Farbstoff und Sonden-Quencher zu groß wird und damit die Fluoreszenzemission nicht mehr vollständig unterdrückt werden kann. Dieses Problem konnte durch die Entwicklung von Molecular-Beacons-Sonden gelöst werden. Die Haarnadelstruktur der Molecular-Beacons-Sonden ist so lange stabil, bis die Probe an der spezifischen Targetsequenz hybridisiert, was zu einer Konformationsänderung und damit auch Freisetzung der Sonden-Fluoreszenz führt, wobei die emittierte Sonden-Fluoreszenz mittels eines optischen Systems nach jedem PCR-Zyklus detektiert werden kann.
Ein weiteres Verfahren ist das Hybprobes-Verfahren, bei dem Hybridisierungssonden, die jeweils aus einem Paar von Sonden bestehen, eingesetzt werden, wobei eine Sonde an ihrem 3'-Ende mit einem Sonden-Farbstoff wie z.B. Fluoreszein und die andere am 5'-Ende mit dem Sonden-Quencher wie z.B. Light Cycler Red markiert ist und deren 3'-Hydroxylgruppe mit einer Phosphatgruppe gegen die nicht erwünschte Extension durch die Polymerase blockiert ist. Demgemäß kommt es zu einer Hybridisierung der Sonde und dem Sonden-Quencher mit einem maximalen Abstand von 3 Nukleotiden auf der Targetsequenz, wodurch der FRET-Prozess zwischen Sonde und Quencher ermöglicht wird, das heißt, die Neubildung der Targets wird durch eine Signalabnahme des Reporterfarbstoffes bzw. der Signalzunahme des Quenchers detektiert.
Weiterhin sind im Stand der Technik Sonden beschrieben, wie z.B. die Scorpion-Sonden, bei denen die Sonde bzw. der Sonden-Farbstoff mit einem für die Amplifikation notwendigen Primer über einen Amplifikationsblocker verknüpft ist. Somit ist die Sonde ein langes und aufwendig zu synthetisierendes Oligo, da es eine Kopplung zwischen einem Molecular Beacon und einem Primer über einen modifizierten Spacer darstellt. Bei diesem Verfahren ist der spezifische Nachweis der Amplifikationssequenz durch die Hybridisierung nicht mehr unabhängig von den für die Amplifikation verwendeten Primern.
Die Methoden zum Nachweis der Target-Nukleinsäuresequenz, insbesondere die homologen Echtzeitverfahren, weisen mehrere Nachteile auf. Bei dem TagMan-Verfahren muss die in der PCR verwendete Polymerase eine 5'→3'-Exonuklease-Aktivität aufweisen. Weiterhin benötigt die TagMan-Sonde eine Phosphorylierung. Bei Molecular-Beacons-Sonden ist die Kinetik und Thermodynamik der Bindung des Sondenmoleküls an die Target-Nukleinsäuresequenz nachteilig durch das Auftreten der Haarnadelstruktur beeinflusst. Bei den Scorpion-Sonden (Duplex Scorpions) ist die Sonde mit dem für die Amplifikation notwendigen Primer direkt verknüpft, was unter anderem dazu führt, dass auch die Sequenz des Quencher-Oligos nicht unabhängig von der Targetsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure gewählt werden kann. Bei dem Hybprobes-Verfahren müssen zwei benachbarte Sonden mit der gleichen Bindungsenergie an ihrem 3'-, bzw. 5'-Ende an dem Target binden, damit Reporter- und Quencherfarbstoff während der Messung in räumlicher Nähe gehalten werden. Da jedes Oligo auf Veränderungen in seiner unmittelbaren Umgebung, z.B. Änderungen der Salzkonzentrationen, individuell reagiert, ist dieses Verfahren sehr labil und die Effizienz des FRET kann leicht gestört werden. Weiterhin wird bei dem Verfahren gemäß Hybprobes ein großes Amplicon benötigt.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Detektionsverfahren bereitzustellen, das die genannten Nachteile nicht aufweist und die Detektion einer Target-Nukleinsäuresequenz kostengünstig und einfach, insbesondere während einer Amplifikationsreaktion ermöglicht.
Die Erfindung löst diese technische Aufgabe durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Detektion einer Target-Nukleinsäuresequenz in einer Probe, wobei die Target-Nukleinsäuresequenz mit (i) einer Sonde umfassend eine zu der Nukleinsäuresequenz komplementäre Sequenz, die von zu einem Sonden-Quencher komplementären Sequenzen flankiert ist und (ii) dem Sonden-Quencher umfassend eine durch einen Spacer getrennte komplementäre Sequenz zu der Sonde in Kontakt gebracht und die Sonde und/oder der Sonden-Quencher detektiert werden.
Im Folgenden sollen folgende Begriffe wie folgt verwendet werden.
Im Sinne der Erfindung bezieht sich der Ausdruck Nukleinsäuresequenz, Polynucleotid und Oligonucleotid auf Primer, Sonden und Oligomerfragmente, die nachgewiesen werden sollen, Oligomerkontrollen und nicht markierte, blockierende Oligomere, und allgemein auf Polydesoxyribonucleotide, die 2-Desoxy-D-Ribose enthalten und auf jede andere Art von Polynucleotid, das ein N-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase oder modifizierte Purin- oder Pyrimidinbasen ist. Es gibt keine vorsätzliche Längenunterscheidung zwischen den Begriffen Nukleinsäuresequenz, Polynucleotid und Oligonucleotid, und diese Begriffe werden austauschbar verwendet. Diese Begriffe beziehen sich insbesondere auf die Primärstruktur des Moleküls. Deshalb umfassen diese Begriffe doppel- und einzelsträngige DNA ebenso wie doppel- und einzelsträngige RNA. Das Oligonucleotid umfasst eine Sequenz von ungefähr mindestens 8 Nucleotiden, vorzugsweise mindestens 10–15 Nucleotiden, und besonders bevorzugt mindestens etwa 20–40 Nucleotiden, die einem Bereich der bezeichneten Nucleotidsequenz entspricht. "Entsprechend" bedeutet identisch oder komplementär zu der bezeichneten Sequenz.
Das Oligonucleotid ist nicht notwendigerweise physikalisch abgeleitet von irgendeiner existierenden oder natürlichen Sequenz, sondern kann in jeder Weise gewonnen werden, einschließlich chemische Synthese, DNA Replikation, reverse Transkription oder eine Kombination davon. Die Begriffe Oligonucleotid oder Nukleinsäuresequenz bedeuten ein Polynucleotid von genomischer DNA oder RNA, cDNA, halbsynthetischem oder synthetischem Ursprung, das wegen seiner Herkunft oder wegen einer Manipulation: (1) nicht mit dem gesamten oder einem Teil des Polynucleotids assoziiert ist, mit dem es in der Natur assoziiert ist; und/oder (2) mit einem anderen Polynucleotid als in der Natur verknüpft ist; und (3) in der Natur nicht gefunden wird. Es kann sich selbstverständlich auch um dem Fachmann bekannte Derivate handeln, z.B. solche, die Phosphorothioatbindungen oder Methylphophonatbindungen umfassen.
