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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung
und/oder Quantifizierung einer aus einer biologischen Probe erhaltenen
Zielverbindung, durch Bindung auf ein Einfangmolekül, das auf Chips
gebunden ist.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung für eine Identifizierung
und/oder eine Quantifizierung, welche auf dem obigen Verfahren basiert
und welche die Identifizierung und/oder die Quantifizierung von
positiven Stellen von gebundenen Zielverbindungen auf die besagten
Chips erlaubt.
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Hintergrund der Erfindung und Stand der
Technik
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Biologische
Untersuchungen beruhen im Wesentlichen auf der spezifischen Wechselwirkung zwischen
zwei biologischen Molekülen,
etwa zwei Strängen
von Nukleinsäuremolekülen, einem
Antigen und einem Antikörper
oder zwischen einem Liganden und seinem Rezeptor. Die jetzige Herausforderung
der biologischen Untersuchungen besteht darin, gleichzeitig den
mehrfachen Nachweis von in einer Probe anwesenden Molekülen durchzuführen. Die
Miniaturisierung und Entwicklung von Gruppierungen auf der Oberfläche von „Biochips" sind Werkzeuge,
die Vielfachreaktionen in einem mikroskopischen Format erlauben,
wobei der besagte Nachweis mit einem begrenzten Volumen einer Probe
für die Trennung
(screening) und/oder die Identifizierung von mehreren möglichen
Zielverbindungen durchgeführt
wird. Diese Gruppierungen werden aus diskreten Bereichen gebildet,
die ein spezifisches Einfangmolekül enthalten, das für die Bindung
der Zielverbindung verwendet wird. Diese diskreten Bereiche, so klein
wie ein paar Mikrometer, erlauben die Bindung von mehreren Tausend
Einfangmolekülen
pro cm
2 Oberfläche (
WO 95/11995 ).
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Der
Nachweis gebundener Zielverbindungen ist jedoch schwierig, weil
ihre Menge wegen der genannten Miniaturisierung (wenige Femtomole
oder sogar wenige Attomole) sehr klein ist. Daher sind nur äußerst empfindliche
Verfahren für
solch einen Nachweis angemessen.
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Es
wurde vorgeschlagen, eine Zielverbindung, wie etwa DNA, nach ihrer
möglichen
genetischen Verstärkung
mit Fluoreszenzmolekülen,
zu markieren. Wenn ein Molekül
RNA nachgewiesen werden muss, wird es vor einer möglichen
Verstärkung
desselben zuerst in eine cDNA transformiert. Wenn eine direkte Markierung
der Zielverbindung nicht möglich
ist, kann eine Doppelreaktion (Sandwich Reaktion) durchgeführt werden.
Die Menge der Fluoreszenzmoleküle
ist jedoch so gering, dass es notwendig ist, spezifische Gruppierungsscanner
für den
Nachweis und/oder die Quantifizierung der gebundenen Verbindung
auf den „Kreuzungschips" zu entwickeln. Derartige
teure spezifische Scanner enthalten einen Laserscanner für die Anregung
der Fluoreszenzmoleküle,
ein Loch für
die Verminderung des fluoreszierenden Hintergrundrauschens und einen
Photovervielfacher für
die Steigerung der Empfindlichkeit des Nachweises.
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Alternative
Verfahren des Nachweises, die eine hohe Empfindlichkeit aufweisen,
sind in den Dokumenten
US-5,821,060 und
WO 95/04160 beschrieben
und basieren sich auf einen Nachweis, der teure Vorrichtungen verwendet,
wie etwa Massenspektrometer.
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Es
wurden auch Verfahren vorgeschlagen, welche auf der Fällung von
spezifischen Produkten beruhen, die sich aus einer kalorimetrischen
Markierung ergeben (
US 5,270,167 ,
US 4,731,325 ,
EP-A-0301141 ), das Ergebnis
einer enzymatischen Aktivität
sind (
EP-A-0393868 ,
WO 86/02733 ,
EP-A-0063810 ), oder aus einer
Immunodiffusion und Immunelektrophorese erzielt werden (
US 4,244,797 ;
US 4,244,803 ). Die genannten Methoden
sind jedoch entweder durch eine geringe Empfindlichkeit gekennzeichnet
oder sind nicht angemessen für
den Nachweis einer Zielverbindung auf „Kreuzungschips", weil der Niederschlag
in einer bestimmten Entfernung von der Reaktionsbindung stattfindet
und seine Stelle nicht leicht mit einer spezifischen Zielverbindung
in Beziehung gesetzt werden kann. Außerdem ist die Dichte des Niederschlages
von solchen enzymatischen Reaktionen nicht ausreichend lichtundurchlässig, um
einen Nachweis durch Lichtabsorption zu erlauben.
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Es
wurde auch vorgeschlagen, den Nachweis durch die Bindung eines löslichen
Produktes zu verbessern, welches aus der enzymatischen Reaktion
mit einem Metall vor seiner Fällung
erzielt wird. Da jedoch das Ergebnis dieser enzymatischen Reaktion ein
lösbares
Produkt ist, besteht keine Beziehung zwischen der Stelle des Niederschlages
und dem Nachweis einer spezifisch gebundenen Zielverbindung.
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Ziel der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung hat zum Ziel, ein neues Identifizierungs und/oder
Quantifizierungsverfahren von einer oder von mehreren in einer biologischen
Probe vorliegenden Zielverbindungen (ggf. gleichzeitig) bereitzustellen,
das die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweist.
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Die
vorliegende Erfindung hat zum Ziel, solch ein Verfahren bereitzustellen,
das einfach und nicht kostspielig ist, das den Nachweis von Zielverbindungen
durch die Verwendung von gebundenen Einfangmolekülen auf Gruppierungen auf der
Oberfläche
eines festen Trägers
erlaubt.
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Ein
letztes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, auch eine
einfache und nicht kostspielige Vorrichtung bereitzustellen, welche
auf dem obigen Verfahren beruht und welche die Identifizierung und/oder
die Quantifizierung von gebundenen Zielverbindungen auf „Kreuzungschips" verbessert.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung
und/oder Quantifizierung von mindestens einer Zielverbindung, die
in einer biologischen Probe vorliegt, durch ihre Bindung auf ein
Einfangmolekül,
das auf Gruppierungen eines festen Trägers (nachfolgend als „Kreuzungschips" bezeichnet) gebunden
ist, wobei die Bindung der Zielverbindung auf ihr entsprechendes
Einfangmolekül
zu der Bildung eines Metallniederschlages an der Stelle des Einfangmoleküls führt.
