JP2003516166A - ハイブリダイゼーション反応のための標準化コントロール及び二重鎖プローブ - Google Patents
ハイブリダイゼーション反応のための標準化コントロール及び二重鎖プローブInfo
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract
(57)【要約】
試料中のポリヌクレオチドの定量的に測定する方法を示す。一つの方法では、ハイブリダイゼーションの条件下で、異なるポリヌクレオチド標的及び標準ポリヌクレオチド標的を、検出可能なプローブ及び標準標的に対する単独で検出可能な一本鎖又は二本鎖相補体と接触させる。標識された核酸試料の遺伝的性質に関する定量的な情報を得るために、プローブのハイブリダイゼーションパターンを、標準配列のハイブリダイゼーションパターンと比較した。また、本方法を利用するためのキットについて示す。
Description
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションに関する。
【０００２】
(発明の背景)
ハイブリダイゼーションは、核酸を検出及び局在化するのに強力で用途の広い
技術である。分子生物学の一般的な分野では、ハイブリダイゼーションを遺伝子
の地図化、遺伝子発現及びその過剰発現の検出、疾患の診断、疾患の素因の同定
などへ用いている。一般的に、標識化した核酸プローブを標的試料へハイブリダ
イズさせ、続いてハイブリダイゼーションを検出する。蛍光検出法又は抗体-酵
素検出法とカップリングさせたジゴキシゲニン及びビオチン標識化ＤＮＡを用い
る蛍光ベース検出法を含む、標識化されたＤＮＡプローブを視覚化するための各
種の同位体及び非同位体システムが開発されている。
技術である。分子生物学の一般的な分野では、ハイブリダイゼーションを遺伝子
の地図化、遺伝子発現及びその過剰発現の検出、疾患の診断、疾患の素因の同定
などへ用いている。一般的に、標識化した核酸プローブを標的試料へハイブリダ
イズさせ、続いてハイブリダイゼーションを検出する。蛍光検出法又は抗体-酵
素検出法とカップリングさせたジゴキシゲニン及びビオチン標識化ＤＮＡを用い
る蛍光ベース検出法を含む、標識化されたＤＮＡプローブを視覚化するための各
種の同位体及び非同位体システムが開発されている。
【０００３】
標的試料は、溶液中或いはアレイ及びマイクロアレイのような個体支持体上に
固定することができる。マイクロアレイでは、マイクロアレイを用いる典型的な
方法に、ハイブリダイゼーション条件下で溶液中に含まれるヌクレオチド配列を
マイクロアレイ上に固定化した配列と接触させ、次いでハイブリダイゼーション
複合体を検出することが含まれる。バイブリダイズした核酸によって生じたパタ
ーンは、試験した試料の遺伝的性質に関する情報を示す。マイクロアレイにおい
て、ハイブリダイゼーション複合体を検出するために広く用いられている方法は
蛍光法である。一つの方法では、標識化プローブとなるように蛍光標識（レポー
ター）分子とカップリングさせたヌクレオチドの存在下で、生物学的試料から誘
導したプローブを増幅させ、次いでプローブ配列がマイクロアレイ上に固定化し
た相補的配列とハイブリダイズするように、標識化したプローブをマイクロアレ
イとインキュベートする。次いで、蛍光のレベルとパターンを測定するためにス
キャナーを用いる。
固定することができる。マイクロアレイでは、マイクロアレイを用いる典型的な
方法に、ハイブリダイゼーション条件下で溶液中に含まれるヌクレオチド配列を
マイクロアレイ上に固定化した配列と接触させ、次いでハイブリダイゼーション
複合体を検出することが含まれる。バイブリダイズした核酸によって生じたパタ
ーンは、試験した試料の遺伝的性質に関する情報を示す。マイクロアレイにおい
て、ハイブリダイゼーション複合体を検出するために広く用いられている方法は
蛍光法である。一つの方法では、標識化プローブとなるように蛍光標識（レポー
ター）分子とカップリングさせたヌクレオチドの存在下で、生物学的試料から誘
導したプローブを増幅させ、次いでプローブ配列がマイクロアレイ上に固定化し
た相補的配列とハイブリダイズするように、標識化したプローブをマイクロアレ
イとインキュベートする。次いで、蛍光のレベルとパターンを測定するためにス
キャナーを用いる。
【０００４】
マイクロアレイ分析における蛍光検出の利用は、ヒトリン脂質結合タンパク質
（ＰＬＢＰ）の改良発現の検出に関するLalら.,の米国特許第５，８８８，７４
２号 、そしてインシュリンレセプターチロシンキナーゼ基質（ＩＲＳ−ｐ５３
ｈ）の発現レベルのモニタリング、並びに遺伝子機能を確定するためのその遺伝
的変異体、突然変異体及び多型（ポリモフィズム）を同定すること、そして治療
薬の開発とモニタリングに関するHillmanら.,の米国特許第５，８９１，６７４
号に開示されている。
（ＰＬＢＰ）の改良発現の検出に関するLalら.,の米国特許第５，８８８，７４
２号 、そしてインシュリンレセプターチロシンキナーゼ基質（ＩＲＳ−ｐ５３
ｈ）の発現レベルのモニタリング、並びに遺伝子機能を確定するためのその遺伝
的変異体、突然変異体及び多型（ポリモフィズム）を同定すること、そして治療
薬の開発とモニタリングに関するHillmanら.,の米国特許第５，８９１，６７４
号に開示されている。
【０００５】
現在の技術に用いられている標識及び標識化の仕組みが非定量的なシグナルを
発するために、現在のハイブリダイゼーション法では、一般的に定性的な情報の
みを提供することができる。例えば、マイクロアレイでは、プリンディングにお
ける試料間のばらつき、各アレイエレメントの性質及びハイブリダイゼーション
の性能などによってシグナルは影響を受ける。例えば、合成又はスポッティング
性能、ハイブリダイゼーション性能、局所的なノイズなどのばらつきを測定する
ことができる「定量的」な情報が得られる一つの方法は、対象のシグナルと「コ
ントロール」として作用するマイクロアレイ上の他の遺伝子又は配列のシグナル
を比較することを必要とする。しかしながら、このような方法は、未だに試料中
の特定の標的の正確な定量的情報を提供しない。従って、ハイブリダイゼーショ
ン反応から定量的な情報を提供することを可能にする新しい方法の開発への関心
が引き続き存在する。
発するために、現在のハイブリダイゼーション法では、一般的に定性的な情報の
みを提供することができる。例えば、マイクロアレイでは、プリンディングにお
ける試料間のばらつき、各アレイエレメントの性質及びハイブリダイゼーション
の性能などによってシグナルは影響を受ける。例えば、合成又はスポッティング
性能、ハイブリダイゼーション性能、局所的なノイズなどのばらつきを測定する
ことができる「定量的」な情報が得られる一つの方法は、対象のシグナルと「コ
ントロール」として作用するマイクロアレイ上の他の遺伝子又は配列のシグナル
を比較することを必要とする。しかしながら、このような方法は、未だに試料中
の特定の標的の正確な定量的情報を提供しない。従って、ハイブリダイゼーショ
ン反応から定量的な情報を提供することを可能にする新しい方法の開発への関心
が引き続き存在する。
【０００６】
（本発明の概要）
ハイブリダイゼーション反応を標準化し定量化する方法が示されている。主要
な方法では、ハイブリダイゼーションパターンを作製するために、異なるポリヌ
クレオチド標的及び標準ポリヌクレオチド標的を、異なる標的に対して相補的な
検出可能な核酸プローブ、並びに単独で検出可能な標準標的に対する相補体と接
触させる。そして、ハイブリダイゼーションパターンを検出し、試料或いはマイ
クロアレイに配したポリヌクレオチドの量に関する定量的な情報を含む情報を得
るために用いる。単独で検出可能なプローブを一本鎖又は二本鎖にすることが可
能である。一本鎖標準プローブはセンス又はアンチセンスとなることが可能であ
り、二本鎖標準プローブは標準標的に対してセンス及びアンチセンスである。好
ましくは、センス及びアンチセンス相補体はほぼ等モル濃度で存在する。あるい
は、二本鎖プローブは、センス及びアンチセンス鎖が共有結合しているヘアピン
二重鎖となることが可能である。 下記において更に十分に記述した詳細を読むことによって、本発明のこれら及
び他の欠点、利点、及び特徴が、当該分野の技術者にとって明らかになる。 （詳細な説明）
な方法では、ハイブリダイゼーションパターンを作製するために、異なるポリヌ
クレオチド標的及び標準ポリヌクレオチド標的を、異なる標的に対して相補的な
検出可能な核酸プローブ、並びに単独で検出可能な標準標的に対する相補体と接
触させる。そして、ハイブリダイゼーションパターンを検出し、試料或いはマイ
クロアレイに配したポリヌクレオチドの量に関する定量的な情報を含む情報を得
るために用いる。単独で検出可能なプローブを一本鎖又は二本鎖にすることが可
能である。一本鎖標準プローブはセンス又はアンチセンスとなることが可能であ
り、二本鎖標準プローブは標準標的に対してセンス及びアンチセンスである。好
ましくは、センス及びアンチセンス相補体はほぼ等モル濃度で存在する。あるい
は、二本鎖プローブは、センス及びアンチセンス鎖が共有結合しているヘアピン
二重鎖となることが可能である。 下記において更に十分に記述した詳細を読むことによって、本発明のこれら及
び他の欠点、利点、及び特徴が、当該分野の技術者にとって明らかになる。 （詳細な説明）
【０００７】
本方法及びキットを記載する前に、本発明が記載される特定の方法及びキット
に限定されるものではなく、当然のことながら変わり得るものであることは理解
されなければならない。本発明の範囲は添付された請求項によってのみ限定され
るので、ここにおいて用いられる専門用語も特定の実施態様のみを記述する目的
のためであり、意図的に限定されるものではないことは理解されなければならな
い。 特に定義されなければ、ここで用いられるすべての技術的及び科学的用語は、
本発明が属する分野の当業者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。
ここに記載されているのと類似又は同等の何れの方法及び材料を本発明の実践又
は試験へ用いることが可能であるが、好ましい方法及び材料を今回は記載する。
引用されている公開物と関連のある方法及び／材料を開示及び記述するために、
ここで言及するすべての公開物を取り入れている。 （定義）
に限定されるものではなく、当然のことながら変わり得るものであることは理解
されなければならない。本発明の範囲は添付された請求項によってのみ限定され
るので、ここにおいて用いられる専門用語も特定の実施態様のみを記述する目的
のためであり、意図的に限定されるものではないことは理解されなければならな
い。 特に定義されなければ、ここで用いられるすべての技術的及び科学的用語は、
本発明が属する分野の当業者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。
ここに記載されているのと類似又は同等の何れの方法及び材料を本発明の実践又
は試験へ用いることが可能であるが、好ましい方法及び材料を今回は記載する。
引用されている公開物と関連のある方法及び／材料を開示及び記述するために、
