JP2003530116A - アレー上での相同ヌクレオチド配列の検出による生物学的（微）生物の同定 - Google Patents

アレー上での相同ヌクレオチド配列の検出による生物学的（微）生物の同定

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヌクレオチド配列を少なくとも４つの他の相同配列の中から検出することによる、生物学的（微）生物またはその部分の同定および／または定量方法に関し、オリジナル配列の少なくとも部分を、特殊なプライマー対を使用して検出されるべき標的ヌクレオチド配列（２）へと増幅しまたは複製し、所望により前記標的ヌクレオチド配列（２）を標識し、標識された標的ヌクレオチド配列（２）を、不溶性固体支持体（４）、好ましくは非多孔性固体支持体に１つの予め定められた連結によって結合された１本鎖捕捉ヌクレオチド配列（３）と接触させ、標的ヌクレオチド配列（２）とその対応捕捉ヌクレオチド配列（３）との間の相補的塩基対によるハイブリダイゼーションから生じるシグナルを検出、定量および／または記録することによって、生物またはその部分の特異的な標的ヌクレオチド配列（２）の結合を識別することを含み、前記捕捉ヌクレオチド配列（３）はアレーに従って所定位置で不溶性固体支持体（４）に結合され、前記アレーは固体支持体表面１ｃｍ２当たり、少なくとも４つの異なった結合１本鎖捕捉ヌクレオチド配列の密度を有する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の技術分野 本発明は診断分野の発明であり、１つのプライマー対で増幅した後、そのヌク
レオチド配列を同定することによって、相同ヌクレオチド配列を有する他のもの
の中から、（微）生物を同定（検出および／または定量）するための試薬および
手段を含む方法およびキットに関する。
【０００２】 本発明は、同じ属または科である（微）生物の同定および／または定量、ある
いは生物学的試料中に存在する特定（微）生物中の関連遺伝子の検出および／ま
たは定量に特に適している。
【０００３】発明の背景 バイオチップ技術の開発により、所与の分析において同時に多数のヌクレオチ
ド配列を検出でき、したがって、その対応する生物またはその生物の一部分を同
定することができるようになった。アレーは分析されるべき試料中に存在する可
能性がある対応標的ヌクレオチド配列に（ハイブリダイゼーションにより）結合
できる捕捉ヌクレオチド配列（またはプローブ）を担持する一連の別個の領域を
、その表面に含む固体支持体である。もし標的配列が逆転写または前記配列の増
幅中に変性ヌクレオチドで標識されるなら、そのとき、シグナルは結合位置で検
出および測定され得る。その強度は試料中に存在する標的配列の量の評価となる
。このような技術は、診断またはスクリーニングの目的で、遺伝子または種の同
定および／または定量を可能とする。
【０００４】先行技術 企業Affymetrix Inc.は、処理の各工程でマスクを使用することによる特定位
置での固体支持体上のオリゴヌクレオチドの直接合成方法を開発している。この
方法は所望位置で所望配列を得るために、伸長するオリゴヌクレオチド上への新
規なヌクレオチドの付加を含む。この方法は写真平板技術に由来し、新規なヌク
レオチドが添加される前に放出される光防護基の使用に関連する（ＥＰ−Ａ１−
０４７６０１４、米国特許第５４４５９３４号、米国特許第５１４３８５４号お
よび米国特許第５５１０２７０号）。しかしながら、小さなオリゴヌクレオチド
のみが表面上に存在し、かつ、前記方法はアレーに結合された各特定オリゴヌク
レオチドに対応するポジティブスポットのパターンを配列決定するか、あるいは
同定する用途を主に見い出す。標的配列の特性化はこのようなパターンを対照と
比較して得られる。前記技術はミコバクテリウム・ツバキュローシス(Mycobacte
rium tuberculosis)ｒｐｏＢ遺伝子（ＷＯ９７／２９２１２およびＷＯ９８／２
８４４４）の同定に応用された。その際、捕捉ヌクレオチド配列は３０より小さ
いヌクレオチドを含み、１つのヌクレオチドにより異なる２つの異なった配列の
分析（ＳＮＰ同定または遺伝子型同定）から得られる。その長さがより小さい場
合、１つの塩基において異なる２つのオリゴヌクレオチド間の識別がより高くな
るから、小さな捕捉ヌクレオチド配列（１０〜２０ヌクレオチドからなる長さを
有する）が好ましい。
【０００５】 この方法の感度欠如は、この方法が遺伝子増幅（ＰＣＲ）から得たアンプリコ
ンを直接検出できないという事実から説明される。Ｔ３またはＴ７配列を担持す
るプライマーを使用する二重増幅、および次いでＲＮＡポリメラーゼを使用する
逆転写。これらのＲＮＡはアレー上で検出される前に約４０塩基の片へ切断され
る（ＷＯ９７／２９２１２の実施例１）。しかしながら、長いＤＮＡまたはＲＮ
Ａ断片は表面上に存在する捕捉プローブ上に非常にゆっくりとハイブリダイズす
る。相同性は配列にしたがって変化し、そうして、その片の一部が同じ捕捉プロ
ーブ上にハイブリダイズするから、前記方法は相同配列の検出に適していない。
したがって、その結果を解釈するソフトウェアが得られたデータの解釈を可能と
する方法に導入されるべきである。
【０００６】 しかしながら、ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーに基づく遺伝子発現アレーでは、小
さな捕捉プローブアレーを使用する場合：ハイブリダイゼーションの速度が低い
場合、同じ問題に遭遇する。したがって、断片はより小さな片に切断され、また
、方法は所与遺伝子の存在を証明するシグナルのパターンを得るために、数種の
捕捉ヌクレオチド配列の使用を必要とする（ＷＯ９７／１０３６４およびＷＯ９
７／２７３１７）。前記切断はまた、標識ヌクレオチドの数を減少させ、したが
って、得られたシグナルを低下させる。この場合、長い捕捉ヌクレオチド配列の
使用は、より良い検出感度をもたらす。多くの遺伝子発現の応用では、検出され
るべきｃＤＮＡが異なった配列を有する遺伝子から生じた場合、それらの間には
交差反応が存在しないから、長い捕捉プローブの使用は問題ではない。長い捕捉
ヌクレオチド配列は要求される感度をもたらすが、しかしながら、これらは他の
相同配列にハイブリダイズするであろう。
【０００７】 膜またはナイロン支持体を使用することは、支持体と捕捉ヌクレオチド配列の
間にスペーサーを導入して、固体支持体での検出感度を増加させることが提案さ
れている。Van Ness et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 19, p.3345, 1991
)は、ナイロン膜上にＤＮＡを結合するポリ（エチレンイミン）アームについて
記載する。ヨーロッパ特許出願ＥＰ−０５１１５５９は、膜上への小さなオリゴ
ヌクレオチド結合のためのスペーサーとして、ヘキサエチレングリコール誘導体
を記載する。ナイロンなどの膜が支持体として使用される場合、固体支持体とオ
リゴヌクレオチドとの間に結合部位の制御が存在せず、そして、ポリｄＴテイル
が固定収率およびこのようにして得られるハイブリダイゼーションを増加させる
ことが観察された（ＷＯ８９／１１５４８）。同様な結果はポリマー中に存在す
る反復捕捉配列を用いて得られる（米国特許第５６８３８７２号）。
【０００８】 Guo et al.(Nucleic Acids Research 22, 5456, 1994)は、増加したハイブリ
ダイゼーション感度を示すガラス上でのオリゴヌクレオチドの結合のためのスペ
ーサーとして、１５塩基のポリｄＴの使用ついて教示する。
【０００９】 文献ＷＯ９９／１６７８０は、ナイロンストリップ上での遺伝子ｆｅｍＡの４
つの相同配列の検出について記載する。しかしながら、この方法および検出の感
度に関するデータは示されていない。前記文献では、捕捉ヌクレオチド配列はコ
ンセンサス配列と５０％より小さな相同性を有する１５〜３５０塩基を含む。
【００１０】 Anthony et al. (Journal of clinical microbiology, Vol.38, nr.2, p.7817
-8820)の刊行物は、数種の関連生物から生じた低感度の相同配列を用いる、識別
のための膜アレーの使用について記載する。検出する標的はコンセンサスＰＣＲ
によって細菌から増幅されたｒＤＮＡであり、前記細菌の捕捉ヌクレオチド配列
を含み、かつ、ナイロンに共有結合される２０〜３０塩基を有する捕捉ヌクレオ
チド配列を有するナイロンアレー上で検出が得られ、そして、ハイブリダイゼー
ションのために利用可能である配列の部分制御は存在しない。
【００１１】発明の目的 本発明は、相同ヌクレオチド配列を有する多数の（微）生物または（微）生物
の一部分の簡便な同定（検出および／または定量）のためのマイクロアレーまた
はバイオチップ技術を改良する新規な方法および装置を提供することを目的とす
る。
【００１２】 本発明の別の目的は、増幅工程中に１つのプライマーの使用を必要とする簡単