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Wie
in Anspruch 1 angesprochen, bezieht sich die vorliegende Erfindung
auf ein Verfahren zur Identifikation und/oder zur Konspiration einer
Zielverbindung, welche von einer Probe erhalten wird, vorzugsweise
einer biologischen Probe, die Schritte umfassend:
- – das In-Kontakt-Setzen
der Zielverbindung mit einem Einfangmolekül um eine spezifische Bindung zwischen
der Zielverbindung und einem einfachen Molekül zu ermöglichen, wobei das Einfangmolekül an der
Oberfläche
einer festen Auflage entlang einer Matrix, welche eine Dichte von
zumindest 20 diskreten Bereichen pro cm2 umfasst, angeordnet
ist, wobei jeder der diskreten Bereiche mit einer Art von Einfangmolekülen befestigt ist,
- – Ausführen einer
Reaktion, welche zur Bildung eines Niederschlags führt, welcher
am Ort der Bildung gebildet wird, und durch den Niederschlag einer
metallischen Verbindung auf der gebundenen Zielverbindung erhalten
wird,
- – Bestimmen
der möglichen
Bildung und/oder Vorhandensein von Niderschlag/Niederschlägen (einer)
diskreten Region/Regionen und das in Beziehungsetzen der Bildung
und/oder des Niederschlags/der Niederschläge in den/dem diskreten Bereich/Bereichen
mit der Identifikation und/oder einer Quantifizierung der Zielverbindung
unter der Bedingung, dass als feste Auflage eine Compact-Disc, worin
die nicht spaltbaren eingefangenen Moleküle auf der äußeren Oberfläche der Compact-Disc
durch konventionelle physikalische Methoden angegangen werden, wobei
mikro-lithographische und/oder Mikro-Bearbeitungstechniken einer
Bebrütung
benutzt werden, welche die nicht spaltbaren Einfangmoleküle an bestimmten Orten
halten werden, wo sie befestigt sein werden, ausgeschlossen wird.
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Vorzugsweise
Weise umfasst das Verfahren die folgenden weiteren Schritte:
- – das
in Beziehungsetzen des Vorliegens des oder der mehreren metallischen
Niederschläge
an einem oder an mehreren diskreten Bereichen (Niederschlagsmuster)
mit der Identifikation und/oder der Quantifizierung der Zielverbindung in
der biologischen Probe.
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Die „Kreuzungschips" gemäß der Erfindung sind
irgendeine Art eines festen Trägers,
der die Bildung von Gruppierungen von Einfangmolekülen (spezifisches
Muster) auf einer oder auf mehreren seiner Oberflächen erlaubt.
Ein solcher fester Träger kann
aus Gläsern,
aus Filtern, aus einer elektronischen Vorrichtung, aus polymeren
oder aus metallischen Werkstoffen, usw. hergestellt werden. Vorzugsweise
enthalten solche Gruppierungen spezifische Stellen (vorteilhafter
Weise dargestellt gemäß einem
spezifischen Muster), wobei eine jede derselben normalerweise nur
eine Spezies eines Einfangmoleküls
enthält.
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Die
Bindung von DNA Strängen
an Proteine, demnach die spezifisch Bindung an ortsspezifische Stellen
auf dem Substrat befestigt wird, wird im Dokument
US-5,561,071 beschrieben. Es ist auch
bekannt, dass Einfangchemikalien zu Mikroröhren verbunden werden können, die
dann räumlich
angeordnet sind, um ein Gruppierung zu bilden, wie dies im Dokument
GB-3 319 838 beschrieben
wird, oder um eine direkte Synthese der Oligonukleotide auf spezifischen
Oberflächen
durch die Anwendung von photolithografischen Techniken zu erzielen,
wie dies in den Dokumenten
EP-0476014 ,
US-5,510,270 ,
US-5,445,934 ,
WO 97/29212 ,
US-5,605,662 ,
US-5,632,957 und
WO 94/22889 beschrieben wird.
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Alle
diese Verfahren für
die Bindung von Einfangmolekülen
auf die Oberfläche
eines festen Trägers,
um die oben beschriebenen Gruppierungen zu erhalten, sind mit der
vorliegenden Erfindung vereinbar.
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Die
biologischen Zielverbindungen gemäß der Erfindung können in
einer biologischen (oder möglicherweise
in einer nicht-biologischen) Probe, wie etwa in klinischen Proben
vorhanden sein, welche aus Blut, Urin, Fäkalien, Speichelflüssigkeit,
Eiter, Serum, Gewebe, Gärungslösungen oder
Kulturmedien extrahiert worden sind. Die Zielverbindungen werden
vorzugsweise vor ihrem Nachweis und/oder vor ihrer Quantifizierung
auf den „Kreuzungschips" isoliert, gereinigt, aufgespalten,
kopiert und/oder verstärkt,
wenn notwendig, durch von einem Fachmann bekannte Verfahren.
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Vorzugsweise
wird die Bildung eines metallischen Niederschlages an der Stelle
der Bindung mit der Fixierung einer metallischen Verbindung auf
der gebundenen Zielverbindung oder durch das Ergebnis einer Reduktion
eines Metalls in Anwesenheit eines Enzyms erzielt. Vorteilhafter
Weise erlaubt die Reduktion von Silber unter Anwesenheit von kolloidalem
Gold die Bildung eines Niederschlages in einer Entfernung, die ein
paar Mikrometer von der gebundenen Zielverbindung bis zu deren Einfangmolekül nicht übersteigt.
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Gemäß der Erfindung
sind die spezifischen Stellen auf der Gruppierung in der Länge kleiner
als 1000 μm.
