DE60120118T2

DE60120118T2 - Test- und nachweisverfahren für einen mikroarray

Info

Publication number: DE60120118T2
Application number: DE60120118T
Authority: DE
Inventors: Robert C. c/o Datascope Investment C Montvale GETTS
Original assignee: Datascope Investment Corp
Current assignee: Genisphere LLC
Priority date: 2000-03-08
Filing date: 2001-03-08
Publication date: 2007-05-03
Anticipated expiration: 2021-03-09
Also published as: JP2003526095A; EP1261617B1; DE60120118D1; EP1261617A1; ATE328001T1; EP1261617A4; AU4732801A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Mikroarrays, spezieller Verfahren zu einem Nachweis und Assay einer Nucleinsäuresequenz-Probe durch Hybridisierung auf einem Mikroarray.
Hintergrund der Erfindung
Änderungen von Genexpressions-Mustern oder in einer DNA-Sequenz können tiefgreifende Auswirkungen auf biologische Funktionen aufweisen. Derartige Variationen der Genexpression können veränderte physiologische und pathologische Prozesse zur Folge haben. Die Entwicklung von DNA-Techniken stellt rasche und kostengünstige Verfahren zur Identifikation der Genexpression und von genetischen Variationen im großen Maßstab bereit. Eine Hochgeschwindigkeitstechnik, die für die DNA-Analyse nützlich ist, ist der DNA-Mikroarray, der eine Vielzahl von unterschiedlichen DNA- oder Gensonden (d.h. Polynucleotiden) räumlich verteilt auf und stabil mit einer im Wesentlichen ebenen Struktur, wie einer Platte aus Glas, Silicium oder einer Nylon-Membran, assoziiert umfasst. Derartige Mikroarrays sind in einem Bereich von Anwendungen entwickelt worden und werden dabei verwendet, wie bei der Analyse einer Probe bezüglich der Anwesenheit von Genvariationen oder -mutationen (d.h. Genotypisierung) oder bezüglich Genexpressions-Mustern, wobei das Äquivalent von Tausenden von einzelnen "Teströhrchen"-Experimenten in einer kurzen Zeitspanne durchgeführt wird.
Alle Mikroarrays arbeiten mit einem ähnlichen Prinzip: Ein im Wesentlichen ebenes Substrat, wie ein Glasobjektträger, wird mit einem Gitter aus winzigen Flecken von etwa 20 bis 100 Mikrometer Durchmesser beschichtet; jeder Fleck oder jeder Bestandteil enthält Millionen von Kopien einer kurzen Sequenz von DNA oder Nucleotiden; und ein Computer verfolgt jede Sequenz bei einem vorbestimmten Bestandteil. Um eine Analyse zu machen, wird Boten-RNA (mRNA) aus einer Probe von Zellen extrahiert. Unter Verwendung von Enzymen werden Millionen von Kopien der mRNA-Moleküle reproduziert. Kopien von komplementärer DNA (cDNA) werden durch reverse Transkription aus der mRNA erzeugt. Die cDNA-Kopien werden mit einem Marker oder einer Markierung, wie einem Fluoreszenzmarker, markiert und zu kurzen Fragmenten zerbrochen. Die markierten Fragmente werden über das Mikroarray gespült und über Nacht belassen, um zu ermöglichen, dass markierte Fragmente mit der an dem Mikroarray angebrachten DNA hybridisieren.
Nach der Hybridisierung emittieren die Bestandteile auf dem Mikroarray, die sich mit der fluoreszierenden cDNA gepaart haben, ein Fluoreszenzsignal, das mit einem Mikroskop betrachtet oder durch einen Computer erfasst werden kann. Auf diese Weise kann man in Erfahrung bringen, welche Sequenzen auf dem Mikroarray zu der cDNA der Testprobe passen. Obwohl es gelegentliche Fehlpaarungen gibt, stellt die Verwendung von Millionen von Sonden in jedem Fleck oder Bestandteil sicher, dass Fluoreszenz nur nachgewiesen wird, wenn die komplementäre cDNA anwesend ist. Je intensiver das Fluoreszenzsignal ist (d.h., je heller der Fleck), desto mehr übereinstimmende cDNA war in der Zelle anwesend.
Ein Bereich, in dem die Mikroarrays nützlich sind, ist die Genexpressionsanalyse. Bei der Genexpressionsanalyse, die Mikroarrays verwendet, wird ein Array von "Sonden"-Oligonucleotiden mit einer interessierenden Nucleinsäure-Probe, d.h. einem Target, wie cDNA, die aus mRNA erzeugt wurde, welche aus einem speziellen Gewebetyp extrahiert worden war, in Kontakt gebracht. Das In-Kontakt-Bringen wird unter Hybridisierungsbedingungen durchgeführt, und ungebundene Nucleinsäure wird dann entfernt. Das resultierende Muster von hybridisierter Nucleinsäure liefert eine Information über das genetische Profil der getesteten Probe. Das genetische Profil soll Information hinsichtlich der Arten von Nucleinsäuren einschließen, die in der Probe vorliegen (z.B. der Arten von Genen, zu denen sie komplementär sind, sowie der Kopienzahl jeder speziellen Nucleinsäure in der Probe). Die Genexpressionsanalyse kann in einer Vielfalt von Anwendungen nützlich sind, einschließlich beispielsweise der Identifikation einer neuen Expression von Genen, der Korrelation der Genexpression mit einem speziellen Phänotyp, der Durchmusterung bezüglich Krankheitsprädisposition und der Identifikation der Wirkung eines speziellen Mittels auf die zelluläre Genexpression, wie bei Toxizitätstests.
Ein Beispiel des Standes der Technik für ein Verfahren zur Herstellung einer Nucleinsäuresequenz-Probe für den Nachweis und die Analyse einer Genexpressionssequenz ist in 1 gezeigt und wird wie folgt beschrieben. Unter Verwendung bekannter Verfahren wird eine Vielzahl von Gensonden auf der Oberfläche eines Mikroarrays befestigt oder auf diese gedruckt, wie zum Beispiel durch Roboter- oder Laserlithographieverfahren. Die komplementäre DNA (cDNA) wird aus einer mRNA-Probe hergestellt, die Gesamt-RNA oder Poly(A)⁺RNA zusammen mit einer großen Menge an Nucleotid-Basen (Desoxynucleotidtriphosphat, DNTP), Enzymen und Reverse Transkription (RT)-Primer-Oligonucleotiden mit daran angebrachten Einfangsequenz-Abschnitten umfasst. Die neu gebildete cDNA wird dann aus der mRNA-Probe isoliert und mit Ethanol gefällt. Die cDNA wird dann in einem cDNA-Hybridisierungspuffer suspendiert, um die cDNA an den Mikroarray mit den komplementären Gensonden zu hybridisieren, und über Nacht inkubiert. Nach Hybridisierung der cDNA an den präparierten Mikroarray wird der Mikroarray gewaschen, um jegliches überschüssige RT-Primer-Oligonucleotid zu entfernen. Eine Mischung, die markierte dendritische Nucleinsäure-Moleküle enthält, wird dann hergestellt.
Dendritische Nucleinsäure-Moleküle oder Dendrimere sind komplexe, hoch verzweigte Moleküle, die eine Vielzahl von verbundenen natürlichen oder synthetischen monomeren Untereinheiten von doppelsträngiger DNA umfassen. Dendrimere sind in größerer Einzelheit in Nilsen et al., Dendritic Nucleic Acid Structures, J. Theor. Biol., 187, 273-284 (1997), beschrieben.
Dendrimere umfassen zwei Arten von einzelsträngigen Hybridisierungs"armen" auf der Oberfläche, die verwendet werden, um zwei Schlüssel-Funktionalitäten anzubringen. Ein einziges Dendrimer-Molekül kann mindestens einhundert Arme jeder Art auf der Oberfläche aufweisen. Eine Art Arm wird für das Anbringen eines spezifischen ansteuernden Moleküls verwendet, um eine Ziel-Spezifität zu garantieren, und der andere wird für das Anbringen einer Markierung oder eines Markers verwendet. Die Moleküle, welche das Ziel bestimmen, und die Markierungsspezifitäten des Dendrimers sind entweder als Oligonucleotide oder als Oligonucleotid-Konjugate angebracht. Unter Verwendung einfacher DNA-Markierungs-, Hybridisierungs- und Ligierungsreaktionen kann ein Dendrimer-Molekül so konfiguriert werden, dass es als hoch markierte Ziel-spezifische Sonde wirkt.
Die hergestellte Mischung wird in Anwesenheit eines geeigneten Puffers formuliert, um eine Dendrimer-Hybridisierungsmischung zu liefern, die Dendrimere mit fluoreszierenden Markierungen, welche an einer Art "Arm" angebracht sind, und mit Oligonucleotiden enthält, die an einer anderen Art "Arm" angebracht sind und komplementär zu den Einfangsequenzen der an den RT-Primer gebundenen cDNA-Fragmente sind. Die Dendrimer-Hybridisierungsmischung, welche die Dendrimer-Moleküle enthält, wird dann zu dem Mikroarray gegeben und über Nacht inkubiert, um ein Hybridisierungsmuster zu erzeugen. Anschließend an die Dendrimer-cDNA-Hybridisierung wird der Mikroarray gewaschen, um alle überschüssigen, nicht hybridisierten Dendrimere abzuspülen. Der Mikroarray wird gescannt, um das Signal zu erfassen, das durch die Markierung erzeugt wird, um eine Genexpressionsanalyse des Hybridisierungsmusters zu ermöglichen. Einer der Nachteile bei der Verwendung dieses Verfahrens umfasst die übermäßige Zeit und Mühe, die erforderlich sind, um die Probe zu herzustellen und den Assay durchzuführen, einschließlich der Hybridisierungs- und Waschschritte.
Es wäre hoch wünschenswert, die Menge an Zeit und Mühe zu verringern, die bei der Herstellung der Probe und der Durchführung des Assays aufgewandt werden, ohne wünschenswerte Eigenschaften, wie Empfindlichkeit, niedriges Hintergrundrauschen" und minimale "falsch positive Ergebnisse" zu opfern. Es wäre ein signifikanter Fortschritt in der Technik der Genexpressionsnachweis-Mikroarrays, weiter ein Verfahren bereitzustellen, das signifikant die Komplexität und die Schritte verringert, die erforderlich sind, um Genproben und den Assay für die Genexpressionsanalyse herzustellen, und das unter Verwendung herkömmlicher Laborreagenzien, -ausrüstung und -techniken durchgeführt werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren für einen Assay und Nachweis auf einem Mikroarray. Die vorliegende Erfindung stellt eine signifikante Verringerung der Zeit und Arbeit bereit, welche erforderlich sind, um ein Hybridisierungsmuster zum Erhalt von Information über das genetische Profil der Ziel-Nucleinsäure-Probe und die Quelle, aus der die Probe erhalten wurde, zu erzeugen. Die vorliegende Erfindung stellt weiter einen Mikroarray mit ausgezeichneter Empfindlichkeit und geringem Hintergrund"rauschen" und minimalen "falsch positiven Ergebnissen" bereit. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann in einem Bereich von Anwendungen verwendet werden.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für einen Assay und Nachweis auf einen Mikroarray bereitgestellt, welches die Schritte umfasst:

1) In-Kontakt-Bringen eines Mikroarrays, der darauf eine Vielzahl von Bestandteilen aufweist, von denen jeder eine erste spezielle erste Nucleotidsequenz enthält, mit einer Mischung, welche enthält: a) eine erste Komponente, die ein cDNA-Reagens umfasst, das aus mRNA einer Ziel-Probe erhalten wurde, wobei die cDNA eine Einfangsequenz aufweist; und b) eine zweite Komponente, die ein Dendrimer mit mindestens einem ersten Arm, der eine Markierung enthält, die ein nachweisbares Signal emittieren kann, und mindestens einem zweiten Arm mit einer zweiten, zu der Einfangsequenz komplementären Nucleotidsequenz umfasst;
2) Mischen der ersten und zweiten Komponente bei einer Temperatur und über eine Zeit, die ausreichen, um zu ermöglichen, dass sich die erste Komponente an die zweite Komponente bindet; und
3) Inkubieren dieser Mischung mit dem Mikroarray, um zu ermöglichen, dass die erste Nucleotidsequenz an die erste Komponente bindet, wobei eine derartige Bindung zur Folge hat, dass der Bestandteil das nachweisbare Signal emittiert.

