JP2002330767A

JP2002330767A - 核酸固定化アレイ

Info

Publication number: JP2002330767A
Application number: JP2001142082A
Authority: JP
Inventors: Junichi Mineno; 純一峰野; Masatomo Mutsushima; 正知六嶋; Narikazu Sotozono; 成和外園; Kiyozou Asada; 起代蔵浅田; Ikunoshin Kato; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2001-05-11
Filing date: 2001-05-11
Publication date: 2002-11-19

Abstract

(57)【要約】【課題】バックグラウンドが低く、かつ高い検出感度
が得られる核酸固定化アレイ、該アレイの作製方法及び
該アレイを用いた標的核酸の高感度検出方法を提供する
こと。【解決手段】同一遺伝子上の異なる部位を含む複数の
核酸の混合物が、担体表面のあらかじめ定められた領域
の同じ位置に固定化されていることを特徴とする核酸固
定化アレイ、該アレイの作製方法及び該アレイを用いる
ことを特徴とする標的核酸の高感度検出方法を提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子解析の分野
で有用な高感度核酸固定化アレイ、該アレイを用いた被
検体中の核酸の検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、ヒトを含む生物種のゲノム解析プ
ロジェクトの進展により、種々の生物種のゲノムの全塩
基配列が解読され始め、得られた塩基配列情報をもとに
して、遺伝子の発現パターンや遺伝子産物の機能を全ゲ
ノムレベルで、同一生物種間及び異種生物間の違いを調
べるプロジェクトが進められてきている。ヒトにおいて
は、個々のヒトや人種間の違い、更にはテーラーメイド
医薬を目指した１塩基置換（ＳＮＰ）等を調べるための
新たなプロジェクトが進められてきている。核酸固定化
アレイ（ＤＮＡアレイ又はＤＮＡチップ）は、これらプ
ロジェクトを効率よく、飛躍的に進展させるための手段
として開発され、全ゲノムが解読された生物種や解析が
ドラフトレベルの生物種などの情報をもとに、各種ゲノ
ム中に含まれる遺伝子の発現解析に核酸固定化アレイ技
術が広く用いられている。

【０００３】ＤＮＡアレイの作製方法としては、例えば
アレイ固相表面上のあらかじめ定められた領域で１本鎖
ＤＮＡを合成する方法、あるいはあらかじめ調製された
１本鎖ＤＮＡあるいは２本鎖ＤＮＡをアレイ固相上のあ
らかじめ定められた領域にスポッティングする方法が知
られている。上記前者のＤＮＡアレイとしては、米国特
許第５４４５９３４号、米国特許第５７４４３０５号あ
るいは米国特許第５７００６３７号に記載の高密度オリ
ゴヌクレオチドアレイが例示される。また、上記後者の
方法としては、米国特許第５８０７５２２号あるいは国
際公開公報第９８／１８９６１号パンフレットに記載の
スポッティングアレイが例示される。該方法を用いるこ
とにより、固相表面上のあらかじめ定められた領域にス
ポッティングすることでアレイを作製することができ
る。

【０００４】アレイを作製する場合は、例えばポリＬ−
リシンコーティングやシラン化など、特殊加工したスラ
イドガラスなどの固相担体上にＤＮＡ断片をピン先で物
理的にスポットしていく。この場合、結合は静電気的に
行われるものであり、固相担体のコーティングの状態に
よりその結合の効率に違いが認められる。

【０００５】これら固相担体に核酸をスポッティングす
るスポッティングアレイの場合、固定化する核酸を大量
に合成する必要があるが、そのほとんどはＤＮＡポリメ
ラーゼを利用した酵素的方法により実施されている。こ
の酵素的方法においては、増幅の際の鋳型として各遺伝
子のクローンを必要し、アレイに搭載できる遺伝子はク
ローンが用意できるものに限定される。また、クローン
が調製可能な遺伝子についても、それらを鋳型とした増
幅反応は非常に操作が煩雑であり、また、増幅反応は厳
密なコントロールを必要とすることから、安定した増幅
産物が得難いという問題点を有する。さらに増幅産物が
目的とする遺伝子の塩基配列を有しているかどうかを、
塩基配列を決定して確認する必要がある。

【０００６】さらに、２本鎖ＤＮＡをスポッティングす
る場合、使用する前にＤＮＡアレイ上に固定化された２
本鎖ＤＮＡを変性して１本鎖にする工程が必須となり、
分析操作が繁雑である。また、１本鎖ＤＮＡをスポッテ
ィングしたスポッティングアレイの場合は、固相上に固
定化する前に２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡを調製する
工程が必要になり、アレイ作製操作が煩雑である。

【０００７】一方、スポッティングアレイに使用する核
酸の調製方法としては、上記酵素的方法以外として、Ｄ
ＮＡ合成機で化学反応により合成するという方法があ
る。該方法では、遺伝子のクローンを必要としないの
で、塩基配列情報さえあればいかなる遺伝子もＤＮＡア
レイに搭載することが可能である。また、合成されるＤ
ＮＡは１本鎖であることから、固相上に固定化する際に
も、特に変性処理を行う必要はない。しかしながら、合
成機で合成できるＤＮＡは数十塩基の1本鎖オリゴヌク
レオチドに限定されることから、酵素的方法で調製した
長鎖ＤＮＡと比較すると、作製されるＤＮＡアレイは標
的核酸の検出感度という点で問題があった。また、ＤＮ
Ａ合成機においては、合成鎖長が長くなるほど収率が低
下するため純度及び量的な問題があった。

【０００８】一方、上記高密度オリゴヌクレオチドアレ
イにおいては、高密度での固相合成法のための大規模な
装置が必要となる。また、合成ヌクレオチド鎖の塩基配
列の正確性及び合成収率の観点からも問題があり、実用
上可能な合成鎖長は２５ｍｅｒ程度までに限定される。
さらに、該方法ではハイブリダイゼーションによって得
られるシグナルは偽陽性のものを多く含むことから、正
確な検出を行うためには１つの遺伝子の核酸配列に対し
て３０〜４０種類のオリゴヌクレオチドを設計する必要
がある。

【０００９】このように従来のＤＮＡアレイ及び該アレ
イの作製方法やその検出感度においては、いろいろな問
題をかかえている。

【００１０】また、上記ＤＮＡアレイにおいて核酸を固
相に固定化する方法は、非共有結合型と共有結合型に大
別される。前記非共有結合による固定化方法としては、
例えば、ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウ
ム）等の塩溶液に溶解したＤＮＡをそのままあるいは変
性処理した後、ポリリジンやポリエチレンイミン等の塩
基性ポリ陽イオン、あるいはアミノ基を有する塩基性シ
ランカップリング剤等でコートしたスライドガラス（担
体）にスポットし、ＵＶ照射により固定化する方法が知
られている。この場合、固相担体とＤＮＡ断片との結合
は静電的に行なわれる。該方法によれば、どのようなＤ
ＮＡも固定化することができるはずであるが、実際には
オリゴヌクレオチドや０．３ｋｂ以下の短鎖ＤＮＡは固
定化されにくいという問題点がある。また、長鎖ＤＮＡ
を担体に固定化する場合においても、洗浄や標的核酸と
のハイブリダイゼーションの工程で固定化したＤＮＡが
剥離し易く、標的核酸の検出感度を低下させる要因とな
る。さらには、担体表面に残存する塩基性官能基（陽イ
オン）と標的核酸との非特異的な結合により、バックグ
ラウンドが高くなり易いという欠点がある。

【００１１】一方、共有結合による固定化方法では、オ
リゴヌクレオチドを含むいずれのＤＮＡも固定化するこ
とができ、非共有結合型の固定化方法と比較すると、ハ
イブリダイゼーションと洗浄の工程でＤＮＡが剥離する
という問題は少ない。しかしながら、一般的に、官能基
としてアミノ基等の陽イオン基を有する担体を使用する
ので、前述の如くバックグラウンドが高くなり、この方
法の場合も検出感度が低下するという欠点があった。