Diese Stellen oder Punkte haben vorzugsweise einen Durchmesser,
der im Bereich zwischen 10 und 500 μm liegt, und sind durch einen
Abstand von einer ähnlichen
Größenordnung
getrennt, so dass die Gruppierung des festen Trägers zwischen 100 und 250.000
Punkten auf der Oberfläche
von 1 cm2 umfasst. Es ist jedoch auch möglich, kleinere Punkte
als 1 μm
oder weniger herzustellen, auf denen die Einfangmoleküle gebunden
werden. Die Bildung dieser Punkte oder Stellen würde durch bekannte mikroelektronische
oder photolithografische Verfahren und Vorrichtungen erzielt werden,
welche die Bindung der Einfangmoleküle auf die Oberfläche des
festen Trägers
entweder durch eine kovalente Verbindung oder durch eine nicht kovalente
Absorption erlauben. Man bevorzugt die Technik der kovalenten Verbindung,
um besonders die Stellen der Bindung der Einfangmoleküle zu überwachen
und um mögliche
Nachteile zu vermeiden, die mit mehreren Einfangmolekülen (wie
Nukleinsäuren
oder Antikörper)
entstehen können,
die während
der Inkubation oder des Verfahrensschrittes des Waschens desorbiert
werden können.
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Eine
der bevorzugten Ausführungen
ist die Bindung biologischer Moleküle wie Proteine, Peptide oder
Nukleinsäuresequenzen
durch Bindung von Aminogruppen auf einem aktivierten Glas, das einen Aldehydteil
trägt.
Die Einbindung einer Aminogruppe in die Nukleinsäurekette wird leicht bewerkstelligt,
indem man aminierte Nukleotide während
ihrer Synthese verwendet. Aminierte Aminosäuren können auf der Oberfläche eines
festen Trägers
wie Glas, das Alde hydgruppen trägt
gebunden werden, wie dies von Schena et al. beschrieben wird (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 93, pp. 10614–10619 (1996)) oder wie dies
beschrieben wird im Dokument
US-5,605,662 und
in der Veröffentlichung
von Krensky et al. (Nucleic Acids Research, 15, pp. 2891–2909 (1987)).
Die Verbindung zwischen einer Amino- und einer Karboxylgruppe erzielt
man durch die Anwesenheit eines Kopplungswirkstoffes, wie etwa von
Carbodiimidverbindungen, wie dies von Joos et al. (Anal. Biochem., 247,
pp. 96–101
(1997)) beschrieben wird. Thiol veränderte Oligonukleotide können auch
verwenden werden, um eine Reaktion mit Aminogruppen auf der Oberfläche eines
festen Trägers
unter Anwesenheit von Vernetzungsmolekülen zu erzielen (Thrisey et al.,
Nucleic Acids Research, 24, pp. 3031–3039 (1996)). Ähnlich können Oligonukleotide
an einem gelähnlichen
Polyacrylamid abgebunden werden, das Hydroxyl- und Aldehydgruppen
trägt,
wie in den Dokumenten
US-5,552,270 und
WO 98/2844 beschrieben.
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Die
Bindung (oder die Erkennung) der Zielverbindung an ihre entsprechenden
spezifischen Einfangmoleküle
ist eine spontane nicht kovalente Reaktion, wenn sie unter optimalen
Bedingungen durchgeführt
wird. Sie impliziert nicht kovalente chemische Bindungen. Die mittlere
Zusammensetzung und andere physikalische und chemische Faktoren
beeinflussen die Rate und die Stärke
der Bindung. Zum Beispiel erniedrigen die geringe Stringenz und
die hohe Temperatur die Rate und die Stärke der Bindung zwischen den
zwei komplementären
Strängen für die Erkennung
des Nukleotidstranges. Jedoch erniedrigen sie auch die nicht spezifische
Bindung zwischen den zwei Strängen
(welche nicht vollständig komplementär sind)
sehr stark. Wenn mehrere Sequenzen ähnlich sind, kann die Spezifizität der Bindung
durch eine Zugabe einer kleinen Menge an nicht markierten Molekülen, die
mit ihrer komplementären
Sequenz im Wettbewerb stehen vergrößert werden, aber bei weitem
mehr mit den anderen, wodurch der Grad der Kreuzreaktionen erniedrigt
wird.
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Die
Optimierung der Bedingungen der Bindung ist auch notwendig für die Erkennung
von Antigen/Antikörper
oder Ligand/Rezeptoren, aber sie sind gewöhnlich eher spezifisch.
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Eine
bevorzugte Ausführung
dieser Erfindung liegt auch darin, an der Verstärkung teilzunehmen, die durch
die katalytische Reduktion von Ag+ im Kontakt
mit anderen Metallen wie Gold gegeben wird. Nanopartikel von Gold
sind gegenwärtig
verfügbar und
sie können
leicht an Moleküle
wie Protein gebunden werden. Zum Beispiel sind mit Streptavidin
beschichtete Goldpartikel auf dem Markt erhältlich.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführung
dieser Erfindung verwendet man ein markiertes Zielmolekül, welches
dann von einem Konjugat erkannt wird. Dieses markierte Molekül (Biotin,
Haptene, ...) kann als ein erstes Glied des Bindungspaares betrachtet
werden. Für
DNA kann die Markierung leicht während
dessen Verstärkung
durch eine Einbindung von biotinylierten Nukleotiden bewerkstelligt
werden. Für
RNA werden biotinylierte Nukleotide für ihre Kopie in eDNA oder danach
bei dem Schritt der Verstärkung
verwendet. Die Verstärkung
der Nukleotidsequenzen ist eine gängige Praxis, da die Zielmoleküle oft in
sehr geringen Konzentrationen vorliegen. Proteine werden leicht
markiert, indem man NHS-Biotin oder andere Reaktionen verwendet.
Wenn die biotinylierten Moleküle
erst einmal eingefangen sind, wird ein Streptavidingoldkomplex hinzugefügt, der
das zweite Glied des Bindungspaares ist, und das Streptavidin erkennt
spezifisch das Biotin, so dass der Komplex an der Stelle gebunden
wird, wo das Ziel gebunden ist. Wenn Haptene als Marker verwendet werden,
setzt man einen Antikörper-Goldkomplex ein.
Dann wird eine reaktive Mischung, die Ag+ und ein
Reduktionsmittel enthält,
auf die Oberfläche
hinzugefügt
und Schichten von Ag werden auf den Goldpartikeln niederschlagen,
was zu der Bildung von Kristallpartikeln führt.
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Eine
direkte Markierung von Zielmolekülen mit
Gold ist durch den Einsatz von goldmarkierten Antigenen, Antikörpern oder
Nukleotiden möglich.
