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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
Erfindung nutzt die Leistungsfähigkeit von
neuronaler Netzwerk- und statistischer Software aus, um komplexe
Muster zu analysieren, die mit Hilfe von Arrays von eigenständigen Sensorelementen mit
mittleren Affinitäten
und Spezifitäten
(breite Spezifität)
gebildet worden sind, als eine Strategie zur Unterscheidung von
komplexen Proben. Eigenständige
Sensorelemente mit geeigneten Affinitäten und Spezifitäten werden
so ausgewählt,
dass jedes Element in dem Array ein akzeptables Signal-Rausch-Verhältnis aufweist.
Der von dieser Assaystrategie gewonnene Informationsgehalt wäre nichtssagend,
wenn er mit herkömmlichen
Verfahren analysiert würde,
d.h. positiver gegenüber
negativer Analyseart. Demzufolge wird ein auf Mustererkennung basierendes
Verfahren zur Datenanalyse eingesetzt, das neuronale Netzwerk- und
statistische Software verwendet (aber nicht darauf beschränkt ist),
die entwickelt und/oder angepasst werden muss, um in der Lage zu
sein, komplexe Proben zu unterscheiden. Mustererkennung bildet die
Grundlage für den
Unterscheidungsprozess, der den erhöhten Informationsgehalt dieser
diagnostischen Strategie voll ausnutzt.
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Demnach
wird das gebundene Material durch Bestimmen der Zunahme der Dicke
oder der Masse an der Oberfläche
des Sensors quantifiziert, anstatt die genaue Menge einer bekannten
Verbindung zu quantifizieren, die an ein spezifisches Sensorelement
gebunden hat (wie es bei der konventionellen Diagnostik der Fall
ist). Dies lässt
sich erreichen indem man eine Reihe von markierungsfreien Nachweisprinzipien
verwendet, einschließlich
aber nicht beschränkt
auf Quarzkristall-Mikroanalysewaagen, optische Verfahren wie z.B.
Optoakustik, Reflektometrie, Ellipsometrie und Oberflächenplasmonresonanz
(SPR). Ein entscheidender Gesichtspunkt dieser Strategie ist die
Tatsache, dass die an die Sensorelemente gebundenen Bestandteile
nicht identifiziert werden müssen,
um den Assay durchzuführen. Dies
ermöglicht
es, Erkennungselemente mit komplexen Wechselwirkungen zu benutzen,
wie jene, die in der Natur zu finden sind. Die Proben werden unterschieden
indem man die Werte von dem ganzen Array mit Hilfe von Mustererkennung
miteinander korreliert und mit einer Referenzprobe vergleicht. Dies
erhöht
die Geschwindigkeit und verringert die zur Durchführung der
Assays erforderliche Zeit, wodurch Kosten reduziert werden, was
alles Ziele dieser Erfindung sind.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung werden, wie in den Ansprüchen erläutert, Arrays von Lectinen
in Kombination mit neuronaler Netzwerk-Analyse als einem diagnostischen
Hilfsmittel verwendet, um komplexe Proben wie Serumproben zu unterscheiden.
Lectine werden auf separaten Gebieten auf einem Array auf ebenen
mit Gold beschichteten Oberflächen
immobilisiert, wobei empirisch entwickelte Hochdichte-Immobilisierungsprotokolle
verwendet werden. Diese Ausführungsform
der Erfindung macht sich die Fähigkeit
von Lectinen zunutze, Saccharide, Oligosaccharide und andere bislang
unbekannte sowohl natürliche
als auch synthetische Liganden zu erkennen, die eine Affinität für Lectine
aufweisen, frei oder an Proteine (Glycoproteine), Lipide (Glycolipide)
und andere Biomoleküle
gebunden. Die ubiquitäre
Gegenwart von Kohlenhydraten in allen lebenden Organismen stellt
ein fast universelles Mittel zur Identifizierung komplexer biologischer Proben
zur Verfügung.