【００１２】上記のように、従来の固定化方法では、高
感度で目的の核酸を検出することが困難であったが、本
発明者らは、この問題を解決すべく共有結合型の固定化
担体としてあらたにポリアニオン（polyanion）をコー
ティングした核酸固定化用担体を開発した。この固定化
担体は、担体の表面にポリアニオンを有しており、ポリ
アニオンによるコーティングの後にアルカリ処理を行っ
て作成されることを特徴とし、ポリアニオンの３次構造
により、核酸の固定化量が多く、当該核酸はハイブリダ
イズ可能な形で担体に固定化されいるため、効率よく核
酸を固定化した担体を製造することができる。また核酸
が結合していない未反応のポリアニオンの活性エステル
誘導体は加水分解によりポリアニオンになり、負荷電の
核酸の非特異的吸着を阻止するため、当該固定化担体に
核酸が固定化された担体は、極めてバックグランドの低
い高感度核酸検出用担体として使用することができる。

【００１３】しかしながら、この固定化担体において
も、固定化するオリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレ
オチドに相補的な被検体中の核酸の配列により、検出感
度が左右されやすい等の問題点があり、目的とする被検
体中の核酸配列を検出するための、高い検出感度が得ら
れるアレイの提供が求められていた。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、バッ
クグラウンドが低く、かつ高い検出感度が得られるアレ
イ及び該アレイを用いた標的核酸の高感度検出方法を提
供することにある。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、同一遺伝子上の異なる部位を含む核酸を複数設
計して合成し、これらの混合物を担体表面上のあらかじ
め定められた領域の同じ位置に固定化することにより、
従来の１種類あるいは重複する部位を固定化したアレイ
に比べて、飛躍的に検出感度が高くなることを見出し
た。さらに、該混合物をポリアニオンで表面を処理した
担体表面上に固定化することにより、バックグラウンド
が低く、高い検出感度が得られるアレイを開発すること
に成功し、本発明を完成するに至った。

【００１６】本発明を概説すれば、本発明の第１の発明
は、担体表面上のあらかじめ定められた領域に核酸が整
列固定化されたアレイであって、同一遺伝子の異なる部
位の塩基配列を有する少なくとも２種類以上の核酸が同
じ位置に固定化されていることを特徴とする核酸固定化
アレイに関する。

【００１７】本発明の第１の発明において、固定化され
ている核酸の鎖長は、少なくとも４０ｍｅｒ以上である
ことが好ましい。また、固定化されている核酸は、デオ
キシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドある
いはそれらの誘導体で構成されているものが好適に使用
でき、該核酸は、互いのクロスハイブリダイゼーション
が抑制されるように選択された配列からなる核酸である
ものが好適に使用できる。また、固定化されている核酸
は、共有結合及び／又は静電結合を介して担体に結合さ
れているものが好適に使用できる。

【００１８】本発明の第１の発明において用いられる担
体は、非多孔性担体であるものが好適に使用でき、特に
限定はされないがガラスであるものが例示される。ま
た、当該担体は、該担体の表面をポリアニオンで処理
し、該ポリアニオンを活性エステル誘導体としたものが
好適に使用できる。さらに本発明の第１の発明におい
て、固定化されている核酸は、活性化エステル誘導体と
反応性を有する官能基で修飾されている核酸であり、当
該官能基を介し担体に結合されていることが好ましい。

【００１９】本発明の第２の発明は、本発明の第１の発
明の核酸固定化アレイを作製する方法であって、同一遺
伝子の異なる部位の塩基配列を有する少なくとも２種類
以上の核酸の混合物を担体表面上のあらかじめ定められ
た領域にスポットすることを特徴とする核酸固定化アレ
イの作製方法に関する。

【００２０】本発明の第３の発明は、本発明の第１の発
明の核酸固定化アレイを用いることを特徴とする標的核
酸の検出方法に関する。

【００２１】本発明の第４の発明は、被検体中の標的核
酸を検出する方法であって、（ａ）本発明の第１の発明
の核酸固定化アレイに固定化された核酸と、当該核酸に
相補的な被検体中の核酸をハイブリダイズさせる工程、
（ｂ）ハイブリダイズした核酸を検出する工程、を包含
することを特徴とする標的核酸の検出方法に関する。

【００２２】

【発明の実施の形態】本明細書において核酸とは、オリ
ゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチド、またはそれ
らの誘導体のことをいう。該ポリヌクレオチドは、鎖長
が１００ｍｅｒ以上のものが含まれる。

【００２３】本明細書において核酸固定化アレイとは、
上記核酸をあらかじめ定められた領域に固定化したアレ
イであって、その同一箇所に標的核酸中の任意の１遺伝
子の複数の部位の塩基配列を有する核酸が固定化された
アレイのことをいう。

【００２４】本明細書において共有結合とは、化学結合
の１つで、互いに最外殻電子を共有することによって安
定化される結合のことをいう。

【００２５】本明細書において静電結合とは、正と負の
電荷間に働くクーロン力相互作用によって安定化される
結合のことをいう。

【００２６】以下、本発明を詳細に説明する。（１）本発明の核酸固定化アレイ本発明の核酸固定化アレイに用いる核酸は、デオキシリ
ボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドあるはその
誘導体で構成されたものが好適に使用できる。また、こ
れらの核酸は一本鎖、二本鎖のいずれであってもよい。
さらに、上記誘導体としては、担体表面への固定化を可
能にする修飾であれば特に限定はされないが、後述の担
体上のポリアニオン中に含まれる官能基との共有結合を
形成するものが好ましく、例えば、アミノ基、チオール
基等で修飾された誘導体を例示することができる。該修
飾は、固定化する核酸の５'末端、３'末端あるいは核酸
配列の内部にあってもよい。また、別の態様として５’
末端に修飾ヌクレオチドが存在する場合には、架橋剤や
スぺーサーとしてのリンカー、例えばアルキルアミン等
を付加した誘導体も使用することが出来る。

【００２７】本発明の核酸固定化アレイに用いる核酸
は、任意の同一遺伝子上の異なる部位を含む核酸であれ
ば特に限定はないが、例えば該核酸を２種類以上含んで
いる混合物であることが好ましい。また、該混合物を構
成する核酸の塩基配列部位については特に限定はない
が、同一遺伝子上の重複しない異なる部位であることが
好ましい。特に限定はないが、好ましくは２種類以上で
あり、さらに好ましくは３種類以上であり、特に好まし
くは５種類以上の部位の塩基配列である。しかしながら
目的となる遺伝子の長さによっては設定できる領域の数
には制限がある。この場合は、検出効率が実質的に低下
しない限りにおいて、重複した部位を使用することがで
きる。

【００２８】また、上記アレイは、同一位置に固定化さ
れた複数の核酸間のクロスハイブリダイゼーションが抑
制されるようにデザインされているため、標的核酸との
ハイブリダイゼーション効率を向上させることができ
る。さらに、異なる位置に固定化された核酸間でも同様
にクロスハイブリダイゼーションが抑制されるようデザ
インされていることから、偽陽性の発生を押さえること
ができる。また、上記クロスハイブリダイゼーションが
抑制されることから、Ｓ／Ｎ比を向上させることができ
る。

【００２９】上記核酸の鎖長は、検出効率が実質的に低
下しない限りにおいては、特に限定はないが、例えば４
０ｍｅｒ以上が好ましく、更に好ましくは６０ｍｅｒ以
上、特に好ましくは８０ｍｅｒ以上、より好ましくは１
００ｍｅｒ以上が好ましい。

【００３０】これらの核酸は、特に限定はされないが、
例えばＰＣＲ法、ＳＤＡ法、ＩＣＡＮ法、ＴＭＡ法ある
いはＮＡＳＢＡ法等の公知の核酸増幅方法により調製し
たものでもよく、また、組換体等により得られた遺伝子
を制限酵素により切断したものでもよい。さらに、任意
の配列を持つように化学合成されたものでもよく、特に
限定はされないが、例えばアプライドバイオシステム
ズ（ＡＢＩ：ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ）社
製のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホア
ミダイト法により合成したものでもよい。別法としてリ
ン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホ
ネート法等、いかなる方法で合成されたものであっても
良い。