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Eine
Alternative besteht darin, jede Markierung des Zielmoleküls zu vermeiden,
und darin wird man eine zweite Nukleotidsequenz verwenden, die markiert
wird. Sie bilden dann eine Sandwich-Kreuzung oder eine Sandwich-Reaktion mit dem
Einfangmolekül,
welches das Ziel und die markierte Nukleotidsequenz bindet, was
es erlaubt, mit der Fortsetzung des Nachweises weiterzufah ren. Wie
oben ist die markierte Nukleotidsequenz fähig, von selbst den Niederschlag
des Metalls zu katalysieren oder sie tut es durch einen zweiten
Komplex.
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Der
Ag Niederschlag entspricht einer Stelle der Bindung der biotinylierten
Nukleotidsequenz. Weil diese Stelle gut definiert ist, ist es möglich das Vorhandensein
des Niederschlages (spezifischer Punkt auf der Gruppierung) zu identifizieren.
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Der
metallische Niederschlag hat die Form von kleinen Kristallen, die
im Laufe der Zeit einen Durchmesser von etwa 1 μm erreichen. Die Bildung dieser
kleinen Kristalle stellt eine wirkliche Verstärkung des Signals dar, da dieselben
von dem Vorhandensein von Goldpartikeln mit einem Durchmesser von
ein paar nm herrühren.
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Unerwarteter
Weise konnte innerhalb eines gegebenen Bereiches von markierten
Nukleotidsequenzen, die auf der Oberfläche vorliegen, zwischen der
goldmarkierten Nukleotidsequenzkonzentration und der Menge des Niederschlages
auf der Oberfläche
eine Konzentrationskurve erhalten werden. Eine Beschränkung der
Gruppierung besteht darin, dass das Nachweissignal mit der Stelle
von der es herstammt, in Beziehung gesetzt werden muss.
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Wegen
seiner granulierten Form verändert der
Niederschlag auf vorteilhafte Weise die Reflektion des Lichtes.
Er führt
auch zu einer starken Diffusion des Lichtes (Punktnachweis), was
mit bekannten Nachweisgeräten
aufgezeichnet werden kann. Solche Diffusionsversuche werden in typischer
Weise aus der Reflektion eines Lichtstrahles mit Photodioden nachgewiesen
und aufgezeichnet. Eine unerwartete Beobachtung ist, dass dieser
Versuch auf Vorliegen von Silberkristallen sich als unerwartet stark empfindlich
herausstellte.
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Die
Tatsache, dass der Silberniederschlag als eine schwarze Oberfläche erscheint,
erlaubt den Einsatz eines Scanners (Absorption des Lichtes durch
die transparente Oberfläche
der Gruppierung). Das Vorhandensein eines unlöslichen Niederschlages wird
das Licht absorbieren, welches dann nachgewiesen und aufgezeichnet
wird. Der Vorteil des Scanners ist, dass nur ein kleiner Teil der
Grup pierung zur gleichen Zeit nachgewiesen wird, so dass eine viel
bessere Auflösung
erzielt werden kann. Es wird entweder der Beleuchtungsstrahl oder
die Nachweis oberfläche
fokussiert und das Signal wird so aufgezeichnet, dass das Bild der
Gruppierung wiederhergestellt werden kann. Das Nachweisgerät (Detektor)
kann eine CCD oder CMOS Kamera sein, welche die gesamte Gruppierung
misst. Die Auflösung
des Nachweises hängt
dann von der Zahl der Pixel der Kamera ab. Auf der anderen Seite
kann der Detektor aus Photodioden bestehen, die in einer Linie angeordnet
sind, und das Bild wird durch eine Bewegung entlang der Vorderseite
dieser Linie gescannt. Scanner mit einer Empfindlichkeit von 11 μm für einen
Pixel können
gebaut werden, die ausreichen um Punkte mit einem Durchmesser von
50 μm oder
größer zu analysieren.
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Eine
volle Beleuchtung der Gruppierung kombiniert mit einer Aufzeichnung
des übertragenen Lichtes
ist auch möglich
(schneller als der Scanner, scheint aber weniger empfindlich zu
sein).
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Als
Metall ist Silber in der Lage Licht selbst zu reflektieren. Selbst
wenn die Wirkung dieser Reflektion gering ist, so ist sie doch vorhanden
und sie kann verwendet werden, um den Niederschlag des Silbers (Punkte)
zu lokalisieren. Wegen seiner Metallnatur sind auch andere Verfahren
möglich,
etwa eine Veränderung
eines elektromagnetischen Feldes oder einer elektrischen Leitfähigkeit.
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Ein
anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Vorrichtung
zur Diagnose und/oder zur Quantifizierung von einer oder von mehreren identischen
oder verschiedenen Zielverbindungen, die aus einer Probe gewonnen
worden sind, wobei diese Vorrichtung besteht aus:
- – Einfangmoleküle, welche
auf einer Oberfläche einer
festen Auflage entlang einer Matrix, welche eine Dichtung von zumindest
20 unterschiedlichen Bereichen pro cm2 enthält, befestigt
sind, wobei jeder der diskreten Bereiche mit einer Art von Einfangmolekülen befestigt
ist;
- – ein
metallischer Niederschlag, welcher an einem Ort der Bindung zwischen
der Zielverbindung und dem Einfangmolekül gebildet wird,
- – eine
Detektier- und/oder Quantifizierungsvorrichtung eines metallischen
Niederschlags, welcher an einem Ort der Bindung zwischen der Zielverbindung
und dem Einfangmolekül
gebildet wird,
- – möglicherweise
eine Auslösevorrichtung
von Information(en), welche auf der festen Auflage aufgenommen werden,
und
- – ein
Computer, welcher programmiert ist, um:
- – die
Resultate zu sammeln (welche von der Bildung eines metallischen
Niederschlags an dem spezifischen Ort resultieren), welche von der
Detektiervorrichtung erhalten werden, und möglicherweise die Information(en),
welche von der Auslösevorrichtung
erhalten werden, und
- – Ausführen einer
Diagnose und/oder einer Quantifizierung der Zielverbindung(en) unter
der Bedingung, dass als feste Auflage eine Compact-Disc, worin die
nicht spaltbaren eingefangenen Moleküle auf der äußeren Oberfläche der
Compact-Disc durch konventionelle physikalische Methoden angegangen
werden, wobei mikro-lithographische und/oder Mikro-Bearbeitungstechniken
einer Bebrütung
benutzt werden, welche die nicht spaltbaren Einfangmoleküle an bestimmten
Orten halten werden, wo sie befestigt sein werden, ausgeschlossen
wird.