ここで言及するすべての公開物を取り入れている。 （定義）
【０００８】
特に文脈において明確な指示がない限り、本明細書及び添付請求項に用いられ
ているような、単数形「a」、「an」及び「the」は複数対象物を含むことに特に
留意すべきである。従って、例えば、「a probe」については、そのようなプロ
ーブの一つ以上が組成物に存在することが可能であることを意味する。同じよう
に、「a microarray」又は「the microarray element」については、一つ以上の
マイクロアレイの可能性などを含む。
ているような、単数形「a」、「an」及び「the」は複数対象物を含むことに特に
留意すべきである。従って、例えば、「a probe」については、そのようなプロ
ーブの一つ以上が組成物に存在することが可能であることを意味する。同じよう
に、「a microarray」又は「the microarray element」については、一つ以上の
マイクロアレイの可能性などを含む。
【０００９】
「蛍光性の」という用語は、紫外線、可視光線、又はｘ線のような輻射エネル
ギーによって活性化される間に光線を発する物質（例えば蛍光物質（フルオロフ
ォア） ）の特性を指す。 「プローブ」又は「試料プローブ」という用語は、その相補体又は特定のマイ
クロアレイエレメントによって認識される分子を指す。本発明によって調べるこ
とが可能なプローブの例としては、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ
、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、多糖類、糖、タンパク質、ペプチド、モノク
ローナル抗体、トキシン、ウイルスエピトープ、ホルモン、ホルモンレセプター
、酵素、酵素基質、補因子、及び細胞表層レセプターのアゴニスト及びアンタゴ
ニストを含む薬剤を含む。
ギーによって活性化される間に光線を発する物質（例えば蛍光物質（フルオロフ
ォア） ）の特性を指す。 「プローブ」又は「試料プローブ」という用語は、その相補体又は特定のマイ
クロアレイエレメントによって認識される分子を指す。本発明によって調べるこ
とが可能なプローブの例としては、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ
、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、多糖類、糖、タンパク質、ペプチド、モノク
ローナル抗体、トキシン、ウイルスエピトープ、ホルモン、ホルモンレセプター
、酵素、酵素基質、補因子、及び細胞表層レセプターのアゴニスト及びアンタゴ
ニストを含む薬剤を含む。
【００１０】
「標的」，「ＤＮＡエレメント」又は「マイクロアレイエレメント」という用
語は、与えられた試料に対して親和性を有する分子を指す。エレメントは天然発
生又は合成分子でもよく、直接に或いは特異的な結合基質を介するかの何れかに
よって表層と共有又は非共有的に結合し得る。本発明によって用いられることが
可能なエレメントの例には、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリ
ゴヌクレオチド、類似体などが含まれる。 ここで用いられる「相補的」又は「相補性」という用語は、塩基対合による塩
及び温度の許容条件下でのポリヌクレオチドの天然結合を指す。例えば、配列「
Ａ−Ｇ−Ｔ」は相補的配列である「Ｔ−Ｃ−Ａ」と結合する。二つの一本鎖分子
間の相補性は、一部の核酸が結合するのみの「部分的」であり得るか、或いは一
本鎖分子の間に全相補性が存在した場合に相補性は完全となり得る。核酸鎖間の
相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率と輝度にかなりの影
響を与える。従って、エレメントとそのプローブ、並びにエレメントとプローブ
間の接触領域が、相補的であると説明できる。
語は、与えられた試料に対して親和性を有する分子を指す。エレメントは天然発
生又は合成分子でもよく、直接に或いは特異的な結合基質を介するかの何れかに
よって表層と共有又は非共有的に結合し得る。本発明によって用いられることが
可能なエレメントの例には、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリ
ゴヌクレオチド、類似体などが含まれる。 ここで用いられる「相補的」又は「相補性」という用語は、塩基対合による塩
及び温度の許容条件下でのポリヌクレオチドの天然結合を指す。例えば、配列「
Ａ−Ｇ−Ｔ」は相補的配列である「Ｔ−Ｃ−Ａ」と結合する。二つの一本鎖分子
間の相補性は、一部の核酸が結合するのみの「部分的」であり得るか、或いは一
本鎖分子の間に全相補性が存在した場合に相補性は完全となり得る。核酸鎖間の
相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率と輝度にかなりの影
響を与える。従って、エレメントとそのプローブ、並びにエレメントとプローブ
間の接触領域が、相補的であると説明できる。
【００１１】
「ハイブリッド」という用語は、相補性の結果であるプローブとマイクロアレ
イエレメント間のハイブリダイゼーションによる産物を指す。 「フラグメント」、「セグメント」又は「ＤＮＡフラグメント」という用語は
、一つの染色体又は染色体の一つの領域に生じるような、より大きなＤＮＡポリ
メラーゼ又は配列のある部分を指す。 「遺伝子発現」という用語は、特異的な遺伝子から転写された特異的ｍＲＮＡ
の量又は総量を指す。 「マイクロアレイ」という用語は、高密度で、例えば紙、ナイロン又は他のタ
イプの膜、フィルター、チップ、ガラススライド、ビーズ、或いは他のすべての
適切な固体支持体上において合成又は結合又は配した異なるポリヌクレオチド又
はオリゴヌクレオチドのアレイを指す。 「アンチセンス」という用語は、特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列に対して相補的
なヌクレオチド配列を含むすべての組成物を指す。「アンチセンス鎖」という用
語は、「センス」鎖に対して相補的な核酸鎖に関して用いられる。アンチセンス
分子には、ペプチド核酸が含まれ、並びに合成又は転写を含むすべての方法によ
って作製され得る。
イエレメント間のハイブリダイゼーションによる産物を指す。 「フラグメント」、「セグメント」又は「ＤＮＡフラグメント」という用語は
、一つの染色体又は染色体の一つの領域に生じるような、より大きなＤＮＡポリ
メラーゼ又は配列のある部分を指す。 「遺伝子発現」という用語は、特異的な遺伝子から転写された特異的ｍＲＮＡ
の量又は総量を指す。 「マイクロアレイ」という用語は、高密度で、例えば紙、ナイロン又は他のタ
イプの膜、フィルター、チップ、ガラススライド、ビーズ、或いは他のすべての
適切な固体支持体上において合成又は結合又は配した異なるポリヌクレオチド又
はオリゴヌクレオチドのアレイを指す。 「アンチセンス」という用語は、特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列に対して相補的
なヌクレオチド配列を含むすべての組成物を指す。「アンチセンス鎖」という用
語は、「センス」鎖に対して相補的な核酸鎖に関して用いられる。アンチセンス
分子には、ペプチド核酸が含まれ、並びに合成又は転写を含むすべての方法によ
って作製され得る。
【００１２】
一実施態様では、ハイブリダイゼーションパターンを作製するために、ハイブ
リダイゼーション条件下で、異なるポリヌクレオチド標的及び標準ポリヌクレオ
チド標的を、標識化核酸プローブ及び別々に検出可能な標準プローブと接触させ
る。その他の実施態様では、識別可能及び標準ポリヌクレオチド標的をアレイ又
はマイクロアレイ上の同じ位置へ共に整列させる。ハイブリダイゼーションの条
件下で、このアレイ及びマイクロアレイを異なるポリヌクレオチド標的に対して
相補的な標識化核酸プローブ、並びに標準配列に対して相補的な別々に検出可能
な標準プローブを含む液体試料と接触させる。
リダイゼーション条件下で、異なるポリヌクレオチド標的及び標準ポリヌクレオ
チド標的を、標識化核酸プローブ及び別々に検出可能な標準プローブと接触させ
る。その他の実施態様では、識別可能及び標準ポリヌクレオチド標的をアレイ又
はマイクロアレイ上の同じ位置へ共に整列させる。ハイブリダイゼーションの条
件下で、このアレイ及びマイクロアレイを異なるポリヌクレオチド標的に対して
相補的な標識化核酸プローブ、並びに標準配列に対して相補的な別々に検出可能
な標準プローブを含む液体試料と接触させる。
【００１３】
標準ポリヌクレオチド及び異なるポリヌクレオチドは共有結合させ、次いでプ
ローブの試料と接触するか、或いはプローブの試料と接触させる前に個々のアレ
イエレメントとして整列させることが可能である。ヘアピンを例として、別々に
標識化した標準プローブは、一本鎖化することが可能であるか、或いはおよそ等
量モル濃度で存在するセンス及びアンチセンス鎖を有することが可能であるか、
或いは共有結合しているセンス及びアンチセンス鎖を有することが可能である。
ハイブリダイゼーション後、標準配列とハイブリダイズした標準プローブの量に
対応する蛍光測定は、各アレイ化エレメントのハイブリダイゼーションレベルを
定量化するためのコントロールシグナルとして用いられる。この情報は、遺伝子
機能の確定、疾患を遺伝的原理で理解すること、疾患の診断、並びに治療薬の活
性を開発し、モニターすることにとって有用である（Hellerら., (1997) Proc.
Natl. Sci. 94:2150-55）。 マクロアレイは、ＰＣＴ出願 ＷＯ９５／１１９９５（タイリング方法、Chee
ら., ）、Lockhart, D.J.ら., （写真平版及びオリゴヌクレオチド化学によるイ
ンサイツ合成，1996；Nat. Biotech. 14: 1675-1680）及びSchena, M.ら（マイ
クロデポジション，Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619）に従って調製し
用いられ、これらすべては、そのすべてが文献として個々で取り入れられている
。
ローブの試料と接触するか、或いはプローブの試料と接触させる前に個々のアレ
イエレメントとして整列させることが可能である。ヘアピンを例として、別々に
標識化した標準プローブは、一本鎖化することが可能であるか、或いはおよそ等
量モル濃度で存在するセンス及びアンチセンス鎖を有することが可能であるか、
或いは共有結合しているセンス及びアンチセンス鎖を有することが可能である。
ハイブリダイゼーション後、標準配列とハイブリダイズした標準プローブの量に
対応する蛍光測定は、各アレイ化エレメントのハイブリダイゼーションレベルを
定量化するためのコントロールシグナルとして用いられる。この情報は、遺伝子
機能の確定、疾患を遺伝的原理で理解すること、疾患の診断、並びに治療薬の活
性を開発し、モニターすることにとって有用である（Hellerら., (1997) Proc.