Weil Mononucleotide bei der Bildung von Oligonucleotiden so zur Reaktion gebracht werden, dass das 5'-Phosphat eines Mononucleotid-Pentoserings mit dem 3'-Sauerstoff seines Nachbarn in einer Richtung mittels einer Phosphodiesterbindung verknüpft wird, wird ein Ende eines Oligonucleotids als das 5'-Ende bezeichnet, wenn sein 5'-Phosphat nicht mit dem 3'-Sauerstoff eines Mononucleotid-Pentoserings verknüpft ist, und als das 3'-Ende, wenn sein 3'-Sauerstoff nicht mit dem 5'-Phosphat eines folgenden Mononucleotid-Pentoserings verknüpft ist. Wie hier verwendet, kann man auch von einer Nukleinsäuresequenz, selbst wenn im Innern eines größeren Oligonucleotids, sagen, dass sie 5'- und 3'-Enden hat.
Selbstverständlich umfassen die erfindungsgemäßen Ausdrücke Nukleinsäuresequenz, Polynucleotid, Oligonucleotid aber auch Aminosäuresequenz oder andere organische polymere Verbindungen auch alle Derivate, Modifikationen, Mutationen oder Fragmente dieser Verbindungen. Solche modifizierten Strukturen können beispielsweise sogenannte Plastik-DNA-Strukturen sein. Bei der Plastik-DNA befinden sich im Rückgrat insbesondere nur ungeladene Polyethyleneinheiten. Durch das Modifizieren von Zucker-Phosphatstrukturen können Polyamid-Nukleinsäuren (PNA) erhalten werden, die im Sinne der Erfindung ebenfalls Nukleinsäuresequenzen darstellen. Bei auf Aminoethylglycineinheiten basierenden PNA findet sich vorteilhafterweise die Tendenz zur Hybridisierung mit komplementären DNA und RNA-Strukturen. Weitere Derivate sind beispielsweise POT-Strukturen, die insbesondere DNA-Moleküle umfassen, bei denen DNA-Telomere durch verschiedene Mechanismen bzw. Sturkturen geschützt sein können. Desweiteren werden 2'-OMe oder 3'-NH₂ Gruppen an den Nukleosiden als Modifikationen im obigen Sinn betrachtet.
Ein Spacer im Sinne der Erfindung bezeichnet den Abstand zwischen zwei Nukleotiden, der durch eine Bindung zwischen diesen, insbesondere eine Phosphat- oder Phosphorthioatbindung, oder mehreren verbundenen Molekülen, insbesondere weiteren Nukleotiden, bestimmt ist.
Im Sinne der Erfindung heißt flankierende Sequenz, daß die Sequenz mit oder ohne Spacer an eine andere Struktur, insbesondere eine Sequenz, angrenzt. Das heißt, die flankierende Sequenz kann dergestalt flankierend sein, daß sie direkt an eine andere Sequenz bindet oder z.B. über einen Spacer aus mehreren Molekülen an die andere Sequenz bindet. Demgemäß heißt flankierend im Sinne der Erfindung sowohl direkt flankierend als auch flankierend vermittelt über mindestens einen Spacer.
Eine Probe im Sinne der Erfindung ist die Bezeichnung für ein durch Probenentnahme entnommenes biologisches oder chemisches Gut oder eines Teiles bzw. einer kleinen Menge eines solchen, dessen Beschaffenheit chemisch, biologisch, klinisch oder ähnlich geprüft werden soll. Die Probenentnahme erfolgt insbesondere so, dass die entnommene Teilmenge einem Durchschnitt der gesamten Menge entspricht. Die durch Untersuchung der Probe ermittelten Merkmale dienen der Beurteilung der durch die Probe erfassten Menge, die Rückschlüsse auf die Gesamtmenge, z.B. Trinkwasser, Lebensmittel, Lebensmittelzutaten oder Vorstufen, Pflanzenmaterial, Blut, transplantierte Organe u.a., zulässt. Für die Untersuchung können die Proben durch Mischen, Zerteilen, Zerkleinern, Zugabe von Enzymen oder Markern bzw. anders vorbehandelt werden. Dem Fachmann sind verschiedene Möglichkeiten der Vorbehandlung von Proben bekannt. Selbstverständlich kann es auch vorgesehen sein, dass die Probe so entnommen wird, dass sie keinem Durchschnitt der gesamten Menge entspricht. Eine Probe können alle biologischen, und nichtbiologischen Materialien sein, wie biologische Gewebe und Flüssigkeiten, z.B. Blut, Lymphe, Urin, Gehirnflüssigkeit und andere, sowie Umweltabwässer oder andere Umweltproben, z.B. Filtrate, Wischproben, Bioreaktorenflüssigkeiten, Lebensmittelinhaltsstoffe, Futtermittel, Gefahrenstoffe u.v.a. mehr. Wie hier verwendet bezieht sich eine Probe demgemäß auf jede Substanz, die eine Nukleinsäure enthält oder vermutlich enthält, und umfasst eine Probe von Gewebe oder Flüssigkeit, die von einem Individuum oder Individuen isoliert ist, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, zum Beispiel Haut, Plasma, Serum, Rückenmarksflüssigkeit, Lymphe, Synovialflüssigkeit, Urin, Tränen, Blutzellen, Abstriche, Gewebeproben, Organe, Tumore, und auch auf Proben von Bestandteilen von in vitro-Zellkulturen; einschließlich, aber nicht beschränkt auf konditioniertes Medium vom Wachstum von Zellen in einem Zellkulturmedium, rekombinante Zellen und Zellbestandteile; insbesondere handelt es sich bei den Proben um Lebensmittel und Pflanzenmaterial. Lebensmittel im Sinne der Erfindung sind Stoffe, die dazu bestimmt sind, in unverändertem, zubereitetem oder verarbeitetem Zustand von Menschen verzehrt zu werden; eingeschlossen sind Stoffe, die überwiegend dazu bestimmt sind, zu anderen Zwecken als zur Ernährung oder zum Genuss verzehrt zu werden, z.B. Arzneimittel oder Tinkturen. Den Lebensmitteln gleichgestellt sind Umhüllungen oder Überzüge von Lebensmitteln, die dazu bestimmt sind, mitverzehrt zu werden (z.B. Käserinde) oder bei denen der Mitverzehr vorauszusehen ist. Zu den Lebensmitteln zählt auch Trinkwasser. Der Begriff Lebensmittel schließt die Nahrungsmittel und Genussmittel ein. Auch Lebensmittelzusatzstoffe sind Lebensmittel, soweit sie dazu bestimmt sind, mit dem Lebensmittel verzehrt zu werden. Lebensmittel können neben ihren natürlichen Bestandteilen, unter denen es auch solche mit möglichen Schadwirkungen gibt, weitere Stoffe natürlicher oder synthetischer Herkunft enthalten.
