DE69610304T2

DE69610304T2 - Methoden and reagentien fuer die kombination einer pcr-amplifizierung mit einem hybridisierungs-assay

Info

Publication number: DE69610304T2
Application number: DE69610304T
Authority: DE
Inventors: Paul E. Mayrand
Original assignee: Perkin Elmer Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1995-05-05
Filing date: 1996-04-05
Publication date: 2001-04-05
Anticipated expiration: 2016-04-06
Also published as: US7241596B2; US7413708B2; US20030215826A1; US6395518B1; US20080050742A1; CA2219891A1; US7847076B2; JP2005110666A; CA2219891C; AU5442896A; US20110275071A1; JPH11504219A; JP4040519B2; US5691146A; US20090258351A1; JP2004000185A; EP0826066A1; JP4040087B2; ATE196322T1; US20050227247A1

Description

Die Erfindung betrifft allgemein die Amplifizierung und Hybridisierung von Nukleinsäuren und insbesondere Verfahren und Zusammensetzungen für die PCR- und Sonden-Hybridisierung mit einem einzigen Reagenziengemisch.
Nukleinsäure-Amplifizierungsverfahren sind wirksame Mittel für die Untersuchung von genetischem Material. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist insbesondere ein Werkzeug von großer Bedeutung und findet Anwendung bei der Klonierung, Analyse der genetischen Expression, DNA-Sequenzierung, der genetischen Kartierung, Arzneistoff-Entdeckung, gerichtsmedizinischen Untersuchungen und ähnlichem; vgl. z. B. Innis et al., in PCR Protocols A guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego (1990) und US- PSen Nr. 4,683,195, 4,683.
In vielen wichtigen Anwendungen ist es zusätzlich zur Amplifikation einer Ziel-Nukleinsäuresequenz wünschenswert, diese Sequenz weiter durch Behandlung mit einer Nukleinsäure- Hybridisierungssonde, d. h. einem markierten einzelsträngigen Polynukleotid, das zu der gesamten oder einem Teil der Zielsequenz komplementär ist, zu charakterisieren; vgl. z. B. Nucleic Acid Hybridization, Hames et al., Hrsg., IRL Press, Oxford (1985). Die Hybridisierung mit einer Sonde kann für eine zusätzliche Sequenzselektivität gegenüber einer einfachen PCR-Amplifikation sorgen und kann die Charakterisierung vieler Sequenzstellen in der Ziel- Nukleinsäuresequenz in einer unabhängigen Weise ermöglichen.
Üblicherweise wurden PCR- und Sonden-Hybridisierung getrennt voneinander durchgeführt. Es wäre jedoch besser, die PCR und die Sonden-Hybridisierungsreaktionen in Kombination mit einem einzigen Reagenziengemisch, das PCKrReagenzien und Hybridisierungsreagenzien enthält, durchzuführen. Eine Kombination von PCR und dem Hybridisierungsverfahren bietet mehrere Vorteile: (i) die Zugabe nur eines Reagenzes ist erforderlich und ermöglicht so, dass die kombinierten Reaktionen erfolgen, ohne dass die Reaktionsgefäße geöffnet werden müssen, wodurch die Möglichkeit einer Probendurchmischung und -kontamination vermindert wird; (ii) weniger Reagenzien sind erforderlich; (iii) weniger Schritte, bei denen Reagenzien zugegeben werden, sind erforderlich, was eine Automatisierung besser voranschreiten lässt; und (iv) im Fall von in situ-Verfahren ist kein Auseinandernehmen des Probenbehältnisses erforderlich, das dem Schutz der zellulären Probe während der Thermozyklisierung dient.
Ein bekanntes Verfahren, das PCR mit Sonden-Hybridisierung in einer einzigen Reaktion kombiniert, ist die als "Taqman" bekannte Technik; vgl. z. B. Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 7276-7280 (1991). In dem Taqman-Assay wird eine Oligonukleotid-Sonde in die PCR-Reaktion gegeben, die am 3'-Ende nicht verlängerbar ist, am 5'-Ende markiert ist und entworfen wurde, um mit der Zielsequenz zu hybridisieren. Hybridisierung des Sondenmoleküls an einen Strang des PCR-Reaktionsprodukts während der Amplifikation schafft ein für die Exonuklease-Aktivität der PCR-Polymerase geeignetes Substrat. Somit baut die 5'→3'- Exonuklease-Aktivität des Polymerase-Enzyms während der Amplifikation das Sondenmolekül in kleinere Fragmente ab, die von der nicht-abgebauten Sonde unterschieden werden können. Obwohl er merkliche Verbesserungen gegenüber früheren Verfahren aufweist, besitzt der Taqman-Assay eine Reihe von entscheidenden Nachteilen, die seine Anwendung begrenzen, einschließlich (i) das Erfordernis, dass das in der PCR verwendete Polymerase- Enzym eine 5'→3'-Exonuklease-Aktivität aufweisen muss, (ii) die 5'→3'-Exonuklease-Aktivität muss zum wirksamen Verdau eines mit einem Farbstoff markierten Nukleotids fähig sein, und (iii) das nachweisbare Produkt des Verdaus ist klein und diffundiert schnell, was eine räumliche Lokalisierung der Zielsequenz bei einer Anwendung in in situ-Verfahren beeinträchtigen kann.
Ein zweites bekanntes Verfahren, das PCR mit Hybridisierung in einer einzigen Reaktion kombiniert, ist das von Higuchi et al., in Biotechnology 10 : 413-417 (1992) beschriebene. Bei diesem Verfahren wird Ethidiumbromid zu der PCR-Reaktion hinzugegeben und eine Erhöhung der Fluoreszenz kann mit der Anhäufung von doppelsträngigem PCR-Produkt in Bezug gebracht werden, da die Fluoreszenz des Ethidiumbromids in Gegenwart doppelsträngiger DNA steigt. Jedoch bietet dieses Verfahren keine Sequenzspezifität außer der PCR-Reaktion und ist auf den Nachweis einer einzigen Sequenzstelle innerhalb der Ziel-Nukleinsäuresequenz beschränkt.
Ein drittes Verfahren, das die kombinierte Amplifikation und Hybridisierung ermöglicht, ist das von Bagwell in der EP-A2-0 601 889 beschriebene. Das in dem Verfahren von Bagwell verwendete Sondenmolekül umfasst eine Nukleotidsequenz, die (i) ein zu der Ziel-Nukleinsäure komplementäres Segment und (ii) ein Segment, das zur Bildung einer oder mehrerer Haarnadeln fähig ist, besitzt. Das Sondenmolekül umfasst auch kovalent gebundene Fluoreszenz- und Quencher-Moleküle, die derart angeordnet sind, dass bei der Bildung einer Haarnadel das Fluoreszenzmolekül und das Quencher-Molekül nahe genug beieinander liegen, so dass ein Resonanz-Energietransfer zwischen ihnen möglich ist. Dieses Verfahren besitzt den großen Mangel, dass es die möglichen Sondensequenzen auf die begrenzt, die zur Bildung einer Haarnadelstruktur fähig sind. Außerdem wird die Kinetik und Thermodynamik der Bindung des Sondenmoleküls an das Ziel nachteilig durch das Auftreten der Haarnadelstruktur beeinträchtigt.
Die Erfindung betrifft allgemein Verfahren und Reagenzien, die für kombinierte Amplifikation und Nachweis der amplifizierten Nukleinsäure-Zielsequenz durch Sonden-Hybridisierung in einem einzigen Reaktionsgefäß mit einem einzigen Reagenz verwendbar sind.
