DE20023342U1 - Vorrichtung und Kit zur Identifizierung und/oder Quantifizierung einer Zielverbindung auf Chips - Google Patents

Vorrichtung und Kit zur Identifizierung und/oder Quantifizierung einer Zielverbindung auf Chips

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Description

Unterlagen die der Eintragung des Gebraughanusters .zugrunde JÄegan Anlage
-1 -
31. Juli 2003
Eppendorf Array Technologies E100016GBM MR/UK/cf
Vorrichtung und Kit zur Identifizierung und/oder Quantifizierung einer Zielverbindung auf Chips
Gebiet der Erfindung
[0001] Die vorliegende Erfindung basiert auf einem Verfahren zur Identifizierung und/oder Quantifizierung einer aus einer biologischen Probe erhaltenen Zielverbindung, durch Bindung an ein Einfangmolekül, das auf Chips gebunden ist.
[0002] Die vorliegende Erfindung betrifft Vorrichtungen zur Identifizierung und/oder Quantifizierung, welche auf dem obigen Verfahren basiert und welche die Identifizierung und/oder die Quantifizierung von positiven Stellen gebundener Zielverbindungen auf besagten Chips erlaubt.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
[0003] Biologische Untersuchungen beruhen im Wesentlichen auf der Spezifität der Wechselwirkung zwischen zwei biologischen Molekülen, etwa zwei Strängen von Nukleinsäuremolekülen, einem Antigen und einem Antikörper oder zwischen einem Liganden und seinem Rezeptor. Die jetzige Herausforderung der biologischen Untersuchungen besteht darin, gleichzeitig den mehrfachen Nachweis von in einer Probe anwesenden Molekülen durchzuführen.
• · a
-2-
Die Miniaturisierung und die Entwicklung von Arrays auf der Oberfläche von „Biochips" sind Werkzeuge, die Multiplexreaktionen in einem mikroskopischen Format erlauben, wobei der besagte Nachweis mit einem begrenzten Proben-Volumen für das Screening und/oder die Identifizierung von mehreren möglichen Zielverbindungen durchgeführt wird. Diese Arrays werden durch diskrete Bereiche gebildet, die ein spezifisches Einfangmolekül enthalten, das für die Bindung der Zielverbindung verwendet wird. Diese diskreten Bereiche, die so klein wie ein paar Mikrometer sind, erlauben die Bindung von mehreren Tausend Einfangmolekülen pro cm2 Oberfläche (WO 95/11995).
[0004] Der Nachweis gebundener Zielverbindungen ist jedoch schwierig, weil ihre Menge wegen der genannten Miniaturisierung (wenige Femtomole oder sogar wenige Attomole) sehr klein ist. Daher sind nur äußerst empfindliche Verfahren für solch einen Nachweis geeignet.
[0005] Es wurde vorgeschlagen, eine Zielverbindung, wie etwa DNA, nach ihrer möglichen genetischen Amplifizierung mit Fluoreszenzmolekülen zu markieren. Wenn ein RNA-Molekül nachgewiesen werden muss, wird es vor einer möglichen Amplifikation desselben zuerst in eine cDNA transformiert. Wenn eine direkte Markierung der Zielverbindung nicht möglich ist, kann eine Doppelreaktion (Sandwich Reaktion) durchgeführt werden. Die Menge der Fluoreszenzmoleküle ist jedoch so gering, dass es notwendig ist, spezifische Arrayscanner für den Nachweis und/oder die Quantifizierung der gebundenen Verbindung auf den „Hybridisierungschips" zu entwickeln. Derartige teure spezifische Scanner enthalten einen Laserscanner für die Anregung der Fluoreszenzmoleküle, eine Blende (engl. pinhole) für die Verminderung des fluoreszenten Hintergrundrauschens und einen Photomultiplier für die Steigerung der Empfindlichkeit des Nachweises.
[0006] Alternative Verfahren des Nachweises, die eine hohe Empfindlichkeit aufweisen, sind in den Dokumenten US-5,821,060 und WO 95/04160 beschrieben und basieren auf einem Nachweis, der teure Vorrichtungen verwendet, wie etwa Massenspektrometer.
[0007] Es wurden auch Verfahren vorgeschlagen, welche auf der Präzipitierung von spezifischen Produkten beruhen, die aus einer kolorimetrischen Markierung resultieren (US 5,270,167, US 4,731,325, EP-A-0301141) oder das Ergebnis einer enzymatischen Aktivität sind (EP-A-0393868, WO 86/02733, EP-A-0063810). Die genannten Methoden sind jedoch entweder durch eine geringe Empfindlichkeit gekennzeichnet oder sind nicht geeignet für den Nachweis einer Zielverbindung auf „Hybridisierungschips", weil sich der Niederschlag in einer bestimmten Entfernung von der Reaktionsbindung bildet und seine Position nicht leicht mit einer gebundenen spezifischen Zielverbindung in Beziehung gesetzt werden kann.
Außerdem ist die Dichte des Niederschlages von solchen enzymatischen Reaktionen nicht ausreichend opak, um einen Nachweis durch Lichtabsorption zu erlauben.
[0008] Es wurde auch vorgeschlagen, den Nachweis durch die Bindung eines löslichen Produktes zu verbessern, welches aus der enzymatischen Reaktion mit einem Metall vor seiner Präzipitierung erhalten wird. Da jedoch das Ergebnis dieser enzymatischen Reaktion ein lösliches Produkt ist, besteht keine Beziehung zwisehen der Stelle des Niederschlages und dem Nachweis einer spezifisch gebundenen Zielverbindung.
Ziel der Erfindung
[0009] Die vorliegende Erfindung hat zum Ziel, Vorrichtungen für ein neues Identifiziemngs und/oder Quantifizierungsverfahren von einer oder von mehreren in einer biologischen Probe vorliegenden Zielverbindungen (ggf. gleichzeitig) bereitzustellen, die die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen.
[0010] Die vorliegende Erfindung hat zum Ziel, Vorrichtungen für ein Verfahren bereitzustellen, die einfach und nicht kostspielig sind, die den Nachweis besagter Zielverbindungen durch die Verwendung von gebundenen Einfangmolekülen auf Arrays auf der Oberfläche eines festen Trägers erlauben.
[0011] Ein letztes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, auch einfache und nicht kostspielige Vorrichtungen bereitzustellen, welche auf dem obigen Verfahren beruhen und welche die Identifizierung und/oder die Quantifizierung von gebundenen Zielverbindungen auf „Hybridisierungschips" verbessern.
Zusammenfassung der Erfindung
[0012] Die vorliegende Erfindung betrifft Vorrichtungen für ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Quantifizierung von mindestens einer Zielverbindung, die in einer biologischen Probe vorliegt, durch ihre Bindung an ein Einfangmolekül, das auf Arrays eines festen Trägers (nachfolgend als „Hybridisierungschips" bezeichnet) gebunden ist, wobei die Bindung der Zielverbindung an ihr entsprechendes Einfangmolekül zu der Bildung eines Metallniederschlages an der Position (engl. location) des besagten Einfangmoleküls führt.