【００３１】本発明の核酸固定化アレイに用いる核酸固
定化用担体は、不溶性のものであれば特に限定はなく、
ガラス、プラスチック等で作製された板状の担体の他、
ニトロセルロースやナイロン製の膜状の担体が好適に使
用できる。更に好ましくは、非多孔性で、表面がなめら
かな構造を有する材質、例えば、スライドガラス等のガ
ラスが好適に使用できる。また、担体を表面処理する場
合には、一般的なコーティング方法を用いることができ
る。本発明においては、予め陰イオン官能基を有する化
合物を保持するような表面処理を行うことが好ましく、
これらの官能基は担体自体の表面特性として存在してい
ても良い。また、シランカップリング剤等で処理した担
体であっても、該表面処理に不都合が無い限り使用する
ことができる。

【００３２】上記コーティング方法として特に限定はさ
れないが、例えばポリアニオンによるコーティング方法
があげられる。当該方法は、担体をポリアニオンの溶液
に浸した後、洗浄、乾燥することによりポリアニオンコ
ーティング担体を得ることができる。該ポリアニオンと
しては、特に限定はされないが、核酸との非特異的結合
を防ぐ効果のある、カルボキシル基、リン酸基、硫酸基
などの酸性官能基を有するポリマー、例えばポリアクリ
ル酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリリ
ン酸などが好適に使用できる。

【００３３】上記ポリアニオンコーティング法において
は、核酸を効率よく固定化させる観点から、活性エステ
ル誘導体とすることが好ましい。該活性エステル誘導体
としては、特に限定はされないがカルボキシル基であれ
ばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエス
テル）、リン酸基であればイミダゾールエステルなどが
例示される。

【００３４】上記担体への核酸の固定化方法としては、
担体に核酸が結合可能であれば特に限定はなく、静電気
的結合、共有結合等を可能にする方法であればよい。本
発明においては、結合の安定性の観点から、担体と核酸
の共有結合及び／又は静電結合による結合が好ましい。

【００３５】担体表面上に核酸を共有結合を介して固定
化するためには、コーティング等により表面を処理し官
能基を活性化した担体と、核酸を接触することが好まし
い。その際、マイクロピペットやＤＮＡチップ作製装置
（アレイヤー）等を用いて、担体上のあらかじめ定めら
れた位置に一定量ずつスポットすることにより行うこと
ができる。

【００３６】担体表面上に核酸を静電結合を介して固定
化するためには、表面に正電荷を有する担体と核酸と
を、前述のごとく物理的に接触させることが好ましい。
上記担体としては、正電荷が担体の素材の特性として既
にその表面上に存在しているもの、もしくは表面処理を
行なうことにより担体の表面に正電荷を付加ことができ
るものであれば特に限定されない。本発明においては、
１種類の核酸をスポットした後、同一遺伝子上の重複し
ない異なる部位を含む核酸を更に同じ位置にスポットし
てもよいが、操作の簡便性の観点から、これらの核酸の
混合物をスポットすることが好ましい。

【００３７】このようにして得られた核酸固定化アレイ
としては、特に限定はないが、例えば、ＤＮＡアレイ
（又はＤＮＡチップ）が挙げられる。該ＤＮＡアレイ
は、多数の異なる遺伝子あるいはＤＮＡ断片を固相担体
上の所定の領域あるいは、所定の位置に整列させて固定
化したものである。上記所定の領域、所定の位置あるい
はあらかじめ定められた領域とは、その領域あるいはそ
の位置にどの遺伝子のどの部位を含む核酸が固定化され
ているかがわかっていればよく、該核酸の塩基配列は、
未知あるいは既知のいずれであってもよい。本発明にお
いては、同一遺伝子の異なる部位を含む核酸を、少なく
とも２種類以上、担体上の同じ位置に固定化されている
核酸固定化アレイが好ましい。

【００３８】（２）本発明の核酸固定化アレイの作製方
法本発明の核酸固定化アレイの作製方法においては、まず
１種類の核酸をスポットした後に、同一遺伝子上の異な
る部位を含む核酸を更に同じ位置にスポットしてもよ
い。また、同一遺伝子上の異なる部位を含む核酸の混合
物を担体表面のあらかじめ定められた領域にスポットし
てもよい。特に限定はされないが、操作の簡便さの観点
から、後者の核酸の混合物をスポットすることが好まし
い。

【００３９】（３）本発明の核酸固定化アレイを用いた
標的核酸の検出方法本発明の核酸固定化アレイは、同一遺伝子の複数の部位
の塩基配列を有する核酸が固定化されているため、標的
核酸とのハイブリダイゼーションの効率を向上させるこ
とができる。従って、得られる標識信号の強度も増強さ
れ、Ｓ／Ｎ比の改善された標的核酸の検出を行うことが
できる。

【００４０】さらに、本発明の核酸固定化アレイは、標
識信号を増強させることができることから標的核酸の高
感度検出に用いることができる。すなわち、試料又は被
検体中より調製した核酸試料、好ましくは標識された核
酸試料と本発明の核酸固定化アレイを接触させてハイブ
リダイゼーションを行うことにより、核酸試料中に存在
する、アレイ上の所定の領域に整列させて固定化された
核酸と相補的な塩基配列を有する標的核酸の存在を高感
度に調べることが可能である。

【００４１】

【実施例】以下、本発明を実施例により、更に具体的に
説明するが、本発明はこれら実施例によって限定される
ものではない。

【００４２】実施例１（オリゴヌクレオチドの長さに
よるシグナル強度への影響） λファージＤＮＡ断片に対応するオリゴヌクレオチドを
用いたモデル実験において、固定化される１本鎖合成オ
リゴヌクレオチドの鎖長の違いが、ハイブリダイゼーシ
ョンで得られるシグナル強度に与える影響を検討した。
また、同一のＲＮＡ分子に対応する複数のオリゴヌクレ
オチドを混合することによるシグナル強度の変化につい
ても検討した。

【００４３】（１）マイクロアレイの作製以下に示すようなオリゴヌクレオチドを合成し、本実施
例のマイクロアレイ作製に使用した。なお、合成したオ
リゴヌクレオチドは、担体上への共有結合による固定化
のため、すべて５’末端をアミノ基で修飾した。

【００４４】（ａ）λファージＤＮＡ断片１配列表の配列番号１に記載の、１０００ｂｐのλＤＮＡ
断片の塩基配列をもとに、配列表の配列番号３〜１７に
記載の塩基配列を有する２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチ
ド１５種類、配列表の配列番号１８〜２５に記載の塩基
配列を有する４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド８種類及
び配列表の配列番号２６〜３０に記載の塩基配列を有す
る６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド５種類を合成し、λ
ファージＤＮＡ断片１とした。

【００４５】（ｂ）λファージＤＮＡ断片２配列表の配列番号２に記載の、１１００ｂｐのλＤＮＡ
断片の塩基配列をもとに、配列表の配列番号３１〜４５
に記載の塩基配列を有する２０ｍｅｒのオリゴヌクレオ
チド１５種類、配列表の配列番号４６〜５３に記載の塩
基配列を有する４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド８種類
及び配列表の配列番号５４〜５８に記載の塩基配列を有
する６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド５種類を合成し、
λファージＤＮＡ断片２とした。なお、これらは陰性コ
ントロールとして使用した。

【００４６】（ｃ）ヒト β−アクチン遺伝子ジーンバンク登録番号Ｘ００３５１のヒト β−アクチ
ン（ａｃｔｉｎ）遺伝子の塩基配列をもとに配列表の配
列番号５９〜６６に記載の塩基配列を有する４０ｍｅｒ
のオリゴヌクレオチド８種類及び配列表の配列番号６７
〜７１に記載の塩基配列を有する６０ｍｅｒのオリゴヌ
クレオチド５種類を合成した。