Die komplexen biosynthetischen Reaktionswege, die verwendet werden,
um diese Kohlenhydrate zu synthetisieren, werden durch geringfügige Veränderungen
in deren Umgebung bewirkt. Diese Veränderungen führen zu einer Reihe von komplexen
allgemeinen Modifikationen im Aufbau und damit in der Struktur der
Kohlenhydrate.
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Diese
Erfindung mach sich diese Diversität zunutze, um die Informationsmenge,
die gewonnen werden kann, zu erhöhen,
anstatt die genaue Menge einer bestimmten Verbindung zu quantifizieren,
die an ein spezifisches Lectin gebunden hat, wie es routinemäßig bei
der herkömmlichen
Diagnostik gemacht wird. Die Verwendung von Arrays von Lectinen ermöglicht die
Identifizierung von umfassenden Veränderungen in komplexen Proben,
was eine Unterscheidung gestattet. Wir gehen davon aus, dass viele verschiedene
Stoffe mit einem weiten Bereich von Affinitäten für ein bestimmtes Sensorelement
um die Erkennungsstellen auf den Lectinen konkurrieren.
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Ein
weiteres Ziel der Erfindung ist die Fähigkeit der Assaystrategie,
die bislang noch nicht identifizierten Erkennungsfähigkeiten
auszunutzen, die auf Biomolekülen
vorhanden sind. Diese nicht identifizierten Erkennungselemente werden
Information liefern, welche die Unterscheidung von Proben mit einer
noch nicht dagewesenen und derzeit mit keiner anderen diagnostischen
Assaystrategie möglichen Genauigkeit
erlaubt. Dieses komplexe Zusammenspiel liefert eine Fülle von
Daten, die aufgrund der schnellen Entwicklung von Verfahren der
Computertechnologie und Signalverarbeitung schnell analysiert werden
können.
Darüber
hinaus wird die Leistungsfähigkeit
von Sensorelement-Arrays dramatisch zunehmen, sobald mehr Biomoleküle in dem
Assay getestet werden und deren unbekannte Erkennungsfunktionen
offenkundig werden.
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Eine
Anwendung dieser Erfindung umfasst die Verwendung von Lectin-Arrays,
um Seren von verschiedenen Tierarten zu unterscheiden. In diesen Studien
wird der Bestandteil (werden die Bestandteile), der/die an jedes
Lectin in dem Array gebunden ist/sind, unter Verwendung eines Festwinkel-Ellipsometers
quantifiziert. Die Antworten, die von diesen Experimenten erhalten
wurden, wurden dazu verwendet, das künstliche neuronale Netzwerk
zu trainieren. Bei Verwendung geeigneter Normalisierungsverfahren
war das so erhaltene trainierte Netzwerk in der Lage, alle Serumproben
zu unterscheiden. Der Assay zeigt die Anwendbarkeit der Erfindung
für die allgemeine
Identifizierung von komplexem biologischem Material. Eine andere
Anwendung des Lectin-Affinitäts-Arrays
bestand in der Unterscheidung von „gesunden" und „kranken" Individuen (Menschen). Diese Experimente
zeigen, dass sogar geringfügige
Veränderungen
in der Serum-Zusammensetzung wie z.B. jene, die mit leichten bakteriellen
Infektionen assoziiert sind, identifiziert werden können (bei
Verwendung von künstlichen
neuronalen Netzwerken mit geeigneter Normalisierung). In diesen
Experimenten wurde(n) der Stoff (die Stoffe), der (die) an die Lectine
gebunden war(en), unter Verwendung des SPR-Nachweisprinzips quantifiziert.
Dies zeigt, dass eine Probenunterscheidung nicht von einer bestimmten
markierungsfreien Methode abhängig
ist, sondern universell für
jeden Detektor anwendbar ist, der in der Lage ist, an die Sensorelemente
auf markierungsfreie Weise gebundene Stoffe loszumachen.
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Hintergrund der Erfindung
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Chemische
Sensor-Arrays können
dazu verwendet werden, um komplexe Gasgemische oder Gerüche zu identifizieren
und klassifizieren (Shurmer, HV, An electronic nose. A sensitive
and discriminating substitute for a mammalian olfactory system, IEEE
proc. G 137: 197-204 (1990); Gardner, JW und Bartlett, PN (Hrsg.)