Eine erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung von Verfahren und Reagenzien für die Amplifikation und den Sonden-Nachweis amplifizierter Zielsequenzen, wobei die Amplifikations- und Hybridisierungsschritte in einer kombinierten Weise erfolgen, so dass die Zugabe von Reagenzien nach dem Amplifikationsschritt nicht erforderlich ist.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung von Verfahren und Reagenzien für die Amplifikation und den Sonden-Nachweis amplifizierter Zielsequenzen in Zellen oder Gewebesektionen, wobei ein Zerlegen einer Behälteranordnung zwischen den Amplifikations- und Hybridisierungsschritten nicht erforderlich ist.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung von Verfahren und Reagenzien für die Amplifikation und den Sonden-Nachweis von amplifizierten Zielsequenzen, wobei ein einziges Reagenziengemisch für die Amplifikations- und Hybridisierungsschritte verwendet wird.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung von Verfahren und Reagenzien für die Amplifikation und Hybridisierung von amplifizierten Zielsequenzen in Zellen oder Gewebesektionen, wobei kein Waschschritt zwischen den Amplifikations- und Hybridisierungsschritten erforderlich ist.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung einer Sonden-Zusammensetzung für die Verwendung in den vorstehenden Verfahren, die nachweisbar unterschiedliche Fluoreszenz-Charakteristika besitzt, abhängig davon, ob sie in einem doppelsträngigen Zustand, wie hybridisiert an eine komplementäre Zielsequenz, oder in einem einzelsträngigen Zustand vorliegt.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung von Oligonukleotid-Sonden, die resistent gegenüber der 5'→3'-Exonuklease-Aktivität von Polymerase-Enzymen sind.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung von markierten Sonden, bei denen zum Nachweiszeitpunkt der Marker an eine große, langsam diffundierende Spezies, d. h. eine Spezies mit einer Größe, die größer oder gleich der Größe der Sonde ist, gebunden wird.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung von Sonden, die für ein unterschiedliches Signal zwischen dem doppelsträngigen und einzelsträngigen Zustand keine Haarnadelstrukturen erfordern.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung von Verfahren und Reagenzien für die Amplifikation und den Sonden-Nachweis von amplifizierten Zielsequenzen, wobei die Polymerase keine 5'→3'-Exonuklease-Aktivität besitzen muss.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung von Verfahren und Reagenzien für die Amplifikation und den Sonden-Nachweis von amplifizierten Zielsequenzen, wobei viele Sequenzstellen in einer einzigen Zielsequenz nachgewiesen werden können.
Eine andere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung verschiedener Reagenzien- Kits für die Durchführung der vorstehend genannten Verfahren.
Die vorstehend genannten und weitere erfindungsgemäße Aufgaben werden in einem Aspekt durch eine Oligonukleotid-Sonde gelöst, die aus einem Oligonukleotid besteht, das an eine Ziel-Polynukleotidsequenz hybridisieren kann. Das Oligonukleotid ist derart modifiziert, dass das 5'-Ende unempfindlich gegenüber einem Verdau durch die 5'→3'-Exonuklease-Aktivität einer Polymerase ist, d. h. das 5'-Ende wird nicht durch eine Polymerase mit einer 5'→3'-Exonuklease-Aktivität erkannt, und dass das 3'-Ende unempfindlich gegenüber der 5'→3'-Verlängerungsaktivität einer Polymerase ist, d. h., das 3'-Ende wird nicht durch eine Polymerase mit einer 5'→3-Verlängerungsaktivität erkannt. Weiterhin umfasst die Oligonukleotid-Sonde ein fluoreszierendes Molekül, das an einer ersten Stelle des Oligonukleotids gebunden ist, und ein Quencher-Molekül, das an eine zweite Stelle des Oligonukleotids gebunden ist. Das Quencher-Molekül löscht im wesentlichen die Fluoreszenz des Fluoreszenzmoleküls, falls die Oligonukleotid-Sonde sich in einem einzelsträngigen Zustand befindet, und Fluoreszenz ist im wesentlichen nicht-gelöscht, falls sich die Oligonukleotid- Sonde in einem doppelsträngigen Zustand befindet. Alternativ sind das Fluoreszenz- und Quencher-Molekül durch wenigstens 18 Nukleotide getrennt.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein erstes Verfahren für die kombinierte PCR- Amplifikation und Sonden-Hybridisierung bereit. In diesem Verfahren wird eine Ziel-Nukleinsäuresequenz mit PCR-Reagenzien in Kontakt gebracht, einschließlich wenigstens zwei PCR-Primer, ein Polymerase-Enzym und eine wie vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Oligonukleotid-Sonde. Dieses Gemisch wird dann einer thermischen Zyklisierung unterzogen, die für die Amplifikation der durch die PCR-Reagenzien spezifizierten Ziel-Nukleinsäuresequenz ausreichend ist.
In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung ein zweites Verfahren für eine kombinierte PCR- Amplifikation und Sonden-Hybridisierung bereit, wobei die Ziel-Nukleinsäuresequenz mit PCR-Reagenzien in Kontakt gebracht wird, einschließlich wenigstens zwei PCR-Primer und ein Polymerase-Enzym, im wesentlichen ohne 5'→3'-Exonuklease-Aktivität und eine Oligonukleotid-Sonde. Die Oligonukleotid-Sonde umfasst ein Fluoreszenzmolekül, das an eine erste Stelle des Oligonukleotids gebunden ist, und ein Quencher-Molekül, das an eine zweite Stelle des Oligonukleotids gebunden ist. Das Quencher-Molekül löscht im wesentlichen die Fluoreszenz des Fluoreszenzmoleküls, falls die Oligonukleotid-Sonde in einem einzelsträngigen Zustand vorliegt, und die Fluoreszenz ist im wesentlichen nicht-gelöscht, falls die Oligonukleotid-Sonde in einem doppelsträngigen Zustand vorliegt. Zusätzlich ist das 3'- Ende der Sonde unempfindlich gegenüber der 5'→3'-Verlängerungsaktivität einer Polymerase. Die Ziel-Nukleinsäuresequenz, die Oligonukleotid-Sonde und die PCR-Reagenzien werden einer thermischen Zyklisierung unterzogen, die für die Amplifikation der durch die PCR-Reagenzien spezifizierten Ziel-Nukleinsäuresequenz ausreichend ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die 5'→3'-Exonuklease-Aktivität der Polymerase vor Nachweis der Sonde deaktiviert und es ist nicht erforderlich, dass das Polymerase- Enzym keine 5'→3'-Exonuklease-Aktivität besitzt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung eines ersten bevorzugten Verfahrens einer kombinierten PCR- und Sonden-Hybridisierung, wobei ein Temperaturunterschied zwischen der Schmelztemperatur (Tm) der Sonde und der Reaktionstemperatur der PCR-Polymerisation eingesetzt wird, um eine Störung des PCR-Polymerisationsschritts durch die Sonde und einen Verdau der Sonde zu verhindern.
Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung eines zweiten bevorzugten Verfahrens einer kombinierten PCR- und Sonden-Hybridisierung, wobei ein Strang-Verdränger verwendet wird, um eine Störung des PCR-Polymerisationsschritts durch die Sonde und einen Verdau der Sonde zu verhindern.
Im Nachfolgenden werden die erfindungsgemäßen bevorzugten Ausführungsformen im Detail beschrieben. Während die Erfindung im Zusammenhang mit den bevorzugten Ausführungsformen beschrieben werden wird, ist sie nicht auf diese Ausführungsformen begrenzt. Vielmehr umfasst sie Alternativen, Modifikationen und Äquivalente, die durch die beigefügten Ansprüche definiert sind.