な技術に基づき、かつ、前記マイクロアレー上で１つのスポットシグナルを同定
および／または記録することによって特定標的配列の同定（検出および／または
定量）を可能とするこのような方法および装置を提供することにあり、前記シグ
ナルはその対応する捕捉配列と標的配列の特異的結合からのみ生じる。
【００１３】定義 「核酸、オリゴヌクレオチド、アレー、プローブ、標的核酸、実質的に結合す
る、特異的にハイブリダイズする、バックグランド、定量する」の用語は、国際
特許出願ＷＯ９７／２７３１７（本明細書中に参考として導入する）に記載され
るものである。
【００１４】 「ヌクレオチドトリホスフェート、ヌクレオチド、プライマー配列」の用語は
、文献ＷＯ００／７２０１８およびＰＣＴ／ＢＥ００／００１２３（本明細書中
に参考として導入する）に記載されるものである。
【００１５】 「相同配列」および「コンセンサス配列」の用語は、ヨーロッパ特許出願００
８７００５５．１（本明細書中に参考として導入する）に記載される。
【００１６】発明の要約 本発明者らは、共通したプライマー対を使用する１つの増幅を組み合わせて、
相同配列を有する多くの他の（微）生物の中から、１つまたはいくつかの（微）
生物を同定すること、および捕捉配列とその対応する標的配列との間の結合から
のみ生じる１つのシグナルの存在をアレー上で検出および所望により記録し、か
つ、前記検出標的配列の存在を前記（微）生物の特異的遺伝子配列の同定に相関
づけることによる、可能性のある（微）生物を同定することを非常に簡単化する
ことができることを発見した。これは、本発明の方法および装置が他の相同配列
の中から特定配列の容易な同定／検出、および所望により標的配列の定量（生物
学的試料中の前記生物のコピー数または存在の特性化）を可能とし、前記標的配
列は前記（微）生物の特異的ヌクレオチド配列を有することを意味する。
【００１７】 このような同定は、可能性ある汚染物質（未結合配列）の洗浄後、１つの特定
決定位置での１つのスポットシグナルを検出し、所望により定量し、かつ、記録
することによって直接に得てもよい。その際、前記捕捉ヌクレオチド配列は先に
結合され、そして、前記同定は先行技術の系において提案されているマイクロア
レー上の特定パターンの分析の結果でない。したがって、前記方法および装置は
、画像処理およびソフトウェア解析による前記パターンの詳細な解析を必ずしも
必要としない。
【００１８】 本発明は、一方は１つのかつ有利に予定（限定）された連結によって支持体（
好ましくは非多孔性支持体）に結合されたスペーサーであり、他方はヌクレオチ
ド標的配列とハイブリダイズすることができる特定ヌクレオチド配列である、少
なくとも２つの部分から構成された結合捕捉ヌクレオチド配列を使用して、高感
度でアレー上の他の相同配列から、標的配列が識別され得ることを発見すること
によって可能となった。
【００１９】 さらに、もし高濃度の捕捉ヌクレオチド配列が固体支持体の表面に結合される
なら、前記検出は大きく増加される。
【００２０】 本発明は、（微）生物またはその一部分の少なくとも４つの他の相同配列から
、生物学的（微）生物またはその一部分から得た標的配列、特に生物学的試料中
に存在する可能性があるヌクレオチド配列の同定に関する。前記他の（微）生物
は、同じ生物学的試料中に存在し、かつ、標的（ヌクレオチド配列）と相同なヌ
クレオチド配列を有する。
【００２１】 前記同定は、まず、共通プライマー対によって、前記ヌクレオチド配列（標的
および相同配列）の遺伝子増幅、続いて、（洗浄後）増幅された可能性ある異な
った標的間の識別により得られる。生物学的試料中に存在する可能性がある各（
微）生物に特異的な標的に特異的である、所与の位置の捕捉ヌクレオチド配列を
含むアレーの表面上でのハイブリダイゼーション、および期待される位置のその
対応捕捉配列上でのこの標的の特異的結合から生じるシグナル（１つの位置シグ
ナルは標的に特異的である）の同定および所望により記録による前記特定標的の
同定によって、前記識別は有利に得られる。
【００２２】 本発明によれば、遺伝子増幅の好ましい方法は、前記標的相同ヌクレオチド配
列を認識することができる２つの逆−平行(anti-parallel)コンセンサスプライ
マーを使用するＰＣＲである。
【００２３】 本発明による方法は、下記のものの存在に（所望により記録された）検出シグ
ナルを相関させる工程をさらに含む： ・特定（微）生物、 ・（微）生物から得た配列の遺伝的特徴、 ・前記配列の多型性、 ・生物学的試料が得られた患者（ヒトを含む）の癌を含む、遺伝的疾患の診断素
因(predisposition)または進化（モニターリング）。
【００２４】 したがって、前記（微）生物はいかなる生物学的材料（ウイルス、菌類、細菌
、植物または人体の要素を含む動物細胞）中にも存在する。生物学的試料は、微
生物、生体異物または汚染物質が存在するいかなる培養培地、ならびに植物また
は（ヒトを含む）動物の器官、組織、細胞または生物学的液体（血液、血清、尿
など）から得られた抽出物であることもできる。
【００２５】 本発明の方法は、不溶性固体支持体表面１ｃｍ２当たり、少なくとも４、好ま
しくは少なくとも１０、１６、２０、５０、１００、１０００、４０００、１０
０００またはそれ以上の異なった１本鎖捕捉ヌクレオチド配列の密度を有するア
レーによって、１本鎖捕捉ヌクレオチド配列に結合された（好ましくは、直接共
有結合によって、あるいはスペーサーの中間体によって固体支持体の表面に結合
された）、不溶性固体支持体を少なくとも含む特異的同定（診断および／または
定量）キットまたは装置を使用して実施され得る。前記１本鎖捕捉ヌクレオチド
配列は、有利には約３０〜約６００塩基（スペーサーを含む）からなる長さを有
し、かつ、約１０〜約６０塩基の配列を含み、前記配列は標的に対して特異的で
ある（これは前記配列の前記塩基は、相補的ハイブリダイゼーションによって、
標的配列上のその相補的塩基と結合を形成できることを意味する）。好ましくは
、前記ハイブリダイゼーションは厳密な条件下（当業者に周知である条件下）に
得られる。
【００２６】 本発明の方法およびキットまたは装置では、捕捉ヌクレオチド配列は１６〜６
００塩基、好ましくは３０〜３００塩基、より好ましくは４０〜１５０塩基を有
する配列であり、かつ、スペーサーは（少なくとも４つの炭素鎖の）少なくとも
６．８ｎｍ長の化学鎖であり、３０塩基以上のヌクレオチド配列はＰＭＡなどの
ヌクレオチド誘導体である。
【００２７】 本発明の方法、キットおよび装置は、少なくとも４、１２、１５またはそれ以
上の相同配列が存在する生物学的試料中に存在する可能性がある標的の同定に特
に好適である。高い相同性ゆえに、前記配列は共通プライマーにより増幅され、
その結果、標的の同定は具体的にはマイクロアレー上の所与の位置にすでに結合
された対応捕捉ヌクレオチド配列との結合に続く識別によって得られる。もし捕
捉ヌクレオチド配列が高密度でロボットによってアレーに従って固体支持体表面
にスポットされるなら、感度はまた、より大きく増加され得る。本発明の好まし
い実施態様は、固体支持体表面１ｃｍ２当たり、配列等量約０．０１〜約５ｐｍ
ｏｌｅの結合となる、アレー上にスポットされたある量の捕捉ヌクレオチド配列
を使用することである。
【００２８】 本発明のキットまたは装置はまた、本発明の方法の全てまたはいくつかの特定
工程を実施する種々の媒体または装置を組み込んでいてもよい。前記キット（ま
たは装置）はまた、解析されるべき生物学的試料中に存在する多数の相同ヌクレ
オチド配列の同定および／または定量のための高い処理能力を有するスクリーニ
ング装置などの自動化装置中に含まれ得る。
【００２９】 本発明の方法、キット（装置）または器具では、結合捕捉ヌクレオチド配列の
長さは、好ましくは約３０〜約６００塩基、好ましくは約４０〜約４００塩基、
より好ましくは約４０〜約１００塩基から構成される。もしより長いヌクレオチ
ドがヘアピン系２次構造を採用して、あるいは互いに相互作用して、通常、標的
ヌクレオチド配列の結合収率を低下させないなら、それらが使用され得る。
【００３０】 もし検出されるべき配列間の相同性が低い（３０〜６０％）なら、各配列に特
異的である配列の一部分が、異なった標的配列のそれぞれを結合する特定捕捉ヌ
クレオチド配列の設計に使用され得る。しかしながら、全ての所望配列を増幅ま
たは複製する「コンセンサス」配列を設計するように、十分に保存された配列の
一部分を見つけることはより難しい。もし１対のコンセンサスプライマーが、全
ての相同配列を増幅するのに十分でないなら、そのとき、２つまたはそれ以上の
プライマー対の混合物が所望増幅を得るために添加される。同じコンセンサスプ
ライマーによって増幅された最小相同配列は、２つであるが、この数に限定され
ない。
【００３１】 もし配列がより高い相同性、６０％以上、さらには９０％以上を示すなら、そ
のとき、コンセンサスプライマーの共通配列の発見が容易に達成されるが、特定
捕捉ヌクレオチド配列の選択はより難しくなる。
