JP2003526095A

JP2003526095A - マイクロアレイでのアッセイおよび検出方法

Info

Publication number: JP2003526095A
Application number: JP2001565371A
Authority: JP
Inventors: ゲッツ，ロバート・シィ
Original assignee: データスコープ・インベストメント・コーポレイション
Priority date: 2000-03-08
Filing date: 2001-03-08
Publication date: 2003-09-02
Also published as: DE60120118D1; EP1261617A1; DE60120118T2; ATE328001T1; EP1261617A4; AU4732801A; EP1261617B1

Abstract

(57)【要約】マイクロアレイでのアッセイおよび検出方法を提供する。本発明の方法は、ｉ）標的試料のｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡ試薬から構成される第１成分（前記ｃＤＮＡは捕捉配列を有する）とｉｉ）検出可能なシグナルを放出することができるラベルを含む少なくとも１つの第１アームおよび捕捉配列に相補的な第２ヌクレオチド配列を持つ少なくとも１つの第２アームを有するデンドリマーからから構成される第２成分とを含む混合物を、第１成分を第２成分に結合させてプレハイブリダイズしたｃＤＮＡ−デンドリマー複合体を形成させるのに足りる第１温度で、第１成分を第２成分に結合させてプレハイブリダイズしたｃＤＮＡ−デンドリマー複合体を形成させるのに足りる時間にわたってインキュベートし、それぞれが特定の第１ヌクレオチド配列を含む多数のフィーチャーを有するマイクロアレイを前記混合物と接触させ、前記マイクロアレイおよび前記プレイハイブリダイズしたｃＤＮＡ−デンドリマー複合体を、プレイハイブリダイズしたｃＤＮＡ−デンドリマー複合体を第１ヌクレオチド配列に結合させるのに足りる第２温度で、プレイハイブリダイズしたｃＤＮＡ−デンドリマー複合体を第１ヌクレオチド配列に結合させるのに足りる時間にわたってインキュベートし、そのような結合の結果として検出可能なシグナルを放出するフィーチャーを生成させ、よってハイブリダイゼーションパターンをマイクロアレイ上に形成させることから構成される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願）本願は、２０００年３月８日に出願された米国仮出願第６０／１８７，６８１
号およびＲｏｂｅｒｔＣＧｅｔｔｓの名で２００１年３月８日に出願された
「マイクロアレイでのアッセイおよび検出方法（ＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＡｓ
ｓａｙａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｎａＭｉｃｒｏａｒｒａｙ）」と
題する米国非仮出願（出願番号は未定）の優先権を主張し、前記特許出願はどち
らも参照により完全な形で本明細書に組み込まれる。

【０００２】（発明の分野）本発明はＤＮＡマイクロアレイに関し、より具体的にはマイクロアレイでのハ
イブリダイゼーションによる核酸配列試料の検出およびアッセイ方法に関する。

【０００３】（発明の背景）遺伝子発現パターンまたはＤＮＡ配列の変化は生物学的機能に大きな影響を持
ちうる。このような遺伝子発現の変化は、生理学的過程および病理学的過程の変
化を引き起しうる。ＤＮＡ技術の発達により、遺伝子発現および遺伝子変異を大
規模に同定するための迅速かつ費用対効果の高い方法が得られつつある。ＤＮＡ
解析に役立つ高速技術の一つは、多数の異なるＤＮＡまたは遺伝子プローブ（す
なわちポリヌクレオチド）が空間的に配置され、ガラス板、ケイ素またはナイロ
ン膜などの実質的に平面状の基板に安定に結合されているＤＮＡマイクロアレイ
である。このようなマイクロアレイは既に開発されており、遺伝子変異または突
然変異の有無に関する試料の解析（すなわち遺伝子型別）または遺伝子発現パタ
ーンに関する試料の解析などといった一連の用途に使用され、何千もの個別の「
試験管」実験に相当する実験が短時間のうちに行われている。

【０００４】マイクロアレイは全て類似する原理に基づいて作動している。すなわち、ガラ
ス製カバースライドなどの実質的に平面状の基板を、直径約２０〜１００ミクロ
ンの小さなスポットの格子で覆う。各スポットまたはフィーチャーには短いＤＮ
Ａ配列またはヌクレオチド配列のコピーが何百万も含まれ、コンピューターには
所定のフィーチャーにおける各配列の記録がとられている。解析を行うには、メ
ッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を細胞の試料から抽出する。酵素を使ってｍＲ
ＮＡ分子のコピーを何百万と複製する。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のコピーを逆
転写によってｍＲＮＡから調製する。蛍光マーカーなどのマーカーまたはラベル
でｃＤＮＡコピーにタグを付け、短い断片に切断する。マイクロアレイをタグ付
き断片で濡らし、一晩放置することにより、タグ付き断片を、マイクロアレイに
結合したＤＮＡとハイブリダイズさせる。

【０００５】ハイブリダイゼーション後、蛍光ｃＤＮＡと対を形成したマイクロアレイ上の
フィーチャーは、顕微鏡で観察することまたはコンピューターによって検出する
ことが可能な蛍光シグナルを放出する。このようにして、マイクロアレイ上のど
の配列が試験試料のｃＤＮＡと合致するかを知ることができる。時にはミスマッ
チも起こるが、各スポットまたはフィーチャーに何百万ものプローブを使用する
ことにより、相補的ｃＤＮＡが存在する場合にのみ蛍光を検出することが保証さ
れる。蛍光シグナルが強いほど（すなわちスポットが明るいほど）より多くのｃ
ＤＮＡが細胞中に存在していたことになる。

【０００６】マイクロアレイが役立つ領域の一つは遺伝子発現解析である。マイクロアレイ
を利用する遺伝子発現解析では、「プローブ」オリゴヌクレオチドのアレイを解
析対象核酸試料（すなわち標的、例えば特定の組織タイプから抽出したｍＲＮＡ
から調製したｃＤＮＡなど）と接触させる。接触をハイブリダイゼーション条件
で行った後、結合していない核酸を除去する。その結果得られるハイブリダイズ
した核酸のパターンから、試験した試料の遺伝子プロファイルに関する情報が得
られる。遺伝子プロファイルには、試料中に存在する核酸のタイプに関する情報
（例えばそれらが相補性を示す遺伝子のタイプならびに試料中の各核酸のコピー
数など）が含まれるものとする。遺伝子発現解析は、例えば新規遺伝子発現の同
定、遺伝子発現と特定の表現型との相関関係、疾患素因のスクリーニング、およ
び（毒性試験などにおいて）特定の因子が細胞遺伝子発現に及ぼす影響の確認な
ど、様々な用途に使用することができる。

【０００７】遺伝子発現配列を検出しアッセイするために核酸配列試料を調製する方法の先
行技術例を図１に示し、以下に説明する。既知の方法を使って、例えばロボット
法またはレーザーリソグラフィー法などにより、多数の遺伝子プローブをマイク
ロアレイの表面に添付またはプリントする。大量のヌクレオチド塩基（デオキシ
ヌクレオチド三リン酸、ＤＮＴＰ）、酵素および捕捉配列部分が付加された逆転
写（ＲＴ）プライマーオリゴヌクレオチドを使って、全ＲＮＡまたはポリ（Ａ） ⁺ ＲＮＡを含むｍＲＮＡ試料から相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製する。次に、
新たに生成したｃＤＮＡをｍＲＮＡ試料から単離し、エタノールで沈殿させる。
次に、相補的遺伝子プローブを持つマイクロアレイにｃＤＮＡをハイブリダイズ
させるために、ｃＤＮＡをｃＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液に懸濁し、一
晩インキュベートする。調製したマイクロアレイにｃＤＮＡをハイブリダイズさ
せた後、マイクロアレイを洗浄して過剰のＲＴプライマーオリゴヌクレオチドを
除去する。次に、標識された樹状核酸分子を含む混合物を調製する。

【０００８】樹状核酸分子（すなわちデンドリマー）は、多数の互いに連結された二本鎖Ｄ
ＮＡの天然または合成モノマーサブユニットからなる高度に分岐した複雑な分子
である。デンドリマーはＮｉｌｓｅｎら「樹状核酸構造（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）」Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂ
ｉｏｌ．，１８７，２７３−２８４（１９９７）に詳述されており、その内容は
全て参照により本明細書に組み込まれる。

【０００９】デンドリマーはその表面に２種類の一本鎖ハイブリダイゼーション「アーム」
を持ち、それらを使って２つの重要な機能性が与えられる。一つのデンドリマー
分子はその表面にそれぞれの種類のアームを少なくとも１００個持ちうる。一方
の種類のアームは標的特異性を確立するために特異的ターゲティング分子の結合
に使用され、他方の種類のアームはラベルまたはマーカーの結合に使用される。
デンドリマーの標的およびラベリング特異性を決定する分子は、オリゴヌクレオ
チドとしてまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートとして取り付けられる。デ
ンドリマー分子は、簡単なＤＮＡラベリング、ハイブリダイゼーションおよびラ
イゲーション反応を使って、高度に標識された標的特異的プローブとして働くよ
うに構成することができる。

【００１０】調製した混合物を適当な緩衝剤の存在下で配合することにより、一方の種類の
「アーム」に蛍光ラベルが結合しており、かつ他方の種類の「アーム」にＲＴプ
ライマー結合ｃＤＮＡ断片の捕捉配列に相補的なオリゴヌクレオチドが結合して
いるデンドリマーを含む、デンドリマーハイブリダイゼーション混合物を得る。
次に、デンドリマー分子を含むデンドリマーハイブリダイゼーション混合物をマ
イクロアレイに添加し、一晩インキュベートしてハイブリダイゼーションパター
ンを形成させる。デンドリマー−ｃＤＮＡ間のハイブリダイゼーションに続いて
、マイクロアレイを洗浄することにより、ハイブリダイズしていない過剰のデン
ドリマーを取り除く。ハイブリダイゼーションパターンの遺伝子発現解析を行う
ことができるように、マイクロアレイをスキャンして、ラベルが生成するシグナ
ルを検出する。この方法を使用した場合の欠点の一つとして、試料の調製ならび
にハイブリダイゼーション工程および洗浄工程を含むアッセイの実施に、甚だし
い時間と労力が必要であることが挙げられる。