1. PCR- und in situ-PCR

Der Begriff "PCR-Reagenzien" betrifft hier Chemikalien, abgesehen von der Ziel-Nukleinsäuresequenz, die für die Durchführung der PCR erforderlich sind. Diese Chemikalien bestehen im allgemeinen aus fünf Komponentenklassen: (i) wässriger Puffer, (ii) wasserlösliches Magnesiumsalz, (iii) wenigstens vier Desoxyribonukleotidtriphosphate (dNTPs), (iv) Oligonukleotid-Primer (normalerweise zwei Primer für jede Zielsequenz, wobei die Sequenzen die 5'-Enden der zwei komplementären Stränge der doppelsträngigen Zielsequenz definieren) und (v) eine Polynukleotid-Polymerase, vorzugsweise eine DNA-Polymerase, insbesondere eine thermostabile DNA-Polymerase, d. h. eine DNA-Polymerase, die Temperaturen zwischen 90ºC und 100ºC für eine Gesamtzeit von wenigstens 10 Minuten toleriert, ohne mehr als die Hälfte ihrer Aktivität zu verlieren.
Die vier gewöhnlichen dNTPs sind Thymidintriphosphat (dTTP), Desoxyadenosintriphosphat (dATP), Desoxycytidintriphosphat (dCTP) und Desoxyguanosintriphosphat (dGTP). Diese gewöhnlichen Triphosphate können durch dNTPs ergänzt oder ersetzt werden, die Basen- Analoga enthalten, die in ähnlicher Weise zu den gewöhnlichen vier Basen eine Watson- Crick-Basenpaarung eingehen, wie z. B. Desoxyuridintriphosphat (dUTP).
"In situ-PCR" betrifft eine PCR-Amplifikation in fixierten Zellen, damit eine spezifizierte amplifizierte Nukleinsäure im wesentlichen in einer Zelle oder subzellulären Struktur, die ursprünglich die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthielt, enthalten ist. Die Zellen können in einer wässrigen Suspension vorliegen oder können Teil einer Gewebeprobe wie eine histochemi sche Sektion oder ein cytochemischer Abstrich sein. Der Begriff "histochemische Sektion" betrifft hier eine feste Probe eines biologischen Gewebes, das eingefroren oder chemisch fixiert und durch Einbetten in Wachs oder Plastik gehärtet, in dünne Scheiben geschnitten (typischerweise einige Mikrons dick) und an einen festen Träger wie einen Mikroskop- Objektträger gebunden wurde. Der Begriff "cytochemischer Abstrich" betrifft eine Zellsuspension, z. B. von Blutzellen, die chemisch fixiert und auf einem Mikroskop-Objektträger aufgebracht wurde. Vorzugsweise werden die Zellen für die PCR-Reagenzien durch Verdau mit Protease, Extraktion mit einer oberflächenaktiven Substanz oder einem organischen Lösungsmittel oder durch andere Permeabilisierungsverfahren für die PCR-Reagenzien durchlässig gemacht.
Der Begriff "fixierte Zellen" betrifft hier eine Probe biologischer Zellen, die chemisch behandelt wurde, um die zellulären Strukturen, insbesondere Membranen, gegenüber einer Beschädigung durch Veränderungen des Lösungsmittels, Veränderungen der Temperatur, mechanischen Stress oder Austrocknung zu verstärken. Die Zellen können in Suspension oder als Teil einer Gewebeprobe fixiert werden. Fixierungsmittel für die Zellen sind im allgemeinen Chemikalien, die die Proteinbestandteile der zellulären Strukturen vernetzen, gewöhnlich durch Reaktion mit den Aminogruppen der Proteine. Bevorzugte Fixierungsmittel umfassen gepuffertes Formalin, 95% Ethanol, Formaldehyd, Paraformaldehyd und Glutaraldehyd. Die Durchlässigkeit fixierter Zellen kann durch eine Behandlung mit Proteasen oder oberflächenaktiven Substanzen oder organischen Lösungsmitteln, die Membranlipide lösen, erhöht werden.