【００３２】 本発明の他の好ましい実施態様では、捕捉ヌクレオチド配列は（プログラムさ
れた自動合成機で容易に実施された）１００塩基より短い化学的に合成されたオ
リゴヌクレオチド配列である。このような配列は、支持体上での共有結合におけ
る官能基を高濃度で担持することができる。
【００３３】 より長い捕捉ヌクレオチド配列は、（捕捉ヌクレオチド配列の特定部分および
非特定部分（スペーサー）を含むプラスミド中に導入された配列の）ＰＣＲ増幅
によって、好ましくは合成される。
【００３４】 本発明の他の実施態様では、捕捉ヌクレオチド配列の特定配列は、二重螺旋型
の少なくとも２０塩基対長ヌクレオチドの距離に等しい、少なくとも約６．８ｎ
ｍ長のスペーサーによって固体支持体の表面から分離されている。
【００３５】 本発明の方法、キット（装置）または器具では、標的に相補的である捕捉ヌク
レオチド配列の部分（または一部分）は約１０〜約６０塩基、好ましくは約１５
〜約４０塩基、より好ましくは約２０〜３０塩基から構成される。これらの塩基
は好ましくは捕捉ヌクレオチド配列の末端にあるいはその近くに配置された連続
配列として割り当てられる。この配列は検出のための特定配列として考えられる
。本発明の好ましい形態では、特定捕捉ヌクレオチド配列と支持体表面との間に
位置される配列は、非特定配列である。
【００３６】 本発明の他の実施態様では、約１０〜約６０塩基、好ましくは約１５〜約４０
塩基、より好ましくは約２０〜約３０塩基を含む特定ヌクレオチド配列は、約３
０〜約６００塩基の配列を含む捕捉ヌクレオチド配列上に配置される。
【００３７】 本発明の方法、キット（装置）または器具は、その全長上に一部または全体的
として相同である配列を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡから作られる標的の検出およ
び／または定量に適している。
【００３８】 本発明の方法は、標的が他の分子と３０％より大きい、６０％より大きい、さ
らには８０％より大きい相同性（または配列同一性）を示す場合でも実施され得
る。
【００３９】 本発明の方法、キット（装置）または器具では、捕捉ヌクレオチド配列は有利
には、不溶性固体支持体上に、好ましくは後記するように、その末端の一方で共
有結合（または固定化）される。
【００４０】 本発明の方法は、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、好ましくは約０．１ｎＭ以
下、より好ましくは約０．０１ｎＭ（＝１ｆｍｏｌｅ／１００μｌ）以下の濃度
での溶液中のアンプリコンの同定（検出および定量）を可能とする有意な結果を
生じる。
【００４１】 本発明の他の重要な態様は、表面での非常に濃度の高い捕捉ヌクレオチド配列
を使用することである。もし、非常に低いと、結合収率は急速に低くなり、検出
不可能である。スポッティング溶液中、約６００〜約３０００ｎＭの捕捉ヌクレ
オチド配列濃度が好ましい。しかしながら、約１００ｎＭと低い濃度でも、好ま
しい場合（共有固定率が高い場合、あるいは検出されるべき標的が１本鎖であっ
て、高濃度で存在する場合）には、ポジティブな結果を生じる。このような低ス
ポッティング濃度は、１ｃｍ２当たり２０ｆｍｏｌｅと低い捕捉ヌクレオチド配
列密度を生じるであろう。他方、より高い密度は捕捉溶液の濃度によって、その
分析中に限定されるのみであったが、３０００ｎＭよりもなおも高い濃度はよい
結果を生じる。
【００４２】 これらの非常に高い濃度および長いプローブの使用は、予期されない結果をも
たらす。溶液中の２つのＤＮＡ相補配列間のハイブリダイゼーション速度はＤＮ
Ａ長さの平方根に比例し、より小さなものは限定された因子である(Wetmur, J.G
.およびDavidson, N.1968, J. Mol. Biol. 3, 584)というＤＮＡハイブリダイゼ
ーション理論が提案されている。要求された特異性を得るために、捕捉ヌクレオ
チド配列の特異的配列は標的に比べて小さくなければならなかった。さらに、標
的はＰＣＲ増幅後に得られ、かつ、２本鎖であり、その結果、それらは固体支持
体上に固定された小さな配列にハイブリダイズするよりもより速く、溶液中で再
び会合し、拡散が小さくなり、したがって、反応速度をさらに低下させる。した
がって、同じ短い特定配列とのハイブリダイゼーション収率において、非常に大
きな増加を観察することは予期されないことであった。
【００４３】 スポットに「結合する」標的の量は、存在する捕捉ヌクレオチド配列の量に比
べて非常に小さい。したがって、大過剰の捕捉ヌクレオチド配列が存在し、かつ
、さらにより多くの捕捉ヌクレオチド配列があっても結合を得る理由は存在しな
かった。
【００４４】 増幅または複製後の完全長の配列上で検出を実施してもよく、また標識化が、
標識ヌクレオチドの導入によって実施される場合には、より多くのマーカーがハ
イブリダイズされた標的上に存在し、この分析を感度よいものとする。
【００４５】 本発明の方法、キットおよび器具は、他の結合捕捉ヌクレオチド配列の使用を
含んでもよい。これは（好ましくは共通プライマーにより増幅された）相同配列
の他の群から得た標的を同定するために使用されてもよい。
【００４６】 微生物の分野では、微生物の各科または属に特異的なコンセンサスプライマー
を使用し、次いで、本発明の捕捉ヌクレオチド配列を使用して、アレー中でこれ
らの種々の科のいくつかあるいは全ての種を同定してもよい。他の配列の検出は
、同じアレー上で有利に実施され得る（すなわち、定量のために使用される標準
ヌクレオチド配列、同じまたは異なった微生物株のためのコンセンサス捕捉ヌク
レオチド配列、微生物による可能性ある抗生物質抵抗性遺伝子の検出を可能とし
、またはハイブリダイゼーションのポジティブまたはネガティブコントロールの
ための配列とのハイブリダイゼーションを可能とすることによって）。前記他の
捕捉ヌクレオチド配列は、（所望により）１０〜６０塩基より長い特定配列およ
び６００塩基と同じ全長を有し、また、不溶性固体支持体上に結合される（好ま
しくは、本発明に関する他の結合捕捉ヌクレオチド配列でもって作られたアレー
中に）。長い捕捉ヌクレオチド配列はまた、同じ科または属の微生物の全ての配
列とのハイブリダイゼーションのためのコンセンサス捕捉ヌクレオチド配列とし
て、アレー上に存在してもよく、したがって、生物学的試料中のこのような科、
属の微生物の存在あるいは不存在についての情報を与える。
【００４７】 同じアレーはまた、細菌群（グラム陽性またはグラム陰性種またはさらに全て
の細菌）に特異的な捕捉ヌクレオチド配列を担持することもできる。
【００４８】 他の応用は、生物学的試料中に存在する可能性がある全てのチトクロームに対
するコンセンサス捕捉ヌクレオチド配列の存在下あるいは不存在下に、特定捕捉
ヌクレオチド配列による種々のチトクロームＰ４５０などの同じ種のコンセンサ
スタンパク質から得た相同遺伝子の検出である。このような検出は、ｃＤＮＡへ
の逆転写による遺伝子レベルで実施される。
【００４９】 本発明の固体支持体は、ゲル層、ガラス、電子機器、シリコーンまたはプラス
チック支持体、ポリマー、コンパクトディスク、金属支持体またはこれらの混合
体からなる群から選択される材料であるか、またはこれらから製造され得る（Ｅ
Ｐ０５３５２４２、米国特許第５７３６２５７号、ＷＯ９９／３５４９９、米国
特許第５５５２２７０号など）。有利には、前記固体支持体は別の手段（バーコ
ード、マーカーなど）または本発明の方法を改良するための媒体を含んでいても
よい１つのガラススライドである。
【００５０】 本発明の方法で使用される増幅工程は、好ましくはＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｌ
ＣＲ、ＣＰＴ、ＮＡＳＢＡ、ＩＣＲまたはＡｄｖａｎｃｈｅＤＮＡ技術からなる
群から選択される周知の増幅プロトコールによって有利に得られる。
【００５１】 有利には、同定されるべき標的は１本鎖捕捉ヌクレオチド配列とのハイブリダ
イゼーションより前もって標識化されている。前記標識化（当業者には周知であ
る技術でもって）は、好ましくは、変性に先立つ増幅配列上でも得られる（もし
この方法が増幅工程を含むなら）。
【００５２】 有利には、標的の長さは好ましくは１００〜２００塩基、好ましくは１００〜
４００塩基、より好ましくは１００〜８００塩基の限定された長さを有するもの
として選択される。この好ましい要求は、試料中におそらく存在する要求される
配列を増幅するためのコンセンサスプライマーを見つける可能性に依存する。あ
まりに長い標的は、より速く再配置し、捕捉ヌクレオチド配列上の固定を阻害す
る２次構造をとるであろう。
【００５３】 遺伝子の検出はまた、本発明の好ましい応用である。相同遺伝子の検出は、ま
ずｍＲＮＡの逆転写、次いで本発明中に記載されるコンセンサスプライマーによ
る増幅によって得られる。
【００５４】 本発明のさらなる態様では、本発明の方法、キット（装置）または器具は、生