-5-
[0013] Vorteilhafterweise umfasst das Verfahren, in dessen Rahmen die erfindungsgemäßen Vorrichtungen verwendet werden können, die folgenden Schritte:
- das Inkontaktbringen der Ziel verbindung mit einem Einfangmolekül, um eine spezifische Bindung zwischen der Zielverbindung mit einem (entsprechenden) Einfangmolekül zu ermöglichen, wobei das Einfangmolekül auf eine Oberfläche eines festen Trägers gebunden wird, in einem Array, der eine Dichte von mindestens 20 diskreten Bereichen pro cm2 aufweist, wobei ein jeder dieser diskreten Bereiche mit einer Spezies eines Einfangmoleküls verbunden ist;
- Durchführung einer Reaktion, vorzugsweise einer (chemischen oder biochemischen) katalytischen Reaktion, die zur Bildung eines Niederschlages an der Position der Bindung führt;
- Bestimmung des möglichen Vorliegens eines Niederschlages in einem diskreten Bereich, vorzugsweise durch die Verwendung eines Scanners; und
- das Inbeziehungsetzen des Vorliegens des oder der Niederschläge an dem oder den diskreten Bereichen (Niederschlagsmuster) mit der Identifikation und/oder der Quantifizierung der besagten Zielverbindung in der biologischen Probe.
[0014] Die „Hybridisierungschips" gemäß der Erfindung sind irgendeine Art eines festen Trägers, der die Bildung von Arrays von Einfangmolekülen (spezifisches Muster) auf einer oder auf mehreren seiner Oberflächen erlaubt. Ein solcher fester Träger kann aus Gläsern, aus Filtern, aus einem elektronischen Baustein, aus Polymeren oder aus metallischen Werkstoffen, usw. hergestellt werden. Vorzugsweise enthalten solche Arrays spezifische Positionen (engl. location) (vorteilhafterweise dargestellt anhand eines spezifischen Musters), wobei jeder derselben normalerweise nur eine Spezies eines Einfangmoleküls aufweist.
-6-
[0015] Die Bindung von DNA-Strängen an Proteine, danach die spezifische Bindung an ortsspezifische Stellen (engl. site specific locations) auf dem Substrat, wird im Dokument US-5,561,071 beschrieben.
Es ist auch bekannt, dass Einfangchemikalien mit Mikrotubuli verbunden werden können, welche dann räumlich angeordnet werden, um ein Array zu bilden, wie dies im Dokument GB-3 319 838 beschrieben wird, oder das Erzielen einer direkten Synthese der Oligonukleotide auf spezifischen Oberflächen durch die Anwendung von photolithografisehen Techniken, wie dies in den Dokumenten EP-0476014, US-5,510,270, US-5,445,934, WO 97/29212, US-5,605,662, US-5,632,957 und WO 94/22889 beschrieben wird.
[0016] Alle diese Verfahren für die Bindung von Einfangmolekülen auf der Oberfläche eines festen Trägers, um die oben beschriebenen Arrays zu erhalten, sind mit der vorliegenden Erfindung vereinbar.
[0017] Die biologischen Zielverbindungen gemäß der Erfindung können in einer biologischen (oder möglicherweise in einer nicht-biologischen) Probe, wie etwa in klinischen Proben vorhanden sein, welche aus Blut, Urin, Fäkalien, Speichelflüssigkeit, Eiter, Serum, Gewebe, Fermentationslösungen oder Kulturmedien extrahiert worden sind. Die Zielverbindungen werden vorzugsweise vor ihrem Nachweis und/oder vor ihrer Quantifizierung auf den „Hybridisierungschips" isoliert, gereinigt, aufgespalten, kopiert und/oder amplifiziert, wenn notwendig, durch einem Fachmann bekannte Verfahren.
-7-
[0018] Vorzugsweise wird die Bildung eines Niederschlages an der Bindungsstelle (engl. location of the binding) durch die Fixierung einer metallischen Verbindung auf der gebundenen Zielverbindung oder durch das Ergebnis einer Reduktion eines Metalls in Anwesenheit eines Enzyms erzielt. Vorteilhafterweise erlaubt die Reduktion von Silber unter Anwesenheit von kolloidalem Gold die Bildung eines Niederschlages in einer Entfernung, die ein paar Mikrometer von der gebundenen Zielverbindung bis zu deren Einfangmolekül nicht übersteigt.
[0019] Gemäß der Erfindung weisen die spezifischen Bereiche (engl. locations) auf den Arrays eine Länge kleiner als 1000 &mgr;&pgr;&igr; auf. Diese Bereiche oder Punkte haben vorzugsweise einen Durchmesser, der zwischen 10 und 500 &mgr;&pgr;&igr; liegt, und sind durch einen Abstand von einer ähnlichen Größenordnung getrennt, so dass der Array des festen Trägers zwischen 100 und 250.000 Punkte auf der Oberfläehe von 1 cm2 umfasst. Es ist jedoch auch möglich, kleinere Punkte als 1 &mgr;&pgr;&igr; oder weniger herzustellen, auf denen die Einfangmoleküle gebunden werden.
Die Bildung dieser Punkte oder Bereiche würde durch bekannte mikroelektronische oder photolithografische Verfahren und Vorrichtungen erzielt werden, welche die Bindung der Einfangmoleküle auf der Oberfläche des festen Trägers entweder durch eine kovalente Verbindung oder durch eine nicht kovalente Adsorption erlauben. Die Technik der kovalenten Verbindung ist bevorzugt, um die Stellen der Einfangsmolekülbindungen speziell zu kontrollieren und um mögliche Nachteile zu vermeiden, die mit mehreren Einfangmolekülen (wie Nukleinsäuren oder Antikörper) entstehen können, die während der Inkubation oder des Wasch-Schrittes desorbiert werden können.
• * * &igr;
-8-
[0020] Eine der bevorzugten Ausführungen ist die Bindung biologischer Moleküle wie Proteine, Peptide oder Nukleinsäuresequenzen durch Bindung von Aminogruppen an ein aktiviertes Glas, das einen Aldehydteil trägt. Die Inkorporation einer Aminogruppe in die Nukleinsäurekette wird leicht bewerkstelligt, indem man aminierte Nukleotide während ihrer Synthese verwendet. Aminierte Aminosäuren können auf der Oberfläche eines festen Trägers wie Glas, das Aldehydgruppen trägt, gebunden werden, wie dies von Schena et al. beschrieben wird (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93, pp. 10614-10619 (1996)) oder wie dies beschrieben wird im Dokument US-5,605,662 und in der Veröffentlichung von Krensky et al. (Nucleic Acids Research, 15, pp. 2891-2909 (1987)). Die Verbindung zwischen einer Amino- und einer Carboxylgruppe erhält man durch die Anwesenheit eines Kopplungswirkstoffes, wie etwa von Carbodiimidverbindungen, wie dies von Joos et al. (Anal. Biochem., 247, pp. 96-101 (1997)) beschrieben wird.
Thiol modifizierte Oligonukleotide können auch verwenden werden, um eine Reaktion mit Aminogruppen auf der Oberfläche eines festen Trägers unter Anwesenheit von Cross-Linking-Molekülen zu erzielen (Thrisey et al., Nucleic Acids Research, 24, pp. 3031-3039 (1996)). Ähnlich können Oligonukleotide an einem gelähnlichen Polyacrylamid gebunden werden, das Hydroxyl- und Aldehydgruppen trägt, wie in den Dokumenten US-5,552,270 und WO 98/28444 beschrieben.
[0021] Die Bindung (oder die Erkennung) der Ziel verbindung an ihre entsprechenden spezifischen Einfangmoleküle ist eine spontane nicht kovalente Reaktion, wenn sie unter optimalen Bedingungen durchgeführt wird. Sie bringt nicht kovalente chemische Bindungen mit sich. Die Medium-Zusammensetzung und andere physikalische und chemische Faktoren beeinflussen die Rate und die Stärke der Bindung. Zum Beispiel erniedrigen geringe Stringenz und hohe Temperatur die Rate und die Stärke der Bindung zwischen zwei komplementären Strängen
bei der Nukleotidstrangerkennung. Jedoch erniedrigen sie auch die nichtspezifische Bindung zwischen den zwei Strängen (welche nicht vollständig komplementär sind) sehr stark. Wenn mehrere Sequenzen ähnlich sind, kann die Spezifizität der Bindung durch eine Zugabe einer kleinen Menge an nicht markierten Molekülen vergrößert werden, die mit ihrer komplementären Sequenz im Wettbewerb stehen, aber bei weitem mehr mit den anderen, wodurch der Grad der Kreuzreaktionen erniedrigt wird.