Sensors and Sensory Systems for an Electronic Nose, Proc NATO Advances
Research Workshop, Reykjavik, 1992). Chemische Sensoren sind im
Allgemeinen unspezifisch, weisen aber unterschiedliche Selektivitätsmuster
für die
Geruchsarten auf. Genauer gesagt ist es gezeigt worden, wie große Sensoroberflächen, die
aus verschiedenen katalytischen Metallen in Metalloxid-Halbleiter-Feldeffekt-Strukturen
bestehen, zusammen mit einer optischen Messmethode dazu verwendet
werden können,
optisch identifizierbare Bilder von Gerüchen zu gewinnen (I. Lundström, R. Erlandsson,
U. Frykman, E. Hedborg, A. Spetz, H. Sundgren, S. Welin und F. Winquist,
Artificial ,olfactory' images
from a chemical sensor using a light-pulse technique, Nature 352:
47-50 (1991). Es ist wichtig anzumerken, dass dieser erhöhte Informationsgehalt
von dem sich (kontinuierlich) ändernden
Selektivitätsprofil
entlang der Sensoroberfläche
für den
Sensor-Array abgeleitet ist. Es ist nicht bekannt, dass eigenständige Erkennungselemente
existieren. Man kann unterschiedliche Mustererkennungsverfahren
verwenden, die auf statistischen Ansätzen oder künstlichen neuronalen Netzwerken
basieren, um die Signalmuster von diesen Sensoren zu beurteilen.
Diese Vorrichtungen sind verwendet worden, um eine Reihe von Lebensmitteln
zu untersuchen (Winquist, F., Hörnsten, E.G.,
Sundgren, H. und Lundström,
I., Performance of an electronic nose for quality estimation of
ground meat, Meas. Sci. Technol. 4: 1493-1500 (1993); Winquist,
F., Hörnsten,
G., Holmberg, M., Nilsson, L. und Lundström, I., Classification of Bacteria
using a simplified sensor array and neural nets, zur Veröffentlichung
eingereicht).
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Neues
Sensor-Konzept. Die Analogie zwischen diesen Sensoren und denen
von biologischen Sensor-Systemen, wie z.B. dem Geruchssystem, ist konzeptionell
wichtig gewesen, die Entwicklung dieser Technologie voranzutreiben.
Die Grundlage für den
menschlichen Geruchssinn besteht darin, dass ein Signalmuster von
den Rezeptorzellen im Riechkolben erzeugt wird. Die Rezeptorzellen
sind nicht spezifisch für
ein bestimmtes Molekül,
sondern gehören
vielmehr zu verschiedenen Selektivitätsklassen. Die Grundlage für den Geruchssinn
(Geruch) scheint die Signale zu kombinieren, die von jeder der Rezeptorklassen
mit niedriger Spezifität
erhalten werden. Der kombinatorische Effekt, der daraus resultiert, führt zu einer
Zunahme der Unterscheidungsfähigkeit des
Systems (trotz der relativ kleinen Zahl von Rezeptorklassen). Die
chemischen Sensorelemente können
Gerüche
erkennen, aber ihnen fehlen eigenständige Erkennungsfähigkeiten,
welche Biomoleküle
und synthetische biomimetische Moleküle besitzen. Wie erwähnt verwenden
chemische Sensoren kontinuierliche Gradienten und andere Ansätze als Erkennungselemente
und sind nicht eigenständig. Die
Natur verwendet eigenständige
identifizierbare Sensorelemente, die Erkennungsfähigkeiten in einem biologischen
Kontext entwickelt haben. Ein Ziel der Erfindung ist es, eigenständige Bio-Sensorelemente
auf eine Weise anzuwenden, welche den Informationsgehalt des diagnostischen
Assays erhöht. Dies
würde den
Einsatz eines Biomoleküls
mit breiten Erkennungseigenschaften notwendig machen, welches normalerweise
als zu unklar angesehen würde,
um in der herkömmlichen
Diagnostik nützlich zu