In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren für einen Assay und Nachweis auf einem Mikroarray bereitgestellt, welches die Schritte umfasst:

1) Inkubieren einer Mischung, welche einschließt: i) eine erste Komponente, die ein cDNA-Reagens umfasst, das aus mRNA einer Ziel-Probe erhalten wurde, wobei die cDNA eine Einfangsequenz aufweist; und ii) eine zweite Komponente, die ein Dendrimer mit mindestens einem ersten Arm, der eine Markierung enthält, die in der Lage ist, ein nachweisbares Signal zu emittieren, und mindestens einem zweiten Arm mit einer zweiten, zu der Einfangsequenz komplementären Nucleotidsequenz umfasst,

2) In-Kontakt-Bringen eines Mikroarrays, der darauf eine Vielzahl von Bestandteilen aufweist, von denen jeder eine spezielle erste Nucleotidsequenz enthält, mit der Mischung; und
3) Inkubieren des Mikroarrays und des vorhybridisierten cDNA-Dendrimer-Komplexes bei einer zweiten Temperatur und über eine Zeit, die ausreichen, um zu induzieren, dass der vorhybridisierte cDNA-Dendrimer-Komplex an die erste Nucleotidsequenz bindet, wobei eine derartige Bindung zur Folge hat, dass der Bestandteil das nachweisbare Signal emittiert, wodurch ein Hybridisierungsmuster auf dem Mikroarray erzeugt wird.

In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für einen Assay und Nachweis auf einem Mikroarray bereitgestellt, welches die Schritte umfasst:

1) In-Kontakt-Bringen eines Mikroarrays, der darauf eine Vielzahl von Bestandteilen aufweist, von denen jeder eine erste spezielle erste Nucleotidsequenz enthält, mit einer Mischung, welche enthält: a) eine erste Komponente, die ein cDNA-Reagens umfasst, das aus mRNA einer Ziel-Probe erhalten wurde, wobei die cDNA eine Einfangsequenz aufweist; und b) eine zweite Komponente, die ein Dendrimer mit mindestens einem ersten Arm, der eine Markierung enthält, die in der Lage ist, ein nachweisbares Signal zu emittieren, und mindestens einem zweiten Arm mit einer zweiten, zu der Einfangsequenz komplementären Nucleotidsequenz umfasst;
2) Mischen der ersten und zweiten Komponente bei einer Temperatur und über eine Zeit, die ausreichen, um zu ermöglichen, dass die erste Komponente an die zweite Komponente bindet; und
3) Inkubieren des Mikroarrays und des vorhybridisierten cDNA-Dendrimer-Komplexes bei einer zweiten Temperatur und über eine Zeit, die ausreichen, um zu induzieren, dass der vorhybridisierte cDNA-Dendrimer-Komplex an die erste Nucleotidsequenz bindet, wobei eine derartige Bindung zur Folge hat, dass der Bestandteil das nachweisbare Signal emittiert, wodurch ein Hybridisierungsmuster auf dem Mikroarray erzeugt wird.

2) Mischen der ersten und zweiten Komponente bei einer Temperatur und über eine Zeit, die ausreichen, um zu ermöglichen, dass die erste Komponente an die zweite Komponente bindet; und
3) Inkubieren des Mikroarrays und des vorhybridisierten cDNA-Dendrimer-Komplexes bei einer zweiten Temperatur und über eine Zeit, die ausreichen, um zu induzieren, dass der vorhybridisierte cDNA-Dendrimer-Komplex an die erste Nucleotidsequenz bindet, wobei eine derartige Bindung zur Folge hat, dass der Bestandteil das nachweisbare Signal emittiert, wodurch ein Hybridisierungsmuster auf dem Mikroarray erzeugt wird.