【００１１】望ましい特性（感度が高いこと、バックグラウンド「ノイズ」が低いこと、お
よび「偽陽性」がごくわずかであることなど）を犠牲にすることなく、試料の調
製およびアッセイの実施に費やされる時間と労力を著しく削減することは、大い
に望ましいだろう。遺伝子発現解析用の遺伝子試料の調製およびアッセイに必要
な複雑さおよび工程数を著しく低減し、しかも通常の研究用試薬、装置および技
術を使って実施することが可能な方法をさらに提供することは、遺伝子発現検出
マイクロアレイの技術分野における有意義な進歩になるだろう。

【００１２】（発明の要旨）本発明は概してマイクロアレイでのアッセイおよび検出方法に関する。本発明
により、標的核酸試料および試料採取源の遺伝子プロファイルに関する情報を得
るためのハイブリダイゼーションパターンの作成に必要な時間および労力が著し
く削減される。さらに本発明は、優れた感度を有し、バックグラウンド「ノイズ
」が低く、「偽陽性」がごくわずかなマイクロアレイを提供する。本発明の方法
は一連の用途に使用することができる。

【００１３】本発明の一態様として、マイクロアレイでのアッセイおよび検出方法であって
、１）それぞれが第１特定第１ヌクレオチド配列を含む多数のフィーチャーを有
するマイクロアレイを、ａ）標的試料のｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡ試薬から構成される第１成分
（前記ｃＤＮＡは捕捉配列を有する）と、ｂ）検出可能なシグナルを放出することができるラベルを含む少なくとも１
つの第１アームおよび捕捉配列に相補的な第２ヌクレオチド配列を持つ少なくと
も１つの第２アームを有するデンドリマーから構成される第２成分、とを含む混合物と接触させる工程、２）第１成分および第２成分を、第１成分が第２成分に結合することを可能と
するに足りる温度で、第１成分が第２成分に結合することを可能とするに足りる
時間にわたって混合する工程、および３）この混合物を前記マイクロアレイと共にインキュベートすることにより、
第１ヌクレオチド配列が第１成分に結合することを可能とし、そのような結合の
結果として検出可能なシグナルを放出するフィーチャーを生成する工程、から構成される方法を提供する。

【００１４】本発明のもう１つの態様として、マイクロアレイでのアッセイおよび検出方法
であって、１）ｉ）標的試料のｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡ試薬から構成される第１成
分（前記ｃＤＮＡは捕捉配列を有する）と、ｉｉ）検出可能なシグナルを放出することができるラベルを含む少なくとも１
つの第１アームおよび捕捉配列に相補的な第２ヌクレオチド配列を持つ少なくと
も１つの第２アームを有するデンドリマーから構成される第２成分、とを含む混合物を、第１成分を第２成分に結合させてプレハイブリダイズしたｃ
ＤＮＡ−デンドリマー複合体を形成させるのに足りる第１温度で、第１成分を第
２成分に結合させてプレハイブリダイズしたｃＤＮＡ−デンドリマー複合体を形
成させるのに足りる時間にわたってインキュベートする工程、２）それぞれが特定の第１ヌクレオチド配列を含む多数のフィーチャーを有す
るマイクロアレイを、前記混合物と接触させる工程、および３）マイクロアレイおよびプレハイブリダイズしたｃＤＮＡ−デンドリマー複
合体を、プレハイブリダイズしたｃＤＮＡ−デンドリマー複合体を第１ヌクレオ
チド配列に結合させるのに足りる第２温度で、プレハイブリダイズしたｃＤＮＡ
−デンドリマー複合体を第１ヌクレオチド配列に結合させるのに足りる時間にわ
たってインキュベートし、そのような結合の結果として検出可能なシグナルを放
出するフィーチャーを生成させることにより、マイクロアレイ上にハイブリダイ
ゼーションパターンを形成させる工程、から構成される方法を提供する。

【００１５】本発明のもう１つの態様として、マイクロアレイでのアッセイおよび検出方法
であって、１）それぞれが第１特定第１ヌクレオチド配列を含む多数のフィーチャーを有
するマイクロアレイを、ａ）標的試料のｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡ試薬から構成される第１成分
（前記ｃＤＮＡは捕捉配列を有する）と、ｂ）検出可能なシグナルを放出することができるラベルを含む少なくとも１
つの第１アームおよび捕捉配列に相補的な第２ヌクレオチド配列を持つ少なくと
も１つの第２アームを有するデンドリマーから構成される第２成分、とを含む混合物と、接触させる工程、２）第１成分および第２成分を、第１成分が第２成分に結合することを可能と
するに足りる温度で、第１成分が第２成分に結合することを可能とするに足りる
時間にわたって混合する工程、３）マイクロアレイおよびプレハイブリダイズしたｃＤＮＡ−デンドリマー複
合体を、プレハイブリダイズしたｃＤＮＡ−デンドリマー複合体を第１ヌクレオ
チド配列に結合させるのに足りる第２温度で、プレハイブリダイズしたｃＤＮＡ
−デンドリマー複合体を第１ヌクレオチド配列に結合させるのに足りる時間にわ
たってインキュベートし、そのような結合の結果として検出可能なシグナルを放
出するフィーチャーを生成させることにより、マイクロアレイ上にハイブリダイ
ゼーションパターンを形成させる工程、から構成される方法を提供する。

【００１６】本発明のもう１つの態様として、マイクロアレイでのアッセイおよび検出方法
であって、１）ｉ）標的試料のｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡ試薬から構成される第１成
分（前記ｃＤＮＡは捕捉配列を有する）と、ｉｉ）検出可能なシグナルを放出することができるラベルを含む少なくとも
１つの第１アームおよび捕捉配列に相補的な第２ヌクレオチド配列を持つ少なく
とも１つの第２アームを有するデンドリマーから構成される第２成分、とを含む混合物を、第１成分を第２成分に結合させてプレハイブリダイズしたｃ
ＤＮＡ−デンドリマー複合体を形成させるのに足りる第１温度で、第１成分を第
２成分に結合させてプレハイブリダイズしたｃＤＮＡ−デンドリマー複合体を形
成させるのに足りる時間にわたってインキュベートする工程、２）第１成分および第２成分を、第１成分が第２成分に結合することを可能と
するに足りる温度で、第１成分が第２成分に結合することを可能とするに足りる
時間にわたって混合する工程、および３）マイクロアレイおよびプレハイブリダイズしたｃＤＮＡ−デンドリマー複
合体を、プレハイブリダイズしたｃＤＮＡ−デンドリマー複合体を第１ヌクレオ
チド配列に結合させるのに足りる第２温度で、プレハイブリダイズしたｃＤＮＡ
−デンドリマー複合体を第１ヌクレオチド配列に結合させるのに足りる時間にわ
たってインキュベートし、そのような結合の結果として検出可能なシグナルを放
出するフィーチャーを生成させることにより、マイクロアレイ上にハイブリダイ
ゼーションパターンを形成させる工程、から構成される方法を提供する。

【００１７】本発明のさらなる実施形態では、スピンカラム（例えば図４または図５に記載
のスピンカラムなど）を使って、またはハイブリダイゼーションチャンバーもし
くはハイブリダイゼーションステーションを使って、上記ｃＤＮＡを精製する。

【００１８】添付の図面（図中の同じ符号は同じ部品を示すものとする）により本発明の実
施形態を例示するが、本願の一部をなす特許請求の範囲によって包含される発明
が、これらの図面によって限定されると解釈してはならない。

【００１９】（発明の実施の形態）本発明は概して、マイクロアレイでの検出およびアッセイを行うための核酸配
列試料を、マイクロアレイでの試料のアッセイに通例必要とされる時間および労
力が著しく削減されるような手法で調製する方法に関する。本発明の方法には、
研究用途および臨床用途に要求される感度、バックグラウンド「ノイズ」の低さ
および「偽陽性」の少なさを確保しつつ、より少ない工程数を使って、より短時
間で核酸配列試料を調製することができるという利点がある。経済性に優れた効
率のよい手法によって核酸配列試料が調製され、通常の研究技術、装置および試
薬を使って本発明の方法を実施できることから、これらは特に研究用途および臨
床用途に適している。

【００２０】本発明の方法では、実質的に平面状の基板の表面に固定されたまたは安定に結
合されたＤＮＡまたは遺伝子プローブのアレイを、相補的プローブ／標的複合体
のハイブリダイゼーションパターンを生成させるのに十分なハイブリダイゼーシ
ョン条件で、標的核酸の試料と接触させる。当技術分野では、使用することがで
きる多種多様なマイクロアレイが知られている。次に、ハイブリダイズした核酸
試料を、標識デンドリマープローブの標的とし、ハイブリダイズさせることによ
り、特定のハイブリダイゼーションパターンに相当する検出可能なシグナルを生
成する。標的核酸にハイブリダイズした個々の標識デンドリマープローブは全て
、既知の強度の同じシグナルを生成することができる。したがって、標的核酸試
料の遺伝子プロファイルに関する定量的情報を得る目的で、マイクロアレイ中の
各陽性シグナルを「カウント」することができる。

【００２１】本発明をさらに詳しく説明する前に、本発明は以下に記載する本発明の特定の
実施形態に限定されないことを理解すべきである。というのも、以下に記載する
特定の実施形態には変更を施すことができ、それらの変更態様もまた本願特許請
求の範囲に包含されるからである。また、使用する用語は特定の実施形態を説明
するためのものであって、限定を意図するものではないことも理解すべきである
。むしろ本発明の範囲は、本願特許請求の範囲によって確定されるものとする。