[0022] Die Optimierung der Bedingungen der Bindung ist auch notwendig für die Antigen/Antikörper- oder Ligand/Rezeptor-Erkennung, aber diese sind gewöhnlich eher spezifisch.
[0023] Eine bevorzugte Ausführung dieser Erfindung liegt darin, die Verstärkung auszunutzen, die durch die katalytische Reduktion von Ag+ im Kontakt mit anderen Metallen wie Gold entsteht. Gold-Nanopartikel sind gegenwärtig verfügbar und sie können leicht an Moleküle wie Protein gebunden werden. Zum Beispiel sind mit Streptavidin beschichtete Goldpartikel auf dem Markt erhältlich.
[0024] Gemäß einer bevorzugten Ausführung dieser Erfindung verwendet man ein markiertes Zielmolekül, welches dann von einem Konjugat erkannt wird. Dieses markierte Molekül (Biotin, Haptene, ...) kann als ein erstes Glied des Bindungspaares betrachtet werden. Für DNA kann die Markierung leicht während der Amplifikation durch eine Einbindung von biotinylierten Nukleotiden bewerkstelligt werden. Für RNA werden biotinylierte Nukleotide bei ihrer Kopie in cDNA oder danach bei dem Amplifikationsschritt verwendet. Die Amplifikation der Nukleotidsequenzen ist eine gängige Praxis, da die Zielmoleküle oft in sehr geringen Konzentrationen vorliegen. Proteine werden leicht markiert, indem man NHS-Biotin oder andere Reaktionen verwendet. Wenn die biotinylierten Moleküle erst einmal eingefangen sind, wird ein Streptavidingoldkomplex hinzugefügt, der das
zweite Glied des Bindungspaares darstellt; und das Streptavidin erkennt spezifisch das Biotin, so dass der Komplex an der Position (engl. location) gebunden wird, wo das Zielmolekül gebunden ist. Wenn Haptene als Marker verwendet werden, setzt man einen Antikörper-Goldkomplex ein. Dann wird eine reaktive Mischung, die Ag+ und ein Reduktionsmittel enthält, auf die Oberfläche gegeben und Schichten von Ag werden auf den Goldpartikeln niederschlagen, was zu der Bildung von Kristallpartikeln führt.
[0025] Eine direkte Markierung von Zielmolekülen mit Gold ist durch den Einsatz von goldmarkierten Antigenen, Antikörpern oder Nukleotiden möglich.
[0026] Eine Alternative besteht darin, jede Markierung des Zielmoleküls zu vermeiden, und dann wird eine zweite Nukleotidsequenz verwendet, die markiert ist. Sie gehen dann eine Sandwich-Hybridisierung oder eine Sandwich-Reaktion mit dem Einfangmolekül ein, welches das Zielmolekül und die markierte Nukleotidsequenz bindet, was es erlaubt, den Nachweis fortzusetzen. Wie oben ist die markierte Nukleotidsequenz fähig, von selbst den Niederschlag des Metalls zu katalysieren oder sie tut es mit Hilfe eines zweiten Komplexes.
[0027] Der Ag-Niederschlag entspricht der Position (engl. location) der Bindung der biotinylierten Nukleotidsequenz. Weil diese Position gut definiert ist, ist es möglich das Vorhandensein des besagten Niederschlages (spezifischer Punkt auf dem Array) zu identifizieren.
[0028] Der Niederschlag hat die Form von kleinen Kristallen, die im Laufe der Zeit einen Durchmesser von etwa 1 &mgr;&pgr;&agr; erreichen. Die Bildung dieser kleinen Kristalle stellt eine wirkliche Verstärkung des Signals dar, da dieselben von der Anwesenheit von Goldpartikeln mit einem Durchmesser von ein paar nm herrühren.
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[0029] Unerwarteter Weise konnte innerhalb eines gegebenen Meßbereiches von markierten Nukleotidsequenzen, die auf der Oberfläche vorliegen, zwischen der Konzentration aus goldmarkierten Nukleotidsequenzen und der Menge des Niederschlages auf der Oberfläche eine Konzentrationskurve erhalten werden. Eine Nebenbedingung (engl. constraint) des Arrays besteht darin, dass das Nachweissignal mit der Stelle von der es herstammt, in Beziehung gesetzt werden muss.
[0030] Wegen seiner granulären Form modifiziert der Niederschlag auf vorteilhafte Weise die Reflektion von Licht. Er führt auch zu einer starken Licht-Diffusion (Punktnachweis), was mit bekannten Nachweisgeräten aufgezeichnet werden kann. Solche Diffusionsassays werden in typischer Weise aufgrund der Reflektion eines Lichtstrahles mit Photodioden nachgewiesen und aufgezeichnet. Eine unerwartete Beobachtung ist, dass sich dieser Versuch auf Vorliegen von Silberkristallen als unerwartet hochempfindlich herausstellte.
[0031] Die Tatsache, dass der Silberniederschlag als eine schwarze Oberfläche erscheint, erlaubt den Einsatz eines Scanners (Absorption des Lichtes durch die transparente Oberfläche des Arrays). Das Vorhandensein eines unlöslichen Niederschlages wird das Licht absorbieren, welches dann nachgewiesen und aufgezeichnet wird. Der Vorteil des Scanners ist, dass nur ein kleiner Teil des Arrays zur gleichen Zeit abgetastet wird, so dass eine viel bessere Auflösung erzielt werden kann. Es wird entweder der Beleuchtungsstrahl oder die Nachweisoberfläche fokussiert und das Signal wird aufgezeichnet, so dass das Bild des Arrays wiederhergestellt werden kann. Das Nachweisgerät (Detektor) kann eine CCD- oder CMOS-Kamera sein, welche den gesamten Array misst. Die Auflösung der Detektion hängt dann von der Zahl der Pixel der Kamera ab. Auf der anderen Seite kann der Detektor aus Photodioden bestehen, die in einer Linie angeordnet sind, und das Bild wird durch eine Bewegung entlang der Frontseite dieser Linie gescannt. Scanner mit einer Empfindlichkeit von 11 &mgr;&pgr;&igr; für einen Pixel können kon-
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struiert werden, die ausreichen, um Punkte mit einem Durchmesser von 50 &mgr;&eegr;&igr; oder größer zu analysieren.
[0032] Eine volle Beleuchtung des Arrays kombiniert mit einer Aufzeichnung des übertragenen Lichtes ist auch möglich (schneller als der Scanner, scheint aber weniger empfindlich zu sein).
[0033] Als Metall ist Silber in der Lage, Licht selbst zu reflektieren. Selbst wenn die Wirkung dieser Reflektion gering ist, so ist sie doch vorhanden und kann verwendet werden, um den/die Silber-Niederschlag(spunkte) zu lokalisieren. Wegen seiner metallischen Natur sind auch andere Verfahren möglich, etwa eine Veränderung eines elektromagnetischen Feldes oder der elektrischen Leitfähigkeit.