2. Oligonukleotid-Sonden

Der Begriff "Oligonukleotid" umfasst hier lineare Oligomere natürlicher oder modifizierter Monomere oder Bindungen, einschließlich Desoxyribonukleotide, Ribonukleotide und ähnliches, die zur spezifischen Bindung an ein Ziel-Polynukleotid durch ein regelmäßiges Muster einer Monomer-Monomer-Interaktion wie Basenpaarung des Watson-Crick-Typs oder ähnliches fähig sind. Gewöhnlich sind die Monomere durch Phosphodiester-Bindungen oder Analoga davon verknüpft, um Oligonukleotide mit einer Größe von wenigen Monomer-Einheiten wie 3-4 bis zu mehreren 10 Monomer-Einheiten zu bilden. Falls ein Oligonukleotid durch eine Sequenz von Buchstaben dargestellt wird, wie "ATGCCTG", sind die Nukleotide von links nach rechts in einer 5'→3'-Anordnung dargestellt und "A" bedeutet Desoxyadenosin, "C" bedeutet Desoxycytidin, "G" bedeutet Desoxyguanosin und "T" bedeutet Thymidin, es sei denn, es ist anders erwähnt. Analoga von Phosphodiester-Bindungen umfassen Phosphorothioate, Phosphoranilidate, Phosphoramidate und ähnliches.
"Nukleotid" umfasst hier die natürlichen Nukleotide, einschließlich 2'-Desoxy- und 2'- Hydroxy-Formen, wie beschrieben in Kornberg und Baker, DNA Replication, 2. Auflage (Freeman, San Francisco, 1992). "Analoga" in Bezug auf Nukleotide umfasst synthetische Nukleotide mit modifizierten Basen und/oder modifizierten Zuckern, wie beschrieben von Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, New York, 1980); Uhlman und Peyman, Chemical Reviews 90 : 543-584 (1990) oder ähnliches, mit der einzigen Bedingung, dass sie zur spezifischen Hybridisierung fähig sind. Derartige Analoga umfassen synthetische Nukleotide, die zur Verstärkung der Bindeeigenschaften, Verminderung der Degeneriertheit, Erhöhung der Spezifität, Verminderung der Aktivität als Enzymsubstrate und ähnliches geschaffen wurden.
Erfindungsgemäße Oligonukleotide können durch eine Reihe von Verfahren synthetisiert werden, vgl. z. B. Ozaki et al., Nucleic Acids Research 20 : 5205-5214 (1992); Agrawal et al., Nucleic Acids Research 18 : 5419-5423 (1990). Die erfindungsgemäßen Oligonukleotid-Sonden werden einfach auf einem automatischen DNA-Synthesegerät wie einem Perkin-Elmer (Foster City, Kalifornien), Modell 392- oder 394-DNAIRNA-Synthesegerät mit Hilfe von Standard-Reaktionen wie der Phosphoramidit-Chemie hergestellt, wie beschrieben in den nachstehenden Referenzen: Beaucage und lyer, Tetrahedron 48 : 2223-2311 (1992); Molko et al., US-PS 4,980,460; Koster et al., US-PS 4,725,677; Caruthers et al., US-PSen 4,415,732, 4,458,066 und 4,973,679. Alternative Reaktionen, die z. B. zu nicht-natürlichen Rückgrad-Gruppen wie Phosphorothioaten, Phosphoramidaten führen, können ebenfalls eingesetzt werden, mit der Maßgabe, dass die Hybridisierungseffizienz der resultierenden Oligonukleotide nicht gegenteilig beeinflusst wird. Vorzugsweise ist die Oligonukleotid-Sonde 15-150 Nukleotide, besser 18-30 Nukleotide lang. Die genaue Sequenz und Länge einer erfindungsgemäßen Oligonukleotid-Sonde hängt zum Teil von der Natur der Ziel-Nukleinsäuresequenz, an die sie hybridisiert, ab. Die Bindestelle und -länge kann für eine geeignete Hybridisierung und Schmelzeigenschaften für eine spezifische Ausführungsform variiert werden. Ein Leitfaden für eine derartige Auswahl findet sich in vielen der vorstehend genannten Referenzen, die Tests des "Taqman"-Typs beschreiben.
Vorzugsweise wird das 3'-terminale Nukleotid der Oligonukleotid-Sonde nicht durch eine Nukleinsäure-Polymerase verlängert. Eine derartige Blockierung kann durch Anbinden eines Fluoreszenz- oder Quencher-Moleküls an den 3'-terminalen Kohlenstoff der Oligonukleotid- Sonde durch eine Verbindungsgruppe oder durch Umwandeln des 3'-terminalen Nukleotids in ein Didesoxynukleotid erfolgen. Alternativ wird das 3'-Ende der Oligonukleotid-Sonde gegenüber der 5'→3'-Verlängerungsaktivität einer Polymerase durch Einbringen einer oder mehrerer modifizierter Internukleotid-Bindungen in das 3'-Ende des Oligonukleotids unemp findlich gemacht. Mindestens die 3'-terminale Internukleotid-Bindung muss modifiziert sein, jedoch können bis hin zu alle Internukleotid-Bindungen modifiziert sein. Derartige Internukleotid-Modifikationen können Phosphorothioat-Bindungen (vgl. Oligonucleotides and Analogs, Kapitel 4 und 5, IRL Press, New York (1991)), Methylphosphonat-Bindungen (Oligonucleotides and Analogs, Kapitel 6, IRL Press, New York (1991)), Boranphosphat-Bindungen (vgl. Shaw et al., Methods Mol. Biol. 20 : 225-43 (1993)) und andere ähnliche Polymerase-resistente Internukleotid-Bindungen umfassen. Ein alternatives Verfahren für die Blockierung der 3'-Verlängerung der Sonde ist die Bildung eines Addukts am 3'-Ende der Sonde mit Hilfe von Mitomycin C oder anderen ähnlichen anti-Tumor-Antibiotika; vgl. z. B. Basu et al., Biochemistry 32 : 4708-4718 (1993).
In einem wichtigen Aspekt einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Oligonukleotid-Sonde gegenüber einem Abbau durch die 5'→3-Exonuklease-Aktivität einer Nukleinsäure-Polymerase unempfindlich gemacht. Vorzugsweise wird das 5'-Ende der Oligonukleotid-Sonde gegenüber einem Verdau durch Einbringen eines oder mehrerer modifizierter Internukleotid-Bindungen in das 5'-Ende des Oligonukleotids unempfindlich gemacht. Mindestens die 5'-terminale Internukleotid-Bindung muss modifiziert sein, jedoch können bis zu alle Internukleotid-Bindungen in dem Oligonukleotid modifiziert sein. Derartige Internukleotid-Modifikationen können modifizierte Bindungen des bei der Synthese von Antisense-Oligonukleotiden verwendeten Typs umfassen. Beispiele derartiger Nuklease-resistenter Bindungen umfassen Phosphorothioat-Bindungen (vgl. z. B. Oligonucleotides and Analogs, Kapitel 4 und 5, IRL Press, New York (1991)), Methylphosphonat-Bindungen (Oligonucleotides and Analogs, Kapitel 6, IRL Press, New York (1991)), Boranphosphat-Bindungen (vgl. Shaw et al., Methods Mol. Biol. 20 : 225-43 (1993)), Polyamid-Nukleinsäure (PNA)-Bindungen (vgl. z. B. Nielsen et al., Science 254 : 1497-1500 (1991)) und andere ähnliche Exonukleaseresistente Bindungen. Alternativ wird ein Peptid-Molekül an das 5'-Ende der Sonde analog zu Soukchareun et al., Bioconjugate Chemistry 6 : 43-53 (1995) gebunden.
In einem weiteren wichtigen Aspekt der erfindungsgemäßen Oligonukleotid-Sonden umfassen die Sonden an das Oligonukleotid gebundene Fluoreszenz- und Quencher-Moleküle. Die Begriffe "Quenching" oder "Fluoreszenz-Energietransfer" betreffen den Prozess, durch den, falls ein Fluoreszenzmolekül und ein Quencher-Molekül nahe benachbart liegen, bei einer Anregung des Fluoreszenzmoleküls ein wesentlicher Teil der Energie des angeregten Zustands ohne Strahlung auf den Quencher übertragen wird, wo sie entweder ohne Strahlung verloren geht oder bei einer anderen Emissionswellenlänge als der des Fluoreszenzmoleküls emittiert wird.