Bei Pflanzenmaterial im Sinne der Erfindung handelt es sich beispielsweise um ein- oder mehrzellige, sowie pro- oder eukaryotische Pflanzen, insbesondere um Algen, Pilze, Moose, Farne, Nacktsamer oder Bedecktsamer, z.B um einkeimblättrige oder zweikeimblättrige Pflanzen.
Der Begriff Primer kann mehr als einen Primer betreffen und betrifft ein Oligonucleotid, entweder natürlich vorkommend, wie in einem gereinigten Restriktionsverdau, oder synthetisch hergestellt, welches in der Lage ist, als Ausgangspunkt der Synthese entlang eines Komplementärstrangs zu fungieren, wenn es unter Bedingungen gestellt wird, bei denen die Synthese eines Primerverlängerungsprodukts, das komplementär ist zu dem Nukleinsäurestrang, katalysiert wird. Solche Bedingungen umfassen die Anwesenheit von verschiedenen Desoxyribonucleosid-Triphosphaten und deren Derivaten, insbesondere dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP, dInosineTP, 5-Br-dUTP, 7-deaza-dGTP, 8-oxo-dGTP, O6-Me-dGTP und eines die Polymerisation induzierenden Agens, wie DNA-Polymerase oder reverse Transkriptase, in einem geeigneten Puffer – Puffer beinhaltet Bestandteile, die Kofaktoren sind, oder die den pH-Wert, die Ionenstärke, usw., beeinflussen – und bei geeigneter Temperatur. Der Primer ist für eine maximale Effizienz bei der Amplifizierung vorzugsweise einzelsträngig.
Das Komplementär einer Nukleinsäuresequenz, wie hier verwendet, betrifft ein Oligonucleotid, das, wenn es mit der Nukleinsäuresequenz so ausgerichtet ist, dass das 5'-Ende einer Sequenz gepaart ist mit dem 3'-Ende der anderen, in der antiparallelen Assoziation ist. Gewisse Basen, die üblicherweise nicht in natürlichen Nukleinsäuren vorkommen, können von den Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung umfasst werden, zum Beispiel Inosin und 7-Deazaguanin. Die Komplementarität muss nicht perfekt sein; stabile Duplexmoleküle können falsch gepaarte Basenpaare oder nicht gepaarte Basen enthalten.
Die Stabilität eines Nukleinsäureduplexmoleküls wird durch die Schmelztemperatur oder T_M gemessen. Die T_M eines speziellen Nukleinsäureduplexmoleküls unter spezifischen Bedingungen ist die Temperatur, bei der die Hälfte der Basenpaare dissoziiert ist.
Wie hier verwendet betrifft der Begriff Targetsequenz oder Target-Nukleinsäuresequenz den Bereich der Nukleinsäuresequenz, der entweder amplifiziert oder nachgewiesen werden soll, oder beides. Die Zielsequenz sitzt zwischen den beiden Primersequenzen, die für die Amplifikation verwendet werden.
Wie hier verwendet betrifft der Begriff Markierung jedes Atom oder Molekül, das zur Erzeugung eines nachweisbaren – vorzugsweise quantifizierbaren – Signals verwendet werden kann und das an eine Nukleinsäure oder ein Protein gebunden werden kann. Markierungen können mittels Fluoreszenz, Radioaktivität, Kolorimetrie, Gravimetrie, Röntgenbeugung oder -absorption, Magnetismus-, enzymischer Aktivität und dergleichen nachweisbare Signale erzeugen.
Eine Sonde im Sinne der Erfindung ist eine Nukleinsäuresequenz, die an ihrem 3'- oder 5'-Ende oder an beiden, oder intern, oder an den Enden und intern eine oder mehrere Markierungen aufweist, wobei die Markierung ein zur Fluoreszenz befähigter Reporter-Farbstoff sein kann. Dieser fluorescente Reporter-Farbstoff kann beispielsweise ein Fluorescein-Derivat sein. Die Verwendung von fluoreszierenden oder von fluorophoren Sonden hat den Vorteil, das bei gleichzeitiger Verwendung verschiedenfarbiger Fluorophore die Möglichkeit der parallelen sowie einer zeitauflösenden, kontinuierlichen Messung besteht. Die Fluoreszenz lässt sich hierbei auch in einem geschlossenen Reaktionsgefäß beobachten. Die Sonde gemäß der Erfindung ist eine Nukleinsäuresequenz, die neben der Sondenmarkierung am 3'- oder 5'-Ende eine Sequenz aufweist, die komplementär zu der Target-Nukleinsäuresequenz ist. Diese komplementären Bereiche der Sondensequenz werden von Sequenzen flankiert, die komplementär sind zu Sequenzen einer Nukleinsäuresequenz, die einen Sonden-Quencher umfasst.