[0034] Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Diagnose und/oder zur Quantifizierung von einer oder von mehreren identischen oder verschiedenen Zielverbindung(en), die aus einer Probe gewonnen worden sind, wobei die besagte Vorrichtung umfasst:
ein Gerät zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung von Niederschlagen (Punkten) auf der Oberfläche eines festen Trägers, die von der Bindung einer Zielverbindung an ihr entsprechendes Einfangmolekül herrühren, wie oben beschrieben,
möglicherweise ein Lesegerät für Informationen, die auf dem festen Träger aufgezeichnet sind (wie z.B. Barcodes), und
- einem Computer, der programmiert ist, um:
_ möglicherweise diskrete Bereiche zu erkennen, die Einfangmoleküle tragen,
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_ die Ergebnisse zu sammeln, die von dem besagten Nachweisgerät erhalten werden, möglicherweise korreliert mit den Informationen, die aus dem Lesegerät erhalten worden sind, und
_ eine Diagnostik und/oder eine Quantifizierung einer oder der mehrerer Ziel verbindungen durchzuführen.
[0035] Daher hängt die Auflösung des Nachweises und noch spezieller die Zuverlässigkeit der abschließenden Quantifizierung stark von den Eigenschaften des Nachweisgerätes ab. Insbesondere, wenn das Nachweisgerät eine CCD-Kamera enthält, hängt die Genauigkeit von der Pixelzahl ab. Die Pixelzahl begrenzt daher die erlaubte Empfindlichkeit der Quantifizierung. Typischerweise ist es möglich, mit einer CCD-Kamera eine Auflösung von 10 &mgr;&eegr;&igr; pro Pixel zu erhalten, was ausreichend ist, um Punkte von 100 &mgr;&eegr;&igr; im Durchmesser oder größer zu analysieren. Eine solche Quantifizierung ist jedoch begrenzt von der Pixelzahl, von der Auflösung pro Pixel und von der Tatsache, dass die Empfindlichkeit nur von einem Ansichtspunkt gegeben ist. Ein Ansichtspunkt hängt von den drei folgenden Schemata ab: die Position des Leseelementes, wie diejenige der CCD-Kamera, die Position des Objektes, das nachgewiesen werden soll, und die Position der Beleuchtung des Objektes.
[0036] Um die genannten Ziele zu erfüllen, betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren (vorzugsweise speziell ausgelegt für den Nachweis und/oder die Quantifizierung eines Niederschlages gemäß der Erfindung, aber nicht nur für einen solchen Niederschlag) für die Quantifizierung eines Volumens eines Niederschlages (der vorzugsweise Metallkristalle enthält) auf einer definierten Oberfläche eines festen Trägers, wobei diese definierte Oberfläche eines festen Trägers definiert ist durch einen Array von mindestens 4, von mindestens 10, von mindestens 16, von mindestens 20 oder von mehr diskreten Bereichen pro cm2, wobei jeder diskrete Bereich möglicherweise einen Niederschlag umfasst.
Gemäß der Erfindung entsprechen die Bilder der besagten definierten Oberfläche, die einen oder mehrere Niederschläge aufweist, verschiedenen Ansichten, wobei diese Bilder analoge Informationen enthalten, die von einer oder von mehreren Kameras und nach einer Beleuchtung durch eine oder durch mehrere Beleuchtungsquellen aufgenommen sind, welche räumlich gemäß einem vorherbestimmten Muster relativ zueinander angeordnet sind; die entsprechende analoge Bildinformation der definierten Oberfläche, die den besagten Niederschlag oder die besagten Niederschläge enthält, wird in eine digitale Form oder in einen Satz digitaler Formen transformiert und konvertiert und sie wird mit einem ersten und mit einem zweiten Referenzstandard verglichen, um das Volumen des besagten Niederschlages oder der besagten Niederschläge, die quantifiziert werden sollen, zu bestimmen.
[0037] Der erste Referenzstandard entspricht der digitalen Form oder einem Satz digitaler Formen, die aus analogen Informationen gewonnen worden sind, die in Bildern enthalten sind, welche von der Oberfläche ohne Niederschlag aufgenommen worden sind.
[0038] Der zweite Referenzstandard entspricht einer digitalen Form oder einem Satz digitaler Formen, die aus analogen Informationen gewonnen worden sind, die in Bildern enthalten sind, welche von der Oberfläche aufgenommen worden sind, die Niederschläge mit einem bekannten Volumen aufweist.
[0039] Der Begriff „Volumen" sollte so verstanden werden, dass dasjenige Volumen gemeint ist, wofür es erwünscht ist, eine Information vom Dimensionstyp zu erhalten. In der vorliegenden Erfindung ergibt sich das Volumen aus einer chemischen oder biochemischen Reaktion im Anschluss an eine Bindung zwischen einer Zielverbindung und ihrer entsprechenden Verbindung. Daher ist das erhaltene Volumen der Ausdruck der chemischen oder biochemischen Reaktion
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im Anschluss an eine Bindung zwischen einer Zielverbindung und ihrer entsprechenden Einfangverbindung.
[0040] Der Begriff „Bild" sollte so verstanden werden, dass eine Gruppe von Pixeln gemeint ist, die eine Darstellung eines Maßes jenes Volumens ist, und die direkt auf einen Monitor übertragen und darauf registriert werden kann, wie etwa auf einem Schirm oder einem Drucker.
[0041] Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung, die Mittel für die Durchführung des genannten Verfahrens enthält; vorzugsweise enthält diese einen oder mehrere Sensoren, die mit Kameras und mit einer oder mit mehreren Beleuchtungsquellen ausgestattet sind, welche räumlich gemäß einem vorherbestimmten Muster relativ zueinander angeordnet sind und welche mit einem System zur Erfassung einer analogen Information verbunden sind, wobei die Information gemessen wird, indem besagte Sensoren verwendet werden, und die Information mit Hilfe einer Verarbeitungseinheit in eine digitale Form umgewandelt wird.
[0042] Vorzugsweise werden die Transformation und die Umwandlung von einer Verarbeitungseinheit in der Kamera oder in einem Computer durchgeführt.
[0043] Die Kameras sind vorzugsweise einfarbige, farbige, infrarote oder spezielle CCD- oder CMOS-Nahbereich-Kameras oder ähnliche Lesetechnologien.
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[0044] Die Beleuchtungsquelle ist vorzugsweise ein infrarotes Licht mit einer Wellenlänge, die ähnlich ist wie die Dimension der Metallkristalle, die in dem einen oder in mehreren Niederschlägen enthalten sind, und die auf vorteilhafte Weise erzeugt werden, indem eine einzelne Diode oder mehrere Dioden mit derselben spektralen Verteilung verwendet werden.
[0045] Die Beleuchtungsquellen sind auf vorteilhafte Weise regelmäßig um den festen Träger herum angeordnet, wobei eine jede dieser Quellen einem Lichtpunkt entspricht, der gleichzeitig oder aufeinanderfolgend automatisch angeschaltet werden kann.
[0046] Die Bilder werden vorzugsweise entweder durch Transparenz, durch Reflektion oder durch eine Kombination derselben erhalten.
[0047] Wie in den beiliegenden Zeichnungen dargestellt, können sich die Vorrichtung und das Verfahren auf die Verwendung einer Kamera und einer Lichtquelle erstrecken, welche über dem festen Träger angeordnet sind, wobei die Kamera und die Beleuchtungsquelle in den drei Dimensionen des Raumes beweglich sind.
[0048] Die Vorrichtung und das Verfahren können auch die Verwendung von zwei oder von mehr Kameras umfassen, die einander gegenüber in einer Ebene angeordnet sind und die sich über dem festen Träger befinden, und eine oder mehrere Beleuchtungsquellen, die unter dem festen Träger angeordnet sind.