【００２２】標的核酸と配列特異的にハイブリダイズすることができるマイクロアレイのＤ
ＮＡまたは遺伝子プローブは、ポリヌクレオチドまたはそのハイブリッド形成性
の類似体もしくはミメティック（例えばホスホジエステル結合がホスホロチオエ
ート、メチルイミノ、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、グアニジンな
どの代替連結基で置換されている核酸、リボースサブユニットが置換されている
（例えばヘキソースホスホジエステル）核酸、ペプチド核酸などを含むが、これ
らに限らない）であってよい。プローブの長さは一般に１０〜１０００ヌクレオ
チドの範囲にわたるだろう。本発明のある実施形態では、プローブは１５〜１５
０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、より一般的には１５〜１００ヌクレオチ
ドのオリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、プローブがさらに長くて通
常１５０〜１０００ヌクレオチド長の範囲にわたる。この場合、ポリヌクレオチ
ドプローブは一本鎖でも二本鎖でもよいが、通常は一本鎖であり、ｃＤＮＡまた
はクローン化された遺伝子から増幅されるＰＣＲ断片であってよい。基板表面の
ＤＮＡまたは遺伝子プローブは、好ましくは、これに限られるのではないが、解
析しようとする生理学的供給源の既知の遺伝子などに相当し、陽性ハイブリダイ
ゼーション事象を標的核酸試料が由来する生理学的供給源における特定の遺伝子
の発現と相関させることができるように、マイクロアレイ上の所定の位置に配置
される。標的核酸試料の作製には後述するような手法をとるため、遺伝子プロー
ブのマイクロアレイは一般的には、それらが対応する遺伝子の非鋳型鎖に相補的
な配列を持つだろう。

【００２３】遺伝子プローブを安定に結合させる基板は、プラスチック、セラミック、金属
、ゲル、膜、ガラスなどを含む様々な素材から製作することができる。マイクロ
アレイは、例えば遺伝子プローブを前もって形成させた後、支持体の表面にそれ
らを安定に結合させる方法、または支持体上で直接遺伝子プローブを成長させる
方法など、任意の好都合な従来の方法論に従って製造することができる。当業者
には多種多様なマイクロアレイ構成およびそれらの製造法が知られている。その
一つはＳｃｉｅｎｃｅ，２８３，８３，１９９９に記載されており、その内容は
参照により本明細書に組み込まれる。

【００２４】本明細書で使用する「ラベル」という用語は、直接的に、またはシグナル生成
系の１もしくは複数の他の要素との相互作用によって、検出可能なシグナルを与
えることができる因子を指す。本発明に利用することができる直接的検出が可能
なラベルとしては、例えばフルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、シアニ
ン色素（例えばＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａのもの）、Ａｌｅｘａ色
素（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．のもの）、蛍光色素ホ
スホルアミダイトなどの蛍光ラベル、および³²Ｓ、³²Ｐ、³Ｈなどの放射性同位
体が挙げられる。シグナル生成系の１または複数の他の要素との相互作用によっ
て検出可能なシグナルを与えるラベルの例としては、例えば直接検出することが
できるラベル部分（上述の蛍光部分など）から構成される相補的結合対要素に特
異的に結合する捕捉部分が挙げられる。ラベルは、好ましくは、可変的シグナル
を与えるのではなく、所定の期間にわたって一定した再現性あるシグナルを与え
るものである。

【００２５】本発明はさらに樹状核酸分子（すなわちデンドリマー）をラベルプローブ分子
として利用する。デンドリマーは、多数の互いに連結された二本鎖ＤＮＡの天然
または合成モノマーサブユニットからなる高度に分岐した複雑な分子である。デ
ンドリマーはＮｉｌｓｅｎら「樹状核酸構造（ＤｅｎｄｒｉｔｉｃＮｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）」Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．，１８
７，２７３−２８４（１９９７）に詳述されており、その内容は全て参照により
本明細書に組み込まれる。デンドリマーの構造および製造に関するさらなる情報
は、米国特許第５，１７５，２７０号、同第５，４８４，９０４号および同第５
，４８７，９７３号に開示されており、これら米国特許の内容はそれぞれ参照に
より本明細書に組み込まれる。

【００２６】デンドリマーはその表面に２種類の一本鎖ハイブリダイゼーション「アーム」
を持ち、それらを使って２つの重要な機能性が与えられる。一つのデンドリマー
分子は各種類のアームを少なくとも１００個持ちうる。一方の種類のアームは標
的特異性を確立するために特異的ターゲティング分子の結合に使用され、他方の
種類のアームはラベルまたはマーカーの結合に使用される。デンドリマーの標的
およびラベリング特異性を決定する分子は、オリゴヌクレオチドとしてまたはオ
リゴヌクレオチドコンジュゲートとして取り付けられる。デンドリマープローブ
は、簡単なＤＮＡラベリング、ハイブリダイゼーションおよびライゲーション反
応を使って、高度に標識された標的特異的試薬として働くように構成することが
できる。

【００２７】蛍光標識デンドリマーを調製するには、Ｃａｐ０１ＲＴプライマーおよびＣａ
ｐ０２ＲＴプライマー（共にＯｌｉｇｏｓＥｔｃ社から入手）上の捕捉配列に
対する相補配列を、既述の方法によって調製される精製樹状コア物質に、それぞ
れ結合させる（前掲のＮｉｌｓｏｎらの文献および上記米国特許’２７０号、’
９０４号および’９７３号を参照されたい）。好ましい実施形態では、Ｃａｐ０
１ＲＴプライマーはＣｙ３（Ｒ）ＲＴプライマーであり、Ｃａｐ０２ＲＴプライ
マーはＣｙ５（Ｒ）ＲＴプライマーであるが、本発明はこれら２つの好ましい実
施形態に限定されるわけではない。５’Ｃｙ３（Ｒ）もしくはＣｙ５（Ｒ）（好
ましい実施形態の場合）、より一般的にはＣａｐ０１およびＣａｐ０２を持つ、
４層デンドリマーの外側アームに相補的な３０ヌクレオチド長オリゴヌクレオチ
ドを合成する（Ｃｙ３（Ｒ）、Ｃｙ５（Ｒ）、Ｃａｐ０１およびＣｐａ０２はＯ
ｌｉｇｏｓＥｔｃ．，Ｉｎｃ．（オレゴン州ウィルソンビル）から入手可能）
。次に、それらＣｙ３（Ｒ）およびＣｙ５（Ｒ）オリゴヌクレオチドをハイブリ
ダイズさせ、それぞれ対応するデンドリマーの外面に共有結合によって架橋する
。次に、過剰の捕捉および蛍光標識オリゴヌクレオチドを、サイズ排除クロマト
グラフィーなどの技術によって除去する。

【００２８】デンドリマーの濃度は、紫外可視分光光度計で、精製物質の２６０ｎｍにおけ
る光学密度を測定することによって決定する。蛍光は蛍光計（ＦｌｕｏｒｏＭａ
ｘ、ＳＰＥＸＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を使って最適信号雑音比波長で測定する
。Ｃｙ３およびＣｙ５を使う好ましい実施形態の場合、Ｃｙ３は５４２ｎｍを励
起し、５７０ｎｍで蛍光を測定することができ、Ｃｙ５は６４１ｎｍで励起し、
６７６ｎｍで蛍光を測定することができる。

【００２９】本発明では、デンドリマープローブを使用することにより、アッセイに必要な
試料ＲＮＡの量が著しく低下すると同時に、デンドリマーの優れたシグナル増幅
能力によって感度が増大する。アッセイに必要なＲＮＡの量を低下させることに
より、ＲＴプライマーの量も同様に低下させて、後述のようにシグナル生成を改
善することができる。ＲＴプライマー量の低下により、アッセイ準備中に必要な
洗浄の回数も減る。本発明により、ハイブリダイゼーション工程も一段階に減っ
て、感度が増大し、使用が容易になり、処理時間が著しく削減される。ハイブリ
ダイゼーションの速度と効率は、まずｃＤＮＡをデンドリマープローブにハイブ
リダイズさせてから、マイクロアレイにｃＤＮＡをハイブリダイズさせることに
よって、著しく増大する。この一段階ハイブリダイゼーション法は、ｃＤＮＡハ
イブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、
１×デンハート液、０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシン、２５０μｇ／ｍＬ剪断
サケ精子ＤＮＡ、２×ＳＳＣ、２０ｍＭトリスｐＨ７．５および再蒸留水）の使
用が省かれることにより、ハイブリダイゼーション緩衝液の数を１つに減らすこ
とにもなる。

【００３０】標的核酸は一般的には天然の供給源に由来するＲＮＡから逆転写されたＤＮＡ
であるだろう。この場合、ＲＮＡは全ＲＮＡ、ポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡ、増幅され
たＲＮＡなどからなる群より選択することができる。最初のｍＲＮＡ源は多種多
様な試料中に存在することができ、その試料は通例生理学的供給源に由来するだ
ろう。生理学的供給源は様々な真核生物供給源に由来することができ、当該の生
理学的供給源には酵母などの単細胞生物ならびに多細胞生物（植物および動物、
特に哺乳動物を含む）に由来する供給源が含まれ、多細胞生物に由来する生理学
的供給源は、多細胞生物の特定の器官または組織に由来するか、そこから得られ
る単離された細胞に由来することができる。解析しようとする試料ＲＮＡをその
生理学的供給源から取得する際は、生理学的供給源を数多くの様々な処理工程に
付すことができる。そのような既知の処理工程としては、例えば組織のホモジナ
イゼーション、細胞の単離および細胞質抽出、核酸抽出などを挙げることができ
る。細胞、組織、器官または生物全体からＲＮＡを単離する方法は当業者に知ら
れており、例えばＭａｎｉａｔｉｓら「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：
ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版）」ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）やＡｕｓｕｂ
ｅｌら「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢ
ｉｏｌｏｇｙ」ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９８）な
どに記載されている（これらの刊行物の内容はそれぞれ参照によって本明細書に
組み込まれる）。

【００３１】試料ｍＲＮＡは、ハイブリダイズしたプライマーの酵素的伸長に十分な条件で
オリゴ（ｄＴ）プライマーまたはＲＴプライマーをｍＲＮＡにハイブリダイズさ
せることによって、ｃＤＮＡ型の標的核酸に逆転写される。プライマーはｍＲＮ
Ａテールに効率よくハイブリダイズするのに十分な長さを持ち、その長さは概し
て１０〜２５ヌクレオチド、通常は１０〜２０ヌクレオチド、より一般的には１
２〜１８ヌクレオチドになるだろう。