【００４７】上記（ａ）〜（ｃ）のオリゴヌクレオチド
を、終濃度が０．１ｍＭになるように、０．２％シュー
クロースモノラウレート（同仁化学社製）を含有する４
０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）に溶解し、スポ
ット溶液とした。次に、鎖長の同じオリゴヌクレオチド
の溶解液を等量ずつ混合し、これを混合スポット溶液と
した。使用する活性化カルボキシル基導入スライドガラ
スは、以下のようにして調製した。すなわち、顕微鏡用
のスライドガラス（松浪ガラス社製）を、２Ｎ硝酸、２
Ｎ水酸化ナトリウム、純水でそれぞれ１０分間ずつ超
音波処理することにより洗浄した。終濃度が４％となる
ように３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ナカラ
イテスク社製）を９５％エタノールに溶解し、先に洗浄
したスライドガラスをこの溶液に２分間浸した後、エタ
ノールでリンスし、１００℃のオーブンで１０分間処理
することにより、スライドガラス表面をアミノプロピル
化した。次に、５ｍｇ／ｍｌとなるようにポリアクリル
酸（分子量１，０００，０００、和光純薬工業社製）を
ジメチルホルムアミドに溶解し、さらに、４．０ｇ／１
００ｍｌとなるようにｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅｃ
ａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ
（ペプチド研究所社製、以下ＷＳＣＤとする）を加え
た。上記スライドガラスをこの溶液に一晩浸し、ジメチ
ルホルムアミド、メタノール、０．３Ｎ水酸化ナトリ
ウム、純水、およびアセトンでリンス後、減圧下で乾燥
した。次いで、４．５ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド（ナカライテスク社製）、８ｇのＷＳＣＤおよび５２
ｍｇのジメチルアミノピリジン（ナカライテスク社製）
を２００ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。上記
で調製したポリアクリル酸コートスライドガラスをこの
溶液に浸し、室温で５時間処理した後、ジメチルホルム
アミドおよびジクロロメタンでリンスし、減圧下で乾燥
してデシケーター中で保存した。

【００４８】上記スポット溶液を、ＤＮＡチップ作製装
置Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１７Ａｒｒａｙｅｒ（アフ
ィメトリックス社製）を用いて上記活性化カルボキシル
基導入スライドガラスにスポットした。スポット後のス
ライドグラスを０．２％ＳＤＳ、次いで蒸留水で２回洗
浄した。その後、０．３ＮＮａＯＨで５分間処理した
のち、蒸留水で２回洗浄し、遠心分離により乾燥させ
た。

【００４９】（２）次に、λファージＤＮＡ断片１に対
応するＲＮＡの調製は、以下のようにして行った。ま
ず、配列表の配列番号７２及び７３に記載の塩基配列を
有するＳＰ６−ＬａｍｂｄａＡ−ＦとＰｏｌｙＴ−Ｌａ
ｍｂｄａＡ−Ｒを用いて、λファージＤＮＡを鋳型とし
てポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ：Ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）
を行った。なお、ＳＰ６−ＬａｍｂｄａＡ−Ｆ（配列番
号７２）には、Ｉｎｖｉｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔｉｏｎのため、５’側部分にＳＰ６配列が含まれてい
る。また、ＰｏｌｙＴ−ＬａｍｂｄａＡ−Ｒ（配列番号
７３）には、ＲＮＡの３’末端にＰｏｌｙＡ配列を付加
するため、その５’末端にＰｏｌｙ−ｄＴ配列が含まれ
ている。

【００５０】ＰＣＲ反応は、ＰＣＲＡｍｐｌｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎｋｉｔ（宝酒造社製）を使用し、プライマ
ーとしてＳＰ６−ＬａｍｂｄａＡ−ＦとＰｏｌｙＴ−Ｌ
ａｍｂｄａＡ−Ｒを各５０ｐｍｏｌずつと、鋳型として
１０ｎｇのλファージゲノムＤＮＡを用い、反応液容量
を１００μｌにして行なった。反応条件は、９４℃２０
秒、５５℃、３０秒、７２℃ １分を１サイクルとして
３０サイクル行なった。反応終了後、ＭＥＧＡｓｃｒｉ
ｐｔ（アンビオン社製）を用いて、キットに添付のプロ
トコールに従いＩｎｖｉｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔｉｏｎを行った。合成されたＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ
ＭｉｄｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてキッ
トのプロトコールに従い精製した。以下、当該ＲＮＡを
λＲＮＡとする）。

【００５１】標識ｃＤＮＡの調製は、以下のようにして
行った。ヒトＨＬ−６０細胞（大日本製薬社製）から、
ＴｒｉｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社
製）とＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（宝
酒造社製）を用い、それぞれのキットのプロトコールに
従いＰｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを調製した。当該ＲＮＡ１
μｇに、上記で調製したλＲＮＡ６００ｐｇを添加し
たものを鋳型として、ＲＮＡＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃ
ｅＬａｂｅｌｉｎｇＣｏｒｅＫｉｔ（宝酒造社
製）を用いて、キットのプロトコールに従いＣｙ３標識
ｃＤＮＡを調製、精製した。

【００５２】次に、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ（宝酒造社
製）の取扱説明書に従い、上記実施例１−（１）で作製
したマイクロアレイと上記のＣｙ３標識ｃＤＮＡとのハ
イブリダイゼーションを行い、洗浄、乾燥の操作を行っ
た。次いで、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８Ａｒｒａ
ｙＳｃａｎｎｅｒ（アフィメトリックス社製）を用い
て、Ｃｙ３（励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：５７０
ｎｍ）の蛍光画像を取得し、各スポットのシグナル強度
を、画像定量解析ソフトＩｍａＧｅｎｅ４．０（Ｂｉｏ
ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社製）を用いて定量した。その結果
を表１〜表３に示す。なお、陰性コントロールである、
λＤＮＡ断片２に対応するオリゴヌクレオチドのスポッ
トからは、バックグラウンドレベルのシグナルしか認め
られなかった。

【００５３】

【表１】

【００５４】

【表２】

【００５５】

【表３】

【００５６】表１〜表３に示したようにλファージＤＮ
Ａ断片１に対応する、１種類のオリゴヌクレオチドから
なるスポットについて、鎖長の異なるオリゴヌクレオチ
ド間でシグナル強度を比較すると、鎖長が長くなるに従
って、シグナル強度が増すことが確認できた。特に、２
０ｍｅｒと４０ｍｅｒの間ではシグナル強度の差が大き
かった。また、１種類のオリゴヌクレオチドからなるス
ポットと、混合したものからなるスポットとを比較した
場合、λファージＤＮＡ断片１のオリゴヌクレオチドと
ヒトβ−ａｃｔｉｎ遺伝子のオリゴヌクレオチドの両方
で、混合したスポット溶液の方がシグナル強度は著しく
高かった。さらに、λファージＤＮＡ断片１の混合した
スポットついて、鎖長の異なるオリゴヌクレオチド間で
シグナル強度を比較すると、１種類の場合と同様に鎖長
が長くなるに従って、シグナル強度が増すことが確認で
きた。また、１種類のオリゴヌクレオチドの結果と同様
に、２０ｍｅｒと４０ｍｅｒの間ではシグナル強度の差
が大きかった。以上の結果から、４０ｍｅｒ以上の鎖長
のオリゴヌクレオチドを使用し、同一ＲＮＡ分子に対応
するオリゴヌクレオチドを複数混合することにより、２
０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１種類からなるマイクロ
アレイに比べて、検出感度が飛躍的に上昇することが確
認できた。

【００５７】実施例２（混合するオリゴヌクレオチド
種類数の検出感度への影響）４０ｍｅｒと６０ｍｅｒのモデルオリゴヌクレオチドに
ついて、混合する種類数の検出感度に与える影響を検討
した。

【００５８】（１）マイクロアレイの作製には、実施例
１で調製した３種類の遺伝子に対応するオリゴヌクレオ
チドに加えて、さらに以下の２種類の遺伝子に対応する
オリゴヌクレオチドを作製し使用した。なお、合成した
オリゴヌクレオチドは、すべて５’末端をアミノ基で修
飾した。