sein. Die Spezifität
muss so gewählt
werden, dass man eine ausreichend breite Bindung erhält (einen hohen
Informationsgehalt), aber nicht so sehr, um eine Unterscheidung
zwischen spezifischer und unspezifischer Bindung unmöglich zu
machen, d.h. ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis. Gleichzeitig
müssen
biologische Sensorelemente klar bestimmte Bindungseigenschaften
aufweisen, welche für
diese Assaystrategie zweckdienlich sind. Die hier beschriebene Erfindung
umfasst die Entwicklung einer neuen Assaystrategie für die Unterscheidung komplexer
Proben mit Hilfe von Arrays von Bio-Erkennungselementen, die weit
informationsreicher ist als herkömmliche
Assays. Ein anderes Ziel ist es, die Zahl der Tests zu verringern,
die durchgeführt
werden müssen,
bevor eine Diagnose erstellt werden kann, wodurch die Zeit verringert
wird, die notwendig ist, um die Behandlung zu beginnen, ebenso wie
die Kosten. Im Gegensatz zu herkömmlichen
diagnostischen Tests, die bekannte Verbindungen nachweisen, weisen
wir die Bindung unbekannter Verbindungen an die Lectine nach. Daher
erfordert die neue Assaystrategie den Einsatz von spezialisierten
markierungsfreien Nachweismethoden, einschließlich aber nicht beschränkt auf
Quarzkristall-Mikroanalysenwaagen und optische Techniken wie wie
z.B. Optoakustik, Reflektometrie, Ellipsometrie und Oberflächenplasmonresonanz
(SPR). Alle diese Methoden, die auf polarisiertem Licht basieren,
das von einer festen Oberfläche
reflektiert wird, haben sich bereits als wertvoll für die Bestimmung
der Dicke von Proteinen auf festen Ober flächen erwiesen. Die Sensitivität der Methoden
ist ungefähr
gleich und liegt in der Größenordnung
von einigen Ågström.
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Biologische
Sensorelemente. Proteine haben die Fähigkeit, spezifisch und reversibel
mit einer Reihe von Liganden zu kombinieren. Enzyme binden zum Beispiel
Substrate und Inhibitoren, während
Antikörper
hergestellt werden können,
die eine Reihe von Antigenen wie z.B. Kohlenhydrate, Proteine und kleine
Moleküle
binden. Eine andere Klasse von Proteinen, Lectine, haben die Fähigkeit,
Zucker zu binden, und haben keine enzymatische Aktivität. Rezeptoren
binden eine weite Bandbreite von Liganden mit hoher Affinität und Spezifität. Die Natur
entwickelt und erhält
Proteine für
spezifische Zwecke mit ausreichender Affinität und Spezifität für einen
bestimmten Zweck. Demnach ist der Einsatz von biologischen oder
synthetischen biomimetischen Sensorelementen der zweckdienlichste
Ansatz zur Identifizierung von Veränderungen, die biologisch von
Bedeutung sind. Wir haben uns dafür entschieden, die hier beschriebene
Erfindung der Biosensor-Affinitäts-Arrays mit
den Lectinen zu testen. Wir werden Lectine beschreiben und mehrere
Vorteile angeben, die diese Klasse von Proteinen bei der Anwendung
dieser Erfindung gegenüber
den gemeinhin verwendeten immunbasierenden Diagnostika hat.
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Lectine
als biologische Erkennungselemente. Wie zuvor erwähnt binden
Lectine an Kohlenhydrate und an Verbindungen mit ähnlicher
Struktur. (Lectins as molecules and as tools. Lis, H. und Sharon,
N., Ann. Rev. Biochem. 55: 35-67 (1986); Advances in Lectin Research,
Band 1, Franz, H. (Hrsg.), Springer Verlag, Berlin, S. 187f, 1987).