Ein Sonden-Quencher im Sinne der Erfindung ist demgemäß eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Sonde in mindestens zwei Bereichen, wovon einer 5', der andere 3' des targetspezifischen Teils gelegen ist, hybridisieren kann. Bevorzugt ist, daß der Sonden-Quencher an seinem 3'- oder 5'-Ende, oder intern, bzw. intern und an seinem 3'- oder 5'-Ende eine oder mehrere Markierungen umfasst, die mit der Sonde so interagieren, dass kein Fluoreszenzsignal der Sonde oder im Wesentlichen ein Energietransfer Signal (FRET) detektierbar ist, wenn Sonde und Sonden-Quencher die hierfür erforderliche räumliche Nähe, beispielsweise bei einer Hybridisierung über ihre komplementären Sequenzen untereinander, aufweisen. Die Begriffe Quenching oder Fluoreszenz-Energietransfer betreffen demgemäß den Prozess, durch den, falls ein Fluoreszenzmolekül und ein Quencher-Molekül nahe benachbart liegen, bei einer Anregung des Fluoreszenzmoleküls ein wesentlicher Teil der Energie des angeregten Zustands ohne Strahlung auf den Quencher übertragen wird, wo sie entweder ohne Strahlung verloren geht oder bei einer anderen Emissionswellenlänge als der des Fluoreszenzmoleküls emittiert wird. Das heißt, die Wechselwirkung zwischen einer durch Strahlung angeregten markierten Sonde und dem Sonden-Quencher verursacht zunächst eine strahlungslose Übertragung der Energie des angeregten Fluorophors auf die Quencher-Moleküle; diese können die Energie dann strahlungslos abgeben oder in einer definierten Wellenlänge emittieren. Die Fluoreszenzmoleküle können z.B. fluoreszierende organische Farbstoffe sein, die für eine Bindung an den 3'-terminalen Nucleotid oder 5'-terminalen Nucleotid der Sonde über eine Verbindungsgruppe derivatisiert sind. Vorzugsweise sind die Quencher-Moleküle ebenfalls organische Farbstoffe, die in Abhängigkeit der Ausführungsform fluoreszent sein können. Im Allgemeinen sollte die Absorptionsbande des Quencher-Moleküls im Wesentlichen mit der Fluoreszenzemissionsbande des Fluoreszenzmoleküls überlappen, unabhängig davon, ob das Quencher-Molekül fluoreszent ist oder einfach die von dem Fluoreszenzmolekül übertragene Energie durch einen Zer fall ohne Strahlung freisetzt. Nicht-fluoreszente Quencher-Moleküle, die Energie von angeregten Fluoreszenzmolekülen absorbieren, jedoch die Energie nicht durch Strahlung freisetzen, werden gemäß der Terminologie der Fachliteratur im Sinne der Erfindung ebenfalls als Quencher bezeichnet.
Eine praktische Anleitung für die Auswahl geeigneter Fluoreszenz-Quencher-Paare für bestimmte Sonden ist in der Literatur verfügbar und in den nachstehenden Referenzen beispielhaft dargestellt: Pesce et al., Hrsg., Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971), White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970). Die Literatur enthält auch Referenzen, die ausführliche Listen von fluoreszenten und chromogenen Molekülen und deren relevante optische Eigenschaften für die Auswahl von Fluoreszenz-Quencher-Paaren bereitstellen; vgl. z.B. Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2. Auflage (Academic Press, New York, 1971), Griffiths, Colour and Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976), Bishop, Hrsg., Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972), Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992). Ferner findet sich in der Literatur eine ausführliche Anleitung für die Derivatisierung von Fluoreszenz- und Quencher-Molekülen für die kovalente Bindung über gewöhnliche reaktive Gruppen, die an ein Oligonucleotid angefügt werden können; vgl. US-PS 3,996,345 , US-PS 4,351,760 .
Beispielhafte Fluoreszenz-Quencher-Paare können aus Xanthen-Farbstoffen, einschließlich Fluoresceinen und Rhodamin-Farbstoffen ausgewählt werden. Viele geeignete Formen dieser Verbindungen sind kommerziell erhältlich und enthalten Substituenten auf ihren Phenylgruppen, die als Bindestelle oder als Bindefunktionalität für die Bindung an ein Oligonucleotid verwendet werden können. Eine weitere Gruppe von fluoreszenten Verbindungen sind Naphthylamine mit einer Aminogruppe in der alpha- oder beta-Position. Diese Naphthylamino-Verbindugen umfassen 1-Dimethylamino-naphthyl-5-sulfonat, 1-Anilino-8-naphthalensulfonat und 2-p-Toluidinyl-6-naphthalensulfonat. Andere Farbstoffe umfassen 3-Phenyl-7-isocyanatocoumarin, Acridine wie 9-Isothiocyanatoacridin-Orange, N-(p-(2-Benzoxyzolyl)-phenyl)-maleimid, Benzoxydiazole, Stilbene, Pyrene. Bevorzugte Fluorophore sind weiterhin SYBR Green, Hex, TET, VIC, JOE, NED, Redmond Red, Alexa Red, Cascade Blue, Yakima Yellow, Cy3, Cy3.5, Tamra/Cy3, Texas Red, ROX, Cy5, Cy5.5, Carboxyrhodamine, LC705 und/oder LC640. Als Quencher können beispielsweise weiterhin eingesetzt werden Tamra, Rhodamin, BHQ1 bis BHQ3, Dansyl, Dabcyl, ElleQuencher und/oder Methylorange. Bevorzugt kann auch eine Konjugation der Nukleinsäureproben mit Minor Grove Binder (MGB) sein. Derartige Strukturen sind beispielsweise in Kutyavin et al., 2000, Nucleic Acids Research beschrieben und sind in den Offenbarungsgehalt der Erfindung mit aufgenommen.
Erfindungsgemäß kann man zwei Arten von Quencher- oder Löschprozessen unterscheiden, einmal die dynamische Fluoreszenzlöschung durch Kollisionsprozesse und die statische Fluoreszenzlöschung durch Komplexbildung zwischen dem Fluorophor, das heißt der Sonde und den Quencher- oder Löscher-Molekülen des Sonden-Quenchers. Das Quenching führt demgemäß zu einer Erniedrigung der Quantenausbeute, die durch Fluoreszenzanregung der markierten Sonde detektiert werden kann. Es ist aber beispielsweise auch möglich, dass die Sonden bei einer sehr hohen Konzentration, beispielsweise auf einem bestimmten Nukleinsäureabschnitt, zum so genannten Selbstquenching neigen, das heißt, dass die einzelnen Moleküle in ihrer Bewegung so gestört werden, dass ebenfalls ein Quenchingeffekt – bedingt durch die hohe Sondendichte – auftritt.