【００３２】応用には通例、配列特異的プライマーを使用する必要があることから、本発明
で使用される標準プライマーには「捕捉配列」ヌクレオチド部分がさらに含まれ
る。ここに挙げる好ましい捕捉配列はＣａｐ０１ＲＴプライマー捕捉配列（Ｏｌ
ｉｇｏｓＥｔｃ．，Ｉｎｃ．（オレゴン州ウィルソンビル））またはＣａｐ０
２プライマー捕捉配列（ＯｌｉｇｏｓＥｔｃ．，Ｉｎｃ．（オレゴン州ウィル
ソンビル））、さらに好ましくはＣｙ３（Ｒ）ＲＴプライマー捕捉配列（Ｏｌｉ
ｇｏｓＥｔｃ．，Ｉｎｃ．（オレゴン州ウィルソンビル））またはＣｙ５（Ｒ
）ＲＴプライマー捕捉配列（ＯｌｉｇｏｓＥｔｃ．，Ｉｎｃ．（オレゴン州ウ
ィルソンビル））である。これらの捕捉配列を以下に示す。Ｃａｐ０１ＲＴプライマー捕捉配列：５’−ｇｇＣＣＴＣＡＣＴｇＣｇＣｇＴＣＴＴＣｔｇＴＣＣＣ
ｇＣＣ−３’ Ｃａｐ０２ＲＴプライマー捕捉配列：５’−ＣＣＴｇＴＴｇＣＴＣＴＡＴＴＴＣＣＣｇＴｇＣｃｇＣ
ＴＣＣｇｇＴ−３’。

【００３３】カスタムプライマーの場合は、対応するカスタムオリゴヌクレオチドプライマ
ーの５’末端に上記の捕捉配列を取り付けるべきである。このようにして標準Ｒ
Ｔプライマーの代わりにカスタムプライマーを使用する。本発明は標準ＲＴプラ
イマーを使用するように工夫されているので、カスタムプライマーに換える場合
はいくつかの変更が必要かもしれない。そのような変更は当業者には知られてお
り、例えば使用するＲＮＡ試料の量およびタイプに基づいてプライマーの量およ
び混合物を調節することなどを挙げることができる。プライマーは上述のように
特異的ヌクレオチド配列からなる捕捉配列を有する。捕捉配列は、少なくとも１
つのラベルをさらに持っているデンドリマープローブのアームに取り付けられた
オリゴヌクレオチドに相補的である。このような相補的オリゴヌクレオチドは、
外部業者から入手することができ、また標識部分として入手することもできる。
ラベルはデンドリマープローブのアームに取り付けられた１または複数のオリゴ
ヌクレオチドに、当技術分野で知られているように直接または連結基を介して取
り付けることができる。好ましい実施形態では、Ｃｙ３（Ｒ）またはＣｙ５（Ｒ
）標識オリゴヌクレオチド（好ましい態様の場合）をデンドリマーアームにハイ
ブリダイズさせて架橋することにより、デンドリマープローブを標識する。これ
らのＣｙ３（Ｒ）またはＣｙ５（Ｒ）標識デンドリマーは、それぞれＣａｐ０１
またはＣａｐ０２ＲＴプライマー捕捉配列に相補的である。

【００３４】標的核酸試料の調製では、逆転写酵素およびプライマー伸長に必要な他の試薬
の存在下に、第１鎖ｃＤＮＡを合成させるのに十分な条件で、プライマーをｍＲ
ＮＡと接触させる。この場合他の試薬には、例えばｄＮＴＰ類、緩衝剤（例えば
トリス塩酸塩）、一価および二価カチオン源（例えばＫＣｌ、ＭｇＣｌ₂）、Ｒ
Ｎアーゼ阻害剤およびスルフヒドリル試薬（例えばジチオスレイトール）などが
ある。第１鎖ｃＤＮＡ合成工程には、逆転写酵素活性を持つ様々な酵素（通常は
ＤＮＡポリメラーゼ）を使用することができる。適切なＤＮＡポリメラーゼの例
には、好熱性の細菌および古細菌、レトロウイルス、酵母、アカパンカビ、ショ
ウジョウバエ、霊長類および齧歯類からなる群より選択される生物に由来するＤ
ＮＡポリメラーゼがある。逆転写酵素活性を持つ適切なＤＮＡポリメラーゼは生
物から単離するか、市販されているものを入手するか、当該ポリメラーゼをコー
ドするクローン化遺伝子を高レベルに発現させる細胞から、当業者に知られた方
法によって得ることができ、ポリメラーゼを得る方法は主に利便性、費用、可用
性などの因子に基づいて選択されるだろう。試薬類を混合する順序は所望により
変更してよい。

【００３５】好ましい一実施形態として、ｃＤＮＡ合成プロトコールでは、約０．２５〜１
μｇの全ＲＮＡまたは約１２．５〜５０ｎｇのポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡを約０．２
ｐｍｏｌｅのＲＴプライマー（０．２ｐｍｏｌｅ）およびＲＮアーゼの入ってい
ない水と混合して、最終体積を約１０μＬとすることにより、ＲＮＡ−ＲＴプラ
イマー混合物を得る。次に、そのＲＮＡ−ＲＴプライマー混合物を混和し、微量
遠心機にかけることによって、微量遠心管の底に内容物を集める。次にＲＮＡ−
ＲＴプライマー混合物を１０分間８０℃に加熱した後、直ちに氷に移す。氷上に
置いた別の微量遠心管で、５×ＲＴ緩衝液約４μＬ、ｄＮＴＰ混合物１μＬ、Ｒ
Ｎアーゼの入っていない水４μＬおよび２００単位の逆転写酵素１μＬを一つに
混合する。穏やかに混和し、微量遠心機に短時間かけることにより、内容物を微
量遠心管の底に集めて、これを反応混合物とする。ＲＮＡ−ＲＴプライマー混合
物を反応混合物と混合し、次に約４２℃で第１鎖ｃＤＮＡプライマー伸長産物を
形成させるのに十分な時間（通常約２時間を要する）インキュベートする。

【００３６】第１鎖の形成によって得られたｃＤＮＡまたは標的核酸を含む混合物をさらに
精製して、逆転写工程の完了後にまだ残っている可能性のある過剰のＲＴプライ
マーを除去することができる。過剰のＲＴプライマーはデンドリマープローブに
結合して、シグナルの強度および明度を低下させることにより、アッセイ感度を
低下させるだろう。この工程は随意の工程であるが、ｃＤＮＡ混合物の精製はマ
イクロアレイ中のシグナル強度を向上させ、結果としてハイブリダイゼーション
パターンのシグナル生成を改善する傾向がある。過剰なＲＴプライマーはシグナ
ルの強度および分解能は低下させうるので、ＲＴプライマーの量はアッセイの品
質に影響を及ぼす。過剰なＲＴプライマーは、例えばスピンカラムアセンブリＱ
ＩＡｑｕｉｃｋ（Ｒ）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ（カリフォルニア州バレ
ンシア））またはハイブリダイゼーションチャンバーもしくはハイブリダイゼー
ションステーションを使用するなど、任意の適切な手段によってｃＤＮＡ混合物
から除去することができる。スピンカラムアセンブリは、遠心分離手段によって
混合物から１または複数の成分を分離するために使用される既知の装置である。

【００３７】好ましくは、図４に示す従来のスピンカラムアセンブリによって、またはもう
１つの実施形態として図５のスピンカラムを使って、過剰のＲＴプライマーを除
去することができる。スピンカラム濾過材は、多数の樹脂細孔が樹脂全体に分布
しているサイズ排除樹脂コアからなる。樹脂細孔は過剰のＲＴプライマーを捕捉
するのに十分な大きさを持ち、ｃＤＮＡを空隙容量に移動させる。過剰のＲＴプ
ライマーを除去するには、ｃＤＮＡ含有混合物をスピンカラムの一端にある保持
チューブに入れ、スピンカラムと混合物をある時間にわたって高い遠心力にかけ
る。混合物はカラムを通って拡散し、反対側から収集容器中に出ていく。その結
果、容器中に集められた溶出液は精製されたｃＤＮＡプローブを含む。

【００３８】本発明の方法を実施する際は、デンドリマープローブと標的ｃＤＮＡとのハイ
ブリダイゼーションを引き起すような温度条件で、ある量の標識デンドリマープ
ローブを精製ｃＤＮＡプローブ溶出液にハイブリダイゼーション緩衝液と共に加
える。具体的には、混合物を第１プレハイブリダイゼーション温度で十分な時間
インキュベートすることにより、デンドリマープローブをｃＤＮＡに付着させる
。ホルムアミドを含まないハイブリダイゼーション緩衝液を使用する場合、好ま
しい第１プレハイブリダイゼーション温度は約４５〜６０℃の範囲にあり、５５
℃が好ましい。ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液を使用する場
合、好ましいプレハイブリダイゼーション温度はホルムアミドの含有率に依存し
、標準ホルムアミド非含有緩衝液の温度範囲からホルムアミドの存在量２％につ
き１℃の割合で低くなる。ｃＤＮＡをデンドリマープローブとハイブリダイズさ
せてプレハイブリダイゼーション混合物を得るためには、混合物を好ましくは約
１５〜２０分間インキュベートする。

【００３９】次にプレハイブリダイゼーション混合物をマイクロアレイに加え、第２ハイブ
リダイゼーション温度で十分な時間インキュベートすることにより、ｃＤＮＡを
マイクロアレイに結合させる。ホルムアミドを含まないハイブリダイゼーション
緩衝液を使用する場合、好ましい第２ハイブリダイゼーション温度は約４２〜６
０℃の範囲にある。ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液を使用す
る場合、好ましいプレハイブリダイゼーション温度はホルムアミドの含有率に依
存し、標準ホルムアミド非含有緩衝液の温度範囲からホルムアミドの存在量２％
につき１℃の割合で低くなる。好ましくは、プレハイブリダイゼーション混合物
とマイクロアレイとを湿室中、第２温度で一晩インキュベートする。