Bekanntermaßen ist die Wirksamkeit des Quenchings eine Funktion der Nähe von Fluoreszenz- und Quencher-Molekül. Das bedeutet, dass die Quenching-Effizienz mit der Nähe der zwei Moleküle steigt. Da das Quenching stark von der physikalischen Nähe des Reporter- Moleküls und des Quencher-Moleküls abhängt, vermutet man, dass das Quencher- und Reporter-Molekül innerhalb weniger Nukleotide an die Sonde gebunden sein müssen, gewöhnlich getrennt durch etwa 6-16 Nukleotide; vgl. z. B. Lee et al., Nucleic Acids Research 21 : 3761-3766 (1993), Mergny et al., Nucleic Acids Research 22 : 920-928 (1994), Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85 : 8790-8794 (1988), Clegg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90 : 2994- 2998 (1993), Ozaki et al., Nucleic Acids Research 20 : 5205-5214 (1992). Typischerweise wird diese Trennung durch Anbringen eines Mitglieds eines Reporter-Quencher-Paares an das 5'-Ende der Sonde und des anderen Mitglieds an eine Base, die 6-15 Nukleotide entfernt liegt, erreicht.
Jedoch wurde erfindungsgemäß erkannt, dass durch Anbringen der Fluoreszenz- und Quencher-Moleküle an scheinbar entfernten Stellen auf dem Oligonukleotid ein unterschiedliches Quenching zwischen dem einzelsträngigen Zustand und dem doppelsträngigen Zustand, d. h. dem hybridisierten Zustand der Oligonukleotid-Sonde auftritt; vgl. z. B. Bagwell et al., Nucleic Acids Research 22(12) : 2424-2425 (1994), Bagwell, EP-A2-0 601 889. Die Fuoreszenzsignale können sich unter Umständen um einen Faktor von 20 zwischen den einzelsträngigen und doppelsträngigen Zuständen unterscheiden, falls das Fluoreszenz- und Quencher-Molekül durch 20 Basen getrennt sind. Dieser Effekt beruht wahrscheinlich darauf, dass im einzelsträngigen Zustand das Oligonukleotid als flexible zufällige Knäuelstruktur vorliegt, wodurch die Enden des Oligonukleotids nahe benachbart sein können, während das Oligonukleotid im doppelsträngigen Zustand als steife, ausgedehnte Struktur vorliegt, in der das Fluoreszenz- und Quencher-Molekül getrennt sind. Somit ist bei dieser Anordnung relativ effizient das Quenching des Fiuoreszenzmoleküls zu erkennen, falls die Oligonukleotid- Sonde im einzelsträngigen oder nicht-hybridisierten Zustand vorliegt. Ein relativ ineffizientes Quenching des Fluoreszenzmoleküls tritt auf, falls die Oligonukleotid-Sonde im doppelsträngigen oder hybridisierten Zustand vorliegt.
Vorzugsweise sind die Fluoreszenzmoleküle fluoreszierende organische Farbstoffe, die für eine Bindung an den 3'-terminalen Kohlenstoff oder 5'-terminalen Kohlenstoff der Sonde über eine Verbindungsgruppe derivatisiert sind. Vorzugsweise sind die Quencher-Moleküle ebenfalls organische Farbstoffe, die in Abhängigkeit der Ausführungsform fluoreszent sein können. Zum Beispiel ist das Quencher-Molekül in einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform fluoreszent. Im allgemeinen sollte die Absorptionsbande des Quencher- Moleküls im wesentlichen mit der Fluoreszenzemissionsbande des Fluoreszenzmoleküls überlappen, egal, ob das Quencher-Molekül fluoreszent ist oder einfach die von dem Fluoreszenzmolekül übertragene Energie durch einen Zerfall ohne Strahlung freisetzt. Nicht-fluoreszente Quencher-Moleküle, die Energie von angeregten Fluoreszenzmolekülen absorbieren, jedoch die Energie nicht durch Strahlung freisetzen, werden hier als chromogene Moleküle bezeichnet.
Eine praktische Anleitung für die Auswahl geeigneter Fluoreszenz-Quencher-Paare für bestimmte Sonden ist in der Literatur verfügbar und in den nachstehenden Referenzen beispielhaft dargestellt: Clegg (supra), Wu et al., Anal. Biochem. 218 : 1-13 (1994), Pesce et al., Hrsg., Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971), White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970). Die Literatur enthält auch Referenzen, die ausführliche Listen von fluoreszenten und chromogenen Molekülen und deren relevante optische Eigenschaften für die Auswahl von Fluoreszenz-Quencher- Paaren bereitstellen; vgl. z. B. Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2. Auflage (Academic Press, New York, 1971), Griffiths, Colour and Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976), Bishop, Hrsg., Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972), Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992), Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949). Ferner findet sich in der Literatur eine ausführliche Anleitung für die Derivatisierung von Fluoreszenz- und Quencher-Molekülen für die kovalente Bindung über gewöhnliche reaktive Gruppen, die an ein Oligonukleotid angefügt werden können; vgl. z. B. Hauland (supra), Ullman et al., US-PS 3,996,345, Khanna et al., US-PS 4,351,760.
Beispielhafte Fluoreszenz-Quencher-Paare können aus Xanthen-Farbstoffen, einschließlich Fluoresceinen, und Rhodamin-Farbstoffen ausgewählt werden. Viele geeignete Formen dieser Verbindungen sind einfach käuflich erhältlich und enthalten Substituenten auf ihren Phenylgruppen, die als Bindestelle oder als Bindefunktionalität für die Bindung an ein Oligonukleotid verwendet werden können. Eine weitere Gruppe von fluoreszenten Verbindungen sind Naphthylamine mit einer Aminogruppe in der alpha- oder beta-Position. Diese Naphthylamino-Verbindungen umfassen 1-Dimethylaminonaphthyl-5-sulfonat, 1-Anilino-8- naphthalensulfonat und 2-p-Toluidinyl-6-naphthalensulfonat. Andere Farbstoffe umfassen 3- Phenyl-7-isocyanatocoumann, Acridine wie 9-Isothiocyanatoacridin-Orange, N-(p-(2-Benzoxyzolyl)-phenyl)-maleimid, Benzoxydiazole, Stilbene, Pyrene.
Vorzugsweise sind Fluoreszenz- und Quencher-Moleküle aus Fluorescein- und Rhodamin- Farbstoffen ausgewählt. Diese Farbstoffe und geeignete Bindungsverfahren für die Bindung an Oligonukleotide sind in vielen Literaturstellen beschrieben; vgl. z. B. Khanna et al. (supra), Marshall, Histochemical J. 7 : 299-303 (1975), Menchen et al., US-PS 5,188,934, Menchen et al., europäische Patentanmeldung Nr. 87 310 256.0 und Bergot et al., internationale Anmeldung Nr. PCT/US90/05565.
Viele Bindungsgruppen und -verfahren für das Binden von Fluoreszenz- oder Quencher- Molekülen an die 5'- oder 3'-Termini von Oligonukleotiden stehen zur Verfügung; vgl. z. B. Eckstein, Hrsg., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991), Zuckerman et al., Nucleic Acids Research 15 : 5305-5321 (1987) (3'-Thiolgruppe auf dem Oligonukleotid), Sharma et al., Nucleic Acids Research 19 : 3019 (1991) (3'-Sulfhydryl), Giusti et al., PCR Methods and Applications 2 : 223-227 (1993) und Fung et al., US-PS 4,757,141 (5'-Phosphoaminogruppe über AminolinkTM II, erhältlich von Applied Biosystems, Foster City, CA), Stabinski, US-PS 4,739,044 (3'-Aminoalkylphosphorylgruppe), Agrawal et al., Tetrahedron Letters 31 : 1543-1546 (1990) (Bindung über Phosphoramidit-Bindungen), Sproat et al., Nucleic Acids Research 15 : 4837 (1987) (5'-Mercaptogruppe), Nelson et al., Nucleic Acids Research 17 : 7187-7194 (1989) (3'-Aminogruppe).
Vorzugsweise werden käuflich erhältliche Bindegruppen eingesetzt, die an ein Oligonukleotid während der Synthese angefügt werden können. Diese sind z. B. von Clontech Laboratories (Palo Alto, CA) erhältlich.
Rhodamin- und Fluorescein-Farbstoffe sind ebenfalls einfach an die 5'-Hydroxylgruppe eines Oligonukleotids beim Abschluss der Festphasensynthese durch Farbstoffe, die mit einem Phosphoramiditrest derivatisiert sind, anfügbar; vgl. z. B. Woo et al., US-PS 5,231,191 und Hobbs, Jr., US-PS 4,997,928.