Lectine haben auch die Fähigkeit,
Zellen zu agglutinieren, Polysaccharide und Glycoproteine zu präzipitieren,
und sind von nicht-immunem Ursprung. Das ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass
sie eine oligomere Struktur aufweisen und gewöhnlich eine Zuckerbindungsstelle
pro Untereinheit enthalten. In dieser Hinsicht haben Lectine agglutinierende
Fähigkeiten,
die ähnlich denen
von Antikörpern
sind. Sie können
auch durch niedermolekulare Verbindungen inhibiert werden, welche
im Fall von Lectinen kleine Kohlenhydrate sind, wie z.B. Monosaccharid,
Oligosaccharide oder Makromoleküle,
welche diese enthalten. Erstens stellen Lectine, verglichen zum
Beispiel mit Antikörpern
oder Enzymen, ein breites Spektrum wohldefinierter Bindungsspezifitäten mit
einem hohen Maß an
Kreuzreaktivitäten
bereit. Des Weiteren sind sie stabil und haben eine weite Bandbreite
von Affinitäten
und Spezifitäten.
Außerdem
sind mehr als hundert Lectine charakterisiert worden. Es scheint
nun, dass Lectine eine Reihe von zellulären Interaktionen während der
Entwicklung und im erwachsenen Tier vermitteln (Drickamer, K. und
Taylor, M.E., Biology of Animal Lectins, Ann. Rev. Cell Biol. 9:
237-64 (1993)). Dies wird durch Daten unterstützt, die zeigen, dass sich
Lectin-Expressionsmuster
während der
ganzen Entwicklung und in Reaktion auf eine weite Bandbreite von
Umweltänderungen
verändern [Varki,
A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are
correct, Glycobiology 3: 97-130 (1993)]. Die Beteiligung von Oligosacchariden
an der Selectin-vermittelten Zell-Zell-Erkennung durch das Immunsystem
in Reaktion auf Entzündung
[Lasky, L.A. Selectins interpreters of cell-specific carbohydrate
information during inflammation. Science 258: 964-969 (1992)] und
die Erkennung von Samenzellen während
der Befruchtung [Miller, D.J., Macek, M.B., Shur, B.D. Complementarity
between sperm surface β1,4-galactosyltransferase
and egg coat ZP3 mediates sperm-egg binding. Nature 357: 589-593 (1992)]
sind nur einige Beispiele. Es ist auch bekannt, dass Modifizieren
der Expression von Glycosiden und Glycosyltransferasen die normale
Entwicklung stört.
Es ist jedoch nicht möglich
gewesen, die jeweiligen Beiträge
einzelner Monosaccharidreste und Oligosaccharidketten zu Stadien-spezifischen und
Gewebespezifischen Entwicklungsprozessen zu definieren.
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Ein
Ziel dieser Erfindung ist die Fähigkeit
der Assaystrategie, komplexe Proben zu unterscheiden, welche dazu
eingesetzt werden könnten,
die komplexen grundlegenden Entwicklungsprozesse zu beschreiben.
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Zweitens
ist das Studium von Lectinen eng mit dem der Kohlenhydrate verbunden
und wird als Glycobiologie bezeichnet (Glycoproteins, Hughes, R.C.
Outline Studies in Biology. Chapman and Hall, London und New York,
S. 95f, 1983). Glycosylierung wird in der Natur in erheblichem Maß zu vielen
verschiedenen Zwecken eingesetzt, einigen allgemeinen wie z.B. Schutz
vor Protease, einigen, die auf bestimmte Proteinklassen gerichtet
sind, wie z.B. Signalmechanismen zur Clearance von Proteinen aus Serum,
sowie einigen hoch spezifischen, wie z.B. Zelladhäsion. Kohlenhydrate
fungieren auch als Kontrollmechanismen, als Signale für die zelluläre Lokalisierung,
zur spezifischen Zelloberflächenerkennung eines
Zelltyps durch einen anderen, für
die Clearance einer bestimmten Glycoform aus Serum, zur Unterstützung bei
der Proteinfaltung etwa durch Bereitstellen von Schutz gegen Proteolyse
(Pareth, R.B. Effects of glycosylation an Protein function. Curr.
Opin. Struct. Biol. 1: 750-54 (1991)).