Die genannten Substanzen werden in einem ersten Verfahrensschritt mit einer Probe, die die Target-Nukleinsäure umfassen kann oder insbesondere nach der PCR-Reaktion umfasst, in Kontakt gebracht. Durch die strukturelle Ausgestaltung der Sonde hybridisiert diese aufgrund der zu dem Sonden-Quencher komplementären Sequenzen mit dem Sonden-Quencher, wodurch kein Signal oder ein Energie-Transfer-Signal der Sonde detektierbar ist. In einem nächsten Verfahrensschritt wird die Probe beispielsweise mit – zu der Target-Nukleinsäuresequenz komplementären – Oligonucleotidprimern und einer Polymerase denaturiert; selbstverständlich ist es auch möglich, die Denaturierung ohne die Primer und/oder die Polymerase durchzuführen. Die Denaturierung kann insbesondere der erste Schritt der Polymerasekettenreaktion sein, bei dem durch Erwärmen auf ca. 90 °C – ca. 105 °C eine Auftrennung der Doppelstränge in Einzelstränge erfolgt. Anschließend kann die Probe beispielsweise wieder auf ca. 50 °C abgekühlt werden, wobei die Oligonucleotidprimer mit den Enden der Einzelstränge der Target-Nukleinsäuresequenzen hybridisieren und somit eine Wiedervereinigung (reannealing) der ursprünglichen Einzelstränge der Target-Nukleinsäuresequenzen verhindern. Während der Annealingphase rehybridisieren die Sonde und der Sonden-Quencher wieder miteinander, wenn eine für die Sonde spezifische Target-Nukleinsäuresequenz nicht vorhanden ist. Ist jedoch als neugebildetes PCR-Produkt bzw. das DNA-Target eine solche Target-Nukleinsäuresequenz vorhanden, so hybridisiert die Sonde mit ihrer zu der Target-Nukleinsäuresequenz komplementären Sequenz an der Target-Nukleinsäuresequenz und verhindert dadurch die räumliche Annäherung des Sonden-Quenchers an die Sonde bzw. der Löschermoleküle des Quenchers an die Fluoreszenzmarkierung der Sonde. Wird die Sonde, insbesondere die Fluoreszenzmarkierung an der Sonde, mit einer definierten elektromagnetischen Strahlung angeregt, so gibt sie die aufgenommene Energie direkt an die Umgebung in Form von Strahlung ab und wird dadurch mit erhöhter Intensität mit dem Fachmann bekannten Methoden detektiert. Werden beispielsweise im Laufe der PCR immer mehr der Target-Nukleinsäuresequenzen gebildet, so lässt sich dies anhand der zunehmenden bzw. abnehmenden Strahlung durch die Bindung von Sonde/Target-Nukleinsäuresequenz direkt verfolgen.
Bevorzugt ist, dass die Probe unter Bedingungen inkubiert wird, die ein Primerannealing und eine Polymerisation erlauben, wobei bei einer Amplifikation der Target-Nukleinsäuresequenz die Sonde an diese hybridisiert.
Bevorzugt ist weiterhin, dass die Sonde und/oder der Sondenquencher markiert sind, wobei es besonders bevorzugt ist, dass die Sonde und/oder der Sondenquencher eine Fluoreszenzmarkierung aufweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Target-Nukleinsäure quantifiziert wird. Dem Fachmann sind verschiedene Möglichkeiten und Verfahren zur Quantifizierung von Target-Nukleinsäuren bekannt; beispielsweise ist es möglich, in einem System oder in einem Parallelsystem Referenzen zeitgleich oder zeitversetzt zu detektieren, anhand derer die Target-Nukleinsäuresequenzen quantifiziert werden können.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Target-Nukleinsäuresequenzen aus Pflanzenmaterialien, Saatgut, tierischen und pflanzlichen Lebensmitteln, Lebensmittelrohstoffen, Lebensmittelinhaltsstoffen, eukaryotischen Geweben tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sowie Mikroorganismen gewonnen werden. Besonders bevorzugt ist es, dass die Target-Nukleinsäuresequenzen aus einem gentechnisch veränderten Organismus, beispielsweise gentechnisch veränderten Nutzpflanzen oder Haustieren bzw. Nutztieren gewonnen werden.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Target-Nukleinsäuren aus Proben gewonnen werden, die für diagnostische Zwecke, sowohl für die humane Diagnostik, als auch für die tierische Diagnostik, bestimmt sind. Hierzu zählen Proben aus Blut, Seren, Körperflüssigkeiten, Körperausscheidungen, Abstrichen auch zur mikrobiologischen Analyse und Gewebeproben.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, die Probe, sei sie mikrobiellen, pflanzlichen, tierischen, menschlichen oder anderen Ursprungs (z.B Umwelt, Zellkultur), mit Hilfe des Verfahres auf den Genexpressionszustand (nötigenfalls auch unter zur Hilfenahme weiterer Verfahren wie z.B. der Reversen Transcription oder RT-PCR), bestimmte genetische Polymorphismen (z.B. HLA Diagnose, Analyse der Gewebeverträglichkeit zw. Spender und Empfänger), die Anwesenheit apathogener oder pathogener (z.B. human-, tier- oder phytopathogener) Organismen (z.B. Bakterien, Pilze, Viren, Viroide oder Parasiten), genetische Dispositionen zu erblichen oder teilweise erblichen Erkrankungen oder andere Prädispositionen zu untersuchen. Weiterhin, kann das Verfahren zur genetischen Charakterisierung, Typisierung oder Identifizierung von Individuen, Populationen und/oder Klonen eingesetzt werden sowie zur Qualitätskontrolle oder Überwachung fermentativer Prozesse sowie zur Bestimmung von Mutationen, Mutationsraten oder von Ploidiegraden verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden als Target-Nukleinsäuresequenzen, Sonden und/oder Sonden-Quencher Desoxyribonucleotide-umfassende Substanzen eingesetzt. Im Sinne der Erfindung sind Desoxyribonukleinsäuren (DNA) Substanzen zwei unverzweigte, hochmolekulare Polynucleotid-Ketten, die einen umeinander gebundenen Doppelstrang bilden. Die Desoxyribonukleinsäuren können als Doppelhelix oder als Superhelix bzw. Triplehelix vorliegen. Bei drastischer Abnahme des Wassergehaltes geht die B-Form der DNA in die starre A-Form über, wobei in beiden DNA-Formen die Doppelhelix rechtshändig verläuft. Die Z-Form wird auch als Links-DNA bezeichnet, da sie linkshändig verläuft. Eine zentrale Eigenschaft der DNA ist ihre Fähigkeit zu denaturieren und zu renaturieren. Vorteilhafterweise kann DNA erfindungsgemäß einfach durch Erhitzen oder durch Zugabe von alkalischen Substanzen denaturiert werden. Unter geeigneten Bedingungen ist die Denaturierung mit Vorteil reversibel, das heißt, komplementäre Nucleotid-Sequenzen finden wieder zueinander, wobei doppelsträngige DNA-Moleküle entstehen (reannealing). Vorteilhafterweise können Desoxynukleinsäuren, das heißt genomische und/oder cDNA-Moleküle, selektiv in vitro, beispielsweise in-situ, durch eine Polymerase-Kettenreaktion vermehrt werden.