In zusätzlichen Ausführungsformen der Erfindung wird eine derartige cDNA unter Verwendung einer Spinsäule (Zentrifugiersäule) (z.B. wie jener von 4 oder 5) oder unter Verwendung einer Hybridisierungskammer oder -station gereinigt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die folgenden Zeichnungen, in denen gleiche Bezugszeichen gleiche Teile anzeigen, veranschaulichen die Ausführungsformen der Erfindung und sollten nicht als Beschränkung der Erfindung angesehen werden, wie sie durch die Ansprüche umfasst wird, welche einen Teil der Anmeldung bilden.
1 ist eine schematische Darstellung von Schritten des Standes der Technik zur Herstellung eines Mikroarrays für einen Nachweis und Assay einer Nucleinsäuresequenz-Probe;
2 ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Mikroarrays für den Nachweis und Assay einer Nucleinsäuresequenz-Probe in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
3 ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Mikroarrays für einen Nachweis und Assay einer Nucleinsäuresequenz-Probe in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung; und
4 ist eine Schnittansicht einer Spinsäulen-Anordnung, die gemäß dem in 3 dargestellten Verfahren verwendet wird.
5 ist eine Schnittansicht einer zusätzlichen Ausführungsform einer Spinsäule zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist allgemein auf ein Verfahren zur Herstellung einer Nucleinsäuresequenz-Probe für einen Nachweis und Assay auf einem Mikroarray auf eine Weise, die für eine signifikante Verringerung von Zeit und Mühe sorgt, welche typisch für einen Assay einer Probe auf einem Mikroarray erforderlich sind, gerichtet. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt den Vorteil der Herstellung der Nucleinsäuresequenz-Probe in einer kürzeren Zeitspanne unter Verwendung von weniger Schritten bereit, während die Empfindlichkeit, das geringe Hintergrund"rauschen" und die minimalen "falsch positiven Ergebnisse" geliefert werden, die für die Labor- und klinische Verwendung erforderlich sind. Die kostengünstige und effiziente Weise, in der die Nucleinsäuresequenz-Proben hergestellt werden und durch welche das Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung herkömmlicher Labortechniken, -ausrüstung und -reagenzien durchgeführt werden kann, macht es für die Forschung und klinische Verwendung besonders geeignet.
In den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Array von DNA- oder Gensonden, die auf der Oberfläche eines im Wesentlichen ebenen Substrats fixiert oder stabil damit verbunden sind, mit einer Probe von Ziel-Nucleinsäuren unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht, die ausreichen, um ein Hybridisierungsmuster von komplementären Sonden/Target-Komplexen zu erzeugen. Eine Vielfalt von verschiedenen Mikroarrays, die verwendet werden können, ist in der Technik bekannt. Die hybridisierten Proben von Nucleinsäuren werden dann durch markierte Dendrimer-Sonden angesteuert und damit hybridisiert, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen, das einem speziellen Hybridisierungsmuster entspricht. Die einzelnen markierten Dendrimer-Sonden, die mit den Ziel-Nucleinsäuren hybridisiert sind, sind alle in der Lage, das gleiche Signal mit bekannter Intensität zu erzeugen. So kann jedes positive Signal in dem Mikroarray "gezählt" werden, um eine quantitative Information über das genetische Profil der Ziel-Nucleinsäure-Probe zu erhalten.
Bevor die vorliegende Erfindung weiter beschrieben wird, versteht es sich, dass die Erfindung nicht auf die speziellen, nachstehend beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung beschränkt ist, da Abwandlungen der speziellen Ausführungsformen vorgenommen werden können, die immer noch in den Bereich der beigefügten Ansprüche fallen. Es versteht sich auch, dass die verwendete Terminologie dem Zweck der Beschreibung spezieller Ausführungsformen dient und nicht beschränkend sein soll. Stattdessen wird der Bereich der vorliegenden Erfindung durch die beigefügten Ansprüche festgelegt.
Die DNA- oder Gensonden der Mikroarrays, die zur sequenzspezifischen Hybridisierung mit Ziel-Nucleinsäure in der Lage sind, können Polynucleotide oder hybridisierende Analoga oder Nachahmer derselben sein, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Nucleinsäuren, in denen die Phosphodiester-Verknüpfung durch eine Ersatz-Verknüpfungsgruppe, wie Phosphorothioat, Methylimino, Methylphosphonat, Phosphoramidat, Guanidin und dergleichen, ersetzt worden ist, Nucleinsäuren, in denen die Ribose-Untereinheit ersetzt worden ist, z.B. Hexosephosphodiester; Peptidnucleinsäuren und dergleichen. Die Länge der Sonden liegt im Allgemeinen im Bereich von 10 bis 1000 Nucleotiden. In einigen Ausführungsformen der Erfindung sind die Sonden Oligonucleotide mit 15 bis 150 Nucleotiden und gewöhnlicher 15 bis 100 Nucleotiden. In anderen Ausführungsformen sind die Sonden länger, gewöhnlich im Bereich von 150 bis 1000 Nucleotiden, wobei die Polynucleotid-Sonden einzel- oder doppelsträngig sein können, gewöhnlich einzelsträngig, und PCR-Fragmente sein können, die aus cDNA oder klonierten Genen amplifiziert worden sind. Die DNA- oder Gensonden auf der Oberfläche der Substrate entsprechen vorzugsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, bekannten Genen der physiologischen Quellen, die analysiert werden, und sind an einem bekannten Ort auf dem Mikroarray angeordnet, so dass positive Hybridisierungsereignisse mit der Expression eines speziellen Gens in der physiologischen Quelle, aus der die Ziel-Nucleinsäure-Probe abstammt, korreliert werden können. Wegen der Weise, in der die Ziel-Nucleinsäure-Probe erzeugt wird, wie nachstehend beschrieben, weisen die Mikroarrays der Gensonden im Allgemeinen Sequenzen auf, die komplementär zu den Nicht-Matrizen-Strängen des Gens sind, dem sie entsprechen.
Die Substrate, mit denen die Gensonden stabil verbunden sind, können aus einer Vielfalt von Materialien bestehen, einschließlich Kunststoff, Keramik, Metall, Gel, Membran, Glas und dergleichen. Die Mikroarrays können gemäß jedem zweckmäßigen und herkömmlichen Verfahren erzeugt werden, wie der Vorbildung der Gensonden und dann der stabilen Verbindung derselben mit der Oberfläche des Trägers oder dem Züchten der Gensonden direkt auf dem Träger. Eine Anzahl von verschiedenen Mikroarray-Konfigurationen und Verfahren zu ihrer Herstellung sind dem Fachmann bekannt, von denen eine in Science, 283, 83, 1999, beschrieben ist.
Der Ausdruck "Markierung" wird hierin verwendet, um Mittel zu bezeichnen, die in der Lage sind, ein nachweisbares Signal zu liefern, entweder direkt oder durch Wechselwirkung mit einem oder mehreren zusätzlichen Mitgliedern eines Signalerzeugenden Systems. Markierungen, die direkt nachweisbar sind und in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Fluoreszenzmarkierungen, wie Fluorescein, Rhodamin, BODIPY, Cyanin-Farbstoffe (z.B. von Amersham Pharmacia), Alexa-Farbstoffe (z.B. von Molecular Probes, Inc.), Fluoreszennfarbstoff-Phosphoramidite und dergleichen; und radioaktive Isotope, wie ³²S, ³²P, ³H usw.; und dergleichen. Beispiele für Markierungen, die ein nachweisbares Signal durch Wechselwirkung mit einem oder mehreren zusätzlichen Mitgliedern eines Signal-erzeugenden Systems liefern, umfassen Einfang-Einheiten, die spezifisch an komplementäre Bindungspaarmitglieder binden, wobei die komplementären Bindungspaarmitglieder eine direkt nachweisbare Markierungseinheit umfassen, wie eine fluoreszierende Einheit, wie oben beschrieben. Die Markierung liefert bevorzugt kein variables Signal, sondern liefert stattdessen ein über eine gegebene Zeitspanne konstantes und reproduzierbares Signal.
Die vorliegende Erfindung verwendet weiter dendritische Nucleinsäure-Moleküle oder Dendrimere als Markierungssonden-Moleküle. Dendrimere sind komplexe, hoch verzweigte Moleküle, die eine Vielzahl von verbundenen natürlichen oder synthetischen monomeren Untereinheiten von doppelsträngiger DNA umfassen. Dendrimere sind in Nilsen et al., Dendritic Nucleic Acid Structures, J. Theor. Biol., 187, 273-284 (1997), beschrieben, dessen gesamter Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Weitere Informationen hinsichtlich der Struktur und Herstellung von Dendrimeren sind in den U.S. Patenten Nr. 5,175,270, 5,484,904 und 5,487,973 beschrieben.
Dendrimere umfassen zwei Arten von einzelsträngigen Hybridisierungs"armen" auf der Oberfläche, die verwendet werden, um Schlüssel-Funktionalitäten anzubringen. Ein einziges Dendrimer-Molekül kann mindestens 100 Arme jeder Art aufweisen. Eine Art von Arm wird für die Anbringung von ansteuernden Molekülen (z.B. einer Einfangsequenz) verwendet, um eine Target-Spezifität zu herzustellen, und der andere wird für die Anbringung einer Markierung oder eines Markers verwendet. Die Moleküle, welche die Target- und Markierungs-Spezifitäten des Dendrimers festlegen, werden entweder als Oligonucleotide oder als Oligonucleotid-Konjugate angebracht. Unter Verwendung einfacher DNA-Markierungs-, Hybridisierungs- und Ligierungsreaktionen können die Dendrimer-Sonden so konfiguriert werden, dass sie als hoch markiertes, Target-spezifisches Reagens wirken.
Um ein Fluoreszenz-markiertes Dendrimer herzustellen, werden die zu der Einfangsequenz komplementären Sequenzen an einem Cap01 RT-Primer und einem Cap02 RT-Primer (beide ebenfalls von Oligos etc.) getrennt an das gereinigte dendritische Kernmaterial ligiert, das durch die zuvor beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist (siehe Nilson et al., oben, und die U.S. Patente Nr. '270, '904 und '973, oben). In den bevorzugten Ausführungsformen ist der Cap01 RT-Primer ein Cy3^® RT-Primer und ist der Cap02 RT-Primer ein Cy5^® RT-Primer; jedoch ist die Erfindung nicht auf diese zwei bevorzugten Ausführungsformen beschränkt. Dreißig Nucleotide lange Oligonucleotide, die komplementär zu den äußeren Armen eines Vierschicht-Dendrimers mit einem 5'-Cy3^® oder -Cy5^® (in den bevorzugten Ausführungsformen) oder allgemeiner -Cap01 und -Cap02 sind (wobei das Cy3^®, Cy5^®, Cap01 und Cap02 von Oligos usw., Inc., Wilsonville, OR erhältlich sind), werden dann synthetisiert. Die Cy3^®- und Cy5^®-Oligonucleotide werden dann mit der äußeren Oberfläche der jeweiligen entsprechenden Dendrimere hybridisiert und kovalent vernetzt. Überschüssige Einfang- und Fluoreszenz-markierte Oligonucleotide werden dann durch Techniken wie Größenausschlusschromatographie entfernt.
Die Dendrimer-Konzentration wird durch Messen der optischen Dichte des gereinigten Materials bei 260 nm in einem UV/Vis-Spektrometer bestimmt. Die Fluoreszenz wird unter Verwendung eines Fluorometers (FluoroMax, SPEX Industries) bei optimalen Signal/Rausch-Wellenlängen gemessen. In der bevorzugten Ausführungsform unter Verwendung von Cy3 und Cy5 ist Cy3 bei 542 nm anregbar, und die Emission wird bei 570 nm gemessen; ist Cy5 bei 641 nm anregbar, und die Emission wird bei 676 nm gemessen.
In der vorliegenden Erfindung verringert die Verwendung von Dendrimer-Sonden signifikant die Menge an Proben-RNA, die erforderlich ist, um einen Assay zu erzeugen, während die Empfindlichkeit aufgrund der überlegenen Signalamplifikationsfähigkeit des Dendrimers gesteigert wird. Durch Verringerung der für den Assay erforderlichen RNA-Menge kann die Menge an RT-Primer für eine verbesserte Signalerzeugung gleichermaßen verringert werden, wie nachstehend erörtert. Die verringerte RT-Primer-Menge verringert auch die bei der Assaypräparation erforderliche Zahl an Waschschritten. Die vorliegende Erfindung verringert auch den Hybridisierungsprozess zu einem einzigen Schritt für eine erhöhte Empfindlichkeit und Leichtigkeit der Verwendung und signifikante Verringerung der Verarbeitungszeit. Die Hybridisierungsgeschwindigkeit und -effizienz wird in großem Maß erhöht, indem man zuerst die cDNA mit den Dendrimer-Sonden hybridisiert, bevor die cDNA an den Mikroarray hybridisiert wird. Dieses Einschritt-Hybridisierungsverfahren verringert auch die Anzahl der Hybridisierungspuffer auf eins durch Ausschaltung der Verwendung eines cDNA-Hybridisierungspuffers (50% Formamid, 10% Dextransulfat, 1X Denhardt-Lösung, 0,2% N-Lauroylsarcosin, 250 μg/ml gescherte Lachssperma-DNA, 2X SSC, 20 mM Tris, pH 7,5 und doppelt destilliertes Wasser).
Die Ziel-Nucleinsäure ist im Allgemeinen DNA, die aus RNA, die aus natürlich vorkommenden Quellen abstammt, revers transkribiert worden ist, wobei die RNA ausgewählt sein kann aus der Gruppe bestehend aus Gesamt-RNA, Poly(A)⁺mRNA, amplifizierter RNA und dergleichen. Die anfängliche mRNA-Quelle kann in einer Vielfalt von verschiedenen Proben vorliegen, wobei die Probe typisch von einer physiologischen Quelle abstammt. Die physiologische Quelle kann von einer Vielfalt von eukaryotischen Quellen abstammen, wobei interessierende physiologische Quellen Quellen einschließen, die von einzelligen Organismen, wie Hefe, und mehrzelligen Organismen, einschließlich Pflanzen und Tieren, insbesondere Säugern, abstammen, wobei die physiologischen Quellen aus mehrzelligen Organismen von speziellen Organen oder Geweben des mehrzelligen Organismus oder aus isolierten Zellen, die daraus abstammen, abstammen können. Beim Erhalt der zu analysierenden Proben-RNAs aus der physiologischen Quelle, aus der sie abgeleitet werden, kann die physiologische Quelle einer Anzahl von verschiedenen Verarbeitungsschritten unterzogen werden, wobei derartige bekannte Verarbeitungsschritte Gewebehomogenisierung, Zellisolierung und Zytoplasma-Extraktion, Nucleinsäure-Extraktion und dergleichen einschließen können. Verfahren zur Isolierung von RNA aus Zellen, Geweben, Organen oder ganzen Organismen sind dem gewöhnlichen Fachmann bekannt und werden zum Beispiel in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, und in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1998, beschrieben.