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Kohlenhydrate
enthalten einen potenziellen Informationsgehalt, der mehrere Größenordnungen größer ist
als jedes andere biologische Oligomer. Wenn man zum Beispiel die
Anzahl der möglichen Strukturen
für ein
Hexamer von Zuckern und die eines Hexamers von Aminosäuren berechnet,
ist die Zahl > 1,05 × 1012 und 4,6 × 104.
Der Unterschied ist mehr als sieben Größenordnungen. Demzufolge stellen
Zucker klar die größte Einzelquelle
von Diversität in
der biologischen Welt bereit (Laie, R.A., eingeladener Kommentar
im Glyco-Forum, Sektion Glycobiologie. 1994, 8: 759-767).
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Es
ist auch gezeigt worden, dass Lectine wichtig bei der Abwehr gegen
eine Vielzahl von Pathogenen sind. Die Mannose bindenden Lectine
bei Tieren vermitteln Antikörper-unabhängige Bindung von
Pathogenen, die eine hohe Konzentration von Mannose auf ihrer Oberfläche enthalten.
Diese Monosaccharide findet man im Allgemeinen nicht an endständigen Positionen
in Serum- oder Zelloberflächen-Glycoproteinen in
Säugersystemen.
Das Erkennungsereignis kann die Komplement-Kaskade in Gang setzen [Ikeda, K., Sannoh,
T., Kawasaki, T. und Yamashima, I. J. Biol. Chem 262: 7451-7454].
Pflanzenlectine sind auch mit der Anlagerung symbiotischer Stickstoff-fixierender
Bakterien an die Wurzeln von Leguminosen und mit dem Schutz von
Pflanzen gegen Pilzpathogene in Verbindung gebracht worden (Bohlool,
B.B. und Schmidt, E.L. Science 185: 269-71 (1974)).
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Drittens
verwenden zahlreiche Pathogene Kohlenhydrat-Lectin-Interaktionen,
um Zutritt in ihre Wirte zu erlangen. Zum Beispiel vermitteln Bakterien und
Darmparasiten wie z.B. Amöben
die Zucker-spezifische Adhärenz
der Organismen an Epithelzellen und ermöglichen so eine Infektion.
(Liener, I.E., Sharon, N., Goldstein, I.J., Hrsg. (1986) The Lectins:
Properties, functions and applications in biology and medicine.
New York, Academic Press). Viren wie z.B. Influenzavirus (Myxovirus)
und Sendaivirus (Paramyxovirus) verwenden ein Hämagglutinin-Protein, das Sialinsäure enthaltende
Rezeptoren auf der Oberfläche
von Zielzellen bindet, um die Virus-Zell-Interaktion zu initiieren (Paulsson,
J.C. Interaction of animal viruses with cell surface receptors in:
The Receptors (Band 2) (Hrsg. P.M. Conn). Academic Press, New York,
S. 131-219 (1985)).
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Ein
anderes Ziel der Erfindung ist es, die Pathogenese von Krankheiten
zu studieren, welche Kohlenhydrate oder Lectine verwenden, um Zutritt
zu Zellen zu erlangen.
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Man
nimmt an, dass Kohlenhydrat bindende Proteine wie z.B. Selectine
eine entscheidende Rolle bei Immunantworten spielen, wozu Entzündung gehört (Springer
et al., Nature 349: 196-197 (1991); Philips et al., Science 250:
1130-32 (1990)). Man hat spezifische Kohlenhydrat-Liganden identifiziert
und diese dazu eingesetzt, Entzündung,
Immunsuppression etc. durch ihre Interaktion mit Selectinproteinen und/oder
anderen Lectinenzu kontrollieren (Gaeta et al.,
US-A- 5,576,305 , entspricht
der
U.S. Patentanmeldung Nr.
07/538,853 , eingereicht am 15. Juni 1990; Ippolito et al.,
US-A- 5,374,655 ,
entspricht
U.S. Patentanmeldung
Nr. 07/889,017 , eingereicht am 26. Mai 1992). Es ist auch
gezeigt worden, dass andere Glycoproteine nützlich sind, Immunreaktionen
von Säugern
zu unterdrücken
(Smith et al.,
US-A- 5,453,272 ,
entspricht der
U.S. Patentanmeldung
Nr. 07/956,043 , eingereicht am 2. Oktober 1992).