Natl. Sci. 94:2150-55）。 マクロアレイは、ＰＣＴ出願 ＷＯ９５／１１９９５（タイリング方法、Chee
ら., ）、Lockhart, D.J.ら., （写真平版及びオリゴヌクレオチド化学によるイ
ンサイツ合成，1996；Nat. Biotech. 14: 1675-1680）及びSchena, M.ら（マイ
クロデポジション，Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619）に従って調製し
用いられ、これらすべては、そのすべてが文献として個々で取り入れられている
。
【００１４】
マイクロアレイエレメントは、試料の核酸との配列特異的ハイブリダイゼーシ
ョンが可能である。このマイクロアレイエレメントは、ポリヌクレオチド又はハ
イブリッド形成アナログ又はその模倣物を含むことができ、ホスホロチオネート
、メチルイミノ、メチルホスホネート、ホスホラミダイト、グアニジンなどのよ
うな代替結合でリン酸ジエステル結合がで置換されている核酸；リボースサブユ
ニットが置換されている核酸、例えばヘキソースリン酸ジエステル；ペプチド核
酸、及び類似物がふくまれる。あるタイプのマイクロアレイでは、標的としては
、長さが７−１０ヌクレオチドのみであるオリゴヌクレオチドを用いることが好
ましい。ポリヌクレオチドマイクロアレイエレメントは、一本又は二本鎖でもよ
く、そしてｃＤＮＡから増幅したＰＣＲフラグメントであってもよい。このマイ
クロアレイは、既知の５’又は３’配列を包含するポリヌクレオチド、全長配列
を包含する連鎖ポリヌクレオチド、或いは配列の長さに沿った特定の領域から選
択された独特のオリゴヌクレオチドを含み得る。マイクロアレイに用いられるポ
リヌクレオチドは、少なくとも配列のフラグメントが知られている対象の遺伝子
群又は遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチド、或いは特定の細胞型、発生
又は疾患段階に共通の一つ以上の未同定ｃＤＮＡに対して特異的なオリゴヌクレ
オチドであり得る。 主要な方法では、標準配列はクローニングベクター、オリゴヌクレオチド、又
はポリヌクレオチド由来とすることができる。この標準配列は、好ましくは約５
−１０００ヌクレオチド長であり、より好ましくは約２０−８０ヌクレオチド長
、最も好ましくは約５０−７０ヌクレオチド長である。一側面では、標準配列は
異なるポリヌクレオチド配列と共有結合している。結合を、５’末端、３’末端
、或いはマイクロアレイエレメント内のどの連続領域ともすることができ、そし
てＰＣＲプライマーと重なり合わせることも重なり合わせないこともできる。こ
の共有結合は、クローニングプロセスの結果であってもよく、或いは異なる配列
への合成的又は酵素的な結合であってもよい。溶液中でハイブリダイゼーション
反応をおこなった場合には、各試料は、好ましくは一つの異なったポリヌクレオ
チド標的を含み、そして各試料は標準ポリヌクレオチド配列を含む。アレイ及び
マイクロアレイ上でハイブリダイゼーション反応をおこなった場合には、各エレ
メントは標準ポリヌクレオチド配列を含む。各エレメントが同じ標準配列を有す
ることができるので、マイクロアレイは共通の標準ポリヌクレオチド配列を有す
る。あるいは、各エレメントは、マイクロアレイ上のｎエレメントの総数のよう
な、異なる標準配列を有することができ、ｎ−１の異なる標準配列がある。その
他の側面では、アレイ又はマイクロアレイ上の同じ位置に、異なるポリヌクレオ
チド標的及び標準ポリヌクレオチド標的を同時に整列させることができる。異な
るポリヌクレオチド及び標準配列を、等モル濃度又は他のどんなの所定及び既知
の化学量論で同時配列することができる。
ョンが可能である。このマイクロアレイエレメントは、ポリヌクレオチド又はハ
イブリッド形成アナログ又はその模倣物を含むことができ、ホスホロチオネート
、メチルイミノ、メチルホスホネート、ホスホラミダイト、グアニジンなどのよ
うな代替結合でリン酸ジエステル結合がで置換されている核酸；リボースサブユ
ニットが置換されている核酸、例えばヘキソースリン酸ジエステル；ペプチド核
酸、及び類似物がふくまれる。あるタイプのマイクロアレイでは、標的としては
、長さが７−１０ヌクレオチドのみであるオリゴヌクレオチドを用いることが好
ましい。ポリヌクレオチドマイクロアレイエレメントは、一本又は二本鎖でもよ
く、そしてｃＤＮＡから増幅したＰＣＲフラグメントであってもよい。このマイ
クロアレイは、既知の５’又は３’配列を包含するポリヌクレオチド、全長配列
を包含する連鎖ポリヌクレオチド、或いは配列の長さに沿った特定の領域から選
択された独特のオリゴヌクレオチドを含み得る。マイクロアレイに用いられるポ
リヌクレオチドは、少なくとも配列のフラグメントが知られている対象の遺伝子
群又は遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチド、或いは特定の細胞型、発生
又は疾患段階に共通の一つ以上の未同定ｃＤＮＡに対して特異的なオリゴヌクレ
オチドであり得る。 主要な方法では、標準配列はクローニングベクター、オリゴヌクレオチド、又
はポリヌクレオチド由来とすることができる。この標準配列は、好ましくは約５
−１０００ヌクレオチド長であり、より好ましくは約２０−８０ヌクレオチド長
、最も好ましくは約５０−７０ヌクレオチド長である。一側面では、標準配列は
異なるポリヌクレオチド配列と共有結合している。結合を、５’末端、３’末端
、或いはマイクロアレイエレメント内のどの連続領域ともすることができ、そし
てＰＣＲプライマーと重なり合わせることも重なり合わせないこともできる。こ
の共有結合は、クローニングプロセスの結果であってもよく、或いは異なる配列
への合成的又は酵素的な結合であってもよい。溶液中でハイブリダイゼーション
反応をおこなった場合には、各試料は、好ましくは一つの異なったポリヌクレオ
チド標的を含み、そして各試料は標準ポリヌクレオチド配列を含む。アレイ及び
マイクロアレイ上でハイブリダイゼーション反応をおこなった場合には、各エレ
メントは標準ポリヌクレオチド配列を含む。各エレメントが同じ標準配列を有す
ることができるので、マイクロアレイは共通の標準ポリヌクレオチド配列を有す
る。あるいは、各エレメントは、マイクロアレイ上のｎエレメントの総数のよう
な、異なる標準配列を有することができ、ｎ−１の異なる標準配列がある。その
他の側面では、アレイ又はマイクロアレイ上の同じ位置に、異なるポリヌクレオ
チド標的及び標準ポリヌクレオチド標的を同時に整列させることができる。異な
るポリヌクレオチド及び標準配列を、等モル濃度又は他のどんなの所定及び既知
の化学量論で同時配列することができる。
【００１５】
ポリヌクレオチドマイクロアレイエレメントが安定に結合している基質は、プ
ラスチック、セラミックス、金属、ゲル、ガラス、ビーズなどを含む種々の材料
から加工することができる。アレイは、ポリヌクレオチドマイクロアレイエレメ
ントを実行し、次いでそれらを表層に結合させるような、どんな簡便性のある方
法によって作製してもよい。異なるアレイの立体配置の数及びそれらの作製方法
は、当業者に知られており、そして米国特許第５，４４５，９３４号（写真平版
によるインサイツ合成）、５，５３２，１２８号（エレクトリカルディストリビ
ューションデファレンシャルによる固層検出）；５，３８４，２６１号（機械的
に方向付けられる流路によるインサイツ合成）；及び５，７００，６３７号（ス
ポッティング、プリンティング又はカップリングによる合成）に開示されていて
、これら開示物のすべては参考文献としてここに取り入れられている。
ラスチック、セラミックス、金属、ゲル、ガラス、ビーズなどを含む種々の材料
から加工することができる。アレイは、ポリヌクレオチドマイクロアレイエレメ
ントを実行し、次いでそれらを表層に結合させるような、どんな簡便性のある方
法によって作製してもよい。異なるアレイの立体配置の数及びそれらの作製方法
は、当業者に知られており、そして米国特許第５，４４５，９３４号（写真平版
によるインサイツ合成）、５，５３２，１２８号（エレクトリカルディストリビ
ューションデファレンシャルによる固層検出）；５，３８４，２６１号（機械的
に方向付けられる流路によるインサイツ合成）；及び５，７００，６３７号（ス
ポッティング、プリンティング又はカップリングによる合成）に開示されていて
、これら開示物のすべては参考文献としてここに取り入れられている。
【００１６】
あるいは、独特の遺伝子の特定配列及び標準配列を含むポリヌクレオチドマイ
クロアレイエレメントは、化学カップリング法及びインクジェット応用装置を用
いて基質の表層上で合成することが可能であり、これはＰＣＴ出願ＷＯ９５／２
５１１１６（Baldeschweilerら)に記載されおり、そのすべてがここで参考文献
として取り入れられている。その他の側面では、真空系、熱、ＵＶ、機械的又は
化学的結合形成法を用いて、基質の表層へｃＤＮＡフラグメント又はオリゴヌク
レオチドを整列させ、連結させるために、ドットブロット（又はスロット）に対
する「格子付き」アレイ類似体を用いてもよい。アレイを手動又は入手可能な装
置（スロット又はドットブロット装置）、材料（すべての適した固体支持体）、
及び機械（ロボット機器を含む）を用いて作製してもよく、そして例えば、８、
２４，９６、３８４、１５３６又は６１４４オリゴヌクレオチド、或いは商業的
に入手可能な計測器の効率的な利用をもたらす２と百万の間のどんな他の倍数を
含んでもよい。
クロアレイエレメントは、化学カップリング法及びインクジェット応用装置を用
いて基質の表層上で合成することが可能であり、これはＰＣＴ出願ＷＯ９５／２
５１１１６（Baldeschweilerら)に記載されおり、そのすべてがここで参考文献
として取り入れられている。その他の側面では、真空系、熱、ＵＶ、機械的又は
化学的結合形成法を用いて、基質の表層へｃＤＮＡフラグメント又はオリゴヌク
レオチドを整列させ、連結させるために、ドットブロット（又はスロット）に対
する「格子付き」アレイ類似体を用いてもよい。アレイを手動又は入手可能な装
置（スロット又はドットブロット装置）、材料（すべての適した固体支持体）、
及び機械（ロボット機器を含む）を用いて作製してもよく、そして例えば、８、
２４，９６、３８４、１５３６又は６１４４オリゴヌクレオチド、或いは商業的
に入手可能な計測器の効率的な利用をもたらす２と百万の間のどんな他の倍数を
含んでもよい。
【００１７】
マイクロアレイを用いて試料の分析を行うために、生物学的試料からのＲＮＡ
又はＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブへ加工する。プローブ核酸は、一
般的には、ＲＮＡが全ＲＮＡ、ポリＡ＋ｍＲＮＡ、増幅ＲＮＡなどでありうる、
天然発生ソースより通常は得られるＲＮＡから逆転写されたＤＮＡである。最初
のｍＲＮＡ試料は、酵母のような単細胞生物を含む生理学的ソース、真核生物ソ
ース、又は植物及び動物、特にほ乳類及び器官、組織を含む多細胞生物、そして
あらゆる体液（例えば、血液、尿、だ液、粘液、胃液など）起源のような哺乳動
物由来の細胞、培養細胞、生検材料、又は他の組織調製物に由来するものであっ
てよい。細胞、組織、器官又は生物全体からＲＮＡを単離する方法は、当業者に
知られており、Maniatisら., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold S
pring Harbor Press)(1989)に記載されている。
又はＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブへ加工する。プローブ核酸は、一
般的には、ＲＮＡが全ＲＮＡ、ポリＡ＋ｍＲＮＡ、増幅ＲＮＡなどでありうる、
天然発生ソースより通常は得られるＲＮＡから逆転写されたＤＮＡである。最初
のｍＲＮＡ試料は、酵母のような単細胞生物を含む生理学的ソース、真核生物ソ
ース、又は植物及び動物、特にほ乳類及び器官、組織を含む多細胞生物、そして
あらゆる体液（例えば、血液、尿、だ液、粘液、胃液など）起源のような哺乳動
物由来の細胞、培養細胞、生検材料、又は他の組織調製物に由来するものであっ
てよい。細胞、組織、器官又は生物全体からＲＮＡを単離する方法は、当業者に
知られており、Maniatisら., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold S
pring Harbor Press)(1989)に記載されている。
【００１８】
ｍＲＮＡは単離され、ｃＤＮＡが作製されて、標的とのハイブリダイゼーショ