【００４０】このような初期条件では、ｃＤＮＡの捕捉配列は、ｃＤＮＡがマイクロアレイ
の遺伝子プローブに結合する前に、デンドリマープローブに取り付けられた相補
鎖とプレハイブリダイズすることができる。次に、デンドリマープローブに結合
した標的ｃＤＮＡを、標的ｃＤＮＡがマイクロアレイ上のＤＮＡまたは遺伝子プ
ローブにハイブリダイズできるような条件で、マイクロアレイと接触させる。得
られた混合物を一晩インキュベートして完全にハイブリダイズさせる。適当なハ
イブリダイゼーション条件は当業者にはよく知られており、Ｍａｎｉａｔｉｓら
の著書（上記参照）にまとめられている。条件はハイブリダイゼーション中に所
望の特異性が得られるように調整することができる。本発明では任意の適当なハ
イブリダイゼーション緩衝液を使用することができる点に注意されたい。好まし
い一形態として、ハイブリダイゼーション緩衝液組成物は０．２５ＭＮａＰＯ ₄ 、４．５％ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡおよび１×ＳＳＣを含むことができる。
もう１つの好ましい形態として、ハイブリダイゼーション緩衝液組成物は４０％
ホルムアミド、４×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含むことができる。

【００４１】ハイブリダイズしていないプローブ−ｃＤＮＡ複合体が検出工程でシグナルを
発することができる場合は、ハイブリダイゼーション工程に続いて洗浄工程を用
いることにより、ハイブリダイズしていない複合体をマイクロアレイから除去し
、マイクロアレイに結合しているハイブリダイズしたｃＤＮＡ−デンドリマープ
ローブの目に見える不連続なパターンを残す。当業者にはそのための洗浄液およ
び洗浄プロトコールが種々知られており、それらを使用することができる。使用
する洗浄条件は使用するシグナル生成系の性質に必然的に依存するが、使用する
シグナル生成系に詳しい当業者にはわかるだろう。

【００４２】結果として得られる標識ｃＤＮＡ断片のハイブリダイゼーションパターンは、
ｃＤＮＡの特定のラベルに基づいて選択される検出方法により、様々な方法で可
視化または検出することができる。代表的な検出手段には、例えばシンチレーシ
ョン計数、オートラジオグラフィー、蛍光測定、熱量測定、発光測定などがある
。

【００４３】上述したようなハイブリダイゼーションおよび洗浄工程および／または後続の
処理に続いて、結果として得られたハイブリダイゼーションパターンを検出する
。ハイブリダイゼーションパターンの検出または可視化では、標識の強度または
シグナル値の検出だけでなく定量も行われるだろう。これはハイブリダイゼーシ
ョンの各スポットからのシグナルを測定することを意味する。

【００４４】検出または可視化に続いて、ハイブリダイゼーションパターンを使って、マイ
クロアレイと接触させることによってハイブリダイゼーションパターンを形成さ
せた標識標的核酸試料ならびに標識標的核酸試料が由来する生理学的供給源の遺
伝子プロファイルに関する定量的および定性的情報を決定することができる。こ
のデータから、標的核酸試料を得た生理学的供給源に関する情報、例えば生理学
的供給源である組織または細胞中で発現される遺伝子のタイプならびに各遺伝子
の発現レベルなどを、特に定量的観点から導き出すことができる。２以上の生理
学的供給源から得た標的核酸の比較に本発明の方法を使用する場合は、ハイブリ
ダイゼーションパターンを比較して、パターン間の相違を確認することができる
。様々なプローブのそれぞれが既知の遺伝子に対応しているマイクロアレイを使
用する場合、不一致は、比較している生理学的供給源における特定遺伝子の示差
的発現に関連づけることができる。したがって本発明方法は示差的遺伝子発現ア
ッセイに役立ち、本発明の方法を疾患組織と正常組織（例えば新生物組織と正常
組織）、異なる組織タイプまたはサブ組織タイプなどの示差的発現解析に利用す
ることができる。

【００４５】上記の議論では本発明の典型的態様を開示し説明したに過ぎない。特許請求の
範囲に定義する本発明の精神と範囲から逸脱することなく様々な変更を施しうる
ことは、上記の議論ならびに添付の図面、特許請求の範囲および実施例から、当
業者には容易に理解されるだろう。

【００４６】実施例１図２を参照して、マイクロアレイでの検出およびアッセイ方法を以下に説明す
る。

【００４７】マイクロアレイの調製マイクロアレイは製造者の指示に従ってまたは常法により調製した。ＤＮＡま
たは遺伝子プローブを構成する核酸配列は既知の技術を用いてポリメラーゼ連鎖
反応で増幅した後、ガラススライド上にスポットし、常法に従って処理した。

【００４８】標的核酸配列試料（ｃＤＮＡ）の調製および濃縮細胞の試料から抽出した全ＲＮＡまたはポリ（Ａ）⁺ＲＮＡから標的核酸配列
（ｃＤＮＡ）を調製した。約１０〜２０μｇの全ＲＮＡまたは５００〜１０００
ｎｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを含む試料の場合は、ｃＤＮＡがマイクロアレイハイ
ブリダイゼーションを行うのに十分な濃度になるので、エタノール沈殿は必要な
く、これを省くことができる点に注意されたい。微量遠心管で、０．２５〜５μ
ｇの全ＲＮＡまたは１２．５〜５００ｎｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを、３μＬのＣ
ｙ３（Ｒ）またはＣｙ５（Ｒ）ＲＴプライマー（０．２ｐｍｏｌｅ）および最終
体積を１０μＬにする量のＲＮアーゼの入っていない水と共に加えて、ＲＮＡ−
ＲＴプライマー混合物とした。得られた混合物を混和し、微量遠心機に短時間か
けることにより、微量遠心管の底に内容物を集めた。次に、集めた内容物を８０
℃に約１０分間加熱した後、直ちに氷上に移した。氷上に置いた別の微量遠心管
で、５×ＲＴ緩衝液４μＬ、ｄＮＴＰ混合物１μＬ、ＲＮアーゼの入っていない
水４μＬおよび逆転写酵素（２００単位）１μＬを混合して反応混合物とした。
反応混合物を穏やかに混和し、微量遠心機に短時間かけることにより、微量遠心
管の底に内容物を集めた。ＲＮＡ−ＲＴプライマー混合物１０μＬと反応混合物
１０μＬとを手早く混和し、４２℃で２時間インキュベートした。３．５μＬの
０．５ＭＮａＯＨ／５０ｍＭＥＤＴＡを混合物に加えることにより、反応を
停止させた。その混合物を６５℃で１０分間インキュベートすることによってＤ
ＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを変性させ、反応系を５μＬの１Ｍトリス塩酸塩（ｐ
Ｈ７．５）で中和した。次に、中和した反応混合物に３８．５μＬの１０ｍＭト
リス（ｐＨ８．０）／１ｍＭＥＤＴＡを加えた（２チャンネル発現アッセイを
調製するために、３μＬのＣｙ３（Ｒ）ＲＴプライマー（０．２ｐｍｏｌｅ）の
代わりに３μＬのＣｙ５（Ｒ）ＲＴプライマー（０．２ｐｍｏｌｅ）を使って上
記の工程を繰り返し、調製したＣｙ３（Ｒ）およびＣｙ５（Ｒ）ｃＤＮＡ混合物
を１０μＬの１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）／１ｍＭＥＤＴＡと共に混合して
得た反応混合物を、以下の工程で処理することもできる）。

【００４９】エタノール沈殿を行うために、２μＬのキャリア核酸（１０ｍｇ／ｍＬ線状ア
クリルアミド）を、中和した反応混合物に加えた。３Ｍ酢酸アンモニウム１７５
μＬを混合物に加えて混和した。次に、得られた混合物に１００％エタノール６
２５μＬを加えた。得られた混合物を−２０℃で３０分間インキュベートした。
試料を１０，０００ｇを越える加速度で１５分間遠心分離した。上清を吸引し、
その上清またはｃＤＮＡペレットに７０％エタノール３３０μＬを加えた。次に
ｃＤＮＡペレットを１０，０００ｇを越える加速度で５分間遠心分離した後、取
り出した。そのｃＤＮＡペレットを乾燥した（すなわち６５℃で２０〜３０分）
。

【００５０】マイクロアレイに対するｃＤＮＡ／デンドリマープローブ混合物のハイブリダ
イゼーションＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液を６５℃に１０分間加熱することによっ
て融解し、再懸濁した。このハイブリダイゼーション緩衝液は４０％ホルムアミ
ドを含んだ。諸成分が間違いなく均等に再懸濁するように、容器の反転によって
緩衝液を混和した。全ての物質が完全に再懸濁するまで、加熱と混和を繰り返し
た。必要に応じて、ある量の競合ＤＮＡ（例えばＣＯＴ−１−ＤＮＡおよびポリ
ｄＡ）を加えた。ｃＤＮＡを５．０μＬの滅菌水に再懸濁した。

【００５１】第１の実施形態（１チャンネル解析）では、１種類の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬（Ｇ
ｅｎｉｓｐｈｅｒｅ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州モントベール））（Ｃｙ３
またはＣｙ５）２．５μＬを、再懸濁したｃＤＮＡに、ＤＮＡハイブリダイゼー
ション緩衝液（４０％ホルムアミドを含むもの）１２．５μＬと共に加えた。も
う１つの態様では、２チャンネル解析用に、２種類の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬（Ｃｙ
３およびＣｙ５で特異的に標識されたデンドリマー）を、再懸濁したｃＤＮＡに
、ＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液１０μＬと共に加えた。多チャンネル解
析（３チャンネル以上）のさらなる一実施形態では、３種類以上の３ＤＮＡ（Ｒ
）試薬（Ｃｙ３、Ｃｙ５および他の標識部分を使って調製された１または複数の
試薬）２．５μＬを、再懸濁したｃＤＮＡに、ＤＮＡハイブリダイゼーション緩
衝液１０μＬと共に加えた。

【００５２】ハイブリダイゼーション緩衝液体積を増やすために、所望の最終体積に達する
ようにＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液を追加してもよい。ハイブリダイゼ
ーション緩衝液体積が３５μＬを越える場合は３ＤＮＡ（Ｒ）試薬を追加する必
要もあるかもしれないことに注意されたい。