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Daher
hängt die
Auflösung
des Nachweises und noch spezieller die Zuverlässigkeit der abschließenden Quantifizierung
stark von den Eigenschaften des Nachweisgerätes ab. Insbesondere wenn das Nachweisgerät eine CCD
Kamera enthält,
hängt die Auflösung von
deren Anzahl an Pixeln ab. Die Anzahl an Pixeln begrenzt daher die
erlaubte Empfindlichkeit der Quantifizierung. Typischerweise ist
es möglich, mit
einer CCD Kamera eine Auflösung
von 10 μm
für einen
Pixel zu erhalten, was ausreichend ist, um Punkte von 100 μm im Durchmesser
oder größer zu analysieren.
Eine solche Quantifizierung ist jedoch begrenzt von der Anzahl der
Pixel, von der Auflösung eines
jeden Pixels und von der Tatsache, dass die Empfindlichkeit nur
von einem Sichtpunkt gegeben ist. Ein Sichtpunkt hängt von
den drei folgenden Muster ab: die Position des Leseelementes, wie
diejenige der CCD Kamera, die Position des Objektes, das nachgewiesen
werden soll, und die Position der Beleuchtung des Objektes.
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Um
die genannten Zielen zu erfüllen
betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren (speziell
ausgelegt für
den Nachweis und/oder die Quantifizie rung eines metallischen Niederschlages
gemäß der Erfindung)
für die
Quantifizierung metallischen eines Volumens eines Niederschlages
auf einer definierten Oberfläche
eines festen Trägers,
wobei diese definierte Oberfläche
eines festen Trägers
definiert ist durch eine Gruppierung von mindestens 4, von mindestens
10, von mindestens 16, von mindestens 20 oder von mehr diskreten
Bereichen pro cm2, wobei jeder diskrete
Bereich möglicherweise
einen Niederschlag umfasst. Gemäß der Erfindung
entsprechen die Bilder der genannten definierten Oberfläche, die einen
oder mehrere Niederschläge
enthalten, verschiedenen Sichten, wobei diese Sichten analoge Informationen
enthalten, die von einer oder von mehreren Kameras und nach einer
Beleuchtung durch eine oder durch mehrere Beleuchtungsquellen aufgenommen
sind, welche räumlich
gemäß einem
vorherbestimmten Muster relativ zueinander angeordnet sind; die
dem Bild entsprechende analoge Information der definierten Oberfläche, die
den einen oder die mehreren Niederschläge enthält, wird in eine digitale Form
oder in einen Satz digitaler Formen transformiert und konvertiert
und sie wird mit einem ersten und mit einem zweiten Referenzstandard
verglichen, um das Volumen des einen oder der mehreren Niederschläge, die
quantifiziert werden sollen, zu bestimmen.
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Der
erste Referenzstandard entspricht der digitalen Form oder einem
Satz digitaler Formen, die aus analogen Informationen gewonnen worden
sind, die in Bildern enthalten sind, welche auf der Oberfläche ohne
Niederschlag aufgenommen worden sind.
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Der
zweite Referenzstandard entspricht einer digitalen Form oder einem
Satz digitaler Formen, die aus analogen Informationen gewonnen worden sind,
die in Bildern enthalten sind, welche auf der Oberfläche aufgenommen
worden sind, die metallische Niederschläge mit einem bekannten Volumen enthält.
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Der
Begriff „Volumen" sollte so verstanden werden,
dass dasjenige Volumen gemeint ist, wofür es erwünscht ist, eine dimensionstypische
Information zu erhalten. In der vorliegenden Erfindung ergibt sich
das Volumen aus einer chemischen oder biochemischen Reaktion im
Anschluss an eine Bindung zwischen einer Zielverbindung und ihrer
entsprechenden Verbindung. Daher ist das erhaltene Volumen der Ausdruck
der chemischen oder biochemischen Reaktion anschlie ßend an
eine Bindung zwischen einer Zielverbindung und ihrer entsprechenden
Verbindung.
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Der
Begriff „Bild" sollte so verstanden
werden, dass eine Gruppe von Pixeln gemeint ist, die eine Darstellung
eines Maßes
jenes Volumens ist, und die direkt auf einen Monitor übertragen
und darauf registriert werden kann, etwa einen Schirm oder einen
Drucker.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung, die Mittel
für die
Durchführung
des genannten Verfahrens enthält;
vorzugsweise enthält diese
einen oder mehrere Sensoren, die mit Kameras und mit einer oder
mit mehreren Beleuchtungsquellen ausgestattet sind, welche räumlich gemäß einem vorherbestimmten
Muster relativ zueinander angeordnet sind und welche mit einem System
zum Erwerb einer analogen Information verbunden sind, wobei die
Information gemessen wird indem Sensoren verwendet werden, während die
Information mit Hilfe einer Verarbeitungseinheit in eine digitale
Form umgewandelt wird.
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Vorzugsweise
werden die Transformation und die Umwandlung von einer Verarbeitungseinheit in
der Kamera oder in einem Computer durchgeführt.
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Die
Kameras sind vorzugsweise einfarbige, farbige, infrarote oder spezielle
Kameras für
den CCD oder CMOS Nahbereich oder ähnliche Lesetechnologien.
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Die
Beleuchtungsquelle ist vorzugsweise ein infrarotes Licht mit einer
Wellenlänge,
die ähnlich
ist wie die Dimension der Metallkristalle, die in dem einen oder
in den mehreren Niederschlägen
enthalten sind, und die auf vorteilhafte Weise erzeugt werden, indem
eine einzelne Diode oder mehrere Dioden mit derselben spektralen
Verteilung verwendet wird.
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Die
Beleuchtungsquellen sind auf vorteilhafte Weise regelmäßig um den
festen Träger
herum angeordnet, wobei eine jede dieser Quellen einem Lichtpunkt
entspricht, der gleichzeitig oder aufeinanderfolgend automatisch
angeschaltet werden kann.
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Die
Bilder werden vorzugsweise erhalten entweder durch Transparenz,
durch Reflektion oder durch eine Kombination derselben.