ンのためのプローブとして用いられる。このプローブを放射性同位元素、化学発
光化合物、重金属原子、分光学マーカー、磁気マーカー、関連酵素、蛍光標識な
どで標識してもよい。蛍光標識を、色素産生ヌクレオチドとして直接にプローブ
へ導入することができるし、或いは増幅の後に、色素−ストレプトアビジン複合
体を用いて、導入されたビオチン含有ヌクレオチドと結合させることができる。
非対称ＰＣＲによって作製されたＤＮＡでは、蛍光色素は直接にプライマーの５
’末端に連結している。波長が２５０ｎｍより大きな光、好ましくは約３５０ｎ
ｍより大きな波長、及び吸収波長より約１０ｎｍ高い波長の蛍光を吸収するよう
に、蛍光標識は選択される。例えば、蛍光標識は、フルオレセイン（最大吸収４
８８ｎｍ）、ジクロロ-フルオレセイン（最大吸収５２５ｎｍ）、ヘキサクロロ-
フルオレセイン（最大吸収５２９ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（商品名）（最大吸収５
３０ｎｍ）ＲＯＸ（最大吸収は５５０ｎｍ）、テトラメチルローダミン（最大吸
収は５５０ｎｍ）、ローダミンＸ（最大吸収は５７５ｎｍ）、Ｃｙ２（商品名）
（最大吸収は５０５ｎｍ）、Ｃｙ３（商品名）（最大吸収は５５０ｎｍ）、Ｃｙ
５（商品名）（最大吸収は６５０ｎｍ）、Ｃｙ７（商品名）（最大吸収は７５０
ｎｍ）、ＩＲＤ４０（最大吸収７８５ｎｍ）などであってもよく、Smithら., (1
996) Nature 321: 647-649に更に記載されている。
ンのためのプローブとして用いられる。このプローブを放射性同位元素、化学発
光化合物、重金属原子、分光学マーカー、磁気マーカー、関連酵素、蛍光標識な
どで標識してもよい。蛍光標識を、色素産生ヌクレオチドとして直接にプローブ
へ導入することができるし、或いは増幅の後に、色素−ストレプトアビジン複合
体を用いて、導入されたビオチン含有ヌクレオチドと結合させることができる。
非対称ＰＣＲによって作製されたＤＮＡでは、蛍光色素は直接にプライマーの５
’末端に連結している。波長が２５０ｎｍより大きな光、好ましくは約３５０ｎ
ｍより大きな波長、及び吸収波長より約１０ｎｍ高い波長の蛍光を吸収するよう
に、蛍光標識は選択される。例えば、蛍光標識は、フルオレセイン（最大吸収４
８８ｎｍ）、ジクロロ-フルオレセイン（最大吸収５２５ｎｍ）、ヘキサクロロ-
フルオレセイン（最大吸収５２９ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（商品名）（最大吸収５
３０ｎｍ）ＲＯＸ（最大吸収は５５０ｎｍ）、テトラメチルローダミン（最大吸
収は５５０ｎｍ）、ローダミンＸ（最大吸収は５７５ｎｍ）、Ｃｙ２（商品名）
（最大吸収は５０５ｎｍ）、Ｃｙ３（商品名）（最大吸収は５５０ｎｍ）、Ｃｙ
５（商品名）（最大吸収は６５０ｎｍ）、Ｃｙ７（商品名）（最大吸収は７５０
ｎｍ）、ＩＲＤ４０（最大吸収７８５ｎｍ）などであってもよく、Smithら., (1
996) Nature 321: 647-649に更に記載されている。
【００１９】
同じように、標準ポリヌクレオチド標的に相当するｃＤＮＡを作製し、異なっ
た標識をした。Ｆｉｇ２Ａ−Ｃに例示されているように、個別に検出可能な標準
プローブは、一本鎖、二本鎖、又はヘアピンとなることができる。二本鎖プロー
ブは、両鎖が同じ標識を有する標準配列に対して相補的であるセンス及びアンチ
センスの双方から構成される。プローブ配列がマイクロアレイの相補的なポリヌ
クレオチドとハイブリッドするのに十分な条件下で、検出可能なプローブ、並び
に標準配列に対して単独で検出可能な一本及び二本鎖相補体を、経時的又は同時
にマイクロアレイと接触させる。標準標的配列に対するセンス及びアンチセンス
相補体は、いかなる化学量論においても存在するが、一般的には、反応液中でほ
ぼ等モル濃度で存在する。更に、種々の方法を用いて、センス及びアンチセンス
配列は共有結合することができる。一つの方法では、下記の実施例４に例示して
いるように、二つの鎖はヘアピンとして連結させることができる。加えて、鎖を
ダブルヘアピンとして合成及び／又は閉鎖ダンベル構造を形成するようにライゲ
ーションすることができる（Annu. Rev. Biophys, Biomol. Struct., 25, 1-28(
1996))。他の方法には、標準的な化学的方法を用いて、センス及びアンチセンス
鎖を共有結合的にカップリングすることが含まれる。そのようなカップリングの
方法は、相補鎖へ導入された機能部と反応するように修飾されたリンカー-腕を
相補鎖へ取り込む。便宜的な部分には、一つの鎖に導入されたアルキルアミン、
並びに他の鎖に導入された活性アミド、アルデヒド、臭化アセトアミド、チオシ
アン酸塩などが含まれており、当業者にはよく知られている。他の便宜的なカッ
プリング部分には、一つの鎖にチオール、並びに二硫化物、マレイミド、及び他
の鎖に臭化アセトアミドが含まれる（例として、Bioconjugate Chemistry, 1, 1
65-187(1990)並びにそれに含まれている参考文献を参照）。このような組み合わ
せを一末端、他の末端、両末端に配するか、二つの鎖の内部を横断して配するこ
とができる。
た標識をした。Ｆｉｇ２Ａ−Ｃに例示されているように、個別に検出可能な標準
プローブは、一本鎖、二本鎖、又はヘアピンとなることができる。二本鎖プロー
ブは、両鎖が同じ標識を有する標準配列に対して相補的であるセンス及びアンチ
センスの双方から構成される。プローブ配列がマイクロアレイの相補的なポリヌ
クレオチドとハイブリッドするのに十分な条件下で、検出可能なプローブ、並び
に標準配列に対して単独で検出可能な一本及び二本鎖相補体を、経時的又は同時
にマイクロアレイと接触させる。標準標的配列に対するセンス及びアンチセンス
相補体は、いかなる化学量論においても存在するが、一般的には、反応液中でほ
ぼ等モル濃度で存在する。更に、種々の方法を用いて、センス及びアンチセンス
配列は共有結合することができる。一つの方法では、下記の実施例４に例示して
いるように、二つの鎖はヘアピンとして連結させることができる。加えて、鎖を
ダブルヘアピンとして合成及び／又は閉鎖ダンベル構造を形成するようにライゲ
ーションすることができる（Annu. Rev. Biophys, Biomol. Struct., 25, 1-28(
1996))。他の方法には、標準的な化学的方法を用いて、センス及びアンチセンス
鎖を共有結合的にカップリングすることが含まれる。そのようなカップリングの
方法は、相補鎖へ導入された機能部と反応するように修飾されたリンカー-腕を
相補鎖へ取り込む。便宜的な部分には、一つの鎖に導入されたアルキルアミン、
並びに他の鎖に導入された活性アミド、アルデヒド、臭化アセトアミド、チオシ
アン酸塩などが含まれており、当業者にはよく知られている。他の便宜的なカッ
プリング部分には、一つの鎖にチオール、並びに二硫化物、マレイミド、及び他
の鎖に臭化アセトアミドが含まれる（例として、Bioconjugate Chemistry, 1, 1
65-187(1990)並びにそれに含まれている参考文献を参照）。このような組み合わ
せを一末端、他の末端、両末端に配するか、二つの鎖の内部を横断して配するこ
とができる。
【００２０】
この標的及びプローブは、以下の段階を含んでなるポリヌクレオチドプローブ
を固定化する方法に用いられる：プローブ及び標的の一つが相補鎖を含んでなる
二本鎖であり、そして他のプローブ及び標的が相補鎖の一つと相補性を有する一
本鎖で、プローブと標的がハイブリダイズすることでプローブが固定化される条
件下で、プローブを固体支持体の表層に安定して結合しているポリヌクレオチド
と結合させる段階である。 他の実施態様では、この方法には、プローブと標的が相補鎖を含んでなる二本
鎖であって相補性を有し、プローブと標的がハイブリダイズすることでプローブ
が固定化される条件下で、プローブを固体支持体の表層に安定して結合している
ポリヌクレオチド標的と結合させる段階が含まれる。
を固定化する方法に用いられる：プローブ及び標的の一つが相補鎖を含んでなる
二本鎖であり、そして他のプローブ及び標的が相補鎖の一つと相補性を有する一
本鎖で、プローブと標的がハイブリダイズすることでプローブが固定化される条
件下で、プローブを固体支持体の表層に安定して結合しているポリヌクレオチド
と結合させる段階である。 他の実施態様では、この方法には、プローブと標的が相補鎖を含んでなる二本
鎖であって相補性を有し、プローブと標的がハイブリダイズすることでプローブ
が固定化される条件下で、プローブを固体支持体の表層に安定して結合している
ポリヌクレオチド標的と結合させる段階が含まれる。
【００２１】
特別な実施態様では、この方法は、固体支持体から固定化プローブを単離し遊
離する段階を更に含む。他の特別な実施態様では、この方法は、固定化プローブ
を増幅する段階を更に含む。他の特別な実施態様では、この方法は、固定化プロ
ーブを増幅し、次いでその結果として生じた増幅プローブを検出する段階を更に
含む。より特別な実施態様では、この方法は、特にプローブが二本鎖で標的が一
本鎖の場合に、標識され、増幅された二本鎖プローブを作製するためにプローブ
を遊離して増幅すること、標識化プローブを固定化するために、標識化プローブ
を標的ポリヌクレオチドへハイブリダイズすること、並びに標識化プローブを検
出することの段階を更に含む。 適切なハイブリダイゼーションの条件は、当業者によく知られており、Maniat
isら.,（上掲）のＷＯ ９５／２１９４４に概説されている。インキュベーショ
ンの条件は、正確な相補性の適合によって、或いは様々な程度の低い相補性によ
ってハイブリダイゼーションが起こるように調節されている。ハイブリダイズし
なかったプローブを除いた後、蛍光のレベル及びパターンの測定のための検出又
は視覚化のためにスキャナーを用いる。すべての異なる配列についてのハイブリ
ダイゼーションの有無、及び量を同時に測定するために、検出システムを用いて
もよい。
離する段階を更に含む。他の特別な実施態様では、この方法は、固定化プローブ
を増幅する段階を更に含む。他の特別な実施態様では、この方法は、固定化プロ
ーブを増幅し、次いでその結果として生じた増幅プローブを検出する段階を更に
含む。より特別な実施態様では、この方法は、特にプローブが二本鎖で標的が一
本鎖の場合に、標識され、増幅された二本鎖プローブを作製するためにプローブ
を遊離して増幅すること、標識化プローブを固定化するために、標識化プローブ
を標的ポリヌクレオチドへハイブリダイズすること、並びに標識化プローブを検
出することの段階を更に含む。 適切なハイブリダイゼーションの条件は、当業者によく知られており、Maniat
isら.,（上掲）のＷＯ ９５／２１９４４に概説されている。インキュベーショ
ンの条件は、正確な相補性の適合によって、或いは様々な程度の低い相補性によ
ってハイブリダイゼーションが起こるように調節されている。ハイブリダイズし
なかったプローブを除いた後、蛍光のレベル及びパターンの測定のための検出又
は視覚化のためにスキャナーを用いる。すべての異なる配列についてのハイブリ
ダイゼーションの有無、及び量を同時に測定するために、検出システムを用いて
もよい。
【００２２】
ハイブリダイゼーションパターンの検出又は視覚化においては、核酸プローブ
上の標識の輝度又はシグナル値、並びに標準配列プローブからの異なった標識の
輝度又はシグナル値が得られる。標準配列に相当する輝度又はシグナル値は、実
験におけるハイブリダイゼーションの総量値又は単位値を表し、コントロールと
しての機能を果たす。マイクロアレイの各エレメントのシグナルを測定し、単位
値と比較する。従って、本発明のこの方法は、ハイブリダイゼーションの結果を
特徴付けるのに二色（チャンネル）を用いる。標準標的の色はエレメントに特異
的なコントロールとなり、それに対してプローブの色をキャリブレーション又は
数値的に調整することができる。従って、本発明は、マイクロアレイの各エレメ
ントに関する定量的情報を提供する。本発明のその他の利点としては、プローブ
配列と標準配列のハイブリダイゼーションは競合的ではなく、それ故に結果に存
在するノイズが減少することである。
上の標識の輝度又はシグナル値、並びに標準配列プローブからの異なった標識の
輝度又はシグナル値が得られる。標準配列に相当する輝度又はシグナル値は、実
験におけるハイブリダイゼーションの総量値又は単位値を表し、コントロールと
しての機能を果たす。マイクロアレイの各エレメントのシグナルを測定し、単位
値と比較する。従って、本発明のこの方法は、ハイブリダイゼーションの結果を
特徴付けるのに二色（チャンネル）を用いる。標準標的の色はエレメントに特異