Die Proben-mRNA wird durch Hybridisieren eines Oligo(dT)-Primers oder RT-Primers mit der mRNA unter Bedingungen, die für eine enzymatische Verlängerung der hybridisierten Primer ausreichen, in eine Ziel-Nucleinsäure in Form einer cDNA revers transkribiert. Der Primer ist ausreichend lang, um für eine effiziente Hybridisierung mit dem mRNA-Schwanz zu sorgen, wobei die Region typisch einen Längenbereich von 10 bis 25 Nucleotiden, gewöhnlich 10 bis 20 Nucleotiden und gewöhnlicher 12 bis 18 Nucleotiden aufweist.
Mit der Erkenntnis, dass Anwendungen typisch die Verwendung von Sequenz-spezifischen Primern erfordern, umfassen die Standard-Primer, wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, weiter "Einfangsequenz"-Nucleotid-Abschnitte. Die bevorzugten Einfangsequenzen, auf die hierin Bezug genommen wird, sind die Cap01-RT-Primer-Einfangsequenz (Oligos etc., Inc., Wilsonville, OR) oder Cap02-Primer-Einfangsequenz (Oligos etc., Inc., Wilsonville, OR) und sind weiter bevorzugt die Cy3^®-RT-Primer-Einfangsequenz (Oligos etc., Inc. Wilsonville, OR) oder die Cy5^®-RT-Primer-Einfangsequenz (Oligos etc., Inc. Wilsonville, OR) und sind nachstehend dargestellt.
Cap01-RT-Primer-Einfangsequenz:
5'-ggC CTC ACT gCg CgT CTT Ctg TCC CgC C-3'; und
Cap02-RT-Primer-Einfangsequenz:
5'-CCT gTT gCT CTA TTT CCC gTg Ccg CTC Cgg T-3'.
Für maßgeschneiderte Primer sollten die obigen Einfangsequenzen an dem 5'-Ende des entsprechenden maßgeschneiderten Oligonucleotid-Primers angebracht werden. Auf diese Weise ersetzt der maßgeschneiderte Primer den Standard-RT-Primer. Da die vorliegende Erfindung zur Verwendung mit dem Standard-RT-Primer entworfen ist, können einige Modifikationen erforderlich sein, wenn ein maßgeschneiderter Primer eingesetzt wird. Derartige Modifikationen sind dem gewöhnlichen Fachmann bekannt und können die Anpassung der Menge und Mischung von Primern auf der Grundlage der Menge und der Art der verwendeten RNA-Probe einschließen. Der Primer trägt eine Einfangsequenz, die aus einer spezifischen Sequenz von Nucleotiden besteht, wie oben beschrieben. Die Einfangsequenz ist komplementär zu den Oligonucleotiden, die an den Armen der Dendrimer-Sonden angebracht sind, welche weiter mindestens eine Markierung tragen. Derartige komplementäre Oligonucleotide können von einem externen Verkäufer erworben werden und können auch als markierte Einheiten erworben werden. Die Markierung kann an einem oder mehreren der Oligonucleotide, die an den Armen der Dendrimer-Sonde angebracht sind, entweder direkt oder durch eine Verknüpfungsgruppe angebracht werden, wie es in der Technik bekannt ist. In der bevorzugten Ausführungsform sind die Dendrimer-Sonden durch Hybridisieren und Vernetzen von Cy3^®- oder Cy5^®-markierten Oligonucleotiden (in der bevorzugten Ausführungsform) mit den Dendrimer-Armen markiert. Die Cy3^®- oder Cy5^®-markierten Dendrimere sind komplementär zu der Cap01- bzw. Cap02-RT-Primer-Einfangsequenz.
Bei der Erzeugung der Ziel-Nucleinsäure-Probe wird der Primer mit der mRNA in Anwesenheit eines Reverse Transkriptase-Enzyms und anderer Reagenzien, die für die Primerverlängerung unter ausreichenden Bedingungen zur Induktion einer Erststrang-cDNA-Synthese erforderlich sind, in Kontakt gebracht, wobei die zusätzlichen Reagenzien umfassen: dNTPs; Puffermittel, z.B. Tris-Cl; Kationenquellen, sowohl einwertige als auch zweiwertige, z.B. KCl, MgCl₂; RNAse-Inhibitor und Sulfhydril-Reagenzien, z.B. Dithiothreit; und dergleichen. Eine Vielfalt von Enzymen, gewöhnlich DNA-Polymerasen, die Reverse Transkriptase-Aktivität besitzen, können für den Erststrang-cDNA-Syntheseschritt verwendet werden. Beispiele für geeignete DNA-Polymerasen umfassen die DNA-Polymerasen, die von Organismen abstammen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus thermophilen Bakterien und Archaebacteria, Retroviren, Hefen, Neurosporae, Drosophilae, Primaten und Nagern. Geeignete DNA-Polymerasen, die Reverse Transkriptase-Aktivität besitzen, können aus einem Organismus isoliert werden, der im Handel erhalten wurde, oder können durch dem Fachmann bekannte Verfahren aus Zellen erhalten werden, die hohe Niveaus an klonierten Genen exprimieren, welche die Polymerasen kodieren, wobei die spezielle Weise zum Erhalt der Polymerase hauptsächlich auf der Grundlage von Faktoren wie Zweckmäßigkeit, Kosten, Verfügbarkeit und dergleichen ausgewählt wird. Die Reihenfolge, in welche die Reagenzien vereinigt werden, kann abgeändert werden, wie gewünscht.
In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet das cDNA-Syntheseprotokoll das Vereinigen von etwa 0,25 bis 1 μg Gesamt-RNA oder von etwa 12,5 bis 50 ng Poly(A)⁺mRNA mit etwa 0,2 pMol RT-Primer (0,2 pMol) und RNase-freiem Wasser auf ein Endvolumen von etwa 10 μl, was eine RNA-RT-Primer-Mischung liefert. Die RNA-RT-Primer-Mischung wird dann gemischt und mikrozentrifugiert, um den Inhalt am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu sammeln. Die RNA-RT-Primer-Mischung wird dann zehn Minuten lang auf 80°C erwärmt und sofort in Eis überführt. In einem getrennten Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis mische man etwa 4 μl 5X RT-Puffer, 1 μl dNTP-Mischung, 4 μl RNase-freies Wasser und 1 μl, 200 Einheiten, Reverse Transkriptase-Enzym zusammen. Man mische sanft und mikrozentrifugiere kurz, um den Inhalt am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu sammeln, was eine Reaktionsmischung liefert. Man mische die RNA-RT-Primer-Mischung mit der Reaktionsmischung und inkubiere dann bei etwa 42°C über eine ausreichende Zeitspanne, um das Erststrang-cDNA-Primer-Verlängerungsprodukt zu bilden, was gewöhnlich etwa 2 Stunden dauert.
Die Mischung, welche die cDNA oder Ziel-Nucleinsäure nach der Bildung umfasst, kann weiter gereinigt werden, um alle überschüssigen RT-Primer zu entfernen, die noch nach Beendigung des Reverse-Transkriptions-Verfahrens verbleiben könnten. Der überschüssige RT-Primer würde an die Dendrimer-Sonden binden, was eine verringerte Signalstärke und -intensität und so eine verringerte Assay-Empfindlichkeit zur Folge hätte. Obwohl dieser Schritt fakultativ ist, tendiert die Reinigung der cDNA-Mischung dazu, die Signalstärke in dem Mikroarray zu verbessern, was eine verbesserte Signalerzeugung des Hybridisierungsmusters zur Folge hat. Die Menge an RT-Primer beeinflusst die Qualität des Assays, da überschüssiger RT-Primer die Signalstärke und die Auflösung verringern kann. Die überschüssigen RT-Primer können durch jedes geeignete Mittel, einschließlich der Verwendung einer Spinsäulen-Anordnung, des QIAquick^®PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, CA) oder einer Hybridisierungskammer oder -station usw., aus der cDNA-Mischung entfernt werden. Spinsäulen-Anordnungen sind bekannte Vorrichtungen, die verwendet werden, um eine oder mehrere Komponenten mittels Zentrifuge aus einer Mischung abzutrennen.
Bevorzugt können die überschüssigen RT-Primer mittels einer in 4 gezeigten herkömmlichen Spinsäulen-Anordnung oder in einer alternativen Ausführungsform unter Verwendung der Spinsäule von 5 entfernt werden. Das Spinsäulen-Medium ist aus einem Größenausschluss-Harzkern zusammengesetzt, der eine Vielzahl von Harzporen umfasst, die in demselben verteilt sind. Die Harzporen sind ausreichend groß, um den überschüssigen RT-Primer einzufangen, und gestatten, dass cDNA in das Leervolumen tritt. Um überschüssigen RT-Primer zu entfernen, wird die cDNA-haltige Mischung in ein Halterohr an einem Ende der Spinsäule gegeben, wo die Spinsäule und die Mischung über eine Zeitspanne einer hohen Zentrifugalkraft ausgesetzt werden. Die Mischung diffundiert durch die Säule und tritt am entgegengesetzten Ende in ein Sammelgefäß. Das in dem Gefäß gesammelte resultierende Eluat umfasst die gereinigte cDNA-Sonde.
Bei der Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine Menge einer markierten Dendrimer-Sonde zusammen mit einem Hybridisierungspuffer unter Temperaturbedingungen zu dem gereinigten cDNA-Sondeneluat gegeben, welche eine Hybridisierung zwischen der Dendrimer-Sonde und der Ziel-cDNA induzieren. Insbesondere wird die Mischung bei einer ersten Vorhybridisierungstemperatur und über eine ausreichende Zeitspanne inkubiert, um zu ermöglichen, dass die Dendrimer-Sonden an die cDNA binden. Der bevorzugte Bereich der ersten Vorhybridisierungstemperatur, wenn ein Formamid-freier Hybridisierungspuffer verwendet wird, beträgt etwa 45 bis 60°C und bevorzugt 55°C. Wenn ein Formamid-haltiger Hybridisierungspuffer verwendet wird, hängt der bevorzugte Bereich der Vorhybridisierungstemperatur von dem prozentualen Gehalt an Formamid ab, wobei die Temperatur für jede 2% vorhandenes Formamid ausgehend von dem Temperaturbereich für den Formamid-freien Standardpuffer um 1°C verringert wird. Die Mischung wird vorzugsweise etwa 15 bis 20 Minuten inkubiert, um zu ermöglichen, dass die cDNA mit den Dendrimer-Sonden hybridisiert, um eine Vorhybridisierungsmischung zu liefern.
Die Vorhybridisierungsmischung wird dann zu dem Mikroarray gegeben und bei einer zweiten Hybridisierungstemperatur und für eine ausreichende Zeit inkubiert, um zu ermöglichen, dass die cDNA an den Mikroarray bindet. Der bevorzugte Bereich der zweiten Hybridisierungstemperatur beträgt, wenn ein Formamid-freier Hybridisierungspuffer verwendet wird, etwa 42 bis 60°C. Wenn ein Formamid-haltiger Hybridisierungspuffer verwendet wird, hängt der bevorzugte Bereich der Vorhybridisierungstemperatur von dem prozentualen Gehalt an Formamid ab, wobei die Temperatur für jede 2% vorhandenes Formamid ausgehend vom Temperaturbereich für den Formamid-freien Standardpuffer um 1°C verringert wird. Vorzugsweise werden die Vorhybridisierungsmischung und der Mikroarray über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei der zweiten Temperatur inkubiert.
Unter solchen Anfangsbedingungen ist die Einfangsequenz der cDNA in der Lage, mit dem an der Dendrimer-Sonde angebrachten Komplement zu hybridisieren, bevor die cDNA an die Gensonde des Mikroarrays bindet. Die Ziel-cDNA, die an der Dendrimer-Sonde angebracht ist, wird dann unter Bedingungen mit dem Mikroarray in Kontakt gebracht, die ausreichen, um die Hybridisierung der Ziel-cDNA mit der DNA- oder Gensonde auf dem Mikroarray zu ermöglichen. Die resultierende Mischung wird für eine vollständige Hybridisierung über Nacht inkubiert. Geeignete Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann wohlbekannt und werden in Maniatis et al., oben, im Überblick aufgeführt, wobei die Bedingungen moduliert werden können, um eine gewünschte Spezifität der Hybridisierung zu erzielen. Es wird angemerkt, dass alle geeigneten Hybridisierungspuffer in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. In einer bevorzugten Form kann die Hybridisierungspuffer-Zusammensetzung 0,25 M NaPO₄, 4,5% SDS, 1 mM EDTA und 1X SSC umfassen. In einer weiteren bevorzugten Form kann die Hybridisierungspuffer-Zusammensetzung 40% Formamid, 4X SSC und 1% SDS umfassen.
Nach dem Hybridisierungsschritt wird, wenn nicht hybridisierte Dendrimer-Sonden-cDNA-Komplexe beim Nachweisschritt ein Signal emittieren können, ein Waschschritt verwendet, bei dem nicht hybridisierte Komplexe von dem Mikroarray abgespült werden, was so ein sichtbares, diskretes Muster von hybridisierten cDNA-Dendrimer-Sonden zurücklässt, die an den Mikroarray gebunden sind. Eine Vielfalt von Waschlösungen und Protokollen für ihre Verwendung sind dem Fachmann bekannt und können verwendet werden. Die speziellen verwendeten Waschbedingungen hängen notwendigerweise von der speziellen Natur des Signal-erzeugenden Systems ab, das verwendet wird, und sind dem Fachmann bekannt, dem das spezielle verwendete Signal-erzeugende System geläufig ist.
Das resultierende Hybridisierungsmuster von markierten cDNA-Fragmenten kann auf vielfältige Weise sichtbar gemacht oder nachgewiesen werden, wobei die spezielle Weise des Nachweises auf der Grundlage der speziellen Markierung der cDNA gewählt wird, wobei repräsentative Nachweismittel Szintillationszählung, Autoradiographie, Fluoreszenzmessung, kolorimetrische Messung, Lichtemissionsmessung und dergleichen einschließen.
Nach der Hybridisierung und jeglichem bzw. jeglichen Waschschritten) und/oder anschließenden Behandlungen, wie oben beschrieben, wird das resultierende Hybridisierungsmuster nachgewiesen. Beim Nachweis oder bei der Sichtbarmachung des Hybridisierungsmusters wird die Intensität oder der Signalwert der Markierung nicht nur nachgewiesen, sondern quantifiziert, womit gemeint ist, dass das Signal aus jedem Flecken der Hybridisierung gemessen wird.