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Wie
in den beiliegenden Zeichnungen dargestellt, können die Vorrichtung und das
Verfahren sich auf die Verwendung einer Kamera und einer Lichtquelle
erstrecken, welche über
dem festen Träger
angeordnet sind, wobei die Kamera und die Beleuchtungsquelle in
den drei Dimensionen des Raumes beweglich sind.
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Die
Vorrichtung und das Verfahren können auch
die Verwendung von zwei oder von mehr Kameras umfassen, die einander
gegenüber
in einer Ebene angeordnet sind und die sich über dem festen Träger befinden,
und eine oder mehrere Beleuchtungsquellen, die unter dem festen
Träger
angeordnet sind.
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Die
Vorrichtung und das Verfahren können auch
die Verwendung von drei oder von mehr Kameras umfassen, die gemäß einer
dreieckigen Ebene oder einem anderen regulären oder irregulären Muster
angeordnet sind und die sich über
dem festen Träger
befinden, und eine oder mehrere Beleuchtungsquellen, die unter dem
festen Träger
angeordnet sind.
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Die
Vorrichtung und das Verfahren können auch
die Verwendung einer Kamera umfassen, die über dem festen Träger angeordnet
ist, eine erste Beleuchtungsquelle, die über dem festen Träger und unter
der Kamera angeordnet ist, eine zweite Beleuchtungsquelle, die unter
dem festen Träger
angeordnet ist, wobei die zwei Beleuchtungsquellen entsprechend
der Position des festen Trägers
fast symmetrisch angeordnet sind.
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Alternative
bevorzugte Ausführungen
der vorliegenden Erfindung beruhen auf der Verwendung von einer
oder von mehreren Beleuchtungsquellen und von einer oder von mehreren
Kameras, welche gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, entweder in Kombination oder
nacheinander, wobei eine oder mehrere Beleuchtungsquellen und/oder
eine oder mehrere Kameras während
des Ablesen festgehalten werden können oder bewegt werden können gemäß einer bevorzugten
Längs-
oder Drehbewegung entlang oder um den festen Träger herum, der das spezifische
Volumen eines Niederschlages enthält.
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Es
ist auch möglich
unter Verwendung von einer oder von mehreren Beleuchtungsquellen und/oder
von einer oder von mehreren Kameras, die Bewegung des festen Trägers zu
erlauben, der ein spezifisches Volumen eines Niederschlages enthält.
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Andere
Ausführungen,
die gemäß der Erfindung
verwendet werden können,
sind Vorrichtungen mit (i) entweder einer Kamera und mehreren Beleuchtungsquellen,
wobei diese verschiedenen Beleuchtungsquellen entsprechend verschiedenen symmetrischen
oder nicht symmetrischen Muster die einen zu den anderen angeordnet
sind, (ii) oder mit einer Beleuchtungsquelle und mit mehreren Kameras,
wobei diese verschiedenen Kameras entsprechend verschiedenen symmetrischen
oder nicht symmetrischen Muster zueinander angeordnet sind, (iii)
oder einer Kombination derselben. Die Beleuchtung ist ein Infrarotlicht
mit einer Wellenlänge ähnlich wie
die Dimension der Kristalle, die in dem Niederschlag enthalten sind.
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Der
Experte in seinem Fach wird auch fähig sein, Mittel für die Durchführung der
verschiedenen Schritte der vorliegenden Erfindung bereitzustellen, insbesondere
für die
Transformation und die Konvertierung des größeren Volumens in eine digitale
Form oder in einen Satz digitaler Formen unter Verwendung bekannter
Mittel oder Verfahren, wie etwa derjenigen, die in der Software
und in den Computertechnologien vorhanden sind.
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Diese
Hilfsmittel sind dazu geeignet die Ergebnisse, die von dem Gerät zum Nachweis und/oder
zur Quantifizierung gewonnen worden sind, und möglicherweise die Information,
die von dem Lesegerät
gewonnen worden ist, zu sammeln und diese Hilfsmittel sind in der
Lage, eine Diagnose und/oder eine Quantifizierung einer spezifischen
Zielverbindung durchzuführen,
die sich aus der Analyse der Ergebnisse ergibt, möglicherweise
in Beziehung mit der gelesenen Information.
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Diese
Hilfsmittel eines solchen Produktes eines Computerprogramms sind
in der Lage, eine Unterscheidung zwischen den Punkten und einem
möglicherweise
erfassten Hintergrundrauschen zu erzielen, zum Beispiel durch eine
Identifikation von homogenen Teilen eines Bildes, nachdem sie zu
zwei Klassen zusammengefasst worden sind, die als Übungsmengen
verwendet werden. Diese Unterscheidung kann durch eine Nachklassifizierung
kontext-abhängiger
Filtertechniken verbessert werden.
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Diese
Mittel sind auch in der Lage, die Kontur des Punktes selbst zu identifizieren,
der dem Originalbild überlagert
wird und der die Messung des Intensitätsgrades der gezählten Pixel
erlauben wird, die in dem Punkt identifiziert werden.
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Die
Mittel zur Quantifizierung erlauben eine Integration der Intensität aller
Pixel, die in dem Punkt vorhanden sind, oder eine Aufzeichnung des
gesamten Grades der Intensität
der homogenen Teile des Punktes.
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Weiterhin
erlauben diese Mittel eine statistische Vergleichsanalyse zwischen
den Punkten einer jeden Probe und einem Kontroll- oder einem Referenzstandard
(standardisierte Zielverbindung) oder zwischen zwei oder mehr Punkten
(vorzugsweise mit einer Beziehung mit der aufgezeichneten Information eines
festen Trägers).
Eine Bildbeziehung zwischen dem Punktbild und dem Punktbild der
standardisierten Zielverbindung könnte erzielt werden, um die Punkte
zu unterscheiden, die in einem Test statistisch verschieden, verglichen
mit einem anderen, sind.
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Die
durch das Nachweisgerät
und das Lesegerät
aufgezeichneten Signale, eines oder mehrere an der Zahl, können mit
Hilfe des genannten geeigneten Computerprogrammproduktes (Software)
wie elektronisch computerisierte Daten gelesen, verarbeitet und
analysiert werden.