【００５９】（ａ）ヒトユビキチン遺伝子ジーンバンク登録番号Ｍ２６８８０に記載のヒトユビ
キチン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）遺伝子の塩基配列をもと
に、配列表の配列番号７４〜８１に記載の塩基配列を有
する４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド８種類及び配列表
の配列番号８２〜８６に記載の塩基配列を有する６０ｍ
ｅｒのオリゴヌクレオチド５種類を合成した。

【００６０】（ｂ）ヒト α−チュブリン遺伝子ジーンバンク登録番号Ｋ００５５７記載のヒト α−チ
ュブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ）遺伝子の塩基配列をもとに
配列表の配列番号８７〜９４に記載の塩基配列を有する
４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド８種類及び配列表の配
列番号９５〜９９に記載の塩基配列を有する６０ｍｅｒ
のオリゴヌクレオチド５種類を合成した。

【００６１】上記の各オリゴヌクレオチドを実施例１と
同様にしてバッファーに溶解し、各１種類のオリゴヌク
レオチドからなるスポット溶液を作製した。また、混合
スポット溶液として、４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド
については２種類〜８種類、６０ｍｅｒのオリゴヌクレ
オチドについては２種類〜５種類のオリゴヌクレオチド
を混合した溶液を調製した。この際、混合するオリゴヌ
クレオチドの種類の数は同じでも組み合わせの異なる複
数の溶液を調製した。４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド
の組み合わせを表４に、６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチ
ドの組み合わせを表５に示す。さらに各数字は、配列表
の配列番号を示す。当該スポット溶液を使用して実施例
１と同様にして、活性化カルボキシル基導入スライドグ
ラスを支持体とするマイクロアレイを作製した。

【００６２】

【表４】

【００６３】

【表５】

【００６４】（２）蛍光標識ｃＤＮＡの調製と解析は、
以下のようにして行った。まず、実施例１で調製したヒ
トＨＬ−６０細胞のｍＲＮＡ１μｇに６０ｐｇの実施
例１で調製したλＲＮＡを添加したものを鋳型として、
実施例１と同様にしてＣｙ３−ｄＵＴＰで標識されたｃ
ＤＮＡを調製した。その後、当該標識ｃＤＮＡと、上記
実施例２−（１）で作製したマイクロアレイを用いて、
実施例１に記載した方法によりハイブリダイゼーション
とスキャニング、シグナル強度の定量を行った。その結
果を表６〜表７に示す。混合しないサンプルは８種類の
平均値を、また遺伝子と鎖長、混合種類数の同じスポッ
トが複数ある場合は、シグナル強度の平均値を算出し
た。

【００６５】

【表６】

【００６６】

【表７】

【００６７】表６〜表７に示したように４０ｍｅｒにつ
いてみると、混合種類数を３種類から４種類程度まで増
やした場合にはシグナル強度の増加が認められた。一
方、６０ｍｅｒの場合には、２種類もしくは３種類程度
の混合種類数の場合、著しいシグナル強度の増加が認め
られた。このことから、４０ｍｅｒもしくは６０ｍｅｒ
のオリゴヌクレオチドを混合してマイクロアレイを作製
する場合、それぞれ３〜４種類と２〜３種類程度のオリ
ゴヌクレオチドを混合すれば十分な感度が得られること
が確認できた。

【００６８】実施例３（オリゴヌクレオチドアレイと
ＰＣＲアレイの比較）４０ｍｅｒもしくは６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを
複数種類混合したスポットからなるマイクロアレイとＰ
ＣＲ法により増幅した２本鎖ＤＮＡをスポットしたマイ
クロアレイを用いた発現解析について検討した。

【００６９】（１）マイクロアレイの作製は、以下のよ
うにして行った。まず、大腸菌Ｋ−１２株の１０個の
ＯＲＦ（ＯｐｅｎＲｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ）に対
応するマイクロアレイを作製した。当該ＯＲＦの遺伝子
名とｏｒｆ＿ｓｈａｒｐ＿ｉｄを表８に示す。なお、表
８中のｏｒｆ＿ｓｈａｒｐ＿ｉｄと遺伝子名の内容は、
ＧｅｎｏＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｅｃｏｌｉ．ａｉｓ
ｔ−ｎａｒａ．ａｃ．ｊｐ／）としてインターネット上
に公開されているデータベースに対応している。また、
各ＯＲＦの塩基配列は、ｏｒｆ＿ｓｈａｒｐ＿ｉｄから
ＧｅｎｏＢａｓｅより入手可能である。

【００７０】

【表８】

【００７１】（２）合成オリゴヌクレオチドのスポット
溶液の調製は、以下のようにして行った。まず、当該Ｏ
ＲＦについて、配列表の配列番号１００〜１５９に記載
の塩基配列を有する４０ｍｅｒ及び６０ｍｅｒの１本鎖
オリゴヌクレオチドを各３種類ずつ設計し合成した。ま
た、表９に配列番号とＯＲＦ番号との対応を示した。な
お、合成したオリゴヌクレオチドは５’末端がアミノ基
で修飾されている。

【００７２】

【表９】

【００７３】上記のオリゴヌクレオチドおよび、配列表
の配列番号５９〜６１に記載の塩基配列を有するヒト
β−アクチン遺伝子の４０ｍｅｒオリゴヌクレオチドと
配列表の配列番号６７〜６９に記載の塩基配列を有する
６０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを、実施例１と同様にし
て炭酸バッファーに溶解し、３種類の溶解液を等量ずつ
混合したものスポット溶液とした。

【００７４】（３）ＰＣＲ産物のスポット溶液の調製
は、以下のようにして行った。まず、大腸菌Ｋ−１２
株のゲノムＤＮＡ１００ｎｇを鋳型として、配列表の
配列番号１６０〜１７９に記載の塩基配列を有するプラ
イマー対を５００ｐｍｏｌずつ用い、ＰＣＲＡｍｐｌ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（宝酒造社製）を使用して
反応液容量を１５００μｌにしてＰＣＲ反応を行なっ
た。反応条件は、９４℃ ２０秒、５５℃、３０秒、７
２℃ １分を１サイクルとして３５サイクル行なった。
なお、プライマーの配列番号とｏｒｆ＿ｓｈａｒｐ＿ｉ
ｄとの対応は、表８に示した。

【００７５】反応終了後、当該増幅産物をＱＩＡｑｕｉ
ｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（キ
アゲン社製）を用いて精製し、精製物をエタノール沈殿
後、終濃度が０．３μｇ／μｌになるように、０．０５
％シュークロースモノラウレートを含有する４０ｍＭ
炭酸バッファー（ｐＨ９．５）に溶解した。なお、ｏｒ
ｆ＿ｓｈａｒｐ＿ｉｄが６１６＃５と６２６＃１、４１
８＃１のＯＲＦについては、目的とするサイズの増幅産
物が得られなかったことから、ＰＣＲ産物のスポット溶
液を調製することができなかった。

【００７６】上記（２）で調製した合成オリゴヌクレオ
チドのスポット溶液と、上記（３）で調製したＰＣＲ産
物のスポット溶液を使用して、実施例１と同様にしてマ
イクロアレイを作製した。

【００７７】（４）蛍光標識ｃＤＮＡの調製と解析は、
以下のようにして行った。大腸菌Ｋ−１２株を、５０
０ｍｌ三角フラスコに用意した１２０ｍｌのＬＢ液体培
地（フナコシ社製）と、４８ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、２
２ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、８．６ｍＭＮａＣｌ、１９ｍ
ＭＮＨ_４Ｃｌ、２ｍＭＭｇＳＯ_４、１ｍＭＣａＣ
ｌ_２、５０μｇ／ｍｌトリプトファン、２．５μｇ／
ｍｌチアミン、０．２％ＣａｓａｍｉｎｏＡｃｉ
ｄｓ（ＤＩＦＣＯ社製）、０．２％グルコースからなる
１２０ｍｌのＭ９−ＣＡＡ培地にて、３７℃で振盪培養
した。６００ｎｍの吸光度が１．０付近に達した培養液
から、菌体を遠心により集め、ＲＮｅａｓｙＭｉｄｉ
Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、キットに添付のプ
ロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮ
ＡをＤＮａｓｅＩ（宝酒造社製）で３７℃、１時間処理
した後、フェノール／クロロホルム処理を行った。次い
で、エタノール沈殿を行った後、ジエチルピロカーボネ
ート（ＤＥＰＣ）処理水に溶解した。