Nach dem Nachweis oder der Sichtbarmachung kann das Hybridisierungsmuster verwendet werden, um eine quantitative oder qualitative Information über das genetische Profil der markierten Ziel-Nucleinsäure-Probe, die mit dem Mikroarray in Kontakt gebracht worden war, um ein Hybridisierungsmuster zu erzeugen, sowie der physiologischen Quelle zu bestimmen, aus welcher die markierte Ziel-Nucleinsäure-Probe abgeleitet wurde. Aus diesen Daten kann man auch Information über die physiologische Quelle ableiten, aus der die Ziel-Nucleinsäure-Probe abgeleitet war, wie die Typen der Gene, die in dem Gewebe oder in der Zelle exprimiert werden, das bzw. die die physiologische Quelle ist, sowie die Expressionsniveaus jedes Gens, insbesondere in quantitativer Hinsicht. Wenn man die vorliegenden Verfahren beim Vergleich von Ziel-Nucleinsäuren aus zwei oder mehr physiologischen Quellen verwendet, können die Hybridisierungsmuster verglichen werden, um Unterschiede zwischen den Mustern zu identifizieren. Wenn Mikroarrays, in denen jede der verschiedenen Sonden einem bekannten Gen entspricht, verwendet werden, können alle Diskrepanzen einer differentiellen Expression eines speziellen Gens in den physiologischen Quellen, die verglichen werden, in Beziehung gebracht werden. So finden die vorliegenden Verfahren Verwendung in differentiellen Genexpressionsassays, bei denen man die vorliegenden Verfahren bei der Differential-Expressionsanalyse von: erkranktem und normalem Gewebe, z.B. neoplastischem und normalem Gewebe, verschiedenen Gewebe- oder Untergewebe-Arten und der gleichen verwenden kann.
BEISPIEL 1
Mit Bezug auf 2 wird nachstehend ein Verfahren für einen Nachweis und Assay auf einem Mikroarray beschreiben.
Mikroarray-Herstellung
Ein Mikroarray wurde nach Anweisung vom Hersteller oder anhand eines üblichen Verfahrensprotokolls hergestellt. Die Nucleinsäure-Sequenzen, welche die DNA- oder Gensonden umfassten, wurden unter Verwendung bekannter Techniken in der Polymerasekettenreaktion amplifiziert, dann auf Glasobjektträger aufgetüpfelt und gemäß herkömmlichen Verfahren verarbeitet.
Herstellung und Konzentration von Ziel-Nucleinsäuresequenzen-Probe oder cDNA
Die Ziel-Nucleinsäuresequenzen oder cDNA wurde aus Gesamt-RNA oder Poly(A)⁺RNA hergestellt, die aus einer Probe von Zellen extrahiert wurde. Es wird angemerkt, dass bei Proben, die etwa 10 bis 20 μg Gesamt-RNA oder 500-1000 ng Poly(A)⁺RNA enthalten, eine Ethanolfällung nicht erforderlich ist und weggelassen werden kann, da die cDNA ausreichend konzentriert ist, um die Mikroarray-Hybridisierung durchzuführen. In einem Mikrozentrifugenröhrchen wurden 0,25 bis 5 μg Gesamt-RNA oder 12,5 bis 500 ng Poly(A)⁺RNA mit 3 μl Cy3^®- oder Cy5^®-RT-Primer (0,2 pMol) und RNase-freiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 10 μl versetzt, was eine RNA-RT-Primermischung lieferte. Die resultierende Mischung wurde kurz gemischt und mikrozentrifugiert, um den Inhalt am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu sammeln. Der gesammelte Inhalt wurde dann etwa zehn (10) Minuten erwärmt und sofort in Eis überführt. In einem getrennten Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis wurden 4 μl 5X RT-Puffer, 1 μl dNTP-Mischung, 4 μl RNase-freies Wasser und 1 μl Reverse Transkriptase-Enzym (200 Einheiten) vereinigt, was eine Reaktionsmischung lieferte. Die Reaktionsmischung wurde sanft gemischt und kurz mikrozentrifugiert, um den Inhalt am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu sammeln. 10 μl der RNA-RT-Primermischung und 10 μl der Reaktionsmischung wurden kurz gemischt und zwei Stunden bei 42°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 3,5 μl 0,5 M NaOH/50 mM EDTA zu der Mischung beendet. Die Mischung wurde zehn (10) Minuten bei 65°C inkubiert, um die DNA/RNA-Hybride zu denaturieren, und die Reaktion wurde mit 5 μl 1 M Tris-HCl, pH 7,5, neutralisiert. 38,5 μl 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA wurden dann zu der neutralisierten Reaktionsmischung gegeben. (Die obigen Schritte können unter Ersatz der 3 μl Cy3^®-RT-Primer (0,2 pMol) durch 3 μl Cy5^®-RT-Primer (0,2 pMol) zur Herstellung von Zweikanal-Expressionsassays wiederholt werden, wobei die hergestellte Cy3^®- und Cy5^®-cDNA-Mischung mit 10 μl 10 Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA zusammengemischt wird, was eine Reaktionsmischung für die Verarbeitung in den folgenden Schritten liefert.)
2 μl Träger-Nucleinsäure (10 mg/ml lineares Acrylamid) wurden für eine Ethanol-Fällung zu der neutralisierten Reaktionsmischung gegeben. 175 μl 3 M Ammoniumacetat wurden zu der Mischung gegeben und dann gemischt. Dann wurden 625 μl 100%-iges Ethanol zu der resultierenden Mischung gegeben. Die resultierende Mischung wurde dreißig (30) Minuten bei –20°C inkubiert. Die Probe wurde bei einer Beschleunigungsrate von mehr als 10000 g fünfzehn (15) Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde aspiriert, und dann wurden 330 μl 70%-iges Ethanol zu dem Überstand oder dem cDNA-Pellet gegeben. Das cDNA-Pellet wurde dann 5 Minuten lang bei einer Beschleunigungsrate von mehr als 10000 g zentrifugiert, dann wurde es entfernt. Das cDNA-Pellet wurde getrocknet (d.h. 20-30 Minuten bei 65° Celsius).
Hybridisierung der cDNA/Dendrimer-Sonden-Mischung an den Mikroarray
Der DNA-Hybridisierungspuffer wurde dann aufgetaut und durch Erwärmen auf 65°C über zehn (10) Minuten resuspendiert. Der Hybridisierungspuffer umfasste 40% Formamid. Der Puffer wurde durch Umdrehen gemischt, um sicherzustellen, dass die Komponenten gleichmäßig resuspendiert wurden. Das Erwärmen und Mischen wurden wiederholt, bis alles Material resuspendiert war. Eine Menge von Konkurrenz-DNA wurde zugesetzt, wie erforderlich (z.B. COT-1-DNA und PolydA). Die cDNA wurde in 5,0 μl sterilem Wasser resuspendiert.
In einer ersten Ausführungsform, einer Einkanal-Analyse, wurden 2,5 μl einer Art von 3DNA^®-Reagens (Genisphere, Inc., Montvale, NJ) (Cy3 oder Cy5) zusammen mit 12,5 μl eines DNA-Hybridisierungspuffers (der 40% Formamid enthielt) zu der resuspendierten cDNA gegeben. In einer alternativen Ausführungsform für die Zweikanal-Analyse wurden 2,5 μl von zwei Arten von 3DNA^®-Reagenzien, Cy3 und Cy5, spezifisch markierte Dendrimere, zusammen mit 10 μl DNA-Hybridisierungspuffer zu der resuspendierten cDNA gegeben. In einer weiteren Ausführungsform der Mehrkanal-Analyse (mit drei oder mehr Kanälen) wurden 2,5 μl von drei oder mehr Arten von 3DNA^®-Reagenzien, Cy3, Cy5 und einem oder mehreren, die unter Verwendung einer anderen Markierungseinheit hergestellt worden waren, zusammen mit 10 μl eines DNA-Hybridisierungspuffers zu der resuspendierten cDNA gegeben.
Bei größeren Hybridisierungspuffer-Volumina kann zusätzlicher DNA-Hybridisierungspuffer auf das erforderliche Endvolumen zugesetzt werden. Es wird angemerkt, dass Hybridisierungspuffer-Volumina von mehr als 35 μl auch zusätzliche 3DNA^®-Reagenzien erfordern können.
Die DNA-Hybridisierungspuffer-Mischung wurde etwa 15 bis 20 Minuten bei etwa 50°C inkubiert, um eine Vorhybridisierung der cDNA mit den 3DNA^®-Reagenzien zu ermöglichen. Die vorhybridisierte Mischung wurde dann zu dem Mikroarray gegeben und dann über Nacht bei 55°C inkubiert. In dieser Stufe wurde die cDNA mit den Gensonden hybridisiert.
Waschen nach Hybridisierung
Der Mikroarray wurde kurz gewaschen, um alle überschüssigen Dendrimer-Sonden zu entfernen. Zuerst wurde der Mikroarray 10 Minuten bei 55°C mit 2X SSC-Puffer, 0,2% SDS gewaschen. Dann wurde der Mikroarray 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 2X SSC-Puffer gewaschen. Schließlich wurde der Mikroarray 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,2X SSC-Puffer gewaschen.
Signalnachweis
Der Mikroarray wurde dann gemäß Anweisung vom Hersteller des Scanners den Nachweis, die Analyse und den Assay des Hybridisierungsmusters gescannt.
BEISPIEL 2
Mit Bezug auf 3 wird nachstehend ein Verfahren für einen Nachweis und Assay auf einem Mikroarray beschrieben. Dieses Verfahren umfasst die Verwendung einer Spinsäulen-Anordnung (z.B. von 4 oder 5) zur Verringerung der Protokollzeit und der Zahl der Schritte und zur Erhöhung der Signalstärke.
Mikroarray-Herstellung
Ein Mikroarray wurde nach Anweisung vom Hersteller oder durch übliche Protokollverfahren hergestellt. Die Nucleinsäuresequenzen, welche die DNA- oder Gensonden umfassten, wurden unter Verwendung bekannter Techniken in einer Polymerasekettenreaktion amplifiziert, dann auf Glasobjektträger aufgetüpfelt und gemäß herkömmlichen Verfahren verarbeitet.
Herstellung und Konzentration von Ziel-Nucleinsäuresequenzen oder cDNA
Die Ziel-Nucleinsäuresequenzen oder cDNA wurde aus Gesamt-RNA oder Poly(A)⁺RNA hergestellt, die aus einer Probe von Zellen extrahiert worden war. In einem Mikrozentrifugenröhrchen wurden 0,25 bis 5 μg Gesamt-RNA oder 12,5 bis 500 ng Poly(A)⁺RNA mit 1 μl Cy3^®- oder Cy5^®-RT-Primer (5 pMol) und RNase-freiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 10 μl versetzt, was eine RNA-RT-Primer-Mischung lieferte. Die resultierende Mischung wurde gemischt und kurz zentrifugiert, um den Inhalt am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu sammeln. Der gesammelte Inhalt wurde dann etwa zehn (10) Minuten auf 80°C erwärmt und sofort in Eis überführt. In einem getrennten Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis wurden 4 μl 5X RT-Puffer, 1 μl dNTP-Mischung, 4 μl RNase-freies Wasser und 1 μl Reverse Transkriptase-Enzym (200 Einheiten) vereinigt, was eine Reaktionsmischung lieferte. Die Reaktionsmischung wurde sanft gemischt und kurz mikrozentrifugiert, um den Inhalt am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu sammeln. 10 μl der RNA-RT-Primermischung und 10 μl der Reaktionsmischung wurden zusammengemischt und zwei Stunden bei 42°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 3,5 μl 0,5 M NaOH/50 mM EDTA beendet. Die Mischung wurde zehn (10) Minuten bei 65°C inkubiert, um die DNA/RNA-Hybride zu denaturieren. Die Reaktionsmischung wurde durch die Zugabe von 5 μl 1 M Tris-HCl, pH 7,5, zu der Mischung neutralisiert. 71 μl 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA wurden zu der neutralisierten Reaktionsmischung gegeben. (Die obigen Schritte können unter Ersatz des 1 μl Cy3^®-RT-Primers (5 pMol) durch 1 μl Cy5^®-RT-Primer (5 pMol) zur Herstellung eines Zweikanal-Expressionsassays wiederholt werden, wobei die hergestellte Cy3^®- und Cy5^®-cDNA-Mischung mit 42 μl 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA zusammengemischt werden, was eine Reaktionsmischung für die Verarbeitung in den folgenden Schritten ergibt.)
cDNA-Reinigung: Entfernung von überschüssigem RT-Primer mittels SC-Spinsäulen-Anordnung
Mit Bezug auf die Spinsäule von 4 wurde die Spinsäule mehrere Male umgedreht, um das Medium zu resuspendieren und eine gleichmäßige Aufschlämmung in der Säule zu schaffen. Die obere und untere Kappe wurden von der Spinsäule entfernt. Ein Mikrozentrifugenröhrchen wurde erhalten, und die untere Spitze des Mikrozentrifugenröhrchens wurde abgeschnitten oder durchbohrt. Ein Ende der Spinsäule wurde in das durchbohrte Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, dann wurde das durchbohrte Mikrozentrifugenröhrchen in ein zweites, intaktes Mikrozentrifugenröhrchen oder Sammelröhrchen gegeben. Die zusammengebaute Spinsäule wurde dann mit dem Mikrozentrifugenröhrchen-Ende zuerst in ein 15 ml-Zentrifugenrohr gegeben, wie in 4 gezeigt. Die Spinsäule wurde etwa 3,5 Minuten lang nach Erreichen der vollen Beschleunigung bei etwa 1000 g zentrifugiert. Die Spinsäule wurde überprüft, um sicherzustellen, dass die Säule nach der Zentrifugation vollständig abgelaufen war und dass das Ende der Spinsäule über dem Flüssigkeitsspiegel im Sammelröhrchen lag. Das Sammelröhrchen enthielt etwa 2 bis 2,5 ml klaren Puffer, der aus der Spinsäule entleert worden war. Das Harz im Säulenzylinder erschien nahezu trocken und ohne Verwerfungen oder Risse gut gepackt. Wenn das Ende der Spinsäule in den flüssigen Teil eingetaucht gewesen wäre, hätte man die Spinsäule verworfen und die obigen Schritte mit einer frischen Spinsäule wiederholt. Die Spinsäule war zu diesem Zeitpunkt präpariert, um den überschüssigen RT-Primer in der neutralisierten Reaktionsmischung zu entfernen.
Die abgelaufene Spinsäule wurde entfernt, und ein neues 1,0 ml-Sammelröhrchen wurde oben auf die Puffer-Sammelröhrchen gegeben, die sich bereits in dem 15 ml-Zentrifugenrohr befanden. Der abgelassene Puffer wurde verworfen. Die abgelaufene Spinsäule wurde in das neue Sammelröhrchen gegeben. 100 μl der neutralisierten Reaktionsmischung, welche die cDNA enthielt, wurden direkt in das Zentrum des Spinsäulen-Mediums geladen. Die Spinsäulen-Anordnung wurde etwa 2,5 Minuten lang nach Erreichen der vollen Beschleunigung bei 10000 × g zentrifugiert. Das Eluat, das sich in dem neuen Sammelröhrchen sammelte, wurde dann gewonnen. Das ursprüngliche Volumen ± 10 Prozent wurden zurückgewonnen. Das Eluat umfasste die cDNA-Sonde.
Alternativ wurde unter Verwendung der Spinsäule von 5 die Spinsäule mehrere Male umgedreht, um das Medium zu resuspendieren und eine gleichmäßige Aufschlämmung in der Säule zu schaffen. Die obere und untere Kappe wurden von der Spinsäule entfernt. Die Spinsäule wurde dann in ein 15 ml-Zentrifugenrohr gegeben, wie in 5 gezeigt. Die Spinsäule wurde etwa 3,5 Minuten lang nach Erreichen der vollen Beschleunigung bei etwa 1000 g zentrifugiert. Die Spinsäule wurde überprüft, um sicherzustellen, dass die Säule nach der Zentrifugation vollständig abgelaufen war und dass sich das Ende der Spinsäule über dem Flüssigkeitsspiegel in dem Sammelröhrchen befand. Das Sammelröhrchen enthielt etwa 2 bis 2,5 ml klaren Puffer, der aus der Spinsäule abgelaufen war. Das Harz im Säulenzylinder erschien nahezu trocknen und ohne Verwerfungen oder Risse gut gepackt. Wenn das Ende der Spinsäule in den flüssigen Teil eingetaucht gewesen wäre, hätte man die Spinsäule verworfen und die obigen Schritte mit einer frischen Spinsäule wiederholt. Die Spinsäule war zu diesem Zeitpunkt präpariert, um den überschüssigen RT-Primer in der neutralisierten Reaktionsmischung zu entfernen.