的なコントロールとなり、それに対してプローブの色をキャリブレーション又は
数値的に調整することができる。従って、本発明は、マイクロアレイの各エレメ
ントに関する定量的情報を提供する。本発明のその他の利点としては、プローブ
配列と標準配列のハイブリダイゼーションは競合的ではなく、それ故に結果に存
在するノイズが減少することである。
【００２３】
ハイブリダイゼーションパターンは、試料中の核酸の遺伝的性質に関する定量
的情報を測定することに用いることができ、この試料は、ハイブリダイゼーショ
ンパターンを作製するために、標識化試料核酸が得られた生理学的ソースだけで
なくアレイと接触させたものである。このデータは、試料核酸が得られた生理学
的ソースに関する情報、例えば、各遺伝子の発現レベルだけでなく生理学的ソー
スである組織又は細胞で発現する遺伝子のタイプなどについて特に定量的表現で
示す。 現在の方法は、パターン間の違いを同定して定量化するために、二つ以上の生
理学的ソースからの核酸試料を比較し、それによって比較された生理学的ソース
の特定遺伝子の差次的発現に関するデータを示す。従って、本発明の方法には、
疾患及び正常組織の分析、異なる組織又はサブ組織の分析などに関する差次的遺
伝子発現アッセイにおける利用が見出される。従って、このデータを、試料中の
配列、変異、変異体、又は多型に関する大規模な相関研究に用いてもよい。
的情報を測定することに用いることができ、この試料は、ハイブリダイゼーショ
ンパターンを作製するために、標識化試料核酸が得られた生理学的ソースだけで
なくアレイと接触させたものである。このデータは、試料核酸が得られた生理学
的ソースに関する情報、例えば、各遺伝子の発現レベルだけでなく生理学的ソー
スである組織又は細胞で発現する遺伝子のタイプなどについて特に定量的表現で
示す。 現在の方法は、パターン間の違いを同定して定量化するために、二つ以上の生
理学的ソースからの核酸試料を比較し、それによって比較された生理学的ソース
の特定遺伝子の差次的発現に関するデータを示す。従って、本発明の方法には、
疾患及び正常組織の分析、異なる組織又はサブ組織の分析などに関する差次的遺
伝子発現アッセイにおける利用が見出される。従って、このデータを、試料中の
配列、変異、変異体、又は多型に関する大規模な相関研究に用いてもよい。
【００２４】
代替的な実施態様では、制御された化学量論で異なるポリヌクレオチドを含む
試料へ標準ポリヌクレオチド配列は潜り込む。標準配列及び異なるポリヌクレオ
チドは、従って共有結合しない。好ましくはマイクロアレイエレメントの配列と
は異なる配列を有する標準配列は既知量で存在し、従って後の分析で較正剤とし
て用いることができる。この方法では、マイクロアレイの組み立てに用いられる
ポリヌクレオチドを含む試料は、標準配列が加えられる。標準配列は、ノーマラ
イゼイションコントロールとして機能する。遺伝子及び標準配列からのポリヌク
レオチドを含む試料は、次いでマイクロアレイ上に配され、標識化試料及び別々
に標識された標準プローブとハイブリダイズされ、そして上記にて記述のように
してハイブリダイゼーションパターンを分析した。 また、提供されているのは、本発明を実行するためのキットであり、そのよう
なキットには、エレメントが異なるポリヌクレオチド配列及び標準ポリヌクレオ
チド配列を含む一つ以上の組み立てられたマイクロアレイ、標準配列に対する標
識化された標準相補体、並びに対象方法を実行するための指示書を含む。このキ
ットは、対象発明の遺伝子発現を行うのに必要な一つ以上の付加的成分をも含ん
でもよく、そのような付加的成分には酵素、例えばポリメラーゼ、逆転写酵素、
エンドヌクレアーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液等が含まれる。
試料へ標準ポリヌクレオチド配列は潜り込む。標準配列及び異なるポリヌクレオ
チドは、従って共有結合しない。好ましくはマイクロアレイエレメントの配列と
は異なる配列を有する標準配列は既知量で存在し、従って後の分析で較正剤とし
て用いることができる。この方法では、マイクロアレイの組み立てに用いられる
ポリヌクレオチドを含む試料は、標準配列が加えられる。標準配列は、ノーマラ
イゼイションコントロールとして機能する。遺伝子及び標準配列からのポリヌク
レオチドを含む試料は、次いでマイクロアレイ上に配され、標識化試料及び別々
に標識された標準プローブとハイブリダイズされ、そして上記にて記述のように
してハイブリダイゼーションパターンを分析した。 また、提供されているのは、本発明を実行するためのキットであり、そのよう
なキットには、エレメントが異なるポリヌクレオチド配列及び標準ポリヌクレオ
チド配列を含む一つ以上の組み立てられたマイクロアレイ、標準配列に対する標
識化された標準相補体、並びに対象方法を実行するための指示書を含む。このキ
ットは、対象発明の遺伝子発現を行うのに必要な一つ以上の付加的成分をも含ん
でもよく、そのような付加的成分には酵素、例えばポリメラーゼ、逆転写酵素、
エンドヌクレアーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液等が含まれる。
【００２５】
（実施例）
下記の実施例は、本発明の作製と利用方法に関する完全なる開示及び説明を当
業者へ提供するために提案されており、本発明に関して発明者が考慮する範囲を
限定することを意図しているものではなく、また、下記の実験が全て、或いは唯
一の実行された実験であることを示すことを意図しているものではない。用いら
れている数字（例えば、量、温度など）に関する正確さを確かなものにする努力
が成されているが、幾つかの実験的誤り及び逸脱は釈明されるべきである。特に
示さない限り、部分は重量で、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度、
そして圧力は大気圧又はその付近である。 特に示さない限り、Brownら.,に対する米国特許第５，８０７，５２２号に従
って作製されたｃＤＮＡマイクロアレイは、インサイト ゲノミックス，インク
．によって提供された。これらの基材は、ポリカチオン性の表層を、例えばポリ
リジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミンなどを供給する。オリゴヌクレオ
チドは、Operon Technologiesによって合成及び精製され、更なる精製をせずに
用いられた。
業者へ提供するために提案されており、本発明に関して発明者が考慮する範囲を
限定することを意図しているものではなく、また、下記の実験が全て、或いは唯
一の実行された実験であることを示すことを意図しているものではない。用いら
れている数字（例えば、量、温度など）に関する正確さを確かなものにする努力
が成されているが、幾つかの実験的誤り及び逸脱は釈明されるべきである。特に
示さない限り、部分は重量で、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度、
そして圧力は大気圧又はその付近である。 特に示さない限り、Brownら.,に対する米国特許第５，８０７，５２２号に従
って作製されたｃＤＮＡマイクロアレイは、インサイト ゲノミックス，インク
．によって提供された。これらの基材は、ポリカチオン性の表層を、例えばポリ
リジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミンなどを供給する。オリゴヌクレオ
チドは、Operon Technologiesによって合成及び精製され、更なる精製をせずに
用いられた。
【００２６】
実施例１
整列済みのｃＤＮＡのベクター部分に対して相補性を有する配列番号：１の５
９merオリゴヌクレオチドを合成し、５’Ｃｙ３蛍光色素で標識した。 5’TTCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCT GTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCA 3’（配列番号：１） 配列番号：１の標識化オリゴヌクレオチドを、ｃＤＮＡマイクロアレイへハイ
ブリダイズした。ハイブリダイゼーションチャンバーには、約１０ｎｇ／ｕＬの
濃度のおよそ２５ｕＬの標識化オリゴヌクレオチド、並びにＣｙ５蛍光色素で標
識されたｍＲＮＡ複合体が含まれていた。６０℃でのハイブリダイゼーション反
応の後、マイクロアレイを二度洗浄した。最初の洗浄液は０．１Ｘ ＳＳＣ及び
０．２％ＳＤＳで構成され、二番目の洗浄液は１Ｘ ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ
で構成されていた。マイクロアレイを、この各洗浄液によって４５℃で１０分間
に渡って洗浄し、ハイブリダイゼーションパターンを検出するために蛍光灯へ曝
露した。非特異的ハイブリダイゼーションは観察されなかった。配列番号：１に
相当するＣｙ３シグナルは、ｍＲＮＡのマイクロアレイ上にある対応する配列へ
のハイブリダイゼーションを定量化するために用いられた。
９merオリゴヌクレオチドを合成し、５’Ｃｙ３蛍光色素で標識した。 5’TTCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCT GTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCA 3’（配列番号：１） 配列番号：１の標識化オリゴヌクレオチドを、ｃＤＮＡマイクロアレイへハイ
ブリダイズした。ハイブリダイゼーションチャンバーには、約１０ｎｇ／ｕＬの
濃度のおよそ２５ｕＬの標識化オリゴヌクレオチド、並びにＣｙ５蛍光色素で標
識されたｍＲＮＡ複合体が含まれていた。６０℃でのハイブリダイゼーション反
応の後、マイクロアレイを二度洗浄した。最初の洗浄液は０．１Ｘ ＳＳＣ及び
０．２％ＳＤＳで構成され、二番目の洗浄液は１Ｘ ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ
で構成されていた。マイクロアレイを、この各洗浄液によって４５℃で１０分間
に渡って洗浄し、ハイブリダイゼーションパターンを検出するために蛍光灯へ曝
露した。非特異的ハイブリダイゼーションは観察されなかった。配列番号：１に
相当するＣｙ３シグナルは、ｍＲＮＡのマイクロアレイ上にある対応する配列へ
のハイブリダイゼーションを定量化するために用いられた。
【００２７】
実施例２
配列番号：１に代わって配列番号：２を用いたことを除いては、実施例１に記
載の方法を繰り返した。 5’TGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACA GCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGAA3’（配列番号：２） 配列番号：２は、配列番号：１の逆相補体であった。実施例１に記載したのと
類似の結果が得られた。
載の方法を繰り返した。 5’TGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACA GCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGAA3’（配列番号：２） 配列番号：２は、配列番号：１の逆相補体であった。実施例１に記載したのと
類似の結果が得られた。
【００２８】
実施例３
全量がおよそ２５ｕＬ中の約１０ｎｇ／ｕＬの標識された配列番号：１、並び
に約１０ｎｇ／ｕＬの標識された配列番号：２をハイブリダイゼーションチャン
バーへ共に配したことを除いては、実施例１に記載した方法を繰り返した。非特
異的ハイブリダイゼーションは観察されなかった。この実験では、同じ試料に対
するハイブリダイゼーションのために四つの異なるＧＥＭアレイを用い、ハイブ
リダイゼーションの結果を分析した。表１は、１５％ｃｖより低かったエレメン
ト群のパーセンテージを示している。
に約１０ｎｇ／ｕＬの標識された配列番号：２をハイブリダイゼーションチャン
バーへ共に配したことを除いては、実施例１に記載した方法を繰り返した。非特
異的ハイブリダイゼーションは観察されなかった。この実験では、同じ試料に対
するハイブリダイゼーションのために四つの異なるＧＥＭアレイを用い、ハイブ
リダイゼーションの結果を分析した。表１は、１５％ｃｖより低かったエレメン
ト群のパーセンテージを示している。
【００２９】
この結果は、センス及びアンチセンス鎖の１：１の混合が、実施例１及び２で
観察されたシグナルのノイズに対する割合を約２から３倍以上改善したことを示
している。
観察されたシグナルのノイズに対する割合を約２から３倍以上改善したことを示
している。