【００７８】上記全ＲＮＡ２０μｇを鋳型として、Ｉ
ｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅの取扱説明書に従い、Ｃｙ３−ｄ
ＵＴＰ（ＬＢ培地）とＣｙ５−ｄＵＴＰ（Ｍ９培地）で
標識されたｃＤＮＡを調製・精製し、次いで、２種類の
標識ｃＤＮＡを混合した。当該混合溶液と、上記マイク
ロアレイを用い、実施例１に記載した方法により、ハイ
ブリダイゼーションとスキャニング、シグナル強度の定
量を行った。この際、Ｃｙ５の蛍光測定には、励起波長
として６３５ｎｍ、測定波長として６６０ｎｍを用い
た。その後、各スポットについて、Ｃｙ５のシグナル強
度に対するＣｙ３のシグナル強度の比率を求め、さらに
当該比率の底を２とする対数を算出した。その結果を表
１０に示す。なお、陰性コントロールであるヒト β−
ａｃｔｉｎ遺伝子に対応するスポットからは、バックグ
ラウンドレベルのシグナルしか認められなかった。な
お、シグナル強度がバックグラウンドレベルであったも
のについては、Ｎ．Ｄ．と表記した。

【００７９】

【表１０】

【００８０】表１０で明らかなように、４０ｍｅｒと６
０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを混合したスポットの発
現比率は遺伝子間で大きく異なっていたが、この値はＰ
ＣＲ産物のスポットの発現比率とおおむね一致してい
た。このことから、４０ｍｅｒもしくは６０ｍｅｒのオ
リゴヌクレオチドを混合して作製したマイクロアレイ
は、従来のＰＣＲ法で増幅した２本鎖ＤＮＡのマイクロ
アレイと同様に、発現解析に好適に使用できることが確
認できた。

【００８１】

【発明の効果】本発明の核酸固定化アレイによって、バ
ックグラウンドが低く、かつ高い検出感度が得られるア
レイ及び該アレイを用いた標的核酸の高感度検出方法が
提供される。