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[0049] Die Vorrichtung und das Verfahren können auch die Verwendung von drei oder von mehr Kameras umfassen, die gemäß einer dreieckigen Ebene oder einem anderen regulären oder irregulären Muster angeordnet sind und die sich über dem festen Träger befinden, und eine oder mehrere Beleuchtungsquellen, die unter dem festen Träger angeordnet sind.
[0050] Die Vorrichtung und das Verfahren können auch die Verwendung einer Kamera umfassen, die über dem festen Träger angeordnet ist, eine erste Beleuchtungsquelle, die über dem festen Träger und unter der Kamera angeordnet ist, eine zweite Beleuchtungsquelle, die unter dem festen Träger angeordnet ist, wobei die zwei Beleuchtungsquellen entsprechend der Position des festen Trägers fast symmetrisch angeordnet sind.
[0051] Alternative bevorzugte Ausführungen der vorliegenden Erfindung beruhen auf der Verwendung von einer oder von mehreren Beleuchtungsquellen und von einer oder von mehreren Kameras, welche gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, entweder in Kombination oder nacheinander, wobei eine oder mehrere besagte Beleuchtungsquellen und/oder eine oder mehrere besagte Kameras während des Ablesens festgehalten werden können, oder bewegt werden können gemäß einer bevorzugten Längs- oder Drehbewegung entlang oder um den festen Träger herum, der das spezifische Volumen eines Niederschlages aufweist.
[0052] Es ist auch möglich unter Verwendung von einer oder von mehreren Beleuchtungsquellen und/oder von einer oder von mehreren Kameras, die Bewegung des festen Trägers zu erlauben, der ein spezifisches Volumen eines Niederschlages enthält.
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[0053] Andere Ausführungen, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, sind Vorrichtungen mit (i) entweder einer Kamera und mehreren Beleuchtungsquellen, wobei diese verschiedenen Beleuchtungsquellen entsprechend verschiedenen symmetrischen oder nicht symmetrischen Mustern zueinander ange-5 ordnet sind, (ii) oder mit einer Beleuchtungsquelle und mit mehreren Kameras, wobei diese verschiedenen Kameras entsprechend verschiedenen symmetrischen oder nicht symmetrischen Mustern zueinander angeordnet sind, (iii) oder einer Kombination derselben.
Die Beleuchtung ist ein Infrarotlicht mit einer Wellenlänge ähnlich wie die Dimension der Kristalle, die in dem Niederschlag enthalten sind.
[0054] Der Fachmann ist in der Lage, Mittel für die Durchführung der verschiedenen Schritte der vorliegenden Erfindung bereitzustellen, insbesondere für die Transformation und die Konvertierung des größeren Volumens in eine digitale Form oder in einen Satz digitaler Formen unter Verwendung bekannter Mittel oder Verfahren, wie etwa derjenigen, die in den Software- und Computertechnologien vorhanden sind.
[0055] Ein solches Mittel ist auch ein Computerprogrammprodukt (Software), aufweisend ein Programmcodemittel zur Durchführung von allen oder von einem Teil der erfindungsgemäßen Verfahrensschritte, wenn das Programm auf einem Computer ausgeführt wird.
[0056] Ein solches Mittel ist auch ein Computerprogrammprodukt, aufweisend Programmcodemittel, welche auf einem computerlesbaren Medium zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens abgespeichert sind, wenn das besagte Programmprodukt auf einem Computer ausgeführt wird.
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[0057] Diese Mittel sind dazu geeignet, die Ergebnisse, die von dem besagten Gerät zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung gewonnen worden sind, und möglicherweise die Information, die von dem besagten Lesegerät gewonnen worden ist, zu sammeln und diese Mittel sind in der Lage, eine Diagnostik und/oder eine Quantifizierung einer spezifischen Zielverbindung durchzuführen, die sich aus der Analyse der Ergebnisse ergibt, möglicherweise in Beziehung mit den gelesenen Informationen.
[0058] Solche Computerprogrammprodukte sind in der Lage, eine Unterscheidung zwischen den Punkten und einem möglicherweise erfassten Hintergrundrauschen zu erzielen, zum Beispiel durch eine Identifikation von homogenen Teilen eines Bildes, nachdem sie zu zwei Klassen zusammengefasst worden sind, die als Übungsmengen verwendet werden. Diese Unterscheidung kann durch eine Nachklassifizierung kontextabhängiger Filtertechniken verbessert werden.
[0059] Besagte Mittel sind auch in der Lage, die Kontur des Punktes selbst zu identifizieren, die dem Originalbild überlagert wird und der die Messung des Intensitätsgrades der gezählten Pixel erlauben wird, die in dem Punkt identifiziert werden.
[0060] Die Mittel zur Quantifizierung erlauben eine Integration der Intensität aller Pixel, die in dem Punkt vorhanden sind, oder eine Aufzeichnung des gesamten Grades der Intensität der homogenen Teile des Punktes.
[0061] Weiterhin erlauben diese Mittel eine statistische Vergleichsanalyse zwischen den Punkten einer jeden Probe und einem Kontroll- oder einem Referenzstandard (standardisierte Zielverbindung) oder zwischen zwei oder mehr Punkten
(vorzugsweise mit einer Beziehung zur aufgezeichneten Information eines festen Trägers). Eine Bildkorrelation zwischen dem Punktbild und dem Punktbild der standardisierten Zielverbindung könnte erhalten werden, um die Punkte zu unterscheiden, die bei dem Vergleich zweier Tests statistisch unterschiedlich sind.
[0062] Die durch das Nachweisgerät und das Lesegerät aufgezeichneten Signale, eines oder mehrere an der Zahl, können mit Hilfe des genannten geeigneten Compute&phgr;rogrammproduktes (Software) wie elektronisch computerisierte Daten gelesen, verarbeitet und analysiert werden.
[0063] Gemäß einer spezifischen Ausführung der vorliegenden Erfindung trägt der Array gebundene Einfang-Oligonukleotidsequenzen, um so einen Nachweis, eine Amplifikation und möglicherweise eine Quantifizierung von Nukleinsäuresequenzen auf demselben festen Träger zu erlauben.
In einer alternativen Form der Ausführung umfasst der Array gebundene PCR-Primer, um die Produktion von Ampliconen zu ermöglichen, und die Bindung der Ampliconen auf der Oberfläche, entsprechend dem von Rasmussen et al. beschriebenen Verfahren (Anal. Bioch., 198, pp. 138-205 (1991)), was danach ihren Nachweis erlaubt.
[0064] Der erfindungsgemäße Array wird in einem diagnostischen Kit verwendet, in einer Vorrichtung zur Diagnostik und/oder zur Quantifizierung, die ein automatisches Ablesen erlaubt, möglicherweise nach einer vorhergehenden Behandlung, wie einer Reinigung, einer Spaltung, einer Kopie und/oder einer genetischen Amplifikation.
[0065] Vorzugsweise ist die Vorrichtung zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung gemäß der Erfindung ein System, das viele Schritte oder Unterschritte innerhalb eines integrierten Systems als automatisches Nukleinsäurediagnostiksystem kombiniert [die Schritte der Reinigung der Nukleinsäuresequenzen in der Probe, die der Amplifikation (durch die bekannten genetischen Amplifikationsverfahren), die Diagnostik und möglicherweise die Quantifizierung].
[0066] Bevorzugte Ausführungen der vorliegenden Erfindung werden in den folgenden keine Begrenzung darstellenden Beispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
[0067] Die Figur 1 vergleicht den Nachweis von Zielmolekülen, die auf Arrays erhalten wurden, die aus Einfang-DNA-Nukleotidsequenzen aufgebaut sind, welehe kovalent auf Glas gebunden sind und die dazu verwendet werden, um 3 Konzentrationen von biötinylierten Ziel-DNAs zu detektieren, entweder als Fluoreszenz oder als Silberkonzentration.