Bevorzugt ist, dass als Derivate insbesondere PNA und/oder PTO eingesetzt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als Polymerase eine DNA-Polymerase, die eine 5'→3'- oder 3'→5'-Exonuklease-Aktivität besitzen kann, verwendet. Der Begriff der 5'→3'-Exonuklease-Aktivität/3'→5'-Exonuklease-Aktivität oder 5' zu 3'-Exonuklease-Aktivität oder 3' zu 5'-Exonuklease-Aktivität betrifft die Aktivität einer matritzenspezifischen Nukleinsäurepolymerase, die eine 5'→3'-Aktivität bzw. eine 3'→5'-Aktivität umfasst, die üblicherweise mit einigen DNA-Polymerasen assoziiert ist. Vorteilhafterweise weist diese DNA-Polymerase keine 5'→3'-Exonuklease-Aktivität auf, das heißt, es erfolgt keine Spaltung einer Phoshordiesterbindung des Sondenoligos.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in parallelen Ansätzen eine Targetsequenz von besonderem Interesse und eine als Referenz benötigte allgemeinbekannte Sequenz amplifiziert. Für beide Systeme wird die Fluoreszenzänderung während der Zyklen gemessen und der Zyklus bestimmt, an dem die Fluoreszenzstrahlung einen vorher festgelegten Schwellenwert über- bzw. unterschreitet. Durch den Vergleich mit einer Probe mit einem bekannten Gehalt der beiden Sequenzen werden deren Verhältnisse in der Probe, bzw. bei geeigneten Referenzmaterialien deren absolute Menge bestimmt.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird als Sonde ein Fluorescein-Farbstoff und als Sonden-Quencher ein Rhodamin-Farbstoff eingesetzt. Mit diesem fluoreszierenden Sonden/Sonden-Quencher-Paar, das in jeweils einer Oligonucleotidsequenz aufgenommen oder integriert sein kann oder mit dieser assoziiert vorliegt, ist es möglich, biologische Ereignisse zu verfolgen, die im Wesentlichen darauf basieren, dass die fluoreszierende Sonde und der Sonden-Quencher voneinander getrennt oder in einem minimalen Löschungsabstand zueinander gebracht werden. Die Fluoreszenz des Fluorescein-Farbstoffes steigt an, wenn er von dem Sonden-Quencher Rhodamin getrennt wird. Der Sonden-Quencher Rhodamin ist hierbei ein Löschungsmolekül, das die Fluoreszenzenergie des angeregten Fluorescein-Farbstoffes absorbieren kann, wobei es das Fluoreszenzsignal, welches ansonsten von dem angeregten Fluorescein-Farbstoff freigesetzt wird, löscht. Neben Rhodamin können insbesondere seine Derivate, oder Texasrot, Fluorescein und seine Derivate, wie 5-Brommethyl-Fluorescein, Lucifergelb, IAEDANS, 7-Me₂N-Coumarin-4-Acetat, 7-OH-4-CH₃-Coumarin-3-Acetat, 7-NH₂-4-CH₃-Coumarin-3-Acetat (AMCA), Monobrombiman, Pyrentrisulfonate, wie Kaskadenblau, und Monobromtrimethylammoniobiman eingebracht werden. Weiterhin können eingesetzt werden BHQ-1, QSY-7, BHQ-2, BHQ-3, Dansyl, Dabcyl oder auch andere Strukturen, die auch als Darkquencher bezeichnet werden können. Selbstverständlich ist es auch möglich, einen der folgenden Marker einzusetzen: Acridine, Alexa 430, Alexa 488, Alexa 594, AMCA, BODIPY FL-Br₂, BODIPY TMR, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY TR, BODIPY R6G, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, Cy2^TM, Cy3^TM, Cy3.5^TM, Cy5^TM, Cy5.5^TM, Cy7^TM, Edans, Eosin, Erythrosin, 6-Fam, Tet, Joe, Hex, LightCycler 640, LightCycler 705, NBD, Oregon Green 488, 500, 514, Rhodol Green, Tamra, TMRIA, Rox, NED and VIC. Generell werden Fluorophore mit einer weiteren Stokes-Verschiebung bevorzugt, um die Verwendung von Fluorimetern mit Filtern statt eines Monochromators zuzulassen und die Effizienz des Nachweises zu erhöhen. Der Fluorescein-Farbstoff kann selbstverständlich auch so angeregt werden, dass ein wesentlicher Teil der Energie ohne Strahlung auf den Quencher bzw. den Rhodamin-Farbstoff übertragen wird und ein Fluoreszenzsignal in einer anderen Emissionswellenlänge emittiert wird. Die Farbstoffe bzw. Fluoreszenz-Farbstoffe Fluorescein und Rhodamin und geeignete Bindungsverfahren für die Bindung an Oligonucleotide bzw. Oligonukleinsäuresequenzen sind in US 5 188 934 und EP 0272007 beschrieben, die in den Offenbarungsgehalt der Erfindung mit aufgenommen sind.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird die innerhalb einer oder mehrerer fixierter Zellen lokalisierte Target-Nukleinsäuresequenz detektiert. Dieses auch als in-situ PCR bezeichnete Verfahren betrifft insbesondere eine PCR-Amplifikation in fixierten Zellen. Die spezifische amplifizierte Nukleinsäuresequenz ist im wesentlichen in einer Zelle oder subzellularen Struktur enthalten. Die Zellen können mit Vorteil in einer wässrigen Suspension vorliegen oder können Teil einer Gewebeprobe, wie eine histochemische Sektion oder ein zytochemischer Abstrich, sein. Der Begriff histochemische Sektion betrifft erfindungsgemäß eine feste Probe eines biologischen Gewebes, das eingefroren oder chemisch fixiert und durch Einbetten in Wachs oder Plastik gehärtet, in dünne Scheiben geschnitten und an einen festen Träger wie einen Objektträger gebunden ist. Ein zytochemischer Abstrich ist insbesondere eine Zellsuspension von beispielsweise Blutzellen, die chemisch fixiert und auf einen Objektträger aufgebracht sind. Bevorzugt werden die Zellen durch Reagenzien, die für eine PCR-Reaktion erforderlich sind, durch Verdau mit Protease, Extraktion mit einer oberflächenaktiven Substanz oder einem organischen Lösungsmittel oder durch andere Permeabilisierungsverfahren für die PCR-Reagenzien durchlässig gemacht. Unter fixierten Zellen sind demgemäß Proben von Zellen zu verstehen, die chemisch behandelt wurden, um die zellulären Strukturen, vor allem Membranen, gegenüber einer Beschädigung durch Veränderung des Lösungsmittels, Veränderung der Temperatur, des mechanischen Stresses und/oder der Austrocknung zu verstärken. Die Zellen können in Suspension oder als Teil einer Gewebeprobe fixiert werden. Fixierungsmittel für die Zellen sind im allgemeinen Chemikalien, die die Proteinbestandteile der zellulären Strukturen vernetzen, vorzugsweise durch Reaktion mit den Aminogruppen der Proteine. Solche Mittel sind beispielsweise Formalin, 95%-iger Ethanol, Formaldehyd, Glutaraldehyd und andere. Die Durchlässigkeit fixierter Zellen kann vorteilhafterweise durch die Behandlung mit Protease oder oberflächenaktiven Substanzen oder organischen Lösungsmitteln, die insbesondere Membranlipide lösen, erhöht werden.