物学的試料中にともにあるいは別個に存在する相同器官についての異なったスタ
フィロコッカス(Staphylococcus)種または変異体、好ましくは、Ｓ・アウレウス
(S. aureus)、Ｓ・エピデルミディス(S.epitermidis)、Ｓ・サプロフィティカス
(S.saprophyticus)、Ｓ・ホミニス(S.hominis)またはＳ・ヘモリティカス(S.hae
molyticus)の同定に有利に使用される。この同定は、好ましくはＦｅｍＡ遺伝子
配列の共通する位置を使用して、前記異なった種中のＦｅｍＡ遺伝子の遺伝的変
異体を検出することによって得られる。
【００５５】 好ましくは、増幅産物を得るために使用されるプライマーおよび前記ＦｅｍＡ
配列の特定部分は、実施例２にて以下に記載されるものである。これらのプライ
マーは試験される１６種のスタフィロコッカスの全ＦｅｍＡ遺伝子の増幅のため
のコンセンサスプライマーとして選択され、それらはおそらく他の可能性あるス
タフィロコッカス種の全てからＦｅｍＡを増幅するであろう。
【００５６】 本発明の１２種のＭＡＧＥの検出は、実施例９に示される。アレーは、特定捕
捉プローブを担持するシグナルにおけるポジティブなラインを観察して、ＭＡＧ
Ｅ数を読むことを可能とする。
【００５７】 同じ応用はＧタンパク質（ＲＣＧＰ）に結合された受容体においても展開され
た。これらの受容体は全ての種類のリガンドと結合し、転写因子の活性を調節す
ることによって細胞質へおよび頻繁には核へのシグナル形質導入の原因となる。
コンセンサスプライマーはドーパミンのためおよびセロトニンとヒスタミンのた
めの種々の亜種ＲＣＧＰのために形成される（実施例１１および１２）。同じこ
とはヒスタミンと他のリガンドにおいても可能である。
【００５８】 種々のＨＬＡ型の検出は本発明の応用の１つでもある（実施例１３）。ＨＬＡ
とは個人の互いに異なる相同配列である。ＨＬＡ型の決定は、供与者と受容者と
の間の適合性の程度を決定するために、組織移植において特に有用である。これ
は免疫化における有用なパラメーターでもある。多数の亜種と相同配列間の近接
した関係があっても、全ての他の配列から１つの配列を完全に識別することはい
つも可能でなく、また、それらのいくつかにおいては、１つまたは２つの交差反
応が存在した。これらの場合、同定を絶対的なものとするために、検出されるべ
き配列を使用する反応および他の交差反応をもたらすアレー上に、他の捕捉プロ
ーブが添加された。
【００５９】 相同配列でもあるいくつかの形態のチトクロームＰ４５０が存在する。
【００６０】 多型性配列の検出（たった１つの塩基がたとえ異なっていても相同として考え
られ得る）も本発明の方法によって行われ得る。あるイソ型の存在がいくつかの
医薬の代謝を変更するから、これはチトクロームＰ４５０において特に有用であ
る。
【００６１】 本発明の他の態様は、上記した配列（特に実施例に記載される特定捕捉ヌクレ
オチド配列）を含むバイオチップまたはマイクロアレーのいかなる部分にも関し
、また、いかなる方法によるいかなる種類のマイクロアレーまたはバイオチップ
上においても相同配列から識別されるファミリー型の前記微生物に特異的な標的
配列の同定における一般的なスクリーニング方法に関する。
【００６２】 アレー上でのハイブリダイゼーション後、標的配列は最新の技術で検出され得
る。標識化しない好ましい方法は、アレーに現在応用されている質量分析法（米
国特許第５８２１０６０号）によるか、または試薬を挿入し、続いての蛍光検出
（WO９７／２７３２９またはFodor et al., Nature 364, p.555 (1993)）による
標的の同定である。
【００６３】 標識会合検出は数が多い。異なった標識分子の考察は、ＷＯ９７／２７３１７
に記載されている。これらは既に標識化されたプライマーを使用するか、あるい
は標識ヌクレオチドを複製または増幅工程中に導入して得られる。標識化はまた
、試験されるべきＲＮＡまたはＤＮＡ上の検出可能な成分（リガーゼにより配列
の末端に結合される標識オリゴヌクレオチド）を結合して得られる。ＲＮＡまた
はＤＮＡの断片はまた、キナーゼ、トランスフェラーゼまたは同様な酵素を使用
して、その５’ＯＨまたは３’ＯＨ末端に標識オリゴヌクレオチドを導入するこ
とができる。
【００６４】 もっとも頻繁に使用される標識は、商業的に入手可能なアレースキャナー(Gen
eral Scanning, Genetic Microsystem, …)を使用してアレーを解析するのに好
適なＣｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ７などの蛍光色素である。放射性標識、金標識ま
たはその後に特定リガンド（ストレプトアビジンまたは抗体）によって認識され
る低分子による間接標識は一般的な方法である。アレー上の標的固定で得られた
シグナルは、蛍光、色素、拡散、電界発光、バイオ−または化学発光、磁気、イ
ンペドメトリックまたはボルタメトリックのような電気的シグナルである（米国
特許第５３１２５２７号）。好ましい方法は沈殿物を得るための結合標的の金標
識、またはスキャナーにより容易に検出され、かつ定量される銀染色の使用に基
づく。
【００６５】 定量は、ハイブリダイゼーション収率および（標的および参照配列について同
一である）アレー上の検出規模のみならず、抽出、増幅（または複製）および標
識化工程をも考慮しなければならない。
【００６６】 本発明の方法はまた、公知濃度で添加された標準ヌクレオチド配列（外部また
は内部標準）を使用して、標的ヌクレオチド配列の定量を得るための手段を含む
。捕捉ヌクレオチド配列はまた、前記標的（できれば、増幅または複製後）と同
じ条件で標準を固定するようにアレー上に存在する。この方法は捕捉ヌクレオチ
ド配列と標準との間の相補的塩基対によって形成された二本鎖ヌクレオチド配列
の生成から生じたシグナルの定量工程、および生物学的試料中の検出および／ま
たは定量されるべきオリジナルなヌクレオチド配列の存在を定量するために、捕
捉ヌクレオチド配列と標的との間の相補的塩基対により形成された二本鎖ヌクレ
オチド配列から得たシグナルと前記二本鎖ヌクレオチド配列の形成から生じるシ
グナルとの相関解析工程を含む。
【００６７】 有利には、標準は最初の生物学的試料中に、あるいは抽出工程後に添加され、
かつ、同じプライマーで増幅されるかあるいは複製され、および／または標的と
比べて同じか、あるいは２０％以下異なる長さおよびＧＣ含量を有する。より好
ましくは、標準は内部標準の特性を有する競合内部標準として設計され得る（Ｗ
Ｏ９８／１１２５３）。前記内部標準は標的と共通するその配列部分および異な
った特定部分を有する。これはまた、その２つの末端にあるいはその近くに、標
的の増幅または複製に使用される２つのプライマーに相補的でありしかも同様な
ＧＣ含量を有する配列を有する。本発明の好ましい実施態様では、標準と標的と
の共通部分は、同じプライマーにより増幅された全標的と相同であるヌクレオチ
ド配列を意味する（すなわち、定量されるべき同じ科または生物に属する）。
【００６８】 好ましくは、この特定配列による標準のハイブリダイゼーション収率は、標的
配列のハイブリダイゼーション収率と同じであるか、あるいは２０％以下異なり
、定量が得られる（ＷＯ９８／１１２５３）。
【００６９】 前記標準ヌクレオチド配列、外部および／または内部標準はまた、所望により
本発明の異なった工程を実施するために必要である媒体および手段の全て（ハイ
ブリダイゼーションおよび培養培地、ポリメラーゼおよび他の酵素、標準配列、
標識分子など）とともに、本発明のキット（装置）または器具に有利に含まれる
。
【００７０】 有利には、バイオチップもまた、種々の濃度（すなわち４種）の標識捕捉ヌク
レオチド配列を有するスポットを含む。これらの標識捕捉溶液およびそのシグナ
ルは、ハイブリダイゼーションの結果を絶対量に変換することを可能とする。こ
れらはまた、検出の再現性について試験することも可能とする。
【００７１】 固体支持体（バイオチップ）は、ミクロ流体技術の使用に基づく、液体溶液の
制御によって他のチャンバーと自動化機械に結合された支持体中に挿入され得る
。このようなミクロ研究システム中に挿入されることによって、これは先の工程
（ＤＮＡの抽出、ＰＣＲによる増幅など）あるいは次の工程（標識化および検出
）においてすら、自動化機械によってインキュベート、加熱、洗浄および標識さ
れ得る。これらの工程はすべて、同じ固体支持体上で実施され得る。
【００７２】 本発明は、添付する図面を参考にして、次の非限定的実施例に詳細に記載され
る。
【００７３】図面の簡単な説明 図１は、コンセンサスプライマーを用いてＰＣＲ増幅した後のバイオチップ上
での５つのスタッフィロコッカス種の同定における、本発明方法に使用される工
程の系統図である。
【００７４】 図２は、スタフィロコッカス種およびＭｅｃＡ遺伝子の存在について、５つの
最も共通するスタフィロコッカス種の決定を可能とするアレーの設計を示す。