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Gemäß einer
spezifischen Ausführung
der vorliegenden Erfindung trägt
die Gruppierung gebundene Oligonukleotideinfangnukleotidsequenzen,
um so einen Nachweis, eine Verstärkung
und möglicherweise
eine Quantifizierung von Nukleinsäuresequenzen auf einem selben
festen Träger
zu erlauben. In einer alternativen Form der Ausführung umfasst die Gruppierung
gebundene PCR Primer, um die Produktion von Ampliconen zu erzielen,
und die Bindung der Ampliconen auf der Oberfläche, entsprechend dem von Rasmussen
et al. beschriebenen Verfahren (Anal. Bioch., 198, pp. 138–205 (1991)),
was danach ihren Nachweis erlaubt.
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Die
Gruppierung gemäß dieser
Erfindung wird in einer Vorrichtung zur Diagnose und/oder zur Quantifizierung
verwendet, die ein automatisches Ablesen erlaubt, möglicherweise
nach einer vorhergehenden Behandlung, wie eine Reinigung, eine Aufspaltung,
eine Kopie und/oder eine genetische Verstärkung.
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Vorzugsweise
ist die Vorrichtung zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung gemäß der Erfindung
ein System, das vielfache Schritte oder Unterschritte innerhalb
eines integrierten Systems kombiniert, wie z. Bsp. in einem automatischen
Nukleinsäurediagnostiksystem
[die Schritte der Reinigung der Nukleinsäuresequenzen in der Probe,
der Verstärkung
(durch die bekannten genetischen Verstärkungsverfahren), der Diagnose
und möglicherweise der
Quantifizierung].
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Bevorzugte
Ausführungen
der vorliegenden Erfindung werden in den folgenden keine Begrenzung
darstellenden Beispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben.
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Kurze Beschreibungen der Zeichnungen
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Die 1 vergleicht
den Nachweis von Zielmolekülen,
die erzielt worden sind auf Gruppierungen, die sich aus DNA Einfangnukleotidsequenzen zusammensetzen,
welche kovalent auf Glas gebunden sind und dazu verwendet werden,
um 3 Konzentrationen von biotinylierten Ziel DNAs entweder in Fluoreszenz
oder nach einer Silberkonzentration nachzuweisen.
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Die 2 bis 7 illustrieren
die räumliche Anordnung
einiger Elemente in verschiedenen Ausführungen der Vorrichtung für die Durchführung des Verfahrens
des Nachweises und/oder der Quantifizierung gemäß der Erfindung.
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Beispiel 1
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Nachweis von DNA auf Biochips
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In
diesem Experiment wird die markierte Ziel DNA durch eine direkte
Kreuzung auf Einfangnukleotidsequenzen, die an der Gruppierung gebunden
sind nachgewiesen. Einfangnukleotidsequenzen wurden kovalent auf
Glas gebunden und eine direkte Kreuzung wurde mit komplementärer biotinylierter
DNA durchgeführt.
Die positive Kreuzung wurde mit einem Silberniederschlag nachgewie sen,
der von Nanogoldpartikeln, die an Streptavidin gebunden waren, katalysiert
wurde.
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Bindung von Einfangnukleotidsequenzen
auf Glas
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Aktiviertes
Glas, das Aldehydgruppen trägt, wurde
bei CEL Associates (USA) gekauft. Aminierte Einfangnukleotidsequenzen
für CMV
DNA wurden hergestellt durch PCR Verstärkung der DNA, indem aminierte
Primer verwendet wurden, wie von Zammatteo et al. (Anal. Biochem.,
253, pp. 180–189 (1997))
beschrieben. Die Primer wurden bei Eurogentec (Lüttich, Belgien) gekauft. Die
Quantifizierung der Ampliconen wurde durch ihre Absorption bei 260 nm
bewerkstelligt.
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Für die Transplantation
auf Glas wurde zuerst eine Lösung
von animierten Ampliconen von 0,2 um in MES 0,1 M pH 6,5 bei 100°C während einer Dauer
von 5 Minuten erhitzt und dann von einem Roboter gesprenkelt unter
Verwendung von Pinlöchern von
250 μm Durchmesser
(Genetix, UK). Nach einer Inkubation von 1 Stunde bei 20°C wurden
sie mit einer SDS Lösung
von 0,1% und dann zweimal mit Wasser gewaschen. Sie wurden dann
mit NaBH4 in einer 2,5 mg/ml Lösung während 5
Minuten inkubiert, dann im Wasser gewaschen und bei 95°C während 3 Minuten
erhitzt, bevor sie getrocknet wurden.
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Kreuzung des Zielmoleküls
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Das
Zielmolekül
wurde durch Verstärkung mittels
PCR in der Anwesenheit von biotinyliertem dUTP von 1 mM (Alexandre
et al., Biotechniques, 25, pp. 676–683 (1998)) erhalten. Plasmide,
welche die Sequenz eines CMV Virus enthielten, wurden für die PCR
verwendet. Nach der Verstärkung
wurden die PCR Produkte gereinigt, und zwar unter Einsatz einer Ausrüstung einer
hochreinen PCR Produktreinigung (Boehringer, Mannheim, Deutschland)
und mit einer Äthidiumbromidfärbung nach
einer Trennung auf einem 2% Agarosegel quantifiziert.
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Für die Kreuzung
wurden verschiedene Konzentrationen 0,67, 6,7 und 67 fm in 5 μl eines biotinylierter
Ziel DNA in eine SSC 2X Denhard Lösung hinzugefügt, die
20 μg Salm
DNA enthält.
Ein Tropfen dieser Lösung
(5 μl) wurde
auf die Gruppierung hinzugefügt
und während
2 h bei 65°C
in einer feuchten Atmosphäre
inkubiert. Die Gruppierung wurde dann 4 mal gewaschen mit einem
Maleinsäurepuffer
von 10 mM pH 7,5, der 15 mM NaCl und 0,1% Tween enthielt.
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Silberniederschlag
auf der Gruppierung nach der Silberfällung Die Gruppierung wurde
zuerst während
45 Minuten mit 0,8 ml eines Streptavidinkollodialgoldes (Sigma)
inkubiert, welches 1.000 fach verdünnt war in einem Maleinsäurepuffer
150 mM pH 7,4, der NaCl 100 mM und 0,1% trockenes Milchpulver enthielt.
Die Gruppierungen wurden dann 5 mal 2 Minuten lang in dem Maleinsäurepuffer
von 10 mM pH 7,4 gewaschen, der 15 mM NaCl und 0,1% Tween enthielt.