【００３０】
実施例４
ヘアピンがベクター配列とバイブリダイズする能力を試験するために、濃度が
約１６ｎｇ／ｕＬのおよそ２５ｕＬの標識された配列番号：３をハイブリダイゼ
ーションチャンバーへ配し、複合Ｃｙ５標識化ｍＲＮＡプローブ試料が除かれた
ことを除いて、実施例１に記載した方法が繰り返された。 5’GTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCATTT TTTGAGCGGA TAACAAT
TTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTAC 3’ （配列番号：３） 配列番号：３のヘアピン構造は、配列番号：１の最初の４７塩基で構成され、
配列番号：２の最後の４７塩基は五つのチミン塩基によって連結されてヘアピン
のループを形成した。実施例１に記載されているように、ハイブリダイゼーショ
ンの結果を分析した。非特異的ハイブリダイゼーションは見出されず、ヘアピン
構造は特異的なハイブリダイゼーション強度及び形態を有し、これらは上記の実
施例１から３の配列番号：１及び２について観察されたものに類似した。
約１６ｎｇ／ｕＬのおよそ２５ｕＬの標識された配列番号：３をハイブリダイゼ
ーションチャンバーへ配し、複合Ｃｙ５標識化ｍＲＮＡプローブ試料が除かれた
ことを除いて、実施例１に記載した方法が繰り返された。 5’GTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCATTT TTTGAGCGGA TAACAAT
TTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTAC 3’ （配列番号：３） 配列番号：３のヘアピン構造は、配列番号：１の最初の４７塩基で構成され、
配列番号：２の最後の４７塩基は五つのチミン塩基によって連結されてヘアピン
のループを形成した。実施例１に記載されているように、ハイブリダイゼーショ
ンの結果を分析した。非特異的ハイブリダイゼーションは見出されず、ヘアピン
構造は特異的なハイブリダイゼーション強度及び形態を有し、これらは上記の実
施例１から３の配列番号：１及び２について観察されたものに類似した。
【００３１】
実施例５
へアピンをノーマライゼイションへ用いるために、Ｃｙ５蛍光色素で標識した
複合ｍＲＮＡとともに、およそ２５ｕＬの標識された配列番号：３を約１６ｎｇ
／ｕＬの濃度でハイブリダイゼーションチャンバーに配することを除いて、実施
例１に記載の方法を繰り返した。実施例１に記載されているように、ハイブリダ
イゼーションの結果を分析した。非特異的ハイブリダイゼーションは見出されず
、シグナルのノイズに対する割合は実施例３で測定したものと類似した。マイク
ロアレイへのヘアピン構造のハイブリダイゼーションに対応するシグナルを、プ
ローブからのシグナルを定量化するために用いた。
複合ｍＲＮＡとともに、およそ２５ｕＬの標識された配列番号：３を約１６ｎｇ
／ｕＬの濃度でハイブリダイゼーションチャンバーに配することを除いて、実施
例１に記載の方法を繰り返した。実施例１に記載されているように、ハイブリダ
イゼーションの結果を分析した。非特異的ハイブリダイゼーションは見出されず
、シグナルのノイズに対する割合は実施例３で測定したものと類似した。マイク
ロアレイへのヘアピン構造のハイブリダイゼーションに対応するシグナルを、プ
ローブからのシグナルを定量化するために用いた。
【００３２】
実施例６
ヘアピンがポリヌクレオチドエレメントとバイブリダイズする能力を試験する
ために、化学的合成した３０mersから成るアレイエレメントで実施例４に記載の
方法を繰り返した。ポリヌクレオチドアレイを次のようにして作製した： ５’アミノ-リンク３０mersをOperon Technologies（Alameda, CA）によって
合成する。これらの配列は、Ｆｉｇ３に例示されているように、ヘアピンの各腕
の４７-mer配列をタイルを張るように横断するよう設計された。これらのポリヌ
クレオチドは、３ｘＳＳＣ中にて２５μＭでＰ-ガラススライド（ポリエチレン
イミンで共有結合的にコーティングし、共有結合のためにサイウラン酸塩化物（
cyuranic acid chloride）で活性化したアレイガラスの表面）に整列させた。Po
lymer Coated Surfaces for Microarray Applicationと題された同時係属中の出
願である出願番号０９／５３２，４１９を参照。アレイは、次の連続した溶液に
浸すことによって後工程を施された：２分間に渡って室温で０．２％ＳＤＳ、室
温でｄＨ２Ｏによる３回の１分間洗浄、２０分に渡って６０℃で０．２５％カゼ
インの１ｘＰＢＳ、５分間に渡る室温で０．２％ＳＤＳ、室温でｄＨ２Ｏによる
２回の２分間洗浄、２分間に渡って沸騰（９５℃−１００℃）中のｄＨ２Ｏ。Ｃ
ｙ３で標識したヘアピンの１０ｎｇ／μｌを５時間に渡って６０℃で０．２％Ｓ
ＤＳ、５ｘＳＳＣでハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションアレイを４５
℃で１０分間に渡って０．１％ＳＤＳ、１ｍＭＤＴＴ、１ｘＳＳＣによって最初
に洗浄した後、０．１ｘ、０．２％ＳＤＳ、１ｍＭ ＤＴＴで２５℃、３分間に
渡って洗浄した。このアレイを、１０ミクロン解像度のGenePix（商品名）スキ
ャナー（Foster City, CA）でイメージした。シグナルは１６-ｂｐｐの解像度に
変換され、５００ｍＶのＰＭＴ設定で６５，３５６カウントダイナミックレンジ
を生じた。インサイトＧＥＭＴｏｏｌ（商品名）ソフトウエア（インサイト ゲ
ノミックス，インク，Palo Alto, CA）は、イメージ分析に用いられた。ヘアピ
ンの異なるエレメントで得られたハイブリダイゼーションシグナルは、Ｆｉｇ４
に示されている。シグナルは、局所的バックグラウンドについて修正した。
ために、化学的合成した３０mersから成るアレイエレメントで実施例４に記載の
方法を繰り返した。ポリヌクレオチドアレイを次のようにして作製した： ５’アミノ-リンク３０mersをOperon Technologies（Alameda, CA）によって
合成する。これらの配列は、Ｆｉｇ３に例示されているように、ヘアピンの各腕
の４７-mer配列をタイルを張るように横断するよう設計された。これらのポリヌ
クレオチドは、３ｘＳＳＣ中にて２５μＭでＰ-ガラススライド（ポリエチレン
イミンで共有結合的にコーティングし、共有結合のためにサイウラン酸塩化物（
cyuranic acid chloride）で活性化したアレイガラスの表面）に整列させた。Po
lymer Coated Surfaces for Microarray Applicationと題された同時係属中の出
願である出願番号０９／５３２，４１９を参照。アレイは、次の連続した溶液に
浸すことによって後工程を施された：２分間に渡って室温で０．２％ＳＤＳ、室
温でｄＨ２Ｏによる３回の１分間洗浄、２０分に渡って６０℃で０．２５％カゼ
インの１ｘＰＢＳ、５分間に渡る室温で０．２％ＳＤＳ、室温でｄＨ２Ｏによる
２回の２分間洗浄、２分間に渡って沸騰（９５℃−１００℃）中のｄＨ２Ｏ。Ｃ
ｙ３で標識したヘアピンの１０ｎｇ／μｌを５時間に渡って６０℃で０．２％Ｓ
ＤＳ、５ｘＳＳＣでハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションアレイを４５
℃で１０分間に渡って０．１％ＳＤＳ、１ｍＭＤＴＴ、１ｘＳＳＣによって最初
に洗浄した後、０．１ｘ、０．２％ＳＤＳ、１ｍＭ ＤＴＴで２５℃、３分間に
渡って洗浄した。このアレイを、１０ミクロン解像度のGenePix（商品名）スキ
ャナー（Foster City, CA）でイメージした。シグナルは１６-ｂｐｐの解像度に
変換され、５００ｍＶのＰＭＴ設定で６５，３５６カウントダイナミックレンジ
を生じた。インサイトＧＥＭＴｏｏｌ（商品名）ソフトウエア（インサイト ゲ
ノミックス，インク，Palo Alto, CA）は、イメージ分析に用いられた。ヘアピ
ンの異なるエレメントで得られたハイブリダイゼーションシグナルは、Ｆｉｇ４
に示されている。シグナルは、局所的バックグラウンドについて修正した。
【００３３】
ヘアピンの３’腕に対して相補的なエレメントは、不完全にハイブリダイズし
たが（ポリヌクレオチド１−４）、ヘアピンの５’腕に対して相補的なすべての
エレメントは（ポリヌクレオチド５−８）、中程度から非常に良い程度でハイブ
リダイズした。このことは、ヘアピン鎖の相補性のために、配列で、ヘアピンプ
ローブの３’末端に対応する一本鎖エレメントは、会合を強く好むことを示して
いる。
たが（ポリヌクレオチド１−４）、ヘアピンの５’腕に対して相補的なすべての
エレメントは（ポリヌクレオチド５−８）、中程度から非常に良い程度でハイブ
リダイズした。このことは、ヘアピン鎖の相補性のために、配列で、ヘアピンプ
ローブの３’末端に対応する一本鎖エレメントは、会合を強く好むことを示して
いる。
【００３４】
実施例７
反転したヘアピンの特異性を試験するために、逆方向ヘアピンを合成し、実施
例６に記載のようにハイブリダイズした。このヘアピンは、その腕が逆方向にな
っているという点で、Ｆｉｇ１に示したヘアピンの変形である（Ｆｉｇ５を参照
）。オリゴ１−４はここでは５’鎖であるが、なお下側に図示した鎖とハイブリ
ダイズする。オリゴ５−８は、現在の３’鎖へハイブリダイズする。この反転し
たヘアピンを、実施例６に記載したように、ポリヌクレオチドアレイ上にハイブ
リダイズした。 反転ヘアピンとのハイブリダイゼーションは、Ｆｉｇ６に示し実施例６に表し
たものと比較し、反対鎖に対して相補的なエレメントとの会合を好む。これらの
エレメントは、同様に（実施例６と比較して）、配列で、ヘアピンプローブの３
’末端に対応する。
例６に記載のようにハイブリダイズした。このヘアピンは、その腕が逆方向にな
っているという点で、Ｆｉｇ１に示したヘアピンの変形である（Ｆｉｇ５を参照
）。オリゴ１−４はここでは５’鎖であるが、なお下側に図示した鎖とハイブリ
ダイズする。オリゴ５−８は、現在の３’鎖へハイブリダイズする。この反転し
たヘアピンを、実施例６に記載したように、ポリヌクレオチドアレイ上にハイブ
リダイズした。 反転ヘアピンとのハイブリダイゼーションは、Ｆｉｇ６に示し実施例６に表し
たものと比較し、反対鎖に対して相補的なエレメントとの会合を好む。これらの
エレメントは、同様に（実施例６と比較して）、配列で、ヘアピンプローブの３
’末端に対応する。
【００３５】
実施例８
長いＤＮＡ二重鎖（５００−２．５ｋｂ）の一本鎖ポリヌクレオチドアレイエ
レメントと会合する能力を試験するために、改良した標準ニックトランスレーシ
ョンキット（Promega Corporation, Madison WI）を用いて長い二重鎖プローブ
を標識した。共通のベクター配列を含むＰＣＲ産物の六つの９６ウェルプレート
は１００ｎｇ／μｌの濃度でプールされ、ニックトランスレーションした。アレ
イエレメント：３０mer、４７mer、及び５９mer配列だけでなくアレイエレメン
トの相補体が、ＰＣＲ産物上にある共通ベクター配列に一致する。５９mer及び
４７merが３’終端より２２塩基で開始し、３０merは３’末端より２６から３７
塩基の間である（Ｆｉｇ７参照）。ＰＣＲ産物は、７５０ｂｐから２．５ｋｂの
長さである。 ニックトランスレーションプロトコールについて、二つの改良を以下のように
しておこなった。ｄＵＴＰの５０％をＣｙ-３標識化ｄＵＴＰで置換し、反応は
１時間のみおこなった。次いで、ＰＣＲプローブをエタノール沈殿によって精製
した。これらの改良によって、Ｃｙ３で標識された保存状態の良い二本鎖ＤＮＡ
が作製された。 ４７mer及び５９mer配列もそれらの相補体とともに含めたことを除いて、実施
例６に記載のようにアレイを調整した。ハイブリダイゼーションは、２．５ｎｇ
／μｌのＰＣＲ二重鎖プローブを用いて、６０℃で６時間に渡って５ｘＳＳＣ／
０．２％ＳＤＳ／１ｍＭ ＤＤＴの溶液中でおこなった。ハイブリダイゼーショ
ン緩衝液に懸濁した２０-ｕｌプローブ（５０ｎｇ）をハイブリダイゼーション
へ負荷した。このプローブをアレイへ塗布し、２２-ｍｍ２-ガラスカバースリッ
プで覆い、蒸発を防ぐために密閉されたチャンバーに置き、そして６０℃でイン
キュベーションした。ハイブリダイゼーションの後、アレイを４５℃で１０分間
に渡って１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ／ＤＴＴで、次いで２５℃で５分間に渡っ
て０．１ｘＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ／ＤＴＴで洗浄した。ｄｓＰＣＲプローブは