【００７５】 図３は、異なった程度の相同性を有する配列間の識別について、捕捉ヌクレオ
チド配列の特定配列の長さの効果を示す。
【００７６】 図４は、Ｓ・アウレウス(S. aureus)の小さな特定捕捉ヌクレオチド配列およ
びコンセンサス配列を担持するアレー上で、Ｓ・アウレウスに由来するＦｅｍＡ
配列の検出において得られた感度を示す。実施例１：長い特定捕捉ヌクレオチド配列を担持するアレー上での相同ＦｅｍＡ 配列の検出（図３） 捕捉ヌクレオチド配列および標的の産生
【００７７】 異なったスタフィロコッカス種に対応するＦｅｍＡ遺伝子は、下記プライマー
を使用して、ＰＣＲによって別個に増幅された。
【外１】
【００７８】 １．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭトリス ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、
０．８Ｍの各プライマー、５０Ｍの各ｄＮＴＰ、５０μＭのビオチン−１６−ｄ
ＵＴＰ、１．５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＢｉｏｔｏｏｌｓ、７．５％
ＤＭＳＯ、５ｎｇのＦｅｍＡ遺伝子含有プラスミドを含む最終容量５０μＬ中に
て、ＰＣＲは実施された。試料はまず、９４℃で３分間、変性された。次いで、
９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間、および７２℃で
１０分間の最終伸長からなる増幅が４０回、実施された。増幅のネガティブコン
トロールとして、水コントロールが使用された。これらのプライマーを使用して
得たアンプリコンの大きさは、Ｓ．サプロフィティカスでは１０８ｂｐ、Ｓ．ア
ウレウスでは１３９ｂｐ、Ｓ．ホミニスでは１１８ｂｐ、Ｓ．エピデルミディス
では１０１ｂｐおよびＳ．ヘモリティカスでは１２８ｂｐであった。捕捉ヌクレ
オチド配列の配列は、対応するアンプリコンと同じであったが、それらは１本鎖
であった。
【００７９】 バイオチップは、その対応する捕捉ヌクレオチド配列上でハイブリダイズされ
たＣＭＶアンプリコンであるポジティブコントロールと、ＣＭＶが結合できなか
ったＨＩＶ−Ｉ配列上の捕捉ヌクレオチド配列であるネガティブコントロールを
含む。
【００８０】 捕捉ヌクレオチド配列固定化 Schena et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10614 (1996))により記載さ
れるプロトコールは、アルデヒド誘導体化されたガラスへのアミノ化ＤＮＡのグ
ラフト化から始められた。アミノ化捕捉ヌクレオチド配列は１５０〜３０００ｎ
Ｍにわたる濃度で溶液からスポットされた。捕捉ヌクレオチド配列は、自家製ロ
ボット装置を使用し、シリル化顕微鏡スライド上に印刷された（Genetix(UK)製
２５０μｍピンおよびCell associates(Houston, USA)製シリル化（アルデヒド
）顕微鏡用スライド）。スポットは直径４００μｍを有し、分散された容積は約
０．５ｎｌである。スライドは室温で乾燥され、使用まで４℃で貯蔵された。
【００８１】 ハイブリダイゼーション ６５μｌのハイブリダイゼーション溶液（ＡＡＴ、Namur,Belgium）は、５μ
ｌのアンプリコンへ添加され、溶液はハイブリダイゼーションチャンバーによっ
て枠組みされたアレー上に負荷された。ポジティブコントロールとして、４３７
ｂｐの２ｎＭビオチン化ＣＭＶアンプリコンが溶液へ添加された。チャンバーは
カバーグラスで閉鎖し、かつ、スライドは９５℃で５分間、変性された。ハイブ
リダイゼーションは６０℃で２時間、実施された。試料は洗浄緩衝液で４回、洗
浄された。
【００８２】 比色検出 ガラス試料は、ブロッキング緩衝液（マレイン酸緩衝液１００ｍＭ ｐＨ７．
５、ＮａＣｌ １５０ｍＭ 、Gloria 乳粉末 ０．１％）中に１０００倍希釈さ
れたコロイド状金で標識された８００μｌのストレプトアビジンとともに、室温
で４５分間、インキュベートされた。洗浄緩衝液で５回洗浄した後、金の存在は
染色顕示溶液（ＡＡＴ、Namur, Belgium）を使用して、銀還元の触媒作用に供し
た。スライドは８００μｌの顕色混合物とともに１０分間、３回インキュベート
され、次いで水でリンスされ、乾燥され、かつ、マイクロアレーリーダーを使用
して解析された。各スライドは次いで特定定量ソフトウェアによって定量された
。
【００８３】 蛍光検出 ガラス試料は、８００μｌのシアニン３またはシアニン５標識ストレプトアビ
ジンとともに室温で４５分間、インキュベートされた。洗浄後、スライドは室温
で貯蔵される前に乾燥された。検出はアレースキャナーＧＳＭ４１８(Genetic M
icrosystem, Woburn, MA, USA)中で実施された。各スライドは次いで特定定量ソ
フトウェアによって定量された。
【００８４】 その結果は、種間の交差反応を示す。例えば、その捕捉プローブ上にハイブリ
ダイズされたエピデルミディスアンプリコンは、１５２の値を示すが、Ｓ．サプ
ロフィティカス、Ｓ．アウレウス、Ｓ．ヘモリティカスおよびＳ．ホミニス捕捉
プローブでは、それぞれ、１４４、９、１３および２０の値を示す。
【００８５】実施例２：小さな特定捕捉ヌクレオチド配列を担持するアレー上の相同ＦｅｍＡ 配列の検出 捕捉ヌクレオチド配列固定化および銀染色検出のプロトコールは、実施例１に
記載されるが、５つのスタフィロコッカス種の特異的捕捉ヌクレオチド配列は、
６００ｎＭの濃度でスポットされ、次の通りである：
【外２】
【００８６】 この例では、標的は次のコンセンサスプライマ−を使用して、ＰＣＲによって
増幅された異なったスタフィロコッカス(Staphylococcus)種に対応するＦｅｍＡ
遺伝子配列の断片である。
【外３】
【００８７】 このＰＣＲは、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭトリス ｐＨ８、１Ｍの各プライ
マー、２００ＭのｄＡＣＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、１５０ＭのｄＴＴＰ、
５０μＭのビオチン−１６−ｄＵＴＰ、２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(B
oehringer Mannheim, Allemagne)、１Ｕの熱不安定性ウラシル−ＤＮＡ−グリコ
シラーゼ(Boehringer Mannheim, Allemagne)、１ｎｇのＦｅｍＡ遺伝子を含むプ
ラスミドを含む最終容量１００μｌ中にて実施された。試料はまず、９４℃で５
分間、変性された。次いで、９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間
、および７２℃で１０分間の最終伸長工程からなる増幅が４０回、実施された。
水コントロールは増幅のネガティブコントロールとして使用された。これらのプ
ライマーを使用して得られたアンプリコンの大きさは、すべての種において４８
９ｂｐであった。図４はＳ．エピデルミディスおよびＳ．キシロサス(S.xylosus
)におけるアンプリコンとともに得られた結果のみを示す。
【００８８】 ハイブリダイゼーション溶液は、実施例１のようにして調製され、スライド上
に負荷された。スライドは９８℃で５分間、変性された。ハイブリダイゼーショ
ンは５０℃で２時間、実施された。次いで、試料は洗浄緩衝液で４回、洗浄され
た。その値は非常に低く、かつほとんど検出不可能であった。
【００８９】実施例３：小さな特定配列とともに長い捕捉ヌクレオチド配列を担持するアレー 上での相同ＦｅｍＡ配列の検出感度におけるスペーサーの長さの効果 実験は同じアンプリコンを使用して実施例２に記載されるように実施されたが
、使用された捕捉ヌクレオチド配列は、次のとおりである：
【外４】
【００９０】 標的アンプリコンは４８９ｂｐ長であったが、捕捉ヌクレオチド配列は２７塩
基の特定配列を有する４７、６７または８７塩基の１本鎖ＤＮＡであった。
【００９１】実施例４：小さな特定配列とともに長い捕捉ヌクレオチド配列を担持する同じア レー上での異なった細菌種から得たＦｅｍＡ配列検出の特異性 実験は実施例２に記載されるように実施されたが、捕捉ヌクレオチド配列は３
０００ｎＭの濃度でスポットされ、次の通りである。
【外５】
【００９２】 標的は、次のコンセンサスプライマーを使用するＰＣＲによって増幅された異
なったスタフィロコッカス種に対応するＦｅｍＡ遺伝子配列の断片である。
【外６】
【００９３】 コンセンサス配列は、試験されたスタフィロコッカス種のすべてを検出するバ
イオチップ上に存在する。すべての標的配列は、同じ対のプライマーを使用して
ＰＣＲにより増幅された。
【００９４】 これらのプライマーを使用して得られたアンプリコンの大きさは、すべての種
において５８７ｂｐであった。コンセンサス配列捕捉プローブは、実施例２で増