【００５３】ＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液混合物を約５０℃で約１５〜２０分間イ
ンキュベートすることにより、ｃＤＮＡを３ＤＮＡ（Ｒ）試薬にプレハイブリダ
イズさせた。次に、プレイハイブリダイズした混合物をマイクロアレイに加え、
５５℃で一晩インキュベートした。この段階でｃＤＮＡは遺伝子プローブにハイ
ブリダイズした。

【００５４】ハイブリダイゼーション後の洗浄マイクロアレイを手早く洗浄して、過剰のデンドリマープローブを除去した。
まず、２×ＳＳＣ緩衝液／０．２％ＳＤＳを使って、マイクロアレイを５５℃で
１０分間洗浄した。次に、２×ＳＳＣ緩衝液を使って、マイクロアレイを室温で
１０分間洗浄した。最後に、０．２×ＳＳＣ緩衝液を使って、マイクロアレイを
室温で１０分間洗浄した。

【００５５】シグナル検出次に、ハイブリダイゼーションパターンを検出し、解析し、アッセイするため
に、スキャナー製造者の指示に従ってマイクロアレイをスキャンした。

【００５６】実施例２図３を参照して、マイクロアレイでの検出およびアッセイ方法を以下に説明す
る。この方法では、プロトコール時間と工程数を削減し、シグナル強度を増大さ
せるために、スピンカラムアセンブリ（例えば図４または図５に記載のもの）を
使用する。

【００５７】マイクロアレイの調製マイクロアレイは製造者の指示に従ってまたは常法により調製した。ＤＮＡま
たは遺伝子プローブを構成する核酸配列は既知の技術を用いてポリメラーゼ連鎖
反応で増幅した後、ガラススライド上にスポットし、常法に従って処理した。

【００５８】標的核酸配列試料（ｃＤＮＡ）の調製および濃縮細胞の試料から抽出した全ＲＮＡまたはポリ（Ａ）⁺ＲＮＡから標的核酸配列
（ｃＤＮＡ）を調製した。微量遠心管で、０．２５〜５μｇの全ＲＮＡまたは１
２．５〜５００ｎｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを、１μＬのＣｙ３（Ｒ）またはＣｙ
５（Ｒ）ＲＴプライマー（５ｐｍｏｌｅ）および最終体積を１０μＬにする量の
ＲＮアーゼの入っていない水と共に加えて、ＲＮＡ−ＲＴプライマー混合物とし
た。得られた混合物を混和し、微量遠心機に短時間かけることにより、微量遠心
管の底に内容物を集めた。次に、集めた内容物を８０℃に約１０分間加熱した後
、直ちに氷上に移した。氷上に置いた別の微量遠心管で、５×ＲＴ緩衝液４μＬ
、ｄＮＴＰ混合物１μＬ、ＲＮアーゼの入っていない水４μＬおよび逆転写酵素
（２００単位）１μＬを混合して反応混合物とした。反応混合物を穏やかに混和
し、微量遠心機に短時間かけることにより、微量遠心管の底に内容物を集めた。
ＲＮＡ−ＲＴプライマー混合物１０μＬと反応混合物１０μＬとを手早く混和し
、４２℃で２時間インキュベートした。３．５μＬの０．５ＭＮａＯＨ／５０
ｍＭＥＤＴＡを混合物に加えることにより、反応を停止させた。その混合物を
６５℃で１０分間インキュベートすることにより、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド
を変性させた。５μＬの１Ｍトリス塩酸塩（ｐＨ７．５）を混合物に加えること
によって反応系を中和した。中和した反応混合物に７１μＬの１０ｍＭトリス（
ｐＨ８．０）／１ｍＭＥＤＴＡを加えた（２チャンネル発現アッセイを調製す
るために、１μＬのＣｙ３（Ｒ）ＲＴプライマー（５ｐｍｏｌｅ）の代わりに１
μＬのＣｙ５（Ｒ）ＲＴプライマー（５ｐｍｏｌｅ）を使って上記の工程を繰り
返し、調製したＣｙ３（Ｒ）およびＣｙ５（Ｒ）ｃＤＮＡ混合物を４２μＬの１
０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）／１ｍＭＥＤＴＡと共に混合して得た反応混合物
を、以下の工程で処理することもできる）。

【００５９】ｃＤＮＡ精製：ＳＣスピンカラムアセンブリによる過剰なＲＴプライマーの除
去図４のスピンカラムに関して、スピンカラムを数回反転することにより、濾過
材を再懸濁し、カラム内を均質なスラリーにした。スピンカラムから両端のキャ
ップをはずした。微量遠心管を用意し、その微量遠心管の底端を切り落とすか穿
刺した。スピンカラムの一端を、穿刺した微量遠心管に入れた後、穿刺した微量
遠心管を、手を加えていない第２の微量遠心管（すなわち収集管）に入れた。次
に、組み立てたスピンカラムを、図４に示すように微量遠心管の先端から１５ｍ
Ｌ遠心管に入れた。このスピンカラムを約１０００ｇで、最大加速度に達してか
ら約３．５分間遠心分離した。スピンカラムをチェックして、遠心分離後にカラ
ムが完全に排液していること、およびスピンカラムの先端が収集管の液面より上
にあることを確認した。収集管にはスピンカラムから放出された約２〜２．５ｍ
Ｌの透明な緩衝液が含まれていた。カラムバレル中の樹脂はほぼ乾燥していて、
変形またはひび割れを起こさずにきっちり充填されているように見えた。スピン
カラムの末端が液体部分に漬かっていた場合は、そのスピンカラムを捨て、新し
いスピンカラムを使って上記の工程を繰り返した。スピンカラムはこの時点で、
中和した反応混合物中の過剰のＲＴプライマーを除去する準備が整った。

【００６０】排液したスピンカラムを取り出し、既に１５ｍＬ遠心管に入っている緩衝液収
集管の上に新しい１．０ｍＬ収集管を置いた。放出された緩衝液を捨てた。排液
したスピンカラムを新しい収集管に入れた。ｃＤＮＡを含む中和した反応混合物
１００μＬをスピンカラム濾過材の中心に直接のせた。スピンカラムアセンブリ
を１０，０００×ｇで、最大加速度に達してから約２．５分間遠心分離した。次
に、新しい収集管に集めた溶出液を回収した。元の体積±１０％が回収された。
溶出液はｃＤＮＡプローブを含んでいた。

【００６１】別法として、図５のスピンカラムを使って、スピンカラムを数回反転すること
により、濾過材を再懸濁し、カラム内を均質なスラリーにした。スピンカラムか
ら両端のキャップをはずした。次に、そのスピンカラムを図５に示すように１５
ｍＬ遠心管に入れた。そのスピンカラムを約１０００ｇで、最大加速度に達して
から約３．５分間遠心分離した。スピンカラムをチェックして、遠心分離後にカ
ラムが完全に排液していること、およびスピンカラムの先端が収集管の液面より
上にあることを確認した。収集管にはスピンカラムから放出された約２〜２．５
ｍＬの透明な緩衝液が含まれていた。カラムバレル中の樹脂はほぼ乾燥していて
、変形またはひび割れを起こさずにきっちり充填されているように見えた。スピ
ンカラムの末端が液体部分に漬かっていた場合は、そのスピンカラムを捨て、新
しいスピンカラムを使って上記の工程を繰り返した。スピンカラムはこの時点で
、中和した反応混合物中の過剰のＲＴプライマーを除去する準備が整った。

【００６２】排液したスピンカラムを取り出し、透明な緩衝液を取り除いた。新しい１．０
ｍＬ収集管を１５ｍＬ遠心管の底に入れた。ｃＤＮＡを含む中和した反応混合物
１００μＬをスピンカラム濾過材の中心に直接のせた。スピンカラムアセンブリ
を１０，０００×ｇで、最大加速度に達してから約２．５分間遠心分離した。次
に、新しい収集管に集めた溶出液を回収した。元の体積±１０％が回収された。
溶出液はｃＤＮＡプローブを含んでいた。

【００６３】エタノール沈殿を行うために、溶出液に２μＬのキャリア核酸（１０ｍｇ／ｍ
Ｌ線状アクリルアミド）を加えた。３Ｍ酢酸アンモニウム２５０μＬを混合物に
加えて混和した。次に、その混合物に１００％エタノール８７５μＬを加えた。
得られた混合物を−２０℃で３０分間インキュベートした。試料を１０，０００
×ｇを越える加速度で１５分間遠心分離した。上清を吸引し、その上清またはｃ
ＤＮＡペレットに７０％エタノール３３０μＬを加えた。次にｃＤＮＡペレット
を１０，０００×ｇを越える加速度で５分間遠心分離した。次に上清を除去した
。そのｃＤＮＡペレットを乾燥した（すなわち６５℃で２０〜３０分）。

【００６４】マイクロアレイに対するｃＤＮＡ／デンドリマープローブ混合物のハイブリダ
イゼーションＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液を６５℃に加熱することによって融解、
再懸濁し、６５℃で１０分間維持した。このハイブリダイゼーション緩衝液は４
０％ホルムアミドを含んだ。諸成分が間違いなく均等に再懸濁するように、容器
の反転によって緩衝液を混和した。全ての物質が完全に再懸濁するまで、加熱と
混和を繰り返した。必要に応じて、ある量の競合ＤＮＡ（例えばＣＯＴ−１−Ｄ
ＮＡおよびポリｄＡ）を加えてもよい。ｃＤＮＡを５．０μＬの滅菌水に再懸濁
した。