[0068] Die Figuren 2 bis 7 illustrieren die räumliche Anordnung einiger Elemente in verschiedenen Ausführungen der Vorrichtung für die Durchführung des Verfahrens des Nachweises und/oder der Quantifizierung gemäß der Erfindung.
Beispiel 1 Nachweis von DNA auf Biochips
[0069] In diesem Experiment wird die markierte Ziel DNA durch eine direkte Hybridisierung mit Einfangnukleotidsequenzen, die auf dem Array gebunden sind, nachgewiesen. Einfangnukleotidsequenzen wurden kovalent auf Glas gebunden und eine direkte Hybridisierung wurde mit komplementärer biotinylierter
DNA durchgeführt. Die positive Hybridisierung wurde mit einem Silberniederschlag nachgewiesen, der von Nanogoldpartikeln, die an Streptavidin gebunden waren, katalysiert wurde.
Bindung von Einfangnukleotidsequenzen auf Glas
[0070] Aktiviertes Glas, das Aldehydgruppen trägt, wurde bei CEL Associates (USA) gekauft. Aminierte Einfangsnukleotidsequenzen für CMV-DNA wurden durch PCR-Amplifizierung der DNA hergestellt, indem aminierte Primer verwendet wurden, wie von Zammatteo et al. (Anal. Biochem., 253, pp. 180-189 (1997)) beschrieben. Die Primer wurden bei Eurogentec (Lüttich, Belgien) gekauft. Die Quantifizierung der Ampliconen wurde durch ihre Absorption bei 260 nm bewerkstelligt.
[0071] Für die Transplantation auf Glas wurde zuerst eine Lösung von aminierten Ampliconen von 0,2 &mgr;&idiagr;&eegr; in MES 0,1 M pH 6,5 bei 1000C 5 Minuten erhitzt und dann von einem Roboter unter Verwendung von Pins von 250 &mgr;&idiagr;&eegr; Durchmesser (Genetix, UK) aufgetragen. Nach einer Inkubation von 1 Stunde bei 20 0C wurden sie mit einer SDS-Lösung von 0,1 % und dann zweimal mit Wasser gewaschen.
Sie wurden dann mit 2,5 mg/ml NaBH* 5 Minuten inkubiert, dann im Wasser gewaschen und bei 95 0C während 3 Minuten erhitzt, bevor sie getrocknet wurden.
Hybridisierung des Zielmoleküls
[0072] Das Zielmolekül wurde durch Amplifikation mittels PCR in der Anwesenheit von biotinyliertem dUTP von 1 mM (Alexandre et al., Biotechniques, 25, pp. 676-683 (1998)) erhalten. Plasmide, welche die Sequenz eines CMV-Virus enthielten, wurden für die PCR verwendet. Nach der Amplifikation wurden die PCR-Produkte gereinigt, und zwar unter Einsatz einer Ausrüstung einer hochreinen
PCR Produktreinigung (Boehringer Mannheim, Deutschland) und mit einer Ethidiumbromidfärbung nach einer Trennung auf einem 2 % Agarosegel quantifiziert.
[0073] Für die Hybridisierung wurden verschiedene Konzentrationen von 0,67, 6,7 und 67 fm in 5 &mgr;&idiagr; einer biotinylierten Ziel-DNA zu einer SSC 2X Denhard-Lösung hinzugefügt, die 20 &mgr;g Salm DNA enthält. Ein Tropfen dieser Lösung (5 &mgr;&idiagr;) wurde auf den Array gegeben und während 2 h bei 65 0C in einer feuchten Atmosphäre inkubiert. Der Array wurde dann 4 mal gewaschen mit einem Maleinsäurepuffer von 10 mM pH 7,5, der 15 mM NaCl und 0,1 % Tween enthielt.
Silberniederschlag auf dem Array nach der Silberfällung
[0074] Der Array wurde zuerst während 45 Minuten mit 0,8 ml Streptavidinkollodialgold (Sigma) inkubiert, welches 1.000 fach verdünnt war in einem Maleinsäurepuffer 150 mM pH 7,4, der NaCl 100 mM und 0,1 % Trockenmilchpulver enthielt. Der Array wurde dann 5 mal 2 Minuten lang in dem Maleinsäurepuffer von 10 mM pH 7,4 gewaschen, der 15 mM NaCl und 0,1 % Tween enthielt. Ein &ldquor;Silberverstärkungsreagens" (40 &mgr;&idiagr;) von Sigma wurde auf den Array gegeben und nach 10 und dann nach 5 Minuten ausgetauscht. Nach dem Waschen in dem Maleinsäurepuffer wurde der Array getrocknet.
Nachweis und Analyse des Arrays
[0075] Der Array wurde gescannt und das digitalisierte Bild mit einer Formerkennungsoftware behandelt, um die Punkte abzugrenzen und zu identifizieren. Das Niveau der Pixel eines jeden Punktes wurde integriert und jedem Punkt wurde ein Wert zugeordnet. Die Werte wurden um das Hintergrundrauschen korrigiert, das an drei Stellen erhalten wurde, wo keine Einfangnukleotidsequenzen gebunden waren.
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Beispiel 2 Nachweis von Proteinen auf Biochips Bindung von Antikörpern auf dem Array
[0076] Das Glas des Arrays wurde aktiviert, wie dies oben beschrieben worden ist, um Aldehydgruppen auf der Oberfläche zu erhalten. Die in diesem Experiment als positive Kontrolle verwendeten Antikörper wurden gegen das Rinderserumalbumin hergestellt und nicht-spezifisches IgG als negative Kontrolle.
Die Antikörper von 10 &mgr;g/ml in PBS-Lösung wurden unter Verwendung von Pins mit 250 &mgr;&eegr;&igr; Durchmesser direkt auf das Glas aufgetragen. Die Aminogruppen der Antikörper konnten mit dem Aldehyd reagieren, das auf dem Glas vorhanden ist. Die Reaktion wurde während 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Gläser wurden mit einem PBS-Puffer gewaschen.
Nachweis von Rinderserumalbumin durch ELISA auf dem Array
[0077] Eine Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) von 10 &mgr;g/ml in PBS, das 0,1 % Casein enthielt, wurde auf den Array gegeben und während 30 Minuten inkubiert. Der Array wurde dann 3 mal gewaschen mit PBS, das 0,1 % Tween 20 enthielt, und dann mit einer Lösung von biotinyliertem anti-BSA mit 20 &mgr;g/ml in PBS inkubiert, das 0,1 % Casein enthielt. Die Inkubation wurde während 30 Minuten durchgeführt. Ein Komplex aus Streptavidingold von 1 &mgr;g/ml wurde dann während 30 Minuten in einer PBS-Lösung inkubiert, die 0,1 % Casein enthielt. Das Vorhandensein von Gold diente als ein Zentrum für die Silberreduktion. Der Silberniederschlag wurde durchgeführt mit einem &ldquor;Silberverstärkungsreagens" von Sigma mit einem Austausch der Lösung nach 10 Minuten und dann wieder
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nach 5 Minuten. Die Gläser wurden dann gescannt und die Daten analysiert, wie in dem Beispiel hier oben dargestellt.