3. Kombinierte PCR-Amplifikation und Sonden-Hybridisierung

Es gibt drei Hauptziele bei der Durchführung von Tests einer kombinierten PCR- und Sonden-Hybridisierung: (i) die Oligonukleotid-Sonde sollte den PCR-Polymerisationsschritt nicht blockieren oder anderweitig stören, wodurch die schrittweise Effizienz der Amplifikation vermindert wird. Der Begriff "Polymerisationsschritt" trifft hier den Schritt in einer PCR, bei dem die Primer an ihren 3'-Enden durch Einbau von Nukleotidbasen durch eine Polymerase-vermittelte Reaktion verlängert werden, (ii) die Oligonukleotid-Sonde darf nicht durch die 5'→3'- Exonuklease-Aktivität des Polymerase-Enzyms verdaut werden und (iii) die Sande sollte durch die Polymerase nicht in Richtung 5'→3' verlängerbar sein.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Stören der PCR-Polymerisation durch die Sonde dadurch verhindert, dass die Sonde so gestaltet ist, dass ihre Schmelztemperatur über der Temperatur des PCR-Polymerisationsschritts liegt. Der Begriff "Schmelztemperatur" wird hier als die Temperatur definiert, bei der die Hälfte der Sonde an die Zielsequenz hybridisiert ist, d. h. in einem doppelsträngigen Zustand, und die andere Hälfte nicht-hybridisiert ist, d. h. sich in einem einzelsträngigen Zustand befindet. Vorzugsweise beträgt die Schmelztemperatur der Sonde zwischen 40ºC und 55ºC und die Schmelztemperatur des PCR-Primers 55ºC bis 70ºC.
Während dem PCR-Polymerisationsschritt ist die Sonde nicht hybridisiert, d. h. sie befindet sich in einem einzelsträngigen Zustand, und ist dadurch gequencht; vgl. Fig. 1. Darüber hinaus kann die PCR-Polymerisation ohne Störung durch die Sonde fortschreiten, da die Sonde nicht an die Zielsequenz gebunden ist. Sodann wird während des Hybridisierungsschritts die Temperatur auf die Hybridisierungstemperatur gesenkt, vorzugsweise eine Temperatur bei oder unterhalb des Tm der Sonde, wodurch die Sonde an das Ziel hybridisiert. Die Hybridisierung der Sonde bewirkt eine Verminderung des Quenching, was zu einem messbaren Signal führt, das anzeigt, dass die Sonde an die Zielsequenz hybridisiert. Dieses Signal ergibt auch eine quantitative Information über die vorhandene Menge an Zielsequenz. Während des Hybridisierungsschritts wird die Sonde nicht durch die Exonuklease- Aktivität der Polymerase verdaut, da die Sonde, wie vorstehend beschrieben, unempfindlich gegenüber der 5→3'-Exonuklease-Aktivität der Polymerase ist.
In einer Ausführungsform der vorstehend beschriebenen Tm vermittelten kombinierten PCR- und Sonden-Hybridisierung wird ein Verdau der Sonde während des Hybridisierungsschritts durch Verwendung einer Polymerase ohne eine 5'→3'-Exonuklease-Aktivität vermieden, gegenüber der Verwendung einer Sonde, die gegenüber der 5'→3'-Exonuklease-Aktivität der Polymerase unempfindlich ist. Beispiele derartiger Polymerasen ohne 5'→3-Exonuklease-Aktivität umfassen das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase und T7-DNA-Polymerase und andere, ähnliche DNA-Polymerasen ohne 5'→3'-Exonuklease-Aktivität; vgl. z. B. Amersham Life Science, Inc., Arlington Heights, IL.
In einer zweiten Ausführungsform der vorstehend beschriebenen Tm-vermittelten kombinierten PCR- und Sonden-Hybridisierung wird die Exonuklease-Aktivität der Polymerase während des Hybridisierungsschritts inaktiviert, gegenüber der Verwendung einer Sonde, die gegenüber der 5'→3'-Exonuklease-Aktivität der Polymerase unempfindlich ist oder der Verwendung einer Polymerase ohne Exonuklease-Aktivität, um die Sonde vor einem Exonuklease-Verdau zu schützen. Eine derartige Inaktivierung kann durch eine Reihe von Maß nahmen erfolgen, einschließlich (i) durch Verwendung einer Polymerase, deren Aktivität bei der Hybridisierungstemperatur stark vermindert ist oder (ii) Einbau eines Enzym-Deaktivierungsschritts vor dem Hybridisierungsschritt, der das Polymerase-Enzym irreversibel deaktiviert, d. h. ein längerer Zeitraum bei hohen Temperaturen.
In einer zweiten bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine Störung des PCR-Polymerisationsschritts durch die Probe durch Einbringen eines Strangverdrängers in die Reaktion verhindert. Der Begriff "Strangverdränger" betrifft hier einen Stoff, der eine Verdrängung einer Oligonukleotid-Sonde von einem Ziel, an das die Sonde hybridisiert ist, bewirken kann. Beispiele sind DNA-Helicase (vgl. z. B. Howard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 12031-12035 (1994)) oder Einzelstrang-Bindeprotein (vgl. z. B. Zijderveld, Journal of Virology 68(2) : 1158-1164 (1994)). In dieser Ausführungsform verdrängt der Strangverdränger während des Polymerisationsschritts die Sonde von dem Matrizenstrang, wodurch die Polymerisation ohne Störung durch die Sonde voranschreiten kann; vgl. Fig. 2. Sodann wird der Strangverdränger inaktiviert, um eine Hybridisierung der Sonde während des Hybridisierungsschritts zu ermöglichen. Eine derartige Inaktivierung kann durch eine Reihe von Maßnahmen erfolgen, einschließlich der vorstehend in Bezug auf die Inaktivierung der Exonuklease-Aktivität genannten. Im allgemeinen ist die Strangverdrängungsaktivität eines Strangverdrängers größer für längere Oligonukleotid-Duplexe und daher sind die PCR-Primer selbst nicht empfänglich für eine Strangverdrängung während der PCR-Reaktion.