Bevorzugt ist auch die Detektion von Target-Nukleinsäuresequenzen auf bestimmten Membranen, wie sie beispielsweise bei der Southern-Blot-Methode verwandt werden. Selbstverständlich ist es aber möglich, Target-Nukleinsäuresequenzen in jedem Verfahren zu detektieren, bei dem die Fähigkeit von Nukleinsäuresequenzen zur Hybridisierung für Nachweiszwecke oder anderes genutzt wird.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die fixierten Zellen, die Sonde, der Sonden-Quencher in einer Behälteranordnung lokalisiert. Vorteilhafterweise ist das Zerlegen einer Behälteranordnung zwischen Amplifikations- und Sondenhybridisierungsschritten nicht erforderlich, um Target-Nukleinsäuresequenzen beispielsweise in einer oder mehreren fixierten Zellen zu detektieren. Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn durch eine in-situ PCR Krankheitserreger oder virale Sequenzen detektiert werden sollen.
Bevorzugt ist weiterhin, dass das Verfahren zur Allelspezifischen PCR (KTC) oder zur Detektion von SNPs eingesetzt wird. Die SNPs sind beispielsweise für die Entwicklung von Arzneimitteln bzw. für patientenspezifische Diagnoseverfahren relevant.
Bevorzugt ist desweitern, dass gleichzeitig mehrere Systeme untersucht werden (Multiplexierung), wobei beispielsweise ein oder mehrere Systeme Housekeeping bzw. Referenzgene detektieren, während mit einem bzw. weiteren Systemen spezifische Sequenzen detektiert werden.
Die Erfindung betrifft auch eine Verwendung (i) einer Sonde umfassend eine zu einer Target-Nukleinsäuresequenz komplementäre Sequenz, die von zu einem Sonden-Quencher komplementären Sequenzen flankiert ist und (ii) den Sonden-Quencher umfassend eine durch einen Spacer getrennte komplementäre Sequenz zu der Sonde zur Detektion der Target-Nukleinsäuresequenzen.
Bevorzugt ist es weiterhin, das erfindungsgemäße Verfahren zur Prophylaxe, Diagnose, Therapie, Verlaufskontrolle und/oder Nachbehandlung von Krankheiten bzw. pathogenen Veränderungen in Organismen oder Abweichungen von physiologischen Normwerten einzusetzen. Es kann beispielsweise vorgesehen sein, daß durch das erfindungsgemäße Verfahren Target-Nukleinsäuren detektiert werden, die dafür verantwortlich sind, daß Stoffwechselprozesse in Organismen in einer Art und Weise reguliert werden, daß nachteilhafte Modifikationen für den Organismus, beispielsweise Krankheiten, auftreten. Durch die Offenbarung der Erfindung ist es dem Fachmann jedoch auch möglich, das Verfahren zur Therapie bzw. zur Verlaufs kontrolle und/oder Nachbehandlung von Krankheiten einzusetzen.
Die Erfindung betrifft einen Detektionskomplex, der aus einer Sonde umfassend eine zu einer Target-Nukleinsäuresequenz komplementäre Sequenz, die von zu einem Sonden-Quencher komplementären Sequenzen flankiert ist, und einem Sonden-Quencher umfassend eine durch einen Spacer getrennte komplementäre Sequenz zu einer Sonde besteht. Bevorzugt liegen die Sonde und der Sonden-Quencher in einem Verhältnis bis zu einem fünfzehnfachen Überschuß einer der beiden Komponenten vor. Besonders bevorzugt ist dabei ein Verhältnis von zweifach bis sechsfach.
Die Erfindung betrifft auch einen Kit, der den Detektionskomplex umfaßt und der bevorzugt weitere Reagenzien wie Primer, dNTP, Pufferkompomenten und/oder Polymerasen umfassen kann. Mit dem Kit ist es möglich, das vorstehend beschriebene Verfahren durchzuführen.
Bevorzugt umfaßt der Kit (i) eine Sonde umfassend zu einer Target-Nukleinsäuresequenz komplementären Sequenz, die von zu einem Sonden-Quencher komplementären Sequenzen flankiert ist und (ii) den Sonden-Quencher umfassend eine durch einen Spacer getrennten komplementären Sequenz zu einer Sonde.
Das erfindungsgemäße Verfahren, die Verwendung und der Kit weisen zahlreiche Vorteile auf. Die Sonden für die unterschiedlichen Target-Nukleinsäuresequenzen unterscheiden sich nur in der spezifischen Target-Erkennungssequenz. Dadurch kann für jedes System der gleiche Sonden-Quencher verwendet werden. Hierdurch kann insbesondere in Multiplexsystemen die Zahl der eingesetzten Nukleinsäurefragmente reduziert werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Sonden nur einfach markiert werden, wodurch ihre Herstellung billiger und ihre Qualität einfacher zu kontrollieren ist. Bei der Hybridisierung der Sonden nach der Denaturierung kommt es zu einer Konkurrenzsituation zwischen der Target-Nukleinsäuresequenz und dem Sonden-Quencher. Dies erhöht vorteilhafterweise die Sensitivität der Sonde auf Mismatches und führt insgesamt zu einer Erhöhung der Spezifität auf verschiedene Mismatches des Verfahrens. Der Anstieg des Fluoreszenzsignals im Verlauf der Bildung der Target-Nukleinsäuresequenzen – insbesondere durch die PCR – ist unabhängig von einer Exonucleaseaktivität der Polymerase. Weitere Vorteile gegenüber dem Stand der Technik sind, dass die Sonden und die Sonden-Quencher auf zwei nicht miteinander verbundenen Nukleinsäuresequenzen positioniert sind, wobei die Detektion der Fluoreszenz nicht von der Exonucleaseaktivität der Polymerase abhängig ist und das Sonden/Sonden-Quencher-Paar unabhängig von den Primern ausgewählt werden kann, wobei insbesondere die Nukleinsäuresequenz des Sonden-Quenchers unabhängig von der Target-Nukleinsäuresequenz ist und während der Detektion das Signal der Sonde direkt – das heißt ohne eine FRET zwischen Sonden und Nukleinsäuresequenz – gemessen wird.
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich wie folgt zusammenfassen: Der Quencher ist universell einsetzbar, in Multiplex-Reaktionen ist nur ein Quencher-Signal erforderlich, die Entwicklung der Sonde erfordert vorteilhafterweise nur einen geringen Aufwand und die Herstellung einer einfach markierten Sonde verursacht nur geringe Kosten, weiterhin ist vorteilhaft, dass keine Phosphoryllierung der Sonde notwendig ist und dass eine hohe Spezifität der konkurrierenden Sekundärstrukturen erreicht werden kann und im Gegensatz zu einigen bekannten Verfahren kann mit einem kleinen Amplikon gearbeitet werden, wobei nur ein geringes Hintergrundsignal detektierbar ist.