Beispiel 3
[0078] Bevorzugte Ausführungen der Vorrichtung für die Durchführung des Verfahren zur Quantifizierung gemäß der Erfindung werden in den Figuren 2 bis 7 gezeigt. Die Vorrichtung enthält einen festen Träger 1, mehrere Beleuchtungsquellen 2, welche regelmäßig voneinander beabstandet auf einem kreisförmigen Träger 4 angeordnet sind, wobei der kreisförmige Träger unter dem festen Träger 1 angeordnet ist, und zwei Kameras 3, 3', wobei die Kameras über dem festen Träger 1 angeordnet sind und einander gegenüber in einer Ebene liegen.
[0079] Die Vorrichtung kann auch einen festen Träger 1 enthalten, mehrere Beleuchtungsquellen 2, welche regelmäßig voneinander beabstandet auf einem kreisförmigen Träger 4 angeordnet sind, wobei der kreisförmige Träger unter dem festen Träger 1 angeordnet ist und eine Kamera 3 über dem festen Träger 1 angeordnet ist.
[0080] Weiterhin kann die Vorrichtung auch einen festen Träger 1 enthalten. Die Vorrichtung umfasst auch einen ersten Satz von Beleuchtungsquellen 2 und einen zweiten Satz von Beleuchtungsquellen 2', wobei die Beleuchtungsquellen eines jeden Satzes 2, 2' regelmäßig voneinander beabstandet in einer Ebene, vorzugsweise auf einem kreisförmigen Träger 4, 4', angeordnet sind. Der erste Satz der Beleuchtungsquellen 2 ist über dem festen Träger 1 angeordnet und der zweite Satz 2' ist unter dem festen Träger 1 angeordnet, wobei der erste und zweite Satz der Beleuchtungsquellen 2, 2' symmetrisch angeordnet sind im Hinblick auf (engl. according to) die Position des festen Trägers 1.
Die Vorrichtung umfasst auch eine Kamera 3, die über dem festen Träger 1 angeordnet ist und über dem ersten Satz von Beleuchtungsquellen 2.
[0081] Weiterhin kann die Vorrichtung auch einen festen Träger 1 enthalten, mit oder ohne mehrere Beleuchtungsquellen 2, die regelmäßig voneinander beabstandet in einer Ebene angeordnet sind, vorzugsweise auf einem kreisförmigen Träger 4, und die sich unter dem festen Träger 1 befinden. Die Vorrichtung umfasst auch eine darüber befindliche Kamera 3. Der kreisförmige Träger 4 und die Kamera 3 sind symmetrisch im Hinblick auf (engl. according to) die Position des festen Trägers 1 angeordnet.
[0082] Ferner kann die Vorrichtung auch einen festen Träger 1 enthalten mit mehreren Beleuchtungsquellen 2, die regelmäßig voneinander beabstandet in einer Ebene angeordnet sind, vorzugsweise auf einem kreisförmigen Träger 4, wobei sich der kreisförmige Träger unter dem festen Träger 1 befindet, und drei Kameras 3, 3', 3", wobei die Kameras sich über dem festen Träger 1 befinden und so angeordnet sind, dass sie in einer Ebene entsprechend einer dreieckigen Anordnung liegen.
[0083] In dem sich anschließenden Beschreibungsteil werden einige Verfahren beschrieben, bei deren Durchführung die erfindungsgemäßen Vorrichtungen, so wie sie durch die Schutzansprüche gekennzeichnet sind, vewendet werden können.
Ein Verfahren zur Identifizierung und / oder Quantifizierung einer Zielverbindung, die aus einer Probe erhalten wird, vorzugsweise aus einer biologischen Probe, weist die folgenden Schritte auf:
&bull; das Inkontaktbringen der Zielverbindung mit einem Einfangmolekül, um eine spezifische Bindung zwischen der besagten Zielverbindung
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mit einem Einfangmolekül zu ermöglichen, wobei das Einfangmolekül auf eine Oberfläche eines festen Trägers befestigt worden ist, entsprechend einem Array, der eine Dichte von mindestens 20 diskreten Bereichen pro cm2 aufweist, wobei jeder der besagten diskreten Bereiche mit einer Spezies eines Einfangmoleküls verbunden ist,
&bull; die Durchführung einer Reaktion, die zu einem am Ort der besagten Bindung gebildeten Niederschlag führt,
&bull; die Bestimmung des möglichen Vorliegens eines oder mehrerer Niederschläge in einem oder mehreren diskreten Bereichen, und
· das Korrelieren des Vorliegens eines oder mehrerer Niederschläge in einem oder mehreren diskreten Bereichen mit der Identifizierung und / oder der Quantifizierung der besagten Zielverbindung.
Das obige Verfahren kann dadurch modifiziert werden, dass die zur Bildung des Niederschlages führende Reaktion durch die Präzipitierung einer metallischen Verbindung auf der gebundenen Zi el verbindung bewerkstelligt wird.
Die obigen Verfahren können dadurch modifiziert werden, dass die metallische Verbindung eine magnetische metallische Verbindung ist.
Die obigen Verfahren können dadurch modifiziert werden, dass die zur Bildung eines Niederschlags führende Reaktion eine Reduktion eines Metalls in Anwesenheit eines Enzyms ist.
Die obigen Verfahren können dadurch modifiziert werden, dass die zur Bildung eines Niederschlags führende Reaktion eine chemische Reduktion von Silber in Anwesenheit von kolloidalen, an die gebundene Zielverbindung gekoppelten Goldpartikeln ist.
Die obigen Verfahren können dadurch modifiziert werden, dass die spezifische Bindung zwischen der Zielverbindung und ihrem entsprechenden Einfangmolekül eine Hybridisierung zwischen zwei Nukleotidsequenzen ist.
Die obigen Verfahren können dadurch modifiziert werden, dass die Bindung zwischen der Zielverbindung und ihrem entsprechenden Einfangmolekül eine Reaktion zwischen einer antigenen Struktur und ihrem entsprechenden Antikörper oder einem hypervariablen Teil desselben ist.
Die obigen Verfahren können dadurch modifiziert werden, dass die Bindung zwischen der Zielverbindung und ihrem entsprechenden Einfangmolekül eine Reaktion zwischen einem Rezeptor und seinem entsprechenden Liganden ist.
Die obigen Verfahren können dadurch modifiziert werden, dass das mögliche Vorliegen eines Niederschlages durch Reflektion, Absorption oder Diffusion eines Lichtstrahles, vorzugsweise eines Laserstrahles, an dem besagten Niederschlag ermittelt wird.
Die obigen Verfahren können dadurch modifiziert werden, dass das Vorliegen eines Niederschlages in einem diskreten Bereich durch Veränderung eines elektromagnetischen Feldes oder der Leitfähigkeit eines elektrischen Stromes erzielt wird.
Die obigen Verfahren können dadurch modifiziert werden, dass Bilder von der besagten definierten Oberfläche, die einen oder mehrere Niederschläge enthalten und die verschiedenen Ansichten entsprechen, wobei die besagten Bilder analoge Informationen enthalten, von einer oder von mehreren Kameras nach einer Beleuchtung durch eine oder mehrere Beleuchtungsquellen aufgenommen werden, räumlich gemäß einem vorherbestimmten Muster relativ zueinander angeordnet und dadurch gekennzeichnet, dass die entsprechende analoge Bildinformation der besagten definierten Oberfläche, die einen oder mehrere besagte Niederschläge enthält, in eine digitale Form oder in einen Satz digitaler Formen transformiert und umgewandelt werden und mit einem ersten und mit einem zweiten Referenzstandard verglichen werden, um das Volumen eines oder mehrerer zu quantifizierender Niederschläge zu bestimmen.
Die obigen Verfahren können dadurch modifiziert werden, dass der erste Referenzstandard einer digitalen Form oder einem Satz digitaler Formen
entspricht, die aus analoger Information gewonnen worden sind, die in Bildern enthalten sind, welche von der Oberfläche des besagten festen Trägers (1) ohne Niederschlag aufgenommen worden sind.