、相補性配列よりも５９mer、４７mer及び３０merへ優先的にハイブリダイズし
た。この結果は、表IIに列挙されている。二重鎖プローブの３’末端に対応する
一本鎖エレメントは、結合への強い傾向を示す。
レメントと会合する能力を試験するために、改良した標準ニックトランスレーシ
ョンキット（Promega Corporation, Madison WI）を用いて長い二重鎖プローブ
を標識した。共通のベクター配列を含むＰＣＲ産物の六つの９６ウェルプレート
は１００ｎｇ／μｌの濃度でプールされ、ニックトランスレーションした。アレ
イエレメント：３０mer、４７mer、及び５９mer配列だけでなくアレイエレメン
トの相補体が、ＰＣＲ産物上にある共通ベクター配列に一致する。５９mer及び
４７merが３’終端より２２塩基で開始し、３０merは３’末端より２６から３７
塩基の間である（Ｆｉｇ７参照）。ＰＣＲ産物は、７５０ｂｐから２．５ｋｂの
長さである。 ニックトランスレーションプロトコールについて、二つの改良を以下のように
しておこなった。ｄＵＴＰの５０％をＣｙ-３標識化ｄＵＴＰで置換し、反応は
１時間のみおこなった。次いで、ＰＣＲプローブをエタノール沈殿によって精製
した。これらの改良によって、Ｃｙ３で標識された保存状態の良い二本鎖ＤＮＡ
が作製された。 ４７mer及び５９mer配列もそれらの相補体とともに含めたことを除いて、実施
例６に記載のようにアレイを調整した。ハイブリダイゼーションは、２．５ｎｇ
／μｌのＰＣＲ二重鎖プローブを用いて、６０℃で６時間に渡って５ｘＳＳＣ／
０．２％ＳＤＳ／１ｍＭ ＤＤＴの溶液中でおこなった。ハイブリダイゼーショ
ン緩衝液に懸濁した２０-ｕｌプローブ（５０ｎｇ）をハイブリダイゼーション
へ負荷した。このプローブをアレイへ塗布し、２２-ｍｍ２-ガラスカバースリッ
プで覆い、蒸発を防ぐために密閉されたチャンバーに置き、そして６０℃でイン
キュベーションした。ハイブリダイゼーションの後、アレイを４５℃で１０分間
に渡って１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ／ＤＴＴで、次いで２５℃で５分間に渡っ
て０．１ｘＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ／ＤＴＴで洗浄した。ｄｓＰＣＲプローブは
、相補性配列よりも５９mer、４７mer及び３０merへ優先的にハイブリダイズし
た。この結果は、表IIに列挙されている。二重鎖プローブの３’末端に対応する
一本鎖エレメントは、結合への強い傾向を示す。
【００３６】
表ＩＩ
エレメント シグナル強度 鎖の優先比
59mer/59mer相補体 23017/1327 17
47mer/47mer相補体 17651/1097 16
30mer/30mer相補体 2550/373 6.8
【００３７】
実施例９
一本鎖プローブが二重鎖ＰＣＲエレメントとハイブリダイズする能力を測定す
るために、一本鎖プローブ５９mer及びその相補体を合成し、５’末端に標識し
た（Operon Technology, Alameda CA）。２０μｌの５ｘＳＳＣ／０．２％ＳＤ
Ｓ／１ｍＭ ＤＤＴ中の１０ｎｇのプローブをハイブリダイゼーションに用いた
。５９mer-Ｃｙ３ハイブリダイゼーションからのシグナルの平均は５６７２であ
り、その標識化相補体からの対応するシグナルは９３であった。表IIIに示され
ているように、鎖の優先比は約６１である。この実施例では、標的二重鎖エレメ
ントの３’配列に対応するプローブは、会合への強い傾向を示す。比較のために
、ＰＣＲ二重鎖を変性し、１００ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３中で整列させた。変性鎖の
結果として得られた割合は約２．６で、このことは、鎖が殆ど変性された場合に
は、それらが対応する相補的な配列とさらに同等にハイブリダイズすることを示
している。
るために、一本鎖プローブ５９mer及びその相補体を合成し、５’末端に標識し
た（Operon Technology, Alameda CA）。２０μｌの５ｘＳＳＣ／０．２％ＳＤ
Ｓ／１ｍＭ ＤＤＴ中の１０ｎｇのプローブをハイブリダイゼーションに用いた
。５９mer-Ｃｙ３ハイブリダイゼーションからのシグナルの平均は５６７２であ
り、その標識化相補体からの対応するシグナルは９３であった。表IIIに示され
ているように、鎖の優先比は約６１である。この実施例では、標的二重鎖エレメ
ントの３’配列に対応するプローブは、会合への強い傾向を示す。比較のために
、ＰＣＲ二重鎖を変性し、１００ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３中で整列させた。変性鎖の
結果として得られた割合は約２．６で、このことは、鎖が殆ど変性された場合に
は、それらが対応する相補的な配列とさらに同等にハイブリダイズすることを示
している。
【００３８】
表ＩＩＩ
アレイ条件 59merーCy3 59-Cy3相補体 鎖の優先比
二重鎖PCR(2xSSC) 5672 93 61
二重鎖PCR(100mM 10614 4062 2.6
Na2CO3)
【００３９】
実施例１０
金属イオンが固体表面で一本鎖構造と二重鎖構造の会合を増加させる能力を測
定するために、低濃度の金属イオンの存在下でハイブリダイゼーション反応を実
行した。１．５ｍＭの濃度でＺｎ＋＋又はＮｉ＋＋を添加したということを除い
て、上記の実施例８に記載したように、二重鎖標識化ＰＣＲプローブを２．５ｎ
ｇ／μｌでハイブリダイズし、処理した。表IVに示されているように、金属イオ
ンは、オリゴマーエレメント３０mer、４７mer及び５９merエレメントのハイブ
リダイゼーションシグナルを増加させた。この効果は、金属が無い場合に最低度
の安定性を有する複合体を形成する３０merエレメントにとって特に重要であっ
た。希土類金属だけでなく、Ｃａ＋＋、Ｆｅ＋＋、Ｆｅ−＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｋ＋ 、Ｃｏ＋＋、Ｃｏ＋＋− を含む他の金属イオンによっても同じように増加した
ハイブリダイゼーションシグナルが得られる。
定するために、低濃度の金属イオンの存在下でハイブリダイゼーション反応を実
行した。１．５ｍＭの濃度でＺｎ＋＋又はＮｉ＋＋を添加したということを除い
て、上記の実施例８に記載したように、二重鎖標識化ＰＣＲプローブを２．５ｎ
ｇ／μｌでハイブリダイズし、処理した。表IVに示されているように、金属イオ
ンは、オリゴマーエレメント３０mer、４７mer及び５９merエレメントのハイブ
リダイゼーションシグナルを増加させた。この効果は、金属が無い場合に最低度
の安定性を有する複合体を形成する３０merエレメントにとって特に重要であっ
た。希土類金属だけでなく、Ｃａ＋＋、Ｆｅ＋＋、Ｆｅ−＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｋ＋ 、Ｃｏ＋＋、Ｃｏ＋＋− を含む他の金属イオンによっても同じように増加した
ハイブリダイゼーションシグナルが得られる。
【００４０】
表ＩＶ
エレメントのハイブリダイゼーションシグナル強度
30mer 47mer 59mer cDNA
5xSSC 976 15119 20110 353
4xSSC/1.5mM Zn＋＋ 4975 21519 24207 526
4xSSC/1.5mM Ni＋＋ 1420 22101 20497 404
【００４１】
実施例１１
ヘアピンの二重鎖ベクター配列へハイブリダイズする能力を試験するために、
実施例４に記載したハイブリダイゼーションを非変性アレイにおいて行った。Ｐ
ＣＲフラグメントを増幅し、標準的なろ過法で精製し、ふいて乾かし、熱変性を
せずに２ｘＳＳＣに再懸濁した。次に、エレメントが二本鎖となるように、これ
ら産物を整列させた。濃度が約１０ｎｇ／ｕｌのおよそ２５ｕｌの標識した配列
番号：３を、ハイブリダイゼーションチャンバーに置いた。ハイブリダイゼーシ
ョンの結果を、実施例１に記載のようにして分析した。非特異的ハイブリダイゼ
ーションは見出されず、ヘアピン構造は、特異的なハイブリダイゼーション強度
、並びに上記の実施例１から３の配列番号：１及び２に関して観察されたのと類
似の形態を有していた。
実施例４に記載したハイブリダイゼーションを非変性アレイにおいて行った。Ｐ
ＣＲフラグメントを増幅し、標準的なろ過法で精製し、ふいて乾かし、熱変性を
せずに２ｘＳＳＣに再懸濁した。次に、エレメントが二本鎖となるように、これ
ら産物を整列させた。濃度が約１０ｎｇ／ｕｌのおよそ２５ｕｌの標識した配列
番号：３を、ハイブリダイゼーションチャンバーに置いた。ハイブリダイゼーシ
ョンの結果を、実施例１に記載のようにして分析した。非特異的ハイブリダイゼ
ーションは見出されず、ヘアピン構造は、特異的なハイブリダイゼーション強度
、並びに上記の実施例１から３の配列番号：１及び２に関して観察されたのと類
似の形態を有していた。
【００４２】
本発明は、その特別な実施態様に対する参考文献によって記載されているが、
種々の変更がなされてもよく、そして本発明の範囲及び趣旨から逸脱することな
く同意義のものが置き換えられてもよいことを当業者は理解すべきである。更に
は、特定の状況、材料、組成物、工程、工程段階又は段階を本発明の目的、趣旨
及び範囲へ適用するために、多くの改良をおこなってもよい。これらの改良のす
べては、ここに 添付した請求項の範囲内にあるようにと意図されている。
種々の変更がなされてもよく、そして本発明の範囲及び趣旨から逸脱することな
く同意義のものが置き換えられてもよいことを当業者は理解すべきである。更に
は、特定の状況、材料、組成物、工程、工程段階又は段階を本発明の目的、趣旨
及び範囲へ適用するために、多くの改良をおこなってもよい。これらの改良のす
べては、ここに 添付した請求項の範囲内にあるようにと意図されている。
【Ｆｉｇ１】 二色を用いる標識化方法の略図。
【Ｆｉｇ２Ａ】 アンチセンス標準プローブによるコーハイブリダイゼーシ
ョンの略図。
ョンの略図。
【Ｆｉｇ２Ｂ】 センス標準プローブによるコーハイブリダイゼーションの
略図。
略図。
【Ｆｉｇ２Ｃ】 センス及びアンチセンス標準プローブによるコーハイブリ
ダイゼーションの略図。
ダイゼーションの略図。
【Ｆｉｇ２Ｄ】 ヘアピン標準プローブによるコーハイブリダイゼーション
の略図。
の略図。
【Ｆｉｇ３】 ヘアピンの構造及びヘアピン（配列番号：３）に対して相補
的な３０-ｍｅｒｓの図案。ポリヌクレオチド１−４は、ヘアピンの３’アーム
に対して相補的である；ポリヌクレオチド５−８は、５’アームに対して相補的
である（実施例６を参照）。
的な３０-ｍｅｒｓの図案。ポリヌクレオチド１−４は、ヘアピンの３’アーム
に対して相補的である；ポリヌクレオチド５−８は、５’アームに対して相補的
である（実施例６を参照）。
【Ｆｉｇ４】 ヘアピンの異なるエレメントで得られたハイブリダイゼーシ
ョンシグナル（実施例６を参照）。
ョンシグナル（実施例６を参照）。
【Ｆｉｇ５】 反転ヘアピンの構造（配列番号：４；実施例７を参照）。
【Ｆｉｇ６】 反転ヘアピンの異なるエレメントで得られたハイブリダイゼ
ーションシグナル（実施例７を参照）。
ーションシグナル（実施例７を参照）。
【Ｆｉｇ７】 ３０ｍｅｒ、４７ｍｅｒ（配列番号：２）、及び５９ｍｅｒ
（配列番号：１）の一本鎖エレメント配列に関連するＰＣＲプローブベクター配
列の配列。エレメントの配列が示されている（実施例８を参照）。
（配列番号：１）の一本鎖エレメント配列に関連するＰＣＲプローブベクター配
列の配列。エレメントの配列が示されている（実施例８を参照）。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ベッディリオン，トッド
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94555 フリーモント， ダンバートン
サークル 6519，インサイト ゲノミック
ス インク．
(72)発明者 ベジェルダンス，エリック
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94555 フリーモント， ダンバートン
サークル 6519，インサイト ゲノミック
ス インク．
(72)発明者 テリオルト，トーマス，ピー．
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94555 フリーモント， ダンバートン
サークル 6519，インサイト ゲノミック
ス インク．
(72)発明者 レイ，ウォーレン