Im Folgenden soll die Erfindung anhand eines Beispiels näher erläutert werden, ohne auf dieses Beispiel beschränkt zu sein.
Anwendungsbeispiel für Doppelstrang Sonde
Template:
Als Template wurde eine 1:10 Verdünnungsreihe des Plasmids pMaiA, welches die Amplikonsequenz beinhaltet, mit den Konzentrationen 100 000 K/Rkt, 10 000 K/Rkt, 1 000 K/Rkt, 100 K/Rkt, 10 K/Rkt und 0 K/Rkt in Duplikaten eingesetzt.
Pufferkomponenten:
Der MasterMix enthielt 1 x Puffer A (von Applied Biosystems, enthält Rox als interne Fluoreszenzkontrolle), je 200 μM dATP, dCTP, dGTP und 400 μM dUTP, 9 mM MgCl₂, 300 nM Primer 35S-for (5'-CTg RCg TAA ggg ATg ACg CAC-3'), 300 nM Primer 35S-rev (5'-CTC TCC AAA TgA AAT gAA CTT CC-3'), 160 nM Sonde 35SsFam-S3 (5'-AgC CCg CCT TCg CAA gAC CCT TCC TCC gCC CgR-Fam-3'), 640 nM Quencher uniTAMRA-3 (5'-Tamra-TCg ggC ggg ATT Agg gCg ggC T-Pho-3') und 0,04 U/μl AmpliTaq Gold (Applied Biosystems). Die Sonde ist in 1 dargestellt, wobei

1 ein targetspezifischer Sequenzabschnitt des Sondenoligos,
2 ein quencherkomplementärer Sequenzabschnitt,
3 ein Spacer zwischen sondenkomplementären Sequenzabschnitten des Quencheroligos,
4 ein sondenkomplementärer Sequenzabschnitt des Quencheroligos,
5 ein Reporter- bzw. Sondenfarbstoff und
6 ein Quenchermolekül ist
7 die Target-Nukleinsäuresequenz ist.

Durchführung:
Der MasterMix wurde hergestellt und je 20 μl in eine 96 well PCR-Platte vorgelegt. Anschließend wurden je well 5 μ1 Template zugegeben, die Platte mit einer optischen Folie verschlossen und in einem ABI 7700 Prism Realtime-PCR-Gerät gecycelt. Das Temperaturprofil setzte sich zusammen aus 10 min Denaturierung bei 95 °C, dann 45 Zyklen mit je 15 sec Denaturierung bei 95 °C und anschließender Annealing und Elongation bei 55 °C für 1 min. Die Fluoreszenz wurde in der Annealing/Elongation Phase gemessen.
Auswertung:
Die gemessenen Cts (Ct ist der Zyklus, bei dem das Fluoreszenzsignal einen eingestellten Schwellenwert überschreitet) werden gegen die logarithmierten Kopienzahlen aufgetragen, was in 2 dargestellt ist. Bei einer idealen Amplifikationseffizienz erhält man eine Steigung von –3,321. Ermittelt wurde bei diesem Versuch eine Steigung von –3,23 zwischen 100 000 und 10 Kopien Template bei einer Korrelation von 0,998.

Claims

Verfahren zur Detektion einer Target-Nukleinsäuresequenz, wobei die Target-Nukleinsäuresequenz mit (i) einer Sonde umfassend eine zu der Nukleinsäuresequenz komplementäre Sequenz, die von zu einem Sonden-Quencher komplementären Sequenzen flankiert ist und (ii) dem Sonden-Quencher umfassend eine durch einen Spacer getrennte komplementäre Sequenz zu der Sonde in Kontakt gebracht und die Sonde und/oder der Sonden-Quencher detektiert werden.
Verfahren zur Detektion einer Target-Nukleinsäuresequenz in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass a) ein Sonden-Quencher umfassend eine durch einen Spacer getrennte komplementäre Sequenz zu einer Sonde und die Sonde umfassend eine zu der Target-Nukleinsäuresequenz komplementäre Sequenz, die von zu dem Sonden-Quencher komplementären Sequenzen flankiert ist, mit der Probe in Kontakt gebracht wird, b) die Probe unter denaturierenden Bedingungen inkubiert wird, wobei die Target-Nukleinsäuresequenz, die Sonde und/oder der Sonden-Quencher denaturiert vorliegen, c) die Probe unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert wird, wobei die Sonde an den Sondenquencher und/oder die Target-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, und d) die Sonde und/oder der Sonden-Quencher detektiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe unter Bedingungen inkubiert wird, die ein Primerannealing und eine Polymerisation erlauben, wobei bei einer Amplifikation der Target-Nukleinsäuresequenz die Sonde an die Target-Nukleinsäuresequenz hybridisiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde und/oder der Sonden-Quencher markiert sind, insbesondere mit Fluoreszenzmarkierungen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Target-Nukleinsäuresequenz quantifiziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Target-Nukleinsäuresequenz aus Pflanzenmaterialien, Lebensmitteln, Lebensmittelinhaltsstoffen, Saatgut, Proben für die Diagnostik und/oder gentechnisch veränderten Organismen gewonnen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als die Target-Nukleinsäuresequenzen, die Sonden und/oder die Sonden-Quencher Desoxyribonukleotide-umfassende Strukturen oder deren Derivate eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Target-Nukleinsäuresequenzen, die Sonden und/oder die Sonden-Quencher in einer Behälteranordnung und/oder auf einem Chip lokalisiert werden.
Verwendung (i) einer Sonde umfassend eine zu einer Target-Nukleinsäuresequenz komplementäre Sequenz, die von zu einem Sonden-Quencher komplementären Sequenzen flankiert ist und (ii) den Sonden-Quencher umfassend eine durch einen Spacer getrennte komplementäre Sequenz zu der Sonde zur Detektion der Target-Nukleinsäuresequenzen.
Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Target-Nukleinsäuresequenz während einer PCR detektiert wird.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Quantifizierung der Target-Nukleinsäuresequenz.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur gleichzeitigen Detektion mehrerer Systeme in einem Ansatz als ein Multiplex-System.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Prophylaxe, Diagnose, Therapie und/oder Nachbehandlung.
Kit umfassend (i) eine Sonde umfassend eine zu einer Target-Nukleinsäuresequenz komplementäre Sequenz, die von zu einem Sonden-Quencher komplementären Sequenzen flankiert ist und/oder (ii) den Sonden-Quencher umfassend eine durch einen Spacer getrennte komplementäre Sequenz zu der Sonde.