Die obigen Verfahren können dadurch modifiziert werden, dass der zweite Referenzstandard einer digitalen Form oder einem Satz digitaler Formen entspricht, die aus analoger Information gewonnen worden sind, die in Bildern enthalten sind, welche von der Oberfläche des besagten festen Trägers (1) aufgenommen worden sind, enthaltend einen oder mehrere Niederschläge mit einem bekannten Volumen.
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Claims (28)

1. Diagnostik- und/oder Quantifizierungsvorrichtung einer oder mehrerer identischer oder verschiedener Zielverbindungen, die aus einer Probe gewonnen worden sind, gekennzeichnet dadurch, dass die Vorrichtung umfaßt:
a) einen festen Träger entsprechend einem Array aufweisend mindestens 20 diskrete Bereiche pro cm2, wobei jeder der besagten diskreten Bereiche mit einer Spezies eines Einfangmoleküls verbunden ist;
einen oder mehrere Niederschläge, gebildet am Ort einer Bindung besagter Zielverbindung mit einem Einfangmolekül auf einer Oberfläche des festen Trägers durch die Präzipitierung einer metallischen Verbindung auf der gebundenen Zielverbindung;
b) ein Gerät zur Detektion und/oder Quantifizierung eines oder mehrerer besagter Niederschläge;
c) einen Computer zum
- Sammeln der vom besagtem Gerät zur Detektion erhalten Ergebnisse, und zur
- Durchführung einer Diagnostik und/oder einer Quantifizierung einer oder mehrerer Zielverbindungen.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Ergebnissen um die Bildung eines Präzipitats an einem spezifischen Ort handelt.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich ein Lesegerät für Informationen, die auf dem festen Träger aufgezeichnet sind, wie Barcodes, umfaßt.
4. Vorrichtung nach Anspruch 1, 2, oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Computer zusätzlich zur Erkennung besagter diskreter Bereiche, die Einfangmoleküle tragen, geeignet ist.
5. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Computer zusätzlich zur Sammlung der Informationen, die von dem Lesegerät erhalten worden sind, geeignet ist.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend ein oder mehrere Sensoren, ausgerüstet mit einer oder mehreren Kameras (3, 3', 3") und mit einer oder mehreren Beleuchtungsquellen (2, 2'), welche gemäß einem vorbestimmten Muster räumlich zueinander angeordnet sind und welche mit einem Erfassungssystem für analoge Informationen in Verbindung stehen, wobei die vorgenannten Informationen mit Hilfe von einem oder mehreren Sensoren gemessen werden und durch eine Verarbeitungseinheit in die digitale Form überführt werden.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere Kameras CCD- oder CMOS-Kameras (3, 3', 3") sind.
8. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsquelle (2, 2') Infrarotlicht einer Wellenlänge aussendet, die ähnlich der Dimension des Metallkristalls ist, welcher in einem oder mehreren Niederschlägen enthalten ist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsquelle (2, 2') Infrarotlicht einer Wellenlänge von etwa 1 µm aussendet.
10. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Satz von Beleuchtungsquellen (2, 2') umfaßt, welche in einer Ebene regelmäßig voneinander beabstandet sind, wobei jede der vorgenannten Quellen einem Lichtpunkt entspricht, welcher simultan oder aufeinander folgend automatisch angeschaltet werden kann.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Kamera (3) und eine Beleuchtungsquelle (2) oberhalb des festen Trägers angeordnet aufweist, wobei Kamera und Beleuchtungsquelle in drei Raumdimensionen beweglich sind.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie zwei oder mehr Kameras (3, 3') in einer Ebene gegenüber angeordnet und oberhalb des festen Trägers plaziert aufweist, wobei die Vorrichtung eine oder mehrere Beleuchtungsquellen (2, 2') unter dem festen Träger (1) plaziert aufweist.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie drei oder mehr Kameras (3, 3', 3") angeordnet entsprechend einer dreieckigen Ebene oder entsprechend einem anderen regelmäßigen oder nicht regelmäßigen Muster und oberhalb des festen Trägers (1) plaziert aufweist und ferner eine oder mehrere Beleuchtungsquellen (2, 2') unter dem festen Träger (1) plaziert aufweist.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie oberhalb des festen Trägers (1) eine Kamera (3) und eine erste Beleuchtungsquelle (2) und unter besagter Kamera (3) eine zweite Beleuchtungsquelle (2') unter dem festen Träger (1) plaziert aufweist, wobei die zwei Beleuchtungsquellen (2, 2') fast symmetrisch entsprechend der Position des festen Trägers (1) plaziert sind.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die metallische Verbindung eine magnetische metallische Verbindung ist.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Niederschlag durch eine Reduktion eines Metalls in Anwesenheit eines Enzyms erhältlich ist.
17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Niederschlag durch eine chemische Reduktion von Ag+ ist in Anwesenheit von anderen Metallen wie Gold erhältlich ist.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Niederschlag durch eine chemische Reduktion von Silber in Anwesenheit von kolloidalen Goldpartikeln erhältlich ist, die an die gebundene Zielverbindung gekoppelt sind.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung zwischen der Zielverbindung und ihrem entsprechenden Einfangmolekül eine Hybridisierung zwischen zwei Nukleotidsequenzen ist.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung zwischen der Zielverbindung und ihrem entsprechenden Einfangmolekül eine Reaktion zwischen einer antigenen Struktur und ihrem entsprechenden Antikörper oder einem hypervariablen Teil desselben ist.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung zwischen der Zielverbindung und ihrem entsprechenden Einfangmolekül eine Reaktion zwischen einem Rezeptor und seinem entsprechenden Liganden ist.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Gerät zur Detektion und/oder Quantifizierung eines oder mehrerer besagter Niederschläge auf der Reflektion, Absorption oder Diffusion eines Lichtstrahles, vorzugsweise eines Laserstrahles, durch den Niederschlag basiert.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Gerät zur Detektion und/oder Quantifizierung eines oder mehrerer besagter Niederschläge auf der Veränderung eines elektromagnetischen Feldes oder der Leitfähigkeit eines elektrischen Stromes durch den Niederschlag basiert.
24. Diagnostik- und Quantfifizierungskit einer oder mehrerer identischer oder unterschiedlicher Zielverbindungen, die von einer Probe gewonnen worden sind,
a) aufweisend einen festen Träger mit Einfangmolekülen, die auf einer Oberfläche des festen Trägers entsprechend einem Array, der eine Dichte von mindestens 20 diskreten Bereichen pro cm2 aufweist, befestigt sind, wobei jeder besagte diskrete Bereich mit einer Spezies eines Einfangmoleküls verbunden ist, und
b) ein Reagenz zur Durchführung einer Reaktion, die zur Bildung eines Niederschlages einer metallischen Verbindungsform auf diskreten Bereichen des besagten festen Trägers führt.
25. Kit nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die metallische Verbindung eine magnetische metallische Verbindung ist.
26. Kit nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion, die zu der Bildung des Niederschlages führt, eine Reduktion eines Metalls in Anwesenheit eines Enzyms ist.
27. Kit nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion, die zu der Bildung des Niederschlages führt, eine chemische Reduktion von Ag+ ist in Anwesenheit von anderen Metallen wie Gold ist.
28. Kit nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion, die zu der Bildung des Niederschlages führt, eine chemische Reduktion von Silber in Anwesenheit von kolloidalen Goldpartikeln ist, die an eine gebundene Zielverbindung gekoppelt sind.
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