Die abgelaufene Spinsäule wurde entfernt, und der klare Puffer wurde ausgeleert. Ein neues 1,0 ml-Sammelröhrchen wurde in das untere Ende des 15 ml-Zentrifugenrohrs gegeben. 100 μl der neutralisierten Reaktionsmischung, welche die cDNA enthielt, wurde direkt in das Zentrum des Spinsäulen-Mediums geladen. Die Spinsäulen-Anordnung wurde etwa 2,5 Minuten lang nach Erreichen der vollen Beschleunigung bei 10000 × g zentrifugiert. Das Eluat, das sich in dem neuen Sammelröhrchen sammelte, wurde dann gewonnen. Das ursprüngliche Volumen ± 10 Prozent wurden zurückgewonnen. Das Eluat umfasste die cDNA-Sonde.
2 μl einer Träger-Nucleinsäure (10 mg/ml lineares Acrylamid) wurden für eine Ethanol-Fällung zu dem Eluat gegeben. 250 μl 3 M Ammoniumacetat wurden zu der Mischung gegeben und gemischt. Dann wurden 875 μl 100%-iges Ethanol zu der Mischung gegeben. Die resultierende Mischung wurde dreißig (30) Minuten bei –20°C inkubiert. Die Probe wurde fünfzehn (15) Minuten lang bei einer Beschleunigungsrate von mehr als 10000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde aspiriert, und 300 μl 70%-iges Ethanol wurden zu dem Überstand oder dem cDNA-Pellet gegeben. Das cDNA-Pellet wurde dann 5 Minuten lang bei einer Beschleunigungsrate von mehr als 10000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde dann entfernt. Das cDNA-Pellet wurde getrocknet (d.h. 20-30 Minuten bei 65° Celsius).
Hybridisierung der cDNA/Dendrimer-Sonden-Mischung an Mikroarray
Der DNA-Hybridisierungspuffer wurde dann aufgetaut und durch Erwärmen auf 65°C und Halten bei 65°C über zehn (10) Minuten resuspendiert. Der Hybridisierungspuffer umfasste 40% Formamid. Der Puffer wurde durch Umdrehen gemischt, um sicherzustellen, dass die Komponenten gleichmäßig resuspendiert wurden. Das Erwärmen und Mischen wurden wiederholt, bis alles Material resuspendiert war. Eine Menge von Konkurrenz-DNA (z.B. COT-1-DNA und PolydA) kann zugesetzt werden, falls erforderlich. Die cDNA wurde in 5,0 μl sterilem Wasser resuspendiert.
In einer ersten Ausführungsform, einer Einkanal-Analyse, wurden 2,5 μl einer Art von 3DNA^®-Reagens (Genisphere, Inc., Montvale, NJ) (Cy3 oder Cy5) zusammen mit 12,5 μl eines DNA-Hybridisierungspuffers (der 40% Formamid enthielt) zu der resuspendierten cDNA gegeben. In einer alternativen Ausführungsform für eine Zweikanal-Analyse wurden 2,5 μl von zwei Arten von 3DNA^®-Reagenzien, Cy3 und Cy5, spezifisch markierte Dendrimere, zusammen mit 10 μL eines DNA-Hybridisierungspuffers zu der resuspendierten cDNA gegeben. In einer weiteren Ausführungsform der Mehrkanal-Analyse (mit drei oder mehr Kanälen) wurden 2,5 μL von drei oder mehr Arten von 3DNA^®-Reagenzien, Cy3, Cy5 und einem oder mehreren, die unter Verwendung einer anderen Markierungseinheit und einer einzigartigen Einfang-Sequenz hergestellt worden waren, zusammen mit 10 μl eines DNA-Hybridisierungspuffers zu der resuspendierten cDNA gegeben.
Bei größeren Hybridisierungspuffer-Volumina können zusätzliche Mengen des DNA-Hybridisierungspuffers zugesetzt werden, um das erforderliche Endvolumen zu erreichen. Es wird auch angemerkt, dass Hybridisierungspuffer-Volumina von mehr als 35 μl auch zusätzliche 3DNA^®-Reagenzien erfordern können. Die DNA-Hybridisierungspuffer-Mischung wurde etwa 15 bis 20 Minuten bei einer Temperatur von etwa 50°C inkubiert, um die Vorhybridisierung der cDNA an die 3DNA^®-Reagenzien oder Dendrimer-Sonden zu ermöglichen. In dieser Stufe hybridisierten die Dendrimer-Sonden des 3DNA^®-Reagens mit der Einfangsequenz auf der cDNA. Nach 20 Minuten wurde dann der DNA-Hybridisierungspuffer zu dem Mikroarray gegeben. Der Mikroarray und der DNA-Hybridisierungspuffer wurden zugedeckt und über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei einer Temperatur von etwa 55°C inkubiert. In dieser Stufe wurde die cDNA mit den Gensonden hybridisiert.
Waschen nach Hybridisierung
Der Mikroarray wurde kurz gewaschen, um alle überschüssigen Dendrimer-Sonden zu entfernen. Zuerst wurde der Mikroarray 10 Minuten bei 55°C mit 2X SSC-Puffer gewaschen, der 0,2% SDS enthielt. Dann wurde der Mikroarray 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 2X SSC-Puffer gewaschen. Schließlich wurde der Mikroarray 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,2X SSC-Puffer gewaschen.
Signalnachweis
Der Mikroarray wurde dann gemäß Anweisung vom Hersteller des Scanners für den Nachweis, die Analyse und den Assay des Hybridisierungsmuster gescannt.
BEISPIEL 3
Ein alternatives Verfahren für einen Nachweis und Assay auf einem Mikroarray
Mikroarray-Herstellung
Ein Mikroarray wurde nach Anweisung des Herstellers oder durch übliche Protokollverfahren hergestellt. Die Nucleinsäuresequenzen, welche die DNA oder Gensonden umfassten, wurden unter Verwendung bekannter Techniken in einer Polymerasekettenreaktion amplifiziert, dann auf Glasobjektträger aufgetüpfelt und gemäß herkömmlichen Verfahren verarbeitet.
Herstellung und Konzentration von Ziel-Nucleinsäure-Sequenzen oder cDNA
Die Ziel-Nucleinsäuresequenzen oder cDNA wurde aus Gesamt-RNA oder Poly(A)⁺RNA hergestellt, die aus einer Probe von Zellen extrahiert worden war. In einem Mikrozentrifugenröhrchen wurden 0,25 bis 10 μg Gesamt-RNA oder 250 bis 500 ng Poly(A)⁺RNA mit 1 μl Cy3^®- oder Cy5^®-RT-Primer (5 pMol) und RNase-freiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 10 μl versetzt, was eine RNA-RT-Primer-Mischung lieferte. Die resultierende Mischung wurde gemischt und kurz zentrifugiert, um den Inhalt am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu sammeln. Der gesammelte Inhalt wurde dann etwa zehn (10) Minuten auf 80°C erwärmt und sofort in Eis überführt. In einem getrennten Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis wurden 4 μl 5X RT-Puffer, 1 μl dNTP-Mischung, 4 μl RNase-freies Wasser und 1 μl Reverse Transkriptase-Enzym (200 Einheiten) vereinigt, was eine Reaktionsmischung lieferte. Die Reaktionsmischung wurde sanft gemischt und kurz mikrozentrifugiert, um den Inhalt am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu sammeln. 10 μl der RNA-RT-Primermischung und 10 μl der Reaktionsmischung wurden zusammengemischt und zwei Stunden bei 42°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 3,5 μl 0,5 M NaOH/50 mM EDTA beendet. Die Mischung wurde zehn (10) Minuten bei 65°C inkubiert, um die DNA/RNA-Hybride zu denaturieren. Die Reaktionsmischung wurde durch die Zugabe von 5 μl 1 M Tris-HCl, pH 7,5, zu der Mischung neutralisiert. 71 μl 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA wurden zu der neutralisierten Reaktionsmischung gegeben.
cDNA-Reinigung: Entfernung von überschüssigem RT-Primer über eine SC-Spinsäulen-Anordnung
Mit Bezug auf die Spinsäule von 4 wurde die Spinsäule mehrere Male umgedreht, um das Medium zu resuspendieren und eine gleichmäßige Aufschlämmung in der Säule zu schaffen. Die obere und untere Kappe wurden von der Spinsäule entfernt. Ein Mikrozentrifugenröhrchen wurde erhalten, und die untere Spitze des Mikrozentrifugenröhrchens wurde abgeschnitten oder durchbohrt. Ein Ende der Spinsäule wurde in das durchbohrte Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, dann wurde das durchbohrte Mikrozentrifugenröhrchen in ein zweites, intaktes Mikrozentrifugenröhrchen oder Sammelröhrchen gegeben. Die zusammengebaute Spinsäule wurde dann mit dem Mikrozentrifugenröhrchen-Ende zuerst in ein 15 ml-Zentrifugenrohr gegeben, wie in 4 gezeigt. Die Spinsäule wurde etwa 3,5 Minuten lang nach Erreichen der vollen Beschleunigung bei etwa 1000 g zentrifugiert. Die Spinsäule wurde überprüft, um sicherzustellen, dass die Säule nach der Zentrifugation vollständig abgelaufen war und dass das Ende der Spinsäule über dem Flüssigkeitsspiegel im Sammelröhrchen lag. Das Sammelröhrchen enthielt etwa 2 bis 2,5 ml klaren Puffer, der aus der Spinsäule entleert worden war. Das Harz im Säulenzylinder erschien nahezu trocken und ohne Verwertungen oder Risse gut gepackt. Wenn das Ende der Spinsäule in den flüssigen Teil eingetaucht gewesen wäre, hätte man die Spinsäule verworfen und die obigen Schritte mit einer frischen Spinsäule wiederholt. Die Spinsäule war zu diesem Zeitpunkt präpariert, um den überschüssigen RT-Primer in der neutralisierten Reaktionsmischung zu entfernen.
Die abgelaufene Spinsäule wurde entfernt, und ein neues 1,0 ml-Sammelröhrchen wurde oben auf die Puffer-Sammelröhrchen gegeben, die sich bereits in dem 15 ml-Zentrifugenrohr befanden. Der abgelassene Puffer wurde verworfen. Die abgelaufene Spinsäule wurde in das neue Sammelröhrchen gegeben. 100 μl der neutralisierten Reaktionsmischung, welche die cDNA enthielt, wurden direkt in das Zentrum des Spinsäulen-Mediums geladen. Die Spinsäulen-Anordnung wurde etwa 2,5 Minuten lang nach Erreichen der vollen Beschleunigung bei 10000 × g zentrifugiert. Das Eluat, das sich in dem neuen Sammelröhrchen sammelte, wurde dann gewonnen. Das ursprüngliche Volumen ± 10 Prozent wurden zurückgewonnen. Das Eluat umfasste die cDNA-Sonde.
Alternativ wurde unter Verwendung der Spinsäule von 5 die Spinsäule mehrere Male umgedreht, um das Medium zu resuspendieren und eine gleichmäßige Aufschlämmung in der Säule zu schaffen. Die obere und untere Kappe wurden von der Spinsäule entfernt. Die Spinsäule wurde dann in ein 15 ml-Zentrifugenrohr gegeben, wie in 5 gezeigt. Die Spinsäule wurde etwa 3,5 Minuten lang nach Erreichen der vollen Beschleunigung bei etwa 1000 g zentrifugiert. Die Spinsäule wurde überprüft, um sicherzustellen, dass die Säule nach der Zentrifugation vollständig abgelaufen war und dass sich das Ende der Spinsäule über dem Flüssigkeitsspiegel in dem Sammelröhrchen befand. Das Sammelröhrchen enthielt etwa 2 bis 2,5 ml klaren Puffer, der aus der Spinsäule abgelaufen war. Das Harz im Säulenzylinder erschien nahezu trocknen und ohne Verwerfungen oder Risse gut gepackt. Wenn das Ende der Spinsäule in den flüssigen Teil eingetaucht gewesen wäre, hätte man die Spinsäule verworfen und die obigen Schritte mit einer frischen Spinsäule wiederholt. Die Spinsäule war zu diesem Zeitpunkt präpariert, um den überschüssigen RT-Primer in der neutralisierten Reaktionsmischung zu entfernen.
Die Spinsäule wurde entfernt, und der klare Puffer wurde ausgeleert. Ein neues 1,0 ml-Sammelröhrchen wurde in das untere Ende des 15 ml-Zentrifugenrohrs gegeben. 100 μl der neutralisierten Reaktionsmischung, welche die cDNA enthielt, wurde direkt in das Zentrum des Spinsäulen-Mediums geladen. Die Spinsäulen-Anordnung wurde etwa 2,5 Minuten lang nach Erreichen der vollen Beschleunigung bei 10000 × g zentrifugiert. Das Eluat, das sich in dem neuen Sammelröhrchen sammelte, wurde dann gewonnen. Das ursprüngliche Volumen ± 10 Prozent wurden zurückgewonnen. Das Eluat umfasste die cDNA-Sonde.
Hybridisierung von cDNA/Dendrimer-Sondenmischung an Mikroarray
Der DNA-Hybridisierungspuffer wurde dann aufgetaut und durch Erwärmen auf 65°C und Halten bei 65°C über zehn (10) Minuten resuspendiert. Der Hybridisierungspuffer umfasste 40% Formamid. Der Puffer wurde durch Umdrehen gemischt, um sicherzustellen, dass die Komponenten gleichmäßig resuspendiert wurden. Das Erwärmen und Mischen wurde wiederholt, bis alles Material resuspendiert war. Eine Menge von Konkurrenz-DNA (z.B. COT-1-DNA und PolydA) kann zugesetzt werden, falls erforderlich. 5,0 bis 10 μl der eluierten cDNA-Sonde wurden für die Hybridisierung verwendet. In einer ersten Ausführungsform, einer Einkanal-Analyse, wurde 2,5 μl einer Art von 3DNA^®-Reagens (Genisphere, Inc., Montvale, NJ) (Cy3 oder Cy5) zusammen mit 12,5 μl eines DNA-Hybridisierungspuffers (der 40% Formamid enthielt) zu der resuspendierten cDNA gegeben. In einer alternativen Ausführungsform für eine Zweikanal-Analyse wurden 2,5 μl von zwei Arten von 3DNA^®-Reagenzien, Cy3 und Cy5, spezifisch markierte Dendrimere, zusammen mit 10 μl eines DNA-Hybridisierungspuffers zu der resuspendierten cDNA gegeben. In einer weiteren Ausführungsform der Mehrkanal-Analyse (mit drei oder mehr Kanälen) wurden 2,5 μl von drei oder mehr Arten von 3DNA^®-Reagenzien, Cy3, Cy5 und einem oder mehreren, die unter Verwendung einer anderen Markierungseinheit hergestellt worden waren, zusammen mit 10 μl eines DNA-Hybridisierungspuffers zu der resuspendierten cDNA gegeben.
Bei größeren Hybridisierungspuffer-Volumina können zusätzliche Mengen des DNA-Hybridisierungspuffers zugesetzt werden, um das erforderliche Endvolumen zu erreichen. Es wird auch angemerkt, dass Hybridisierungspuffer-Volumina von mehr als 35 μl auch zusätzliche 3DNA^®-Reagenzien erfordern können. Die DNA-Hybridisierungspuffer-Mischung wurde etwa 15 bis 20 Minuten bei einer Temperatur von etwa 50°C inkubiert, um die Vorhybridisierung der cDNA mit den 3DNA^®-Reagenzien oder Dendrimer-Sonden zu ermöglichen. In dieser Stufe hybridisierten die Dendrimer-Sonden des 3DNA^®-Reagens mit der Einfangsequenz auf der cDNA. Nach 20 Minuten wurde dann der DNA-Hybridisierungspuffer zu dem Mikroarray gegeben. Der Mikroarray und der DNA-Hybridisierungspuffer wurden zugedeckt und über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei einer Temperatur von etwa 55°C inkubiert. In dieser Stufe wurde die cDNA an die Gensonden hybridisiert.
Waschen nach Hybridisierung
Der Mikroarray wurde kurz gewaschen, um alle überschüssigen Dendrimer-Sonden zu entfernen. Zuerst wurde der Mikroarray 10 Minuten bei 55°C mit 2X SSC-Puffer gewaschen, der 0,2% SDS enthielt. Dann wurde der Mikroarray 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 2X SSC-Puffer gewaschen. Schließlich wurde der Mikroarray 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,2X SSC-Puffer gewaschen.
Signalnachweis
Der Mikroarray wurde dann gemäß Anweisung vom Hersteller des Scanners für einen Nachweis, eine Analyse und einen Assay des Hybridisierungsmusters gescannt.
BEISPIEL 4
Verfahren für einen Nachweis und Assay auf einem Mikroarray unter Verwendung eines Nachweiskits für cDNA-Arrays