4. Beispiele

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter erläutert, die nicht für die Erfindung beschränkend sind.

BEISPIEL 1

Vergleich der Fluoreszenzemission von Sonden in einzelsträngigen und doppelsträngigen Zuständen

Verbindungsarm-Nukleotid ("LAN")-Phosphoramidit wurde von Glen Research bezogen. Standard-DNA-Phosphoramidite, 6-Carboxyfluorescein ("6-FAM")-Phosphoramidit, 6-Carboxytetramethylrhodaminsuccinimidylester ("TAMRA NHS-Ester") und PhosphalinkTM für die Bindung eines 3'-Blockierungsphosphats wurden von Perkin-Elmer, Applied Biosystems Division, bezogen. Die Oligonukleotid-Synthese erfolgte auf einem Modell 394 DNA-Synthesegerät (Applied Biosystems). Oligonukleotide wurden mit Oligo-Reinigungskartuschen (Applied Biosystems) gereinigt.
Doppelmarkierte Sonden wurden mit 6-FAM-markiertem Phosphoramidit am 5'-Ende, wobei LAN eines der T's in der Oligonukieotidsequenz ersetzte, und PhosphalinkTM am 3'-Ende synthetisiert. Nach Entschützung und Fällung mit Ethanol wurde TAMRA NHS-Ester an das LAN-enthaltende Oligonukleotid in 250 mM Na-Hydrogencarbonat-Puffer (pH 9,0) bei Raumtemperatur gekoppelt. Nicht-umgesetzter Farbstoff wurde durch Passagieren über eine PD-10 Sephadex-Säule entfernt. Schließlich wurde die zweifach markierte Sonde durch präparative HPLC mit Standardverfahren gereinigt.
Die Oligonukleotidsequenzen der Sonden und ihren Komplementen sind in Tabelle 1 gezeigt. Der Begriff "Komplement" betrifft hier eine Oligonukleotidsequenz, die zur spezifischen Hybridisierung an eine Sondensequenz fähig ist.

TABELLE 1

Sonde/Komplement Sequenz

I ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT
1 (Komplement) AGACGCAGGATGCCATCGGGAGGGCATAC
2 CGCCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT
2 (Komplement) CCATCTCTTGCTCGAAGTCCAGGGCGAC
3 TCGCATTACTGATCGTTGCCAACCAGT
3 (Komplement) GTACTGGTTGGCAACGATCAGTAATGCGATG
4 CGGATTTGCTGGTATCTATGACAAGGAT
4 (Komplement) TTCATCCTTGTCATAGATACCAGCAAATCCG
Vier Sondenpaare wurden untersucht. Bei jedem Paar war TAMRA an ein internes Nukleotid einer Sonde gebunden und bei der anderen Sonde TAMRA an das Nukleotid am 3'-Ende gebunden. Bei beiden Sonden war 6-FAM an das 5'-Ende gebunden. Für die Messung der Fluoreszenz der Sonden in einem einzelsträngigen Zustand wurden die Fluoreszenzemissionen bei 518 nm gemessen und Lösungen verwendet, die eine Endkonzentration von 50 nM Sonde, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl und 10 mM MgCl&sub2; enthielten. Für die Messung der Fluoreszenz der Sonden in einem doppelsträngigen Zustand enthielten die Lösungen zusätzlich 100 mM Komplement-Oligonukieotid. Vor der Zugabe von MgCl&sub2; wurden 120 ul einer jeden Probe 5 min bei 95ºC erhitzt. Nach der Zugabe von 80 ul 25 mM MgCl&sub2; wurde jede Probe auf Raumtemperatur abgekühlt und die Fluoreszenzemissionen gemessen. Die beschriebenen Werte sind der Durchschnitt aus drei Messungen. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Fluoreszenzmessungen der angegebenen Sonden in einem einzelsträngigen und doppelsträngigen Zustand. Wie aus den Daten in Tabelle 2 zu erkennen ist, bewirkt eine Hybridisierung bei Sonden mit dem Fluoreszenz- und Quencher-Molekül an entgegengesetzten Enden des Oligonukleotids einen dramatischen Anstieg in der Stärke des differentiellen Quenchings im Gegensatz dazu, falls das Fluoreszenz- und Quencher-Molekül nahe zusammen lagen. Im Fall von längeren Sonden erwarten wir, dass es eine optimale Trennung zwischen dem Fluoreszenz- und Quencher-Molekül gibt, so dass das Fluoreszenz- und Quencher-Molekül beide intern, jedoch getrennt durch eine optimale Distanz liegen, und nicht an entgegengesetzten Enden. TABELLE 2
a. Die Lage von TAMRA ist als Anzahl der Nukleotide vom 5'-Ende des Oligonukleotids in einer 5'- zu 3'-Richtung ausgedrückt.
b. Differentielles Quenching ist definiert als die Fluoreszenzemissionsintensität der Sonde in einem doppelsträngigen Zustand geteilt durch die Fluoreszenzemissionsintensität der Sonde in einem einzelsträngigen Zustand.
Obwohl nur wenige Ausführungsformen vorstehend detailliert beschrieben wurden, ist es für den Fachmann klar, dass viele Modifikationen und Variationen in den bevorzugten Ausführungsformen möglich sind, ohne von der technischen Lehre abzuweichen.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Paul E. Mayrand
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Methoden und Reagenzien für die Kombination einer PCR-Amplifizierung mit einem Hybridisierungs-Assay
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 8
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Paul D. Grossman, Perkin-Elmer Corp., Applied Biosystems Division
(B) STRASSE: 850 Lincoln Centre Drive
(C) STADT: Foster City
(D) STAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 94404
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: 3, 5 Zoll Diskette
(B) COMPUTER: IBM kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: Windows 3.10/DOS 6.20
(D) SOFTWARE: Microsoft Word für Windows, Version 2.0
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: 08/435, 509
(B) ANMELDETAG: 5. Mai 1995
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) DATEN DER VORANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG:
(viii) ANGABEN DES VERTRETERS:
(A) NAME: Paul D. Grossman
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 36, 537
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 4273
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
(A) TELEFON: (415) 638-5846
(B) TELEFAX: (415) 638-6071
(C) TELEX:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 26 Nukleotide
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 1:
ATGCCCTCCC CCATGCCATC CTGCGT 26
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Nukleotide
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 2:
AGACGCAGGA TGGCATGGGG GAGGGCATAC 30
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Nukleotide
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 3:
CGCCCTGGAC TTCGAGCAAG AGAT 24
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Nukleotide
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 4:
CCATCTCTTG CTCGAAGTCC AGGGCGAC 28
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 5:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 27 Nukleotide
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 5:
TCGCATTACT GATCGTTGCC AACCAGT 30
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 31 Nukleotide
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 6:
GTACTGGTTG GCAACGATCA GTAATGCGAT G 31
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Nukleotide
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 7:
CGGATTTGCT GGTATCTATG ACAAGGAT 28
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 31 Nukleotide
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 8:
TTCATCCTTG TCATAGATAC CAGCAAATCC G 31