【００８２】配列表フリーテキスト SEQ ID NO:1: Lambda phage SEQ ID NO:2: Lambda phage SEQ ID NO:3: Designed oligonucleotide probe for de
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etecting Human beta-actin mRNA SEQ ID NO:71: Designed oligonucleotide probe for d
etecting Human beta-actin mRNA SEQ ID NO:72: Designed oligonucleotide primer SP6-
LambdaA-F for amplifying Lambda DNA fragment 1 use
d as a template for in vitro transcription SEQ ID NO:73: Designed oligonucleotide primer Poly
T-LambdaA-R for amplifying Lambda DNA fragment 1 u
sed as a template for in vitro transcription SEQ ID NO:74: Designed oligonucleotide probe for d
etecting Human ubiquitin mRNA SEQ ID NO:75: Designed oligonucleotide probe for d
etecting Human ubiquitin mRNA SEQ ID NO:76: Designed oligonucleotide probe for d
etecting Human ubiquitin mRNA SEQ ID NO:77: Designed oligonucleotide probe for d
etecting Human ubiquitin mRNA SEQ ID NO:78: Designed oligonucleotide probe for d
etecting Human ubiquitin mRNA SEQ ID NO:79: Designed oligonucleotide probe for d
etecting Human ubiquitin mRNA SEQ ID NO:80: Designed oligonucleotide probe for d
etecting Human ubiquitin mRNA SEQ ID NO:81: Designed oligonucleotide probe for d
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etecting Human ubiquitin mRNA SEQ ID NO:83: Designed oligonucleotide probe for d
etecting Human ubiquitin mRNA SEQ ID NO:84: Designed oligonucleotide probe for d
etecting Human ubiquitin mRNA SEQ ID NO:85: Designed oligonucleotide probe for d
etecting Human ubiquitin mRNA SEQ ID NO:86: Designed oligonucleotide probe for d
etecting Human ubiquitin mRNA SEQ ID NO:87: Designed oligonucleotide probe for d
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etecting Human alpha-tubulin mRNA SEQ ID NO:100: Designed oligonucleotide probe for
detecting Escherichia coli Succinate dehydrogenase
13k hydrophobic protein mRNA SEQ ID NO:101: Designed oligonucleotide probe for
detecting Escherichia coli Succinate dehydrogenase
13k hydrophobic protein mRNA SEQ ID NO:102: Designed oligonucleotide probe for
detecting Escherichia coli Succinate dehydrogenase
13k hydrophobic protein mRNA SEQ ID NO:103: Designed oligonucleotide probe for
detecting Escherichia coli Periplasmic protein pre
cursor mRNA SEQ ID NO:104: Designed oligonucleotide probe for
detecting Escherichia coli Periplasmic protein pre
cursor mRNA SEQ ID NO:105: Designed oligonucleotide probe for
detecting Escherichia coli Periplasmic protein pre
cursor mRNA SEQ ID NO:106: Designed oligonucleotide probe for
detecting Escherichia coli Citrate synthase mRNA SEQ ID NO:107: Designed oligonucleotide probe for
detecting Escherichia coli Citrate synthase mRNA SEQ ID NO:108: Designed oligonucleotide probe for
detecting Escherichia coli Citrate synthase mRNA SEQ ID NO:109: Designed oligonucleotide probe for
detecting Escherichia coli Glycogen operon protein
GlgX mRNA SEQ ID NO:110: Designed oligonucleotide probe for
detecting Escherichia coli Glycogen operon protein
GlgX mRNA SEQ ID NO:111: Designed oligonucleotide probe for
detecting Escherichia coli Glycogen operon protein
GlgX mRNA SEQ ID NO:112: Designed oligonucleotide probe for
detecting Escherichia coli DNA topoisomerase I mRN
A SEQ ID NO:113: Designed oligonucleotide probe for
detecting Escherichia coli DNA topoisomerase I mRN
A SEQ ID NO:114: Designed oligonucleotide probe for
detecting Escherichia coli DNA topoisomerase I mRN
A SEQ ID NO:115: Designed oligonucleotide probe for
detecting Escherichia coli Translation elongation
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detecting Escherichia coli Translation elongation
factor EF-TU. A mRNA SEQ ID NO:117: Designed oligonucleotide probe for
detecting Escherichia coli Translation elongation
factor EF-TU. A mRNA SEQ ID NO:118: Designed oligonucleotide probe for
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detecting Escherichia coli UDPglucose-hexose-1-pho
sphate uridylyltransferase mRNA SEQ ID NO:120: Designed oligonucleotide probe for
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amplifying Escherichia coli Succinate dehydrogena
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【００８３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takara Shuzo Co., Ltd <120> Array of nucleic acid <130> T-1603 <160> 179 <210> 1 <211> 1000 <212> DNA <213> Lambda phage <220> <223> A portion of Lambda phage genome <400> 1 gtacggtcat catctgacac tacagactct ggcatcgctg tgaagacgac gcgaaattca 60 gcattttcac aagcgttatc ttttacaaaa ccgatctcac tctcctttga tgcgaatgcc 120 agcgtcagac atcatatgca gatactcacc tgcatcctga acccattgac ctccaacccc 180 gtaatagcga tgcgtaatga tgtcgatagt tactaacggg tcttgttcga ttaactgccg 240 cagaaactct tccaggtcac cagtgcagtg cttgataaca ggagtcttcc caggatggcg 300 aacaacaaga aactggtttc cgtcttcacg gacttcgttg ctttccagtt tagcaatacg 360 cttactccca tccgagataa caccttcgta atactcacgc tgctcgttga gttttgattt 420 tgctgtttca agctcaacac gcagtttccc tactgttagc gcaatatcct cgttctcctg 480 gtcgcggcgt ttgatgtatt gctggtttct ttcccgttca tccagcagtt ccagcacaat 540 cgatggtgtt accaattcat ggaaaaggtc tgcgtcaaat ccccagtcgt catgcattgc 600 ctgctctgcc gcttcacgca gtgcctgaga gttaatttcg ctcacttcga acctctctgt 660 ttactgataa gttccagatc 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Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human beta-actin mRNA <400> 67 cgtctggacc tggctggccg ggacctgact gactacctca tgaagatcct caccgagcgc 60 <210> 68 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human beta-actin mRNA <400> 68 ggagaagctg tgctacgtcg ccctggactt cgagcaagag atggccacgg ctgcttccag 60 <210> 69 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human beta-actin mRNA <400> 69 catcatgaag tgtgacgtgg acatccgcaa agacctgtac gccaacacag tgctgtctgg 60 <210> 70 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human beta-actin mRNA <400> 70 tcaggattta aaaactggaa cggtgaaggt gacagcagtc ggttggagcg agcatccccc 60 <210> 71 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human beta-actin mRNA <400> 71 tgcattgtta caggaagtcc cttgccatcc taaaagccac cccacttctc tctaaggaga 60 <210> 72 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer SP6-LambdaA-F for amplifying Lambd a DNA fragment 1 used as a template for in vitro transcription <400> 72 atttaggtga cactatagaa tacgtacggt catcatctga cac 43 <210> 73 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer PolyT-LambdaA-R for amplifying Lam bda DNA fragment 1 used as a template for in vitro transcription <400> 73 tttttttttt tttttttttt tttttgcaat cggcatgtta aacgg 45 <210> 74 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human ubiquitin mRNA <400> 74 cagaggtggg atgcagatct tcgtgaagac cctgactggt 40 <210> 75 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human ubiquitin mRNA <400> 75 agctggaaga tggacgcacc ctgtctgact acaacatcca 40 <210> 76 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human ubiquitin mRNA <400> 76 ccgtcttaga ggtgggatgc agatcttcgt gaagaccctg 40 <210> 77 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human ubiquitin mRNA <400> 77 ctggtgctcc gtctcagagg tgggatgcag atcttcgtga 40 <210> 78 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human ubiquitin mRNA <400> 78 ggtaagacca tcaccctcga ggttgagccc agtgacacca 40 <210> 79 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human ubiquitin mRNA <400> 79 gtggagccca gtgacaccat cgagaacgtc aaggcaaaga 40 <210> 80 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human ubiquitin mRNA <400> 80 agcagaggtt gatctttgcc ggaaagcagc tggaagatgg 40 <210> 81 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human ubiquitin mRNA <400> 81 cagaggtggg atgcagatct tcgtgaagac cctgactggt 40 <210> 82 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human ubiquitin mRNA <400> 82 agatggacgc accctgtctg actacaacat ccagaaagag tccaccctgc acctggttct 60 <210> 83 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human ubiquitin mRNA <400> 83 cagctggaag atggacgcac cctgtctgac tacaacatcc agaaagagtc caccctgcac 60 <210> 84 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human ubiquitin mRNA <400> 84 acctggtgct ccgtctcaga ggtgggatgc aaatcttcgt gaagacactc actggcaaga 60 <210> 85 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human ubiquitin mRNA <400> 85 gtggagccca gtgacaccat cgagaacgtc aaggcaaaga tccaggacaa ggaaggcatt 60 <210> 86 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human ubiquitin mRNA <400> 86 gaaacagctg gaagatggac gcaccctgtc tgactacaac atccagaaag agtccactct 60 <210> 87 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human alpha-tubulin m RNA <400> 87 cccggcgccc caggtttcca cagctgtagt tgagccctac 40 <210> 88 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human alpha-tubulin m RNA <400> 88 atcctcacca cccacaccac cctggagcac tctgattgtg 40 <210> 89 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human alpha-tubulin m RNA <400> 89 tgccctatcc ccgcatccac ttccctctgg ccacatatgc 40 <210> 90 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human alpha-tubulin m RNA <400> 90 gatcaccaat gcttgctttg agccagccaa ccagatggtg 40 <210> 91 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human alpha-tubulin m RNA <400> 91 gcttgctgcc tgttgtaccg tggtgacgtg gttcccaaag 40 <210> 92 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human alpha-tubulin m RNA <400> 92 gccattgcca ccatcaagac caagcgtacc atccagtttg 40 <210> 93 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human alpha-tubulin m RNA <400> 93 gggctcgcct ggaccacaag tttgacctga tgtatgccaa 40 <210> 94 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human alpha-tubulin m RNA <400> 94 ttggggaggg gatggaggaa ggtgagtttt cagaggcccg 40 <210> 95 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human alpha-tubulin m RNA <400> 95 gcagtgtttg tagacttgga acccacagtc attgatgaag ttcgcactgg cacctaccgc 60 <210> 96 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Human alpha-tubulin 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Succ inate dehydrogenase 13k hydrophobic protein mRNA <400> 101 ttctatcttg atccatgcct ggatcggcat gtggcaggtg 40 <210> 102 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Succ inate dehydrogenase 13k hydrophobic protein mRNA <400> 102 gcctgatgct gcaactggtg attgtcgttg cactggtggt 40 <210> 103 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Peri plasmic protein precursor mRNA <400> 103 agatcttatg caacaggccc ggcacgaaca gcctcctgtt 40 <210> 104 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Peri plasmic protein precursor mRNA <400> 104 aaaagtccgc aaccaaatgt atcgcctgtt aacgccggag 40 <210> 105 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Peri plasmic protein precursor mRNA <400> 105 agcagttgcg tgacgtgacg caatggcaaa aaagttcatc 40 <210> 106 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Citr ate synthase mRNA <400> 106 gcgaccgatt ctaactacct ggaagtttgt tacatcctgc 40 <210> 107 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Citr ate synthase mRNA <400> 107 gtaacttcct gaatatgatg ttctccacgc cgtgcgaacc 40 <210> 108 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Citr ate synthase mRNA <400> 108 atgttcaccg tcattttcgc aatggcacgt accgttggct 40 <210> 109 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Glyc ogen operon protein GlgX mRNA <400> 109 aacgatcatt tccgcgatgc tgcccgtcgt ttctggctac 40 <210> 110 <211> 40 <212> DNA 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Cyst eine synthase B mRNA <400> 126 tcagcgcgat gcggaaaaca ccatgcgcga actggcggtg 40 <210> 127 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Cyst eine synthase A mRNA <400> 127 cctgaaattc acgaaaagac caccggtccg gagatatggg 40 <210> 128 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Cyst eine synthase A mRNA <400> 128 taaacctggc ccgcataaaa ttcagggtat tggcgctggt 40 <210> 129 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Cyst eine synthase A mRNA <400> 129 ctacaagaag atgaaagctt taccaacaag aatattgtgg 40 <210> 130 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Succ inate dehydrogenase 13k hydrophobic protein mRNA <400> 130 aggacgcaat ggcgtacatg atttcatcct cgttcgcgct accgctatcg tcctgacgct 60 <210> 131 <211> 60 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detecting Escherichia coli DNA topoisomerase I mRNA <400> 143 gactgcccga cttgtggtcg caaaatgggg attcgcacag cgagcaccgg ggtattcctt 60 <210> 144 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli DNA topoisomerase I mRNA <400> 144 gtggcaccac cgaaagaaga tccggtgcca ttacctgagc tgccgtgcga aaaatcagat 60 <210> 145 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Tran slation elongation factor EF-TU. A mRNA <400> 145 tcgtggtatc accatcaaca cttctcacgt tgaatacgac accccgaccc gtcactacgc 60 <210> 146 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Tran slation elongation factor EF-TU. A mRNA <400> 146 aacgcggtat catcaaagtt ggtgaagaag ttgaaatcgt tggtatcaaa gagactcaga 60 <210> 147 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Tran slation elongation factor EF-TU. A mRNA <400> 147 acaacatcaa aatggttgtt accctgatcc acccgatcgc gatggacgac ggtctgcgtt 60 <210> 148 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli UDPg lucose-hexose-1-phosphate uridylyltransferase mRNA <400> 148 cgatgggctg ctctaacccg catccgcacg gtcagatttg ggcaaatagc ttcctgccta 60 <210> 149 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli UDPg lucose-hexose-1-phosphate uridylyltransferase mRNA <400> 149 tggttagccg tcgtgcctta ctgggctgcc tggccgttcg aaacgctact gctgcccaaa 60 <210> 150 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli UDPg lucose-hexose-1-phosphate uridylyltransferase mRNA <400> 150 tttatccgcc tctgctgcgc tccgccaccg tacgtaaatt tatggttggt tatgaaatgc 60 <210> 151 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli ATP synthase gamma chain mRNA <400> 151 atggccggcg caaaagagat acgtagtaag atcgcaagcg tccagaacac gcaaaagatc 60 <210> 152 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli ATP synthase gamma chain mRNA <400> 152 caccttgcac acggtaatct ggaatataag cacccttacc tggaagaccg cgacgttaaa 60 <210> 153 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli ATP synthase gamma chain mRNA <400> 153 taacccttcc ctgtccgaac tgatcggtcc ggtaaaagtg atgttgcagg cctacgacga 60 <210> 154 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Cyst eine synthase B mRNA <400> 154 aacaataggc aatacgcctc tggtgaagtt gcagcgaatg gggccggata acggcagtga 60 <210> 155 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Cyst eine synthase B mRNA <400> 155 atcactcatt ttgtctccag catggggacg accggcacta tcaccggcgt ctcacgcttt 60 <210> 156 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Cyst eine synthase B mRNA <400> 156 tcagcgcgat gcggaaaaca ccatgcgcga actggcggtg cgggaaggaa tattctgtgg 60 <210> 157 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Cyst eine synthase A mRNA <400> 157 cctgaaattc acgaaaagac caccggtccg gagatatggg aagataccga cggtcaggtt 60 <210> 158 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Cyst eine synthase A mRNA <400> 158 taaacctggc ccgcataaaa ttcagggtat tggcgctggt tttatcccgg ctaacctcga 60 <210> 159 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe for detecting Escherichia coli Cyst eine synthase A mRNA <400> 159 ctacaagaag atgaaagctt taccaacaag aatattgtgg ttattctacc atcatcgggt 60 <210> 160 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying Escherichia coli Su ccinate dehydrogenase 13k hydrophobic protein gene <400> 160 atggtaagca acgcctccgc attag 25 <210> 161 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying Escherichia coli Su ccinate dehydrogenase 13k hydrophobic protein gene <400> 161 tcacacaccc cacaccacaa cgaat 25 <210> 162 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying Escherichia coli Pe riplasmic protein precursor gene <400> 162 atgttcgacg gcataagttt aaccg 25 <210> 163 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying Escherichia coli Pe riplasmic protein precursor gene <400> 163 ctactgggaa cgtgagttgc tacta 25 <210> 164 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying Escherichia coli Ci trate synthase gene <400> 164 atggctgata caaaagcaaa actca 25 <210> 165 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying Escherichia coli Ci trate synthase gene <400> 165 ttaacgcttg atatcgcttt taaag 25 <210> 166 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying Escherichia coli Gl ycogen operon protein GlgX gene <400> 166 atgacacaac tcgccattgg caaac 25 <210> 167 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying Escherichia coli Gl ycogen operon protein GlgX gene <400> 167 tcatctctgg aacacacaca atccg 25 <210> 168 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying Escherichia coli DN A topoisomerase I gene <400> 168 atgggtaaag ctcttgtcat cgttg 25 <210> 169 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying Escherichia coli DN A topoisomerase I gene <400> 169 ttattttttt ccttcaaccc atttg 25 <210> 170 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying Escherichia coli Tr anslation elongation factor EF-TU. A gene <400> 170 gtgtctaaag aaaaatttga acgta 25 <210> 171 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying Escherichia coli Tr anslation elongation factor EF-TU. A gene <400> 171 ttagcccaga actttagcaa caacg 25 <210> 172 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying Escherichia coli UD Pglucose-hexose-1-phosphate uridylyltransferase gene <400> 172 atgacgcaat ttaatcccgt tgatc 25 <210> 173 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying Escherichia coli UD Pglucose-hexose-1-phosphate uridylyltransferase gene <400> 173 ccattttcgc gaatccggag tgtaa 25 <210> 174 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying Escherichia coli AT P synthase gamma chain gene <400> 174 atggccggcg caaaagagat acgta 25 <210> 175 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying Escherichia coli AT P synthase gamma chain gene <400> 175 ttaaaccgcg gcggcccccg agacg 25 <210> 176 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying Escherichia coli Cy steine synthase B gene <400> 176 gtgagtacat tagaacaaac aatag 25 <210> 177 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying Escherichia coli Cy steine synthase B gene <400> 177 ttaaatcccc gccccctggc taaaa 25 <210> 178 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying Escherichia coli Cy steine synthase A gene <400> 178 atgagtaaga tttttgaaga taact 25 <210> 179 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying Escherichia coli Cy steine synthase A gene <400> 179 ttactgttgc aattctttct cagtg 25