Kit-Inhalt:

Fläschchen 1	Cy3^® 3DNA^®-Reagens (Genisphere, Montvale, NJ). Man
	verwendet 2,5 μl pro 20 μl Assay
Fläschchen 2	Hybridisierungspuffer – 0,25 M NaPO₄, 4,5% SDS, 1 mM
	EDTA und 1X SCC (aufbewahrt bei –20°C im Dunkeln).

Mikroarray-Herstellung
Ein Mikroarray wurde nach Anweisung vom Hersteller oder durch übliche Protokollverfahren hergestellt. Die Nucleinsäuresequenzen, welche die DNA oder Gensonden umfassten, wurden unter Verwendung bekannter Techniken in einer Polymerasekettenreaktion amplifiziert, dann auf Glasobjektträger aufgetüpfelt und gemäß herkömmlichen Verfahren verarbeitet.
3DNA^®-Hybridisierung
Der Hybridisierungspuffer von Fläschchen 2 wurde aufgetaut und durch 10-minütiges Erwärmen auf 65°C resuspendiert. Der Puffer wurde durch Umdrehen gemischt, um sicherzustellen, das die Komponenten gleichmäßig resuspendiert wurden. Falls erforderlich, wurde das Erwärmen und Mischen wiederholt, bis alle Komponenten resuspendiert waren. 2,5 μl 3DNA^®-Reagens von Fläschchen 2 wurden zu 17,5 μl Hybridisierungspuffer gegeben, was eine Hybridisierungsmischung lieferte. Die Hybridisierungsmischung wurde dann zu dem Mikroarray gegeben. Der Mikroarray wurde bedeckt und etwa 6 Stunden lang bis über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei einer Temperatur von etwa 37° bis 42°C inkubiert.
Waschen nach Hybridisierung
Der Mikroarray wurde 10 Minuten bei 42°C mit 2X SSC-Puffer gewaschen, der 0,2% SDS enthielt. Dann wurde der Mikroarray 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 2X SSC-Puffer gewaschen. Dann wurde der Mikroarray 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,2X SSC-Puffer gewaschen.
Signalnachweis
Der Mikroarray wurde dann nach Anweisung vom Hersteller des Scanners für den Nachweis, die Analyse und den Assay des Hybridisierungsmuster gescannt.