幅されたＳ．ホミニス(S.hominis)のアンプリコンと相補的である４８９塩基長
の１本鎖ＤＮＡであった。検出は蛍光にて行われた。コンセンサス捕捉プローブ
と１５のＳ．種から得たｆｅｍＡの配列との相同性は、６６〜８５％であった。
すべての配列はこのコンセンサス捕捉プローブ上でハイブリダイズされた。
【００９５】実施例５：相同配列間の識別における捕捉ヌクレオチド配列の特定配列の長さの 効果（図３） 実験は、温度４３℃で実施例４に記載されるようにして実施され、使用された
捕捉ヌクレオチド配列は、ここに添付された表に示される。名前の後の数は、特
定配列の長さを示す。
【００９６】 Ｓ・アナエロビウス(S.anaerobius)（Ｓ・アウレウスの亜種）のＦｅｍＡアン
プリコンは、その末端にＳ・アウレウス、アナエロビウスおよびエピデルミディ
スに特異的である１５、２７および４０塩基のいずれかを有する６７種の１本鎖
塩基の捕捉ヌクレオチド配列を担持するアレー上でハイブリダイズさせた。アナ
エロビウスとアウレウスの捕捉ヌクレオチド配列の相違点は、１５塩基捕捉ヌク
レオチド配列中のたった１個の塩基および２７および４０塩基中の２個の塩基で
あった。
【００９７】 ３種のスタフィロコッカス種から得たＦｅｍＡのアンプリコンは、アレー上で
ハイブリダイズされた。
【外７】
【００９８】実施例６：本発明が提案する特定配列とコンセンサス配列を担持するアレー上で スタフィロコッカス・アウレウスのＦｅｍＡ配列の検出感度（図４） 実験は、濃度３０００ｎＭでスポットされた捕捉ヌクレオチド配列を使用して
、実施例４に記載されるようにして実施された。細菌性ＦｅｍＡ配列はＰＣＲ前
に連続して希釈され、アレーとともにインキュベートされた。実施例７：アレー上での１６種の相同ＦｅｍＡ配列の検出 コンセンサスプライマーおよびアンプリコンは、実施例４に記載されるものと
同じであったが、捕捉プローブは１５種のスタフィロコッカス種の同定のために
選択された。実験は実施例４のように実施された。捕捉プローブはその５’末端
に支持体上に固定された、次の配列
【外８】 を有するスペーサー、続いて異なったスタフィロコッカスから得た種々のｆｅｍ
Ａのための下記特定配列を含む。
【外９】 実施例８：ミコバクテリウム(Mycobacterium)の１９種の相同ｐ３４配列の検出 全てのミコバクテリウム(Mycobacerium)中に存在するｐ３４遺伝子は、下記コ
ンセンサスプライマーを使用して、全て増幅された。 センス
【外１０】 遺伝子の４９６〜５１５位に位置する Ｔｍ＝５６℃ アンチセンス 遺伝子の７３３〜７５０位に位置する
【外１１】 Ｔｍ＝５２〜５８℃ Ｓ ＝ Ｃ または Ｇ Ｒ ＝ Ａ または Ｇ Ｙ ＝ Ｔ または Ｃ 増幅された生産物の大きさは、１２３〜２５８ｂｐの範囲である。 下記捕捉プローブは、ミコバクテリア(Mycobateria)配列の特定捕捉のために
選択されている。
【外１２】 上記配列のそれぞれは、その５’末端にスペーサーを含む。 スペーサー配列
【外１３】 捕捉プローブはその５’末端でアミノ化されている。実施例９：ＭＡＧＥ遺伝子の検出 ＭＡＧＥ遺伝子は下記コンセンサスプライマーを使用して、全てが増幅される
。 センス 遺伝子の３９８〜４２１位に位置する
【外１４】 Ｔｍ＝７８℃ 他のアンプリコンは、いくつかのＭＡＧＥのＰＣＲ効率を増加させるために、
センスプライマーとして加えられている。
【外１５】 アンチセンス 遺伝子の９１３〜９３６位に位置する
【外１６】 Ｔｍ＝７４℃ 増幅産物の大きさは約５３０ｂｐである。
【００９９】 ２７ヌクレオチドを有する下記捕捉プローブは、ＭＡＧＥ配列の特定捕捉とし
て選択されている。
【外１７】
【０１００】 上記配列のそれぞれは、ガラスに共有結合されるために、その５’末端にアミ
ノ化されたスペーサーを含む。
【０１０１】 スペーサー配列
【外１８】
【０１０２】 これらはアルデヒド担持ガラス上にスポットされ、上記されたコンセンサスプ
ライマーによって増幅されたＭＡＧＥの検出のために使用される。その結果は、
１２の特定ＰＣＲを使用する同定に比べて、腫瘍中に存在するＭＡＧＥの多義的
でない同定を各ＭＡＧＥ配列毎に１つ示す。
【０１０３】実施例１０：ラット中のＧ−タンパク質ドーパミン受容体の同定 Ｇ−タンパク質に結合されたドーパミン受容体は、下記コンセンサスプライマ
ーを使用して、全て増幅される。 センス −コンセンサス２−３−４ 遺伝子の２２１〜２４２位に位置する
【外１９】 Ｔｍ＝６６℃ Ｍ ＝ Ａ または Ｃ −コンセンサス１−５ 遺伝子の２２１〜２４０位に位置する
【外２０】 Ｔｍ＝６６℃ Ｍ ＝ Ａ または Ｃ Ｋ ＝ Ｇ または Ｔ Ｗ ＝ Ａ または Ｔ アンチセンス 遺伝子の３９６〜４１６位に位置する
【外２１】 Ｔｍ＝６４〜６８℃ Ｒ ＝ Ａ または Ｇ Ｓ ＝ Ｃ または Ｇ 増幅産物の大きさは、１９６ｂｐである。
【０１０４】 ２７ヌクレオチドの下記捕捉プローブは、ドーパミン受容体配列の特定捕捉の
ために使用されている。 捕捉プローブ
【外２２】
【０１０５】 上記配列のそれぞれは、その５’末端にアミノ化されたスペーサーを含む。ス
ペーサー配列
【外２３】
【０１０６】実施例１１：ラットのＧ−タンパク質ヒスタミン受容体亜種の同定 Ｇ−タンパク質に結合されたヒスタミン受容体は、下記プライマーを使用して
全て増幅された。 センス −Ｈ１センス 遺伝子の３８１〜３９８位に位置する
【外２４】 Ｔｍ＝６０℃ −Ｈ２センス 遺伝子の３８０〜３９８位に位置する
【外２５】 Ｔｍ＝６２℃ −Ｈ３センス 遺伝子の３７８〜３９８位に位置する
【外２６】 Ｔｍ＝６０℃ アンチセンス −Ｈ１アンチセンス 遺伝子の７２２〜７４１位に位置する
【外２７】 Ｔｍ＝６０℃ −Ｈ２アンチセンス 遺伝子の７２２〜７４２位に位置する
【外２８】 Ｔｍ＝６２℃ −Ｈ３アンチセンス 遺伝子の７２２〜７４０位に位置する
【外２９】 Ｔｍ＝６２℃
【０１０７】 増幅産物の大きさは、３５９〜３６４ｂｐの範囲である。
【０１０８】 下記捕捉プローブはヒスタミン受容体配列の特定捕捉のために選択されている
。
【外３０】
【０１０９】 上記配列のそれぞれは、その５’末端にスペーサーを含む。
【０１１０】 スペーサー配列
【外３１】 捕捉プローブはその５’末端でアミノ化されている。
【０１１１】実施例１２：ラットのＧ−タンパク質セロトニン−受容体の同定 Ｇ−タンパク質に結合されているセロトニン受容体は、下記プライマーを使用
して全て増幅される。 センス −亜種１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４、６、７に対して
のコンセンサス
【外３２】
【０１１２】 下記捕捉プローブは、セロトニン受容体亜種配列の特定捕捉のために選択され
ている。
【外３３】
【０１１３】 上記配列のそれぞれは、その５’末端にスペーサーを含む。
【０１１４】 スペーサー配列
【外３４】 捕捉プローブはその５’末端でアミノ化されている。
【０１１５】実施例１３：ＨＬＡ−Ａ亜種の同定 ＨＬＡ−Ａ亜種は、下記コンセンサスプライマーを使用して増幅される。 センス 遺伝子の１８１〜２００位に位置する
【外３５】 Ｔｍ＝７０℃ アンチセンス 遺伝子の７３５〜７５４位に位置する
【外３６】 増幅産物の大きさは５７４６ｐである。
【０１１６】 ２７個のヌクレオチドを有する下記捕捉プローブは、ＨＬＡ−Ａ配列の特定捕
捉のために選択されている。
【外３７】 上記配列のそれぞれは、５’末端にアミノ化スペーサーを含む。 スペーサー配列
【外３８】 実施例１４：チトクロームＰ４５０ ３ａ型の同定 チトクロームＰ４５０型は、下記コンセンサスプライマーを使用して増幅され
る。 センス −コンセンサス ３ａ３遺伝子の１２９７〜１３１１位に位置する
【外３９】 Ｔｍ＝５０℃ アンチセンス −コンセンサスａ３、ａ２３、ａ１、ａ２ ３ａ３遺伝子の１８３９〜１８５８位に位置する
【外４０】 特定ａ９ ３ａ９遺伝子の２０１５〜２０３３位に位置する
【外４１】 特定ａ１８ ３ａ１８遺伝子の１８３０〜１８４６位に位置する
【外４２】 ＰＣＲ産物の長さは約５６０ｂｐである。
【０１１７】 下記捕捉プローブは、チトクロームＰ−４５０ ３ａ型の特定捕捉のために選
択されている。
【外４３】
【０１１８】 上記配列のそれぞれは、その５’末端にスペーサーを含む。
【０１１９】 スペーサー配列
【外４４】 捕捉プローブはその５’末端でアミノ化されている。実施例１５：バイオチップ上でのＧＭＯの同定 バイオチップ上でＧＭＯを検出するためのコンセンサスプライマー：
【外４５】
【０１２０】 これらのプライマーは、下記遺伝子の増幅を可能とする。 １）Ｍｏｎ８０９（トウモロコシ、Ｍｏｎｓａｎｔｏ）中のＣＴＰ１、ＣＴＰ２
、ＣＰ４ＥＰＳＰＳ、Ｓ ＣｒｙＩＡｂおよびｈｓｐ７０Ｉｎｔ． ２）Ｍｏｎ８０（トウモロコシ、Ｍｏｎｓａｎｔｏ）中のｈｓｐ７０Ｉｎｔ．お
よびＳ ＣｒｙＩＡｂ ３）Ｂｔ １１（トウモロコシ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）中のＳ ＣｒｙＩＡｂおよ