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94555 フリーモント， ダンバートン
サークル 6519，インサイト ゲノミック
ス インク．
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA04 CA09 FA10
HA19
4B063 QA13 QQ42 QQ53 QR33 QR36
QR55 QS34
Claims (54)
- 【請求項１】 プローブ及び標的の一つが相補鎖を含んでなる二本鎖であり
、並びに他方のプローブ及び標的が一つの相補鎖と相補性を有する一本鎖であっ
て、プローブ及び標的がハイブリダイズすることでプローブが固定化される条件
下において、プローブと固体支持体の表層に安定に会合しているポリヌクレオチ
ド標的を化合させる段階を含んでなる、ポリヌクレオチドプローブを固定化する
方法。 - 【請求項２】 プローブ及び標的が相補鎖を含んでなる二本鎖であって相補
性を有しており、プローブ及び標的がハイブリダイズすることでプローブが固定
化される条件下で、プローブと固体支持体の表層に安定に会合しているポリヌク
レオチド標的を化合させる段階を含んでなる、ポリヌクレオチドを固定化する方
法。 - 【請求項３】 固体支持体の表層に安定に会合しているポリヌクレオチド標
的と、二本鎖であるポリヌクレオチドプローブを接触させ、そしてプローブの標
的への特異的なハイブリダイゼーションを検出する段階を含んでなる、ポリヌク
レオチドプローブを固定化及び検出する方法。 - 【請求項４】 標的が二本鎖である、請求項３に記載の方法。
- 【請求項５】 プローブ及び標的の特異的ハイブリダイゼーションを検出す
る段階をさらに含んでなる、請求項１、２、３又は４に記載の方法。 - 【請求項６】 固定化プローブの増幅に次いで生成された増幅プローブを検
出する段階をさらに含んでなる、請求項１、２、３又は４に記載の方法。 - 【請求項７】 プローブが二本鎖であり、並びに標的が一本鎖であって、標
識され、増幅された二本鎖プローブを作製するためにプローブを遊離及び増幅す
ること、標識化プローブを固定化するために標的ポリヌクレオチドへ標識化プロ
ーブをハイブリダイズすること、並びに標識化プローブを検出することの段階を
さらに含んでなる、請求項１、２、３又は４に記載の方法。 - 【請求項８】 二本鎖プローブ又は標的が非共有結合した相補鎖を含む、請
求項１、２、３又は４に記載の方法。 - 【請求項９】 二本鎖プローブ又は標的が共有結合した相補鎖を含む、請求
項１、２、３又は４に記載の方法。 - 【請求項１０】 条件が標的及びプローブのハイブリダイゼーションを増加
するのに十分な量の金属イオンを含む、請求項１、２、３又は４に記載の方法。 - 【請求項１１】 金属イオンがＺｎ＋＋、Ｎｉ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｆｅ＋＋、
Ｆｅ＋＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｋ＋、Ｃｏ＋＋、及びＣｏ＋＋＋から成る群から選択さ
れ、条件が標的及びプローブのハイブリダイゼーションを増加するのに十分な量
の金属イオンを含む、請求項１、２、３又は４に記載の方法。 - 【請求項１２】 プローブが共有結合した相補鎖を含み、並びにヘアピン構
造である、請求項１、２、３又は４に記載の方法。 - 【請求項１３】 プローブが共有結合した相補鎖を含み、一本の鎖の最初の
カップリング部分、並びに二番目の鎖の二番目にカップリング部分を通して連結
している、請求項１、２、３又は４に記載の方法。 - 【請求項１４】 （ａ）最初のカップリング部分がアルキルアミンであり、
二番目のカップリング部分が活性エステル、アミド、イミン、アルデヒド、臭化
アセトアミド及びチオシアナートから選択される；或いは（ｂ）最初のカップリ
ング部分がチオールであり、二番目のカッブリング部分が二硫化物、マレイミド
及び臭化アセトアミドから選択される、プローブが共有結合した相補鎖を含み、
それが一つの鎖の最初のカップリング部分、並びに二番目の鎖の二番目にカップ
リング部分を通して連結している、請求項１、２、３又は４に記載の方法。 - 【請求項１５】 プローブが検出可能な標識を含む、請求項１、２、３又は
４に記載の方法。 - 【請求項１６】 標的が一本鎖である、請求項１又は３に記載の方法。
- 【請求項１７】 標的及び固体支持体がマイクロアレイのものである、請求
項１、２、３又は４に記載の方法。 - 【請求項１８】 固体支持体がポリカチオン性の表層を含む、請求項１、２
、３又は４に記載の方法。 - 【請求項１９】 標的及びプローブが、プリン及びピリミジンのヘテロポリ
マーである、請求項１、２、３又は４に記載の方法。 - 【請求項２０】 標準プローブシグナルが試料シグナルのためのノーマライ
ゼーションコントロールを提供する、各試料に試料プローブシグナル及び標準プ
ローブシグナルを含んでなるハイブリダイゼーションパターンを作製するための
条件下で、異なる試料ポリヌクレオチド標的及び標準ポリヌクレオチド標的をそ
れぞれに含んでなる個々の試料を、異なる標的に対して特異的で検出可能な試料
プローブ、並びに標準標的に対して特異的な単独で検出可能な標準プローブと接
触せしめこと、並びにハイブリダイゼーションパターンを検出することを段階と
してを含んでなる、ハイブリダイゼーションアッセイ。 - 【請求項２１】 試料標的及び標準標的が共有結合している、請求項２０の
アッセイ。 - 【請求項２２】 試料標的及び標準標的が結合している、請求項２０のアッ
セイ。 - 【請求項２３】 試料標的及び標準標的が共有結合していない、請求項２０
のアッセイ。 - 【請求項２４】 試料標的及び標準標的が固体支持体の表層へ安定に会合し
ている、請求項２０、２１、２２、又は２３のアッセイ。 - 【請求項２５】 固体支持体をガラス、シリカ、ビーズ、及びナイロン、並
びにこれらの組み合わせから成る群から選択する、請求項２４のアッセイ。 - 【請求項２６】 固体支持体がアレイを含む、請求項２４のアッセイ。
- 【請求項２７】 固体支持体がマイクロアレイを含む、請求項２４のアッセ
イ。 - 【請求項２８】 標準標的が、約５から約１００００のヌクレオチドを含む
請求項２０のアッセイ。 - 【請求項２９】 試料プローブが蛍光標識を含む、請求項２０のアッセイ。
- 【請求項３０】 標準プローブが蛍光標識を含む、請求項２０のアッセイ。
- 【請求項３１】 標準プローブが一本鎖プローブである、請求項２０のアッ
セイ。 - 【請求項３２】 標準プローブがアンチセンスである、請求項３１のアッセ
イ。 - 【請求項３３】 標準プローブが二本鎖プローブである、請求項２０のアッ
セイ。 - 【請求項３４】 二本鎖プローブが、標準プローブに対するセンス及びアン
チセンス相補体を含む、請求項３３のアッセイ。 - 【請求項３５】 センス及びアンチセンス相補体がおよそ等モル量濃度で存
在する、請求項３４のアッセイ。 - 【請求項３６】 センス及びアンチセンス相補体が共有結合している、請求
項３４のアッセイ。 - 【請求項３７】 センス及びアンチセンス相補体がヘアピンを形成するよう
に共有結合している、請求項３４のアッセイ。 - 【請求項３８】ハイブリダイゼーションパターンを検出することが、検出可
能なプローブからのシグナル、並びに単独で検出可能な標準プローブからのシグ
ナルを測定することを含む、請求項２０のアッセイ。 - 【請求項３９】 検出可能なプローブからのシグナルが、標準プローブから
のシグナルを用いて校正される、請求項３８のアッセイ。 - 【請求項４０】 各試料が共通の標準標的を有する、請求項２０のアッセイ
。 - 【請求項４１】 各試料が異なる標準標的を有する、請求項２０のアッセイ
。 - 【請求項４２】 試料標的がｃＤＮＡから増幅された、請求項２０のアッセ
イ。 - 【請求項４３】 試料標的及び標準標的が、あらかじめ決められた及び既知
の化学量論である、請求項２０のアッセイ。 - 【請求項４４】 試料標的及び標準標的が等モル濃度である、請求項２０の
アッセイ。 - 【請求項４５】 標準プローブシグナルが試料シグナルに対するノーマライ
ゼーションコントロールを提供する、各試料に試料プローブシグナル及び標準プ
ローブシグナルを含んでなるハイブリダイゼーションパターンを作製するための
条件下で、異なる試料ポリヌクレオチド標的及び標準ポリヌクレオチド標的を含
んでなる個々の試料のそれぞれを、異なる標的に対して特異的な検出可能な試料
プローブ、並びに標準標的に対して特異的な単独で検出可能な標準プローブと接
触せしめること、並びにハイブリダイゼーションパターンを検出すること、並び
に試料がマイクロデポジションによって作製されたエレメントであって、ハイブ
リダイゼーションパターンを検出することを段階として含んでなる、ハイブリダ
イゼーションアッセイ。 - 【請求項４６】 マイクロデポジションがインクジェット応用装置によって
達成される、請求項４５に記載の方法。 - 【請求項４７】 標準プローブシグナルが試料シグナルに対するノーマライ
ゼーションコントロールを提供する、各試料に試料プローブシグナル及び標準プ
ローブシグナルを含んでなるハイブリダイゼーションパターンを作製するための
条件下で、異なる試料ポリヌクレオチド標的及び標準ポリヌクレオチド標的を含
んでなる個々の試料のそれぞれを、異なる標的に対して特異的な検出可能な試料
プローブ、並びに標準標的に対して特異的な単独で検出可能な標準プローブと接
触せしめること、そして試料が写真平板によるインサイツ合成によって作製され
たマイクロアレイのエレメントであって、ハイブリダイゼーションパターンを検
出することを段階として含んでなる、ハイブリダイゼーションアッセイ。 - 【請求項４８】 標準プローブシグナルが試料シグナルに対するノーマラ
イゼーションコントロールを提供する、各試料に試料プローブシグナル及び標準
プローブシグナルを含んでなるハイブリダイゼーションパターンを作製するため
の条件下で、異なる試料ポリヌクレオチド標的及び標準ポリヌクレオチド標的を
含んでなる個々の試料のそれぞれを、異なる標的に対して特異的な検出可能な試
料プローブ、並びに標準標的に対して特異的な単独で検出可能な標準プローブと
接触せしめること、そして試料プローブが検出可能な最初の蛍光ラベル、並びに
標準プローブが単独で検出可能な二番目の蛍光標識を含み、ハイブリダイゼーシ
ョンパターンを検出することを段階として含んでなる、ハイブリダイゼーション
アッセイ。 - 【請求項４９】 各エレメントが異なる試料ポリヌクレオチド標的及び標準
ポリヌクレオチド標的を含む、複数個のエレメントを含んでなるマイクロアッセ
イ。 - 【請求項５０】 試料標的及び標準標的が共有結合している、請求項４９の
マイクロアレイ。 - 【請求項５１】 試料標的及び標準標的が結合した、請求項４９のマイクロ
アレイ。 - 【請求項５２】 試料標的及び標準標的が共有結合していない、請求項４９
のマイクロアレイ。 - 【請求項５３】 異なる試料ポリヌクレオチド標的及び標的ポリヌクレオチ
ドの試料、並びに標準標的に対して特異的に検出可能な標準プローブを含んでな
る、ハイブリダイゼーションを測定することに用いるキット。 - 【請求項５４】 各エレメントが異なる試料ポリヌクレオチド標的及び標準
ポリヌクレオチド標的を含む、複数個のエレメントを含んでなるマイクロアレイ
、並びに標準標的に対して特異的な検出可能な標準プローブを含んでなる、ハイ
ブリダイゼーションを測定することに用いるキット。
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|---|---|---|---|
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| US09/449,059 | 1999-11-24 | ||
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| US09/586,156 | 2000-06-02 | ||
| PCT/US2000/042243 WO2001042512A2 (en) | 1999-11-24 | 2000-11-22 | Normalization controls and duplex probes for quantitative hybridization reactions |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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