Claims

1. Ein Oligonukleotid-Sondenmolekül, umfassend:

ein Oligonukleotid, das an eine Ziel-Polynukleotidsequenz hybridisieren kann;

ein an eine erste Stelle im Oligonukleotid angebundenes Fluoreszenzmolekül;

ein an eine zweite Stelle im Oligonukleotid derart angebundenes Quencher-Molekül, so dass das Quencher-Molekül das Fluoreszenzmolekül unterdrückt, wenn das Oligonukleotid-Sondenmolekül nicht an die Ziel-Polynukleotidsequenz hybridisiert ist, und so dass das Fluoreszenzmolekül im wesentlichen nicht unterdrückt ist, wenn das Oligonukleotid-Sondenmolekül an die Ziel-Polynukleotidsequenz hybridisiert ist;

ein 5'-Ende, das durch eine Polymerase mit 5'→3' Exonuklease-Aktivität nicht erkannt wird; und

ein 3'-Ende, das durch eine Polymerase mit 5'→3' Verlängerungs-Aktivität nicht erkannt wird.

2. Das Oligonukleotid-Sondenmolekül gemäß Anspruch 1, wobei das Fluoreszenzmolekül ein Fluorescein-Farbstoff und das Quencher-Molekül ein Rhodamin-Farbstoff ist.

3. Die Oligonukleotid-Sondenmolekül gemäß Anspruch 2, wobei die erste Stelle auf dem Oligonukleotid das 5'- Ende ist.

4. Ein Verfahren zur Durchführung kombinierter PCR-Amplifikation und Sonden- Hybridisierung, umfassend die Schritte:

in Kontakt bringen einer Zielnukleinsäuresequenz mit PCR-Reagenzien, einschließlich mindestens zwei PCR-Primern und einem Polymerase-Enzym und einem Oligonukleotid-Sondenmolekül, umfassend:

ein Oligonukleotid, das an eine Ziel-Polynukleotidsequenz hybridisieren kann;

ein an eine erste Stelle im Oligonukleotid angebundenes Fluoreszenzmolekül;

ein an eine zweite Stelle im Oligonukleotid derart angebundenes Quencher-Molekül, so dass das Quencher-Molekül die Fluoreszenz des Fluoreszenzmoleküls im wesentlichen unterdrückt, wenn das Oligonukleotid-Sondenmolekül nicht an die Ziel-Polynukleotidsequenz hybridisiert ist, und so dass das Fluoreszenzmolekül im wesentlichen nicht unterdrückt ist, wenn das Oligonukleotid-Sondenmolekül an die Ziel-Polynukleotidsequenz hybridisiert ist;

ein 3'-Ende, das durch eine Polymerase mit 5'→3' Verlängerungs-Aktivität nicht erkannt wird; und

Behandeln der Zielnukleinsäure, des Oligonukleotid-Sondenmoleküls und der PCR- Reagenzien mit Temperaturzyklen, eingeschlossen einen Polymerisationsschritt, wobei die Temperaturzyklen ausreichen, die durch die PCR-Reagenzien spezifizierte Zielnukleinsäure zu amplifizieren; und Messen des Ausmaßes der Fluoreszenzunterdrückung des Oligonukleotid-Sondenmoleküls bei der Sonden-Hybridisierungstemperatur.

5. Das Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Ziel-Nukleinsäuresequenz innerhalb einer oder mehrerer fixierter Zellen lokalisiert ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der Schritt des Messens des Ausmaßes der Fluoreszenzunterdrückung des Oligonukleotid-Sondenmoleküls bei einer Sonden- Hybridisierungstemperatur in einer Weise erfolgt, die die Sonde innerhalb der einzelnen Zellen, die ursprünglich die Zielnukleinsäure enthalten, lokalisiert.

7. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die fixierten Zellen, die PCR-Reagenzien und das Oligonukleotid-Sondenmolekül in einer Behälteranordnung lokalisiert sind.

8. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Sonden-Hybridisierungstemperatur niedriger oder identisch zur Temperatur des Polymerisationsschrittes der Temperaturzyklen ist.

9. Verfahren gemäß Anspruch 4, weiter umfassend den Schritt der Zugabe eines Strang-Verdrängers vor den Temperaturzyklen zur Vermeidung, dass das Oligonukleotid-Sondenmalekül die 5' 3'-Verlängerung eines stromaufwärts gelegenen PCR-Primers während des Polymerisationsschrittes blockiert.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, weiter umfassend einen auf die Temperaturzyklen folgenden Strang-Verdränger-Deaktivierungsschritt zur Deaktivierung der Strang- Verdrängungs-Aktivität des Strang-Verdrängers.

11. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei der Strang-Verdränger eine Helikase ist.

12. Ein Verfahren zur Durchführung kombinierter PCR-Amplifikation und Sonden- Hybridisierung, umfassend die Schritte:

In-Kontakt-Bringen einer Zielnukleinsäure mit PCR-Reagenzien, einschließlich mindestens zwei PCR-Primern und einem Polymerase-Enzym ohne wesentliche 5'→3' Exonuklease-Aktivität, und einem Oligonukleotid-Sondenmolekül, umfassend:

ein Oligonukleotid;

ein an eine erste Stelle im Oligonukleotid angebundenes Fluoreszenzmolekül;

ein an eine zweite Stelle im Oligonukleotid derart angebundenes Quencher-Molekül, so dass das Quencher-Molekül die Fluoreszenz des Fluoreszenzmoleküls unterdrückt, wenn das Oligonukleotid-Sondenmolekül nicht an die Ziel-Polynukleotidsequenz hybridisiert ist, und so dass das Fluoreszenzmolekül im wesentlichen nicht unterdrückt ist, wenn das Oligonukleotid-Sondenmolekül an die Ziel-Polynukleotidsequenz hybridisiert ist; und

Behandeln der Zielnukleinsäure, des Oligonukleotid-Sondenmoleküls und der PCR- Reagenzien mit Temperaturzyklen, die ausreichen, die durch die PCR-Reagenzien spezifizierte Zielnukleinsäure zu amplifizieren; und

Messen des Ausmaßes der Fluoreszenzunterdrückung des Oligonukleotid-Sondenmoleküls bei der Sonden-Hybridisierungstemperatur.