びＳ Ｐａｔ ４）ＧＴＳ４０−３−２（大豆、Ｍｏｎｓａｎｔｏ）中のＣＴＰ４およびＥＰＳ
ＰＳ
【０１２１】 捕捉プローブは、識別を可能とするために、これらの配列中で選択されるであ
ろう。上記配列のそれぞれは、その５’末端にスペーサーを含む。 スペーサー配列
【外４６】
【図面の簡単な説明】
【図１】 コンセンサスプライマーを用いてＰＣＲ増幅した後のバイオチップ上での５つ
のスタッフィロコッカス種の同定における、発明方法に使用される工程の系統図
である。
【図２】 スタフィロコッカス種およびＭｅｃＡ遺伝子の存在について、５つの最も共通
するスタフィロコッカス種の決定を可能とするアレーの設計を示す。
【図３】 異なった程度の相同性を有する配列間の識別について、捕捉ヌクレオチド配列
の特定配列の長さの効果を示す。
【図４】 Ｓ・アウレウスの小さな特定捕捉ヌクレオチド配列およびコンセンサス配列を
担持するアレー上で、Ｓ・アウレウスに由来するＦｅｍＡ配列の検出において得
られた感度を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 33/569 Ｅ 33/569 33/58 Ａ 33/58 Ｃ１２Ｒ 1:445 //(Ｃ１２Ｍ 1/00 1:44 Ｃ１２Ｒ 1:445） 1:45 (Ｃ１２Ｍ 1/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:44） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (Ｃ１２Ｍ 1/00 Ｃ１２Ｒ 1:45） (Ｃ１２Ｑ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:44） (Ｃ１２Ｑ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｑ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:45） (Ｃ１２Ｑ 1/26 Ｃ１２Ｒ 1:44） (Ｃ１２Ｑ 1/26 Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｑ 1/26 Ｃ１２Ｒ 1:45） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:44） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:45） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ザマテオ， ナタリー ベルギー， ベ−5100 ジャンベ， アヴ ェニュ ジェアン マテルン 202／３ (72)発明者 ロックマン， ローレンス ベルギー， ベ−6600 ボストグン， ル ー エムランル 24 (72)発明者 ドゥフール， ソフィー ベルギー， ベ−7000 モンス， アヴェ ニュ ド クアトリエム ミドルセクス 22 (72)発明者 アレクサンドレ， イサベル ベルギー， ベ−5170 レスヴ， ルー ド センター ３ (72)発明者 ド ロンゲヴィユ， フランソワーズ ベルギー， ベ−5100 ジャンベ， アヴ ェニュ ジェアン マテルン 110 Ｆターム(参考） 2G045 CB21 DA12 DA13 DA14 FB02 FB07 4B024 AA11 AA19 CA03 CA07 CA10 CA12 HA12 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 FA15 4B063 QA19 QA20 QQ03 QQ06 QQ43 QQ53 QR08 QR42 QR56 QS25 QS34 QS39 QX02 【要約の続き】 配列の密度を有する。

Claims (37)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の工程を含む、少なくとも４つの他の相同配列中のヌク
    レオチド配列の検出による、（生物学的試料中に存在する可能性がある）生物学
    的（微）生物またはその一部分の同定および／または定量方法： − 所望により（微）生物からオリジナルなヌクレオチド配列（１）を抽出し
    ； − オリジナルヌクレオチド配列（１）の少なくとも一部分を特異的な対のプ
    ライマーを使用して、検出されるべき標的ヌクレオチオド配列（２）へと増幅ま
    たは複製し； − 所望により前記標的ヌクレオチド配列（２）を標識化し； − 不溶性固体支持体（４）、好ましくは非多孔性固体支持体へ１つの予定さ
    れた連結によって結合された１本鎖捕捉ヌクレオチド配列（３）に、標識化され
    た標的ヌクレオチド配列（２）を接触させ； − 標的ヌクレオチド配列（２）とその対応する捕捉ヌクレオチド配列（３）
    との間の相補的塩基対によるハイブリダイゼーションから得られるシグナルを検
    出、定量および／または記録することによって、生物またはその一部分に特異的
    な標的ヌクレオチド配列（２）の結合を識別する （ただし、前記捕捉ヌクレオチド配列（３）は、アレーに従って所定位置で不
    溶性固体支持体（４）に結合され、前記アレーは固体支持体表面１ｃｍ２当たり
    、少なくとも４つの異なった結合１本鎖捕捉ヌクレオチド配列の密度を有し、か
    つ、 標的ヌクレオチド配列とその対応する捕捉ヌクレオチド配列との間の結合は、
    所定位置に前記シグナルを形成し（生じるであろう）、１つのシグナルの検出は
    相同ヌクレオチド配列から生物またはその一部分に特異的な標的ヌクレオチド配
    列の識別および同定を可能とする）。
  2. 【請求項２】 増幅された相同オリジナルヌクレオチド配列は、ＤＮＡヌク
    レオチド配列である、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 増幅は、同じプライマー対を使用するＰＣＲによって得られ
    る、請求項１または２記載の同定方法。
  4. 【請求項４】 増幅された相同オリジナルヌクレオチド配列は、同じプライ
    マー対を使用して、ｃＤＮＡへと最初に逆転写されたｍＲＮＡである、請求項１
    記載の方法。
  5. 【請求項５】 相同オリジナルヌクレオチド配列の複製は、同じプライマー
    対を使用して行われる、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 １つの（微）生物に対して特異的な同じ捕捉ヌクレオチド配
    列は、固体支持体のアレー上の異なった位置に存在する、請求項１〜５のいずれ
    かに記載の方法。
  7. 【請求項７】 対応する標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが
    できる、捕捉ヌクレオチド配列の特定配列は、少なくとも６．８ｎｍを有するス
    ペーサーにより、固体支持体の表面から離れている、請求項１または３記載の方
    法。
  8. 【請求項８】 前記スペーサーは約１５〜約４０塩基の配列である、請求項
    ７記載の方法。
  9. 【請求項９】 特定位置で表面に結合された捕捉ヌクレオチド配列の密度は
    、固体支持体表面１ｃｍ２当たり、１０ｆｍｏｌｅより大きく、好ましくは１０
    ０ｆｍｏｌｅより大きい、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. 【請求項１０】 検出されるべき標的ヌクレオチド配列は、他の相同ヌクレ
    オチド配列と３０％より高い、好ましくは６０％より高い、より好ましくは８０
    ％より高いの相同性を示す、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  11. 【請求項１１】 生物学的試料中に存在する生物の定量は、シグナルの定量
    によって得られることを特徴とする、請求項１〜１０いずれかに記載の方法。
  12. 【請求項１２】 他のプライマーは、抗生物質抵抗決定配列などの、他のヌ
    クレオチド配列の増幅のための増幅工程に存在することを特徴とする、請求項１
    〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. 【請求項１３】 不溶性固体支持体は、ガラス、電子機器、シリコーン支持
    体、プラスチック支持体、コンパクトディスク、フィルター、ゲル層、金属支持
    体またはこれらの混合体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１
    〜１２のいずれかに記載の方法。
  14. 【請求項１４】 検出および／または定量されるべきオリジナルヌクレオチ
    ド配列は、コンセンサスプライマーおよび所望によりストッパー配列を使用して
    、３’または５’末端の逆転写に付されたＲＮＡ配列である、請求項１〜１３の