【００６５】第１の実施形態（１チャンネル解析）では、１種類の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬（Ｇ
ｅｎｉｓｐｈｅｒｅ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州モントベール））（Ｃｙ３
またはＣｙ５）２．５μＬを、再懸濁したｃＤＮＡに、ＤＮＡハイブリダイゼー
ション緩衝液（４０％ホルムアミドを含むもの）１２．５μＬと共に加えた。も
う１つの実施形態では、２チャンネル解析用に、２種類の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬（
Ｃｙ３およびＣｙ５で特異的に標識されたデンドリマー）を、再懸濁したｃＤＮ
Ａに、ＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液１０μＬと共に加えた。多チャンネ
ル解析（３チャンネル以上）のさらなる一実施形態では、３種類以上の３ＤＮＡ
（Ｒ）試薬（Ｃｙ３、Ｃｙ５および他の標識部分を使って調製された１または複
数の試薬）２．５μＬを、再懸濁したｃＤＮＡに、ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン緩衝液１０μＬと共に加えた。

【００６６】ハイブリダイゼーション緩衝液体積を増やすために、所望の最終体積に達する
ようにＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液を追加してもよい。ハイブリダイゼ
ーション緩衝液体積が３５μＬを越える場合は３ＤＮＡ（Ｒ）試薬を追加する必
要もあるかもしれないことに注意されたい。ＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝
液混合物を約５０℃で約１５〜２０分間インキュベートすることにより、ｃＤＮ
Ａを３ＤＮＡ（Ｒ）試薬（すなわちデンドリマープローブ）にプレハイブリダイ
ズさせた。この段階で、３ＤＮＡ（Ｒ）試薬のデンドリマープローブはｃＤＡＮ
上の捕捉配列とハイブリダイズした。２０分後に、上記ＤＮＡハイブリダイゼー
ション緩衝液をマイクロアレイに加えた。マイクロアレイおよびＤＮＡハイブリ
ダイゼーション緩衝液を覆い、温度約５５℃の湿室で一晩インキュベートした。
この段階で、ｃＤＮＡは遺伝子プローブにハイブリダイズした。

【００６７】ハイブリダイゼーション後の洗浄マイクロアレイを手早く洗浄して、過剰のデンドリマープローブを除去した。
まず、０．２％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ緩衝液を使って、マイクロアレイを５５
℃で１０分間洗浄した。次に、２×ＳＳＣ緩衝液を使って、マイクロアレイを室
温で１０分間洗浄した。最後に、０．２×ＳＳＣ緩衝液を使って、マイクロアレ
イを室温で１０分間洗浄した。

【００６８】シグナル検出次に、ハイブリダイゼーションパターンを検出し、解析し、アッセイするため
に、スキャナー製造者の指示に従ってマイクロアレイをスキャンした。

【００６９】実施例３マイクロアレイでの検出およびアッセイを行うもう一つの方法マイクロアレイの調製マイクロアレイは製造者の指示に従ってまたは常法により調製した。ＤＮＡま
たは遺伝子プローブを構成する核酸配列は既知の技術を用いてポリメラーゼ連鎖
反応で増幅した後、ガラススライド上にスポットし、常法に従って処理した。

【００７０】標的核酸配列試料（ｃＤＮＡ）の調製および濃縮細胞の試料から抽出した全ＲＮＡまたはポリ（Ａ）⁺ＲＮＡから標的核酸配列
（ｃＤＮＡ）を調製した。微量遠心管で、０．２５〜１０μｇの全ＲＮＡまたは
１２．５〜５００ｎｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを、１μＬのＣｙ３（Ｒ）またはＣ
ｙ５（Ｒ）ＲＴプライマー（５ｐｍｏｌｅ）および最終体積を１０μＬにする量
のＲＮアーゼの入っていない水と共に加えて、ＲＮＡ−ＲＴプライマー混合物と
した。得られた混合物を混和し、微量遠心機に短時間かけることにより、微量遠
心管の底に内容物を集めた。次に、集めた内容物を８０℃に約１０分間加熱した
後、直ちに氷上に移した。氷上に置いた別の微量遠心管で、５×ＲＴ緩衝液４μ
Ｌ、ｄＮＴＰ混合物１μＬ、ＲＮアーゼの入っていない水４μＬおよび逆転写酵
素（２００単位）１μＬを混合して反応混合物とした。反応混合物を穏やかに混
和し、微量遠心機に短時間かけることにより、微量遠心管の底に内容物を集めた
。ＲＮＡ−ＲＴプライマー混合物１０μＬと反応混合物１０μＬとを混合し、４
２℃で２時間インキュベートした。３．５μＬの０．５ＭＮａＯＨ／５０ｍＭ
ＥＤＴＡを混合物に加えることにより、反応を停止させた。その混合物を６５
℃で１０分間インキュベートすることにより、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを変
性させた。５μＬの１Ｍトリス塩酸塩（ｐＨ７．５）を混合物に加えることによ
って反応系を中和した。中和した反応混合物に７１μＬの１０ｍＭトリス（ｐＨ
８．０）／１ｍＭＥＤＴＡを加えた。

【００７１】ｃＤＮＡ精製：ＳＣスピンカラムアセンブリによる過剰なＲＴプライマーの除
去図４のスピンカラムに関して、スピンカラムを数回反転することにより、濾過
材を再懸濁し、カラム内を均質なスラリーにした。スピンカラムから両端のキャ
ップをはずした。微量遠心管を用意し、その微量遠心管の底端を切り落とすか穿
刺した。スピンカラムの一端を穿刺した微量遠心管に入れた後、穿刺した微量遠
心管を、手を加えていない第２の微量遠心管（すなわち収集管）に入れた。次に
、組み立てたスピンカラムを、図４に示すように微量遠心管の先端から１５ｍＬ
遠心管に入れた。このスピンカラムを約１０００ｇで、最大加速度に達してから
約３．５分間遠心分離した。スピンカラムをチェックして、遠心分離後にカラム
が完全に排液していること、およびスピンカラムの先端が収集管の液面より上に
あることを確認した。収集管にはスピンカラムから放出された約２〜２．５ｍＬ
の透明な緩衝液が含まれていた。カラムバレル中の樹脂はほぼ乾燥していて、変
形またはひび割れを起こさずにきっちり充填されているように見えた。スピンカ
ラムの末端が液体部分に漬かっていた場合は、そのスピンカラムを捨て、新しい
スピンカラムを使って上記の工程を繰り返した。スピンカラムはこの時点で、中
和した反応混合物中の過剰のＲＴプライマーを除去する準備が整った。

【００７２】排液したスピンカラムを取り出し、既に１５ｍＬ遠心管に入っている緩衝液収
集管の上に新しい１．０ｍＬ収集管を置いた。放出された緩衝液を捨てた。排液
したスピンカラムを新しい収集管に入れた。ｃＤＮＡを含む中和した反応混合物
１００μＬをスピンカラム濾過材の中心に直接のせた。スピンカラムアセンブリ
を１０，０００×ｇで、最大加速度に達してから約２．５分間遠心分離した。次
に、新しい収集管に集めた溶出液を回収した。元の体積±１０％が回収された。
溶出液はｃＤＮＡプローブを含んでいた。

【００７３】別法として、図５のスピンカラムを使って、スピンカラムを数回反転すること
により、濾過材を再懸濁し、カラム内を均質なスラリーにした。スピンカラムか
ら両端のキャップをはずした。次に、そのスピンカラムを図５に示すように１５
ｍＬ遠心管に入れた。そのスピンカラムを約１０００ｇで、最大加速度に達して
から約３．５分間遠心分離した。スピンカラムをチェックして、遠心分離後にカ
ラムが完全に排液していること、およびスピンカラムの先端が収集管の液面より
上にあることを確認した。収集管にはスピンカラムから放出された約２〜２．５
ｍＬの透明な緩衝液が含まれていた。カラムバレル中の樹脂はほぼ乾燥していて
、変形またはひび割れを起こさずにきっちり充填されているように見えた。スピ
ンカラムの末端が液体部分に漬かっていた場合は、そのスピンカラムを捨て、新
しいスピンカラムを使って上記の工程を繰り返した。スピンカラムはこの時点で
、中和した反応混合物中の過剰のＲＴプライマーを除去する準備が整った。

【００７４】排液したスピンカラムを取り出し、透明な緩衝液を取り除いた。新しい１．０
ｍＬ収集管を１５ｍＬ遠心管の底に入れた。ｃＤＮＡを含む中和した反応混合物
１００μＬをスピンカラム濾過材の中心に直接のせた。スピンカラムアセンブリ
を１０，０００×ｇで、最大加速度に達してから約２．５分間遠心分離した。次
に、新しい収集管に集めた溶出液を回収した。元の体積±１０％が回収された。
溶出液はｃＤＮＡプローブを含んでいた。

【００７５】マイクロアレイに対するｃＤＮＡ／デンドリマープローブ混合物のハイブリダ
イゼーションＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液を６５℃に加熱することによって融解、
再懸濁し、６５℃で１０分間維持した。このハイブリダイゼーション緩衝液は４
０％ホルムアミドを含んだ。諸成分が間違いなく均等に再懸濁するように、容器
の反転によって緩衝液を混和した。全ての物質が完全に再懸濁するまで、加熱と
混和を繰り返した。必要に応じて、ある量の競合ＤＮＡ（例えばＣＯＴ−１−Ｄ
ＮＡおよびポリｄＡ）を加えてもよい。溶出したｃＤＮＡプローブ５．０〜１０
μＬをハイブリダイゼーションに使用した。第１の実施形態（１チャンネル解析
）では、１種類の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ，Ｉｎｃ．（ニュ
ージャージー州モントベール））（Ｃｙ３またはＣｙ５）２．５μＬを、再懸濁
したｃＤＮＡに、ＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液（４０％ホルムアミドを
含むもの）１２．５μＬと共に加えた。もう１つの実施形態では、２チャンネル
解析用に、２種類の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬（Ｃｙ３およびＣｙ５で特異的に標識さ
れたデンドリマー）を、再懸濁したｃＤＮＡに、ＤＮＡハイブリダイゼーション
緩衝液１０μＬと共に加えた。多チャンネル解析（３チャンネル以上）のさらな
る一実施形態では、３種類以上の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬（Ｃｙ３、Ｃｙ５および他
の標識部分を使って調製された１または複数の試薬）２．５μＬを、再懸濁した
ｃＤＮＡに、ＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液１０μＬと共に加えた。