Claims

Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung auf einem Mikroarray, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (1) In-Kontakt-Bringen eines Mikroarrays, der eine Mehrzahl von Bereichen hat, welche jeweils eine spezielle erste Nucleotidsequenz umfassen, mit einer Mischung enthaltend: (a) eine erste Komponente enthaltend ein cDNA-Reagenz, das aus mRNA einer Zielprobe erhalten wurde, wobei die cDNA eine Fang-Sequenz aufweist; und (b) eine zweite Komponente enthaltend ein Dendrimer mit mindestens einem ersten Arm, welcher eine Markierung aufweist, die ein detektierbares Signal abgeben kann, und mindestens einem zweiten Arm, der eine zweite Nucleotidsequenz aufweist, welche komplementär zu der Fang-Sequenz ist; (2) Mischen der ersten und der zweiten Komponente bei einer Temperatur und für eine Dauer, die ausreichend sind, um das Binden der ersten Komponente an die zweite Komponente zu ermöglichen; und (3) Inkubieren der Mischung mit dem Mikroarray, um das Binden der ersten Nucleotidsequenz an die erste Komponente zu ermöglichen, wobei eine solche Bindung dazu führt, dass der Bereich ein detektierbares Signal aussendet.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend den Schritt der Herstellung der ersten Komponente, die das cDNA-Reagenz umfasst, durch In-Kontakt-Bringen der Zielproben-mRNA mit einer Menge RT-Primer, der die Fang-Sequenz enthält, einer Reversen Transkriptase und Nucleotiden unter Bedingungen, die eine Initiierung der reversen Transkription der mRNA in das cDNA-Reagenz erlauben.
Verfahren nach Anspruch 2, weiter umfassend den Schritt des Entfernens des überschüssigen RT-Primers aus der ersten Komponente vor dem Inkubieren der Mischung.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Schritt des Entfernens den Schritt des Hindurchleitens der ersten Komponente durch ein Zentrifugiersäulenmedium umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Temperatur, die ausreichend ist, um das Binden der ersten Komponente an die zweite Komponente zu ermöglichen, etwa 50 bis 55°C beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Temperatur, welche ein Binden der ersten Komponente an die erste Nukleotidsequenz erlaubt, 42 bis 60°C beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Zeit, welche ein Binden der ersten Komponente an die erste Nukleotidsequenz erlaubt, ungefähr 4 bis mehr als 72 Stunden beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Zeit, die ausreichend ist um das Binden der zweiten Komponente an die erste Komponente zu ermöglichen, etwa 0,25 bis 1 Stunde beträgt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Mikroarray und die Mischung über Nacht bei einer Temperatur von etwa 42 bis 60°C in einer feuchten Kammer inkubiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei der weiterhin der Mikroarray ausgelesen wird, um das detektierbare Signal und das entstandene Hybridisierungsmuster zu detektieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Mikroarray zusätzlich gewaschen wird, um nach der Inkubation des Mikroarrays und der Mischung nicht angebrachte Dendrimere zu entfernen.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Wasch-Schritt zusätzlich beinhaltet: Waschen des Mikroarrays mit 2X SSC Puffer enthaltend 0,2% SDS bei 55°C für etwa 10 Minuten; Waschen des Mikroarrays mit 2X SSC Puffer bei ungefähr Raumtemperatur für etwa 10 Minuten; und Waschen des Mikroarrays mit 0.2X SSC Puffer bei ungefähr Raumtemperatur für etwa 10 Minuten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Mischung weiter einen Hybridisierungspuffer enthält.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Hybridisierungspuffer weiter 0,25 M NaPO₄, 4.5% SDS, 1 mM EDTA und 1X SSC enthält.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Hybridisierungspuffer weiter 40% Formamid, 4X SSC und 1% SDS enthält.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Schritt des Entfernens weiter die Verwendung einer Hybridisierungskammer beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Schritt des Entfernens weiter die Verwendung einer Hybridisierungsstation beinhaltet.
Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung auf einem Mikroarray, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (1) Inkubieren einer Mischung enthaltend: i) eine erste Komponente enthaltend ein cDNA-Reagenz, welches aus mRNA einer Zielprobe erhalten wurde, wobei die cDNA eine Fang-Sequenz aufweist; und ii) eine zweite Komponente enthaltend ein Dendrimer mit mindestens einem ersten Arm, welcher eine Markierung aufweist, die fähig ist, ein detektierbares Signal abzugeben, und mindestens einem zweiten Arm, der eine zweite Nucleotidsequenz aufweist, welche komplementär zu der Fang-Sequenz ist, bei einer ersten Temperatur und für eine Zeit, die ausreichen, um eine Bindung der ersten Komponente an die zweite Komponente zu veranlassen und dabei einen vorhybridisierten cDNA-Dendrimer-Komplex zu bilden; und (2) In-Kontakt-Bringen eines Mikroarrays, der eine Mehrzahl von Bereichen hat, welche jeweils eine erste spezielle erste Nucleotidsequenz umfassen, mit der Mischung; und (3) Inkubieren des Mikroarrays und des vorhybridisierten cDNA-Dendrimer-Komplexes bei einer zweiten Temperatur und für eine Zeit, die ausreichen, um ein Binden des vorhybridisierten cDNA-Dendrimer-Komplexes an die erste Nucleotidsequenz zu veranlassen, wobei das Binden dazu führt, dass der Bereich ein detektierbares Signal aussendet, wodurch ein Hybridisierungsmuster auf dem Mikroarray erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die cDNA mit Hilfe einer Zentrifugiersäule erhalten wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren eine Bestimmungsverfahren beinhaltet, welches sich der Zweikanal-Analyse bedient.
Eine Verfahren nach einem der Ansprüche 1-19, wobei das Verfahren ein Bestimmungsverfahren beinhaltet, welches sich der Mehrkanal-Analyse bedient, wobei die Mehrkanalanalyse mindestens drei Kanäle verwendet.