    いずれかに記載の方法。
  15. 【請求項１５】 試料中の同定および／または定量されるべきオリジナルヌ
    クレオチド配列は、スタフィロコッカス・アウレウス(S. aureus)、スタフィロ
    コッカス・エピデルミディス(S. epidermidis)、スタフィロコッカス・サプロフ
    ィティカス(S. saprophyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(S. hominis)お
    よび／またはスタフィロコッカス・ヘモリティカス(S. haemolyticus)からなる
    群から選択されるスタフィロコッカス(Staphylococci)種のＦｅｍＡ遺伝子配列
    である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
  16. 【請求項１６】 固体支持体は、共通検出のためのコンセンサス配列ととも
    に、相同標的ヌクレオチド配列との結合に対して特異的な相同配列の特異的な捕
    捉ヌクレオチド配列を担持する、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
  17. 【請求項１７】 固体支持体はスタフィロコッカス(Staphylococcus)属同定
    のためのコンセンサス配列とともに、２種またはそれ以上のスタフィロコッカス
    種の同定に特異的な捕捉ヌクレオチド配列を担持する、請求項１〜１６のいずれ
    かに記載の方法。
  18. 【請求項１８】 試料中の同定および／または定量されるべきオリジナル配
    列はＭＡＧＥ遺伝子ファミリーに属する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方
    法。
  19. 【請求項１９】 試料中の同定および／または定量されるべきオリジナル配
    列はＨＬＡ−Ａ遺伝子ファミリーに属する、請求項１〜１６のいずれかに記載の
    方法。
  20. 【請求項２０】 試料中の同定および／または定量されるべきオリジナル配
    列はタンパク質Ｇ遺伝子ファミリーに結合されたドーパミン受容体に属する、請
    求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
  21. 【請求項２１】 試料中の同定および／または定量されるべきオリジナル配
    列はタンパク質Ｇ遺伝子ファミリーに結合されたコリン受容体に属する、請求項
    １〜１６のいずれかに記載の方法。
  22. 【請求項２２】 試料中の検出および／または定量されるべきオリジナル配
    列はタンパク質Ｇ遺伝子ファミリーに結合されたヒスタミン受容体に属する、請
    求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
  23. 【請求項２３】 試料中の検出および／または定量されるべきオリジナル配
    列はチトクロームＰ４５０型ファミリーに属する、請求項１〜１６のいずれかに
    記載の方法。
  24. 【請求項２４】 請求項１〜２３のいずれかに記載の方法を実施するための
    方法および媒体、好ましくは１本鎖捕捉ヌクレオチド配列が結合される不溶性固
    体支持体を含む診断および／または定量キットであって、前記１本鎖捕捉ヌクレ
    オチド配列が検出および／または定量されるべき標的ヌクレオチド配列に対して
    特異的な約１０〜約６０塩基の配列を含み、かつ、約３０〜約６００塩基を含む
    全長を有し、前記１本鎖捕捉ヌクレオチド配列が、固体支持体表面１ｃｍ２当た
    り、少なくとも４つの１本鎖捕捉ヌクレオチド配列の密度を有するアレーに従っ
    て固体支持体表面上に配置されている、診断および／または定量キット。
  25. 【請求項２５】 不溶性固体支持体は、ガラス、電子機器、シリコーン支持
    体、プラスチック支持体、コンパクトディスク、ゲル層、金属支持体またはこれ
    らの混合体からなる群から選択される、請求項２４記載の診断キット。
  26. 【請求項２６】 捕捉ヌクレオチド配列は、スタフィロコッカス種遺伝子、
    ＭＡＧＥ遺伝子ファミリー、ＨＬＡ−遺伝子ファミリー、タンパク質Ｇ遺伝子フ
    ァミリーに結合されたドーパミン、コリンまたはヒスタミン受容体、チトクロー
    ムＰ４５０型ファミリーまたはＧＭＯ植物ファミリーからなる群から選択される
    遺伝子に対して特異的である、検出および／または定量されるべき標的ヌクレオ
    チド配列に特異的である、請求項２４または２５記載の診断キット。
  27. 【請求項２７】 １つのコンセンサスプライマーを使用するＤＮＡ配列のう
    ちの１つの増幅およびアレー上での検出後に得られた５つの細菌種の同定および
    ／または定量のためのバイオチップを含む、請求項２４〜２６のいずれかに記載
    の診断キット。
  28. 【請求項２８】 １つのコンセンサスプライマーを使用するＤＮＡまたはＲ
    ＮＡ配列のうちの１つの複製および／または増幅、およびアレー上での検出後に
    得られた細菌属の同定とともに、細菌種の同定および／または定量のためのバイ
    オチップを含む、請求項２４〜２６のいずれかに記載の診断キット。
  29. 【請求項２９】 １つのコンセンサスプライマーを使用するＤＮＡ配列のう
    ちの１つの複製および／または増幅、およびアレー上での検出後に得られた１５
    のスタフィロコッカス種の検出および／または定量のためのバイオチップを含む
    、請求項２４〜２８のいずれかに記載の診断キット。
  30. 【請求項３０】 １つのコンセンサスプライマーを使用するＤＮＡまたはｍ
    ＲＮＡ配列のうちの１つの複製および／または増幅、およびアレー上での検出後
    に得られた３つまたはそれ以上のＭＡＧＥ遺伝子の検出および／または定量のた
    めのバイオチップを含む、請求項２４〜２８のいずれかに記載の診断キット。
  31. 【請求項３１】 １つのコンセンサスプライマーを使用するｍＲＮＡまたは
    ＤＮＡ配列のうちの１つの複製および／または増幅、およびアレー上での検出後
    に得られた３つまたはそれ以上のＨＬＡ−Ａ配列の検出および／または定量のた
    めのバイオチップを含む、請求項２４〜２８のいずれかに記載の診断キット。
  32. 【請求項３２】 １つのコンセンサスプライマーを使用するｍＲＮＡまたは
    ＤＮＡ配列のうちの１つの複製および／または増幅、およびアレー上での検出後
    に得られた、タンパク質Ｇに結合された受容体の３つまたはそれ以上の遺伝子配
    列の検出および／または定量のためのバイオチップを含む、請求項２４〜２８の
    いずれかに記載の診断キット。
  33. 【請求項３３】 １つのコンセンサスプライマーを使用するｍＲＮＡまたは
    ＤＮＡ配列のうちの１つの複製および／または増幅、およびアレー上での検出後
    に得られたタンパク質Ｇに結合されたドーパミン受容体の３つまたはそれ以上の
    遺伝子配列の検出および／または定量のためのバイオチップを含む、請求項３２
    記載の診断キット。
  34. 【請求項３４】 １つのコンセンサスプライマーを使用するｍＲＮＡまたは
    ＤＮＡ配列のうちの１つの複製および／または増幅、およびアレー上での検出後
    に得られたタンパク質Ｇに結合されたセロトニン受容体の３つまたはそれ以上の
    遺伝子配列の検出および／または定量のためのバイオチップを含む、請求項３２
    記載の診断キット。
  35. 【請求項３５】 １つのコンセンサスプライマーを使用するｍＲＮＡまたは
    ＤＮＡ配列のうちの１つの複製および／または増幅、およびアレー上での検出後
    に得られたタンパク質Ｇに結合されたヒスタミン受容体の３種またはそれ以上の
    遺伝子配列の検出および／または定量のためのバイオチップを含む、請求項３２
    記載の診断キット。
  36. 【請求項３６】 １つのコンセンサスプライマーを使用するｍＲＮＡまたは
    ＤＮＡ配列のうちの１つの複製および／または増幅、およびアレー上での検出後
    に得られたＧＭＯ植物の３種またはそれ以上の遺伝子配列の検出および／または
    定量のためのバイオチップを含む、請求項２４〜２８のいずれかに記載の診断キ
    ット。
  37. 【請求項３７】 １つのコンセンサスプライマーを使用するｍＲＮＡまたは
    ＤＮＡ配列のうちの１つの複製および／または増幅、およびアレー上での検出後
    に得られたチトクロームＰ４５０型の３つまたはそれ以上の遺伝子配列の検出お
    よび／または定量のためのバイオチップを含む、請求項２４〜２８のいずれかに
    記載の診断キット。
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