【００７６】ハイブリダイゼーション緩衝液体積を増やすために、所望の最終体積に達する
ようにＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液を追加してもよい。ハイブリダイゼ
ーション緩衝液体積が３５μＬを越える場合は３ＤＮＡ（Ｒ）試薬を追加する必
要もあるかもしれないことに注意されたい。ＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝
液混合物を約５０℃で約１５〜２０分間インキュベートすることにより、ｃＤＮ
Ａを３ＤＮＡ（Ｒ）試薬（すなわちデンドリマープローブ）にプレハイブリダイ
ズさせた。この段階で、３ＤＮＡ（Ｒ）試薬のデンドリマープローブはｃＤＡＮ
上の捕捉配列とハイブリダイズした。２０分後に、上記ＤＮＡハイブリダイゼー
ション緩衝液をマイクロアレイに加えた。マイクロアレイおよびＤＮＡハイブリ
ダイゼーション緩衝液を覆い、温度約５５℃の湿室で一晩インキュベートした。
この段階で、ｃＤＮＡは遺伝子プローブにハイブリダイズした。

【００７７】ハイブリダイゼーション後の洗浄マイクロアレイを手早く洗浄して、過剰のデンドリマープローブを除去した。
まず、０．２％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ緩衝液を使って、マイクロアレイを５５
℃で１０分間洗浄した。次に、２×ＳＳＣ緩衝液を使って、マイクロアレイを室
温で１０分間洗浄した。最後に、０．２×ＳＳＣ緩衝液を使って、マイクロアレ
イを室温で１０分間洗浄した。

【００７８】シグナル検出次に、ハイブリダイゼーションパターンを検出し、解析し、アッセイするため
に、スキャナー製造者の指示に従ってマイクロアレイをスキャンした。

【００７９】実施例４ｃＤＮＡアレイ用の検出キットを用いるマイクロアレイでの検出およびアッセ
イ方法キットの内容バイアル１：Ｃｙ３（Ｒ）３ＤＮＡ（Ｒ）試薬（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ（ニュ
ージャージー州モントベール）。２０μＬアッセイにつき２．５μＬを使用。

【００８０】バイアル２：ハイブリダイゼーション緩衝液−０．２５ＭＮａＰＯ₄、４．
５％ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡおよび１×ＳＳＣ（暗所に２０℃で保存）。

【００８１】マイクロアレイの調製マイクロアレイは製造者の指示に従ってまたは常法により調製した。ＤＮＡま
たは遺伝子プローブを構成する核酸配列は既知の技術を用いてポリメラーゼ連鎖
反応で増幅した後、ガラススライド上にスポットし、常法に従って処理した。

【００８２】３ＤＮＡ（Ｒ）ハイブリダイゼーションバイアル２のハイブリダイゼーション緩衝液を６５℃に１０分間加熱すること
によって融解し、再懸濁した。諸成分が間違いなく均等に再懸濁するように、容
器の反転によって緩衝液を混和した。必要に応じて、全ての物質が再懸濁するま
で、加熱と混和を繰り返した。バイアル１の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬２．５μＬを１
７．５μＬのハイブリダイゼーション緩衝液に加えてハイブリダイゼーション混
合物とした。そのハイブリダイゼーション混合物をマイクロアレイに加えた。マ
イクロアレイを覆い、約３７〜４２℃の温度で湿室にて約６時間〜一晩インキュ
ベートした。

【００８３】ハイブリダイゼーション後の洗浄０．２％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ緩衝液を使って、マイクロアレイを４２℃で
１０分間洗浄した。次に、２×ＳＳＣ緩衝液を使って、マイクロアレイを室温で
１０分間洗浄した。最後に、０．２×ＳＳＣ緩衝液を使って、マイクロアレイを
室温で１０分間洗浄した。

【００８４】シグナル検出次に、ハイブリダイゼーションパターンを検出し、解析し、アッセイするため
に、スキャナー製造者の指示に従ってマイクロアレイをスキャンした。

【図面の簡単な説明】

【図１】先行技術による核酸配列試料検出およびアッセイ用マイクロアレ
イの調製工程を表す概念図である。

【図２】本発明の一実施形態による核酸配列試料検出およびアッセイ用マ
イクロアレイの調製方法を表す概念図である。

【図３】本発明のもう１つの実施形態による核酸配列試料検出およびアッ
セイ用マイクロアレイの調製方法を表す概念図である。

【図４】図３に記載の方法で使用されるスピンカラムアセンブリの断面図
である。

【図５】本発明で使用されるスピンカラムのもう１つの実施形態の断面図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA04 HA12 4B029 AA07 AA23 BB20 CC08 FA01 FA12 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ53 QR08 QR32 QR42 QR55 QR62 QR82 QS12 QS34 QS39 QX01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】１）それぞれが第１特定第１ヌクレオチド配列を含む多数の
フィーチャーを有するマイクロアレイを、ａ）標的試料のｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡ試薬から構成される第１成分（
前記ｃＤＮＡは捕捉配列を有する）と、ｂ）検出可能なシグナルを放出することができるラベルを含む少なくとも１つ
の第１アームおよび捕捉配列に相補的な第２ヌクレオチド配列を持つ少なくとも
１つの第２アームを有するデンドリマーから構成される第２成分、とを含む混合物と接触させる工程、２）第１成分および第２成分を、第１成分が第２成分に結合することを可能と
するに足りる温度で、第１成分が第２成分に結合することを可能とするに足りる
時間にわたって混合する工程、および３）この混合物を前記マイクロアレイと共にインキュベートすることにより、
第１ヌクレオチド配列が第１成分に結合することを可能とし、そのような結合の
結果として検出可能なシグナルを放出するフィーチャーを生成する工程、から構成される、マイクロアレイでの検出およびアッセイ方法。
【請求項２】標的試料ｍＲＮＡを、捕捉配列を有するある量のＲＴプライ
マー、逆転写酵素およびヌクレオチドと、前記ｍＲＮＡからｃＤＮＡ試薬への逆
転写を開始するのに十分な条件で接触させることにより、ｃＤＮＡ試薬から構成
される第１成分を形成させる工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】ハイブリダイズしていない過剰のＲＴプライマーを、前記混
合物のインキュベーションに先立って、前記第１成分から除去する工程をさらに
含む、請求項２の方法。
【請求項４】さらに前記除去工程が第１成分をスピンカラム濾過材に通す
工程から構成される請求項３の方法。
【請求項５】第２成分が第１成分に結合することを可能とするに足りる温
度が約５０〜５５℃である請求項１の方法。
【請求項６】第１成分が第１ヌクレオチド配列に結合することを可能とす
るに足りる温度が４２〜６５℃である請求項１の方法。
【請求項７】第１成分が第１ヌクレオチド配列に結合することを可能とす
るに足りる温度が約４時間〜７２時間以上である請求項１の方法。
【請求項８】第２成分が第１成分に結合することを可能とするに足りる時
間が約０．２５時間〜１時間である請求項１の方法。
【請求項９】マイクロアレイおよび混合物を湿室中、約４２〜６５℃の温
度で一晩インキュベートする請求項９の方法。
【請求項１０】生成した検出可能なシグナルおよびハイブリダイゼーショ
ンパターンを検出するためにマイクロアレイをスキャンする工程をさらに含む請
求項１の方法。
【請求項１１】マイクロアレイおよび混合物のインキュベーション後にマ
イクロアレイに結合していないデンドリマーを除去するためにマイクロアレイを
洗浄する工程をさらに含む請求項１の方法。
【請求項１２】さらに前記洗浄工程が、０．２％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ緩衝液を使ってマイクロアレイを５５℃で約
１０分間洗浄すること、２×ＳＳＣ緩衝液を使ってマイクロアレイを室温で約１０分間洗浄すること、
および０．２×ＳＳＣ緩衝液を使ってマイクロアレイを室温で約１０分間洗浄するこ
と、から構成される請求項１１の方法。
【請求項１３】前記混合物がさらにハイブリダイゼーション緩衝液を含む
請求項１の方法。
【請求項１４】さらに前記ハイブリダイゼーション緩衝液が０．２５Ｍ
ＮａＰＯ₄、４．５％ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡおよび１×ＳＳＣから構成され
る請求項１３の方法。
【請求項１５】さらに前記ハイブリダイゼーション緩衝液が４０％ホルム
アミド、４×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳから構成される請求項１３の方法。
【請求項１６】前記除去工程にハイブリダイゼーションチャンバーの使用
がさらに含まれる請求項３の方法。
【請求項１７】前記除去工程にハイブリダイゼーションステーションの使
用がさらに含まれる請求項３の方法。
【請求項１８】１）ｉ）標的試料のｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡ試薬か
ら構成される第１成分（前記ｃＤＮＡは捕捉配列を有する）と、ｉｉ）検出可能なシグナルを放出することができるラベルを含む少なくとも１
つの第１アームおよび捕捉配列に相補的な第２ヌクレオチド配列を持つ少なくと
も１つの第２アームを有するデンドリマーから構成される第２成分、とを含む混合物を、第１成分を第２成分に結合させてプレハイブリダイズしたｃ
ＤＮＡ−デンドリマー複合体を形成させるのに足りる第１温度で、第１成分を第
２成分に結合させてプレハイブリダイズしたｃＤＮＡ−デンドリマー複合体を形
成させるのに足りる時間にわたってインキュベートする工程、２）それぞれが特定の第１ヌクレオチド配列を含む多数のフィーチャーを有す
るマイクロアレイを、前記混合物と接触させる工程、および３）マイクロアレイおよびプレハイブリダイズしたｃＤＮＡ−デンドリマー複
合体を、プレハイブリダイズしたｃＤＮＡ−デンドリマー複合体を第１ヌクレオ
チド配列に結合させるのに足りる第２温度で、プレハイブリダイズしたｃＤＮＡ
−デンドリマー複合体を第１ヌクレオチド配列に結合させるのに足りる時間にわ
たってインキュベートし、そのような結合の結果として検出可能なシグナルを放
出するフィーチャーを生成させることにより、マイクロアレイ上にハイブリダイ
ゼーションパターンを形成させる工程、から構成される、マイクロアレイでの検出およびアッセイ方法。
【請求項１９】前記ｃＤＮＡがスピンカラムを使って得られる請求項１８
の方法。