Ein „Silberverstärkungsreagens" (40 μl) von Sigma
wurde auf die Gruppierung hinzugefügt und es veränderte sich
nach 10 und dann nach 5 Minuten. Nach dem Waschen in dem Maleinsäurepuffer
wurde die Gruppierung getrocknet.
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Nachweis und Analyse der Gruppierung
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Die
Gruppierung wurde gescannt und das digitale Bild wurde mit einer
Formerkennungsoftware behandelt, um die Punkte abzugrenzen und zu
identifizieren. Das Niveau der Pixel eines jeden Punktes wurde integriert
und jedem Punkt wurde ein Wert gegeben. Die Werte wurden um das
Hintergrundrauschen korrigiert, das an drei Stellen erhalten wurde wo
keine Einfangnukleotidsequenzen gebunden waren.
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Beispiel 2
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Nachweis von Proteinen auf Biochips
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Bindung von Antikörpern auf der Gruppierung
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Das
Glas der Gruppierung wurde aktiviert, wie dies oben beschrieben
worden ist, um Aldehydgruppen auf der Oberfläche zu erhalten. Die in diesem
Experiment verwendeten Antikörper
wurden gegen das Rinderserumalbumin aufgezogen für eine positive Kontrolle und
nicht spezifisches IgG für
eine negative Kontrolle. Die Antikörper von 10 μg/ml in PBS-Lösung wurden
unter Verwen dung von 250 μm Durchmesser
Pinlöchern
direkt auf das Glas gesprenkelt. Die Aminogruppen der Antikörper konnten mit
dem Aldehyd reagieren, das auf dem Glas vorhanden ist. Die Reaktion
wurde während
1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Gläser wurden mit einem PBS Puffer
gewaschen.
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Nachweis
von Rinderserumalbumin durch ELISA auf der Gruppierung Eine Lösung von
Rinderserumalbumin (RSA) von 10 μg/ml
in PBS, das 0,1% Kasein enthielt, wurde auf die Gruppierung hinzugegeben
und während
30 Minuten inkubiert. Die Gruppierung wurde dann 3 mal gewaschen
mit PBS, das 0,1% Tween 20 enthielt, und dann inkubiert mit einer Lösung von
biotinyliertem anti-RSA mit 20 μg/ml
in PBS, das 0,1% Kasein enthielt. Die Inkubation wurde während 30
Minuten durchgeführt.
Ein Komplex aus Streptavidinkollodialgold von 1 μg/ml wurde dann während 30
Minuten in einer PBS Lösung
inkubiert, die 0,1% Kasein enthielt. Das Vorhandensein von Gold
diente als ein Zentrum für
die Silberreduktion. Der Silberniederschlag wurde durchgeführt mit
einem „Silberverstärkungsreagens" von Sigma mit einer
Veränderung
der Lösung
nach 10 Minuten und dann wieder nach 5 Minuten. Die Gläser wurden dann
gescannt und die Daten analysiert, wie in dem Beispiel hier oben
dargestellt.
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Beispiel 3
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Bevorzugte
Ausführungen
der Vorrichtung für
die Durchführung
des Verfahrens zur Quantifizierung gemäß der Erfindung werden in den 2 bis 7 gezeigt.
Die Vorrichtung enthält
einen festen Träger 1,
mehrere Beleuchtungsquellen 2, welche regelmäßig voneinander
entfernt auf einem kreisförmigen
Träger 4 angeordnet
sind, wobei der kreisförmige
Träger
unter dem festen Träger 1 angeordnet
ist, und zwei Kameras 3, 3', wobei die Kameras über dem
festen Träger 1 angeordnet
sind und einander gegenüber
in einer Ebene gelegen sind.
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Die
Vorrichtung kann auch einen festen Träger 1 enthalten, mehrere
Beleuchtungsquellen 2, welche regelmäßig voneinander entfernt auf
einem kreisförmigen
Träger 4 angeordnet
sind, wobei der kreisförmige
Träger
unter dem festen Träger 1 angeordnet
ist und eine Kamera 3 über
dem festen Träger 1 angeordnet
ist.
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Weiterhin
kann die Vorrichtung auch einen festen Träger 1 enthalten. Die
Vorrichtung umfasst auch einen ersten Satz von Beleuchtungsquellen 2 und
einen zweiten Satz von Beleuchtungsquellen 2', wobei die Beleuchtungsquellen
eines jeden Satzes 2, 2' regelmäßig voneinander entfernt in
einer Ebene, vorzugsweise auf einem kreisförmigen Träger 4, 4', angeordnet
sind. Der erste Satz der Beleuchtungsquellen 2 ist über dem
festen Träger 1 angeordnet und
der zweite Satz 2' ist
unter dem festen Träger 1 angeordnet,
wobei der erste und zweite Satz der Beleuchtungsquellen 2, 2' symmetrisch
angeordnet sind entsprechend der Position des festen Trägers 1.
Die Vorrichtung umfasst auch eine Kamera 3, die über dem
festen Träger 1 angeordnet
ist und über
dem ersten Satz von Beleuchtungsquellen 2.
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Weiterhin
kann die Vorrichtung auch einen festen Träger 1 enthalten, mit
oder ohne den mehreren Beleuchtungsquellen 2, die regelmäßig voneinander
entfernt in einer Ebene angeordnet sind, vorzugsweise auf einem
kreisförmigen
Träger 4,
und die sich unter dem festen Träger 1 befinden.
Die Vorrichtung umfasst auch eine darüber befindliche Kamera 3.
Der kreisförmige
Träger 4 und
die Kamera 3 sind symmetrisch entsprechend der Position
des festen Trägers 1 angeordnet.
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Ferner
kann die Vorrichtung auch einen festen Träger 1 enthalten mit
mehreren Beleuchtungsquellen 2, die regelmäßig voneinander
entfernt in einer Ebene angeordnet sind, vorzugsweise auf einem kreisförmigen Träger 4,
wobei sich der kreisförmige Träger unter
dem festen Träger 1 befindet,
und drei Kameras 3, 3', 3'',
wobei die Kameras sich über
dem festen Träger 1 befinden
und so angeordnet sind, dass sie in einer Ebene entsprechend einer
dreieckigen Anordnung liegen.