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Ein
anderes Ziel der Erfindung ist es, die Assaystrategie zu verwenden,
um die feineren Erkennungsfunktionen von Lectinen, einschließlich aber nicht
beschränkt
auf Selectin und andere Lectine, bei Immun- und Entzündungsreaktionen
zu umreißen. Viertens
hat die weite Verbreitung und die einfache Verfügbarkeit einer großen Zahl
von Zuckern und Zucker bindenden Proteinen, kombiniert mit deren
Allgegenwärtigkeit
in der ganzen Natur zu derem großflächigen Einsatz als Reagenzien
zum Studium von Kohlenhydraten in Lösung und auf Zelloberflächen geführt. Sie
wurden ursprünglich
für die
Blutgruppenbestimmung (Lis und Sharon), für die Identifizierung und Trennung
von Zellen (Sharon, N. Adv. Immunol. 34: 213-98 (1983)) eingesetzt.
Markierte Lectine dienen als spezifische Reagenzien zum Nachweis
von Glycoproteinen, die auf Gelen aufgetrennt wurden, entweder direkt
oder nach dem Blotten (Rohringer, R., Holden, D.W. Anal. Biochem.
144: 118-27 (1985). Immobiliserte Lectine werden routinemäßig zum
Isolieren von Glycoproteinen wie z.B. dem Insulinrezeptor (Hedo,
J.A., Harrison, L.C., Roth, J. Biochemistry 20: 3385-93 (1981))
und vielen anderen Proteinen eingesetzt. Lectine sind weitverbreitet
dazu verwendet worden, Zellen wie z.B. Thymocyten und Splenocyten
zu trennen (Reisner, Y., Sharon, N. Methods in Enzymol. 108: 168-79
(1984); Maekawa, N., Nishimune, Y. Biol. Reprod. 32: 419-25 (1985)).
Zahlreiche Bakterien sind mit Lectinen typisiert worden (Doyle,
R.J., Keller, K.F. Can. J. Microbiol. 3: 4-9 (1984); DeLucca, A.J.
II Can. J. Microbiol. 3: 1100-4 (1984)). Man kann Primaten anhand
der Gegenwart von spezifischen Zuckerresten von Nicht-Primaten unterscheiden
[Spiro, R.G. und Bhoyroo, V.D. J. Biol. Chem 259: 9858-9866 (1984);
Galili, U., Shohet, S.B., Kobrin, E., Kobrin, E., Stults, C.L.M.
und Macher, B.A. J. Biol. Chem 263: 17755-17762 (1988)]. Diese Anwendungen
sind grundsätzlich
abhängig von
der Fähigkeit
eines bestimmten Lectins, ein Kohlenhydrat, das entweder an ein
lösliches
Biomolekül oder
an eine Zelle oder Organelle gebunden ist, spezifisch zu identifizieren.
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Fünftens verfügen die
meisten Zellen über eine
Beschichtung von Kohlenhydrat-Ketten
in Form von Membran-Glycoproteinen und -Glycolipiden (in Eukaryonten)
oder von Polysacchariden (in Prokaryonten). in Eukaryonten spielen
der Zelltyp und Umweltfaktoren wie z.B. die Konzentration von Glucose eine
Hauptrolle bei der Bestimmung des Ausmaßes und des Typs von Glycosylierung,
welche sowohl Spezies- als auch Gewebe-spezifisch ist (Parekh, R.B.,
Dwek, R.A., Thomas, J.R., Opdenakker, G., Rademacher, T.W. Biochemistry
28: 7644-7662 (1989); Goochee, C.F. und Monica, T. Bio/Technology
8: 421-27 (1990)). Darüber
hinaus kann jede enzymatische Reaktion vollständig oder unvollständig ablaufen,
was zur Entstehunug von Glycoformen oder Glycosylierungsvarianten
des Proteins führt
(Rademacher et al., Ann. Rev. Biochem. 57: 789-838