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者浅田起代蔵滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内 (72)発明者加藤郁之進滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 HA14 HA19 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 CC08 FA12 4B063 QA01 QA13 QQ42 QR32 QR55 QS34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】担体表面上のあらかじめ定められた領域
に核酸が整列固定化されたアレイであって、同一遺伝子
の異なる部位の塩基配列を有する少なくとも２種類以上
の核酸が同じ位置に固定化されていることを特徴とする
核酸固定化アレイ。
【請求項２】固定化されている核酸の鎖長が、少なく
とも４０ｍｅｒ以上であることを特徴とする請求項１記
載の核酸固定化アレイ。
【請求項３】固定化されている核酸が、デオキシリボ
ヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドあるいはそれ
らの誘導体で構成されていることを特徴とする請求項１
〜２のいずれか１項に記載の核酸固定化アレイ。
【請求項４】固定化されている核酸は、互いのクロス
ハイブリダイゼーションが抑制されるように選択された
配列からなる核酸であることを特徴とする請求項１〜３
のいずれか１項に記載の核酸固定化アレイ。
【請求項５】固定化されている核酸が、共有結合及び
／又は静電結合を介して担体に結合されていることを特
徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸固定
化アレイ。
【請求項６】担体が、非多孔性担体である請求項１〜
５のいずれか１項に記載の核酸固定化アレイ。
【請求項７】非多孔性担体が、ガラスである請求項６
記載の核酸固定化アレイ。
【請求項８】担体が、該表面をポリアニオンで処理
し、該ポリアニオンを活性エステル誘導体とした担体で
あることを特徴とする請求項６又は７に記載の核酸固定
化アレイ。
【請求項９】固定化されている核酸は、活性化エステ
ル誘導体と反応性を有する官能基で修飾されている核酸
であり、当該官能基を介し担体に結合されていることを
特徴とする請求項８記載の核酸固定化アレイ。
【請求項１０】請求項１〜９のいずれか１項に記載の
核酸固定化アレイを作製する方法であって、同一遺伝子
の異なる部位の塩基配列を有する少なくとも２種類以上
の核酸の混合物を担体表面上のあらかじめ定められた領
域にスポットすることを特徴とする核酸固定化アレイの
作製方法。
【請求項１１】請求項１〜９のいずれか１項に記載の
核酸固定化アレイを用いることを特徴とする標的核酸の
検出方法。
【請求項１２】被検体中の標的核酸を検出する方法で
あって、（ａ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸固定化
アレイに固定化された核酸と、当該核酸に相補的な被検
体中の核酸をハイブリダイズさせる工程、（ｂ）ハイブリダイズした核酸を検出する工程、を包含
することを特徴とする標的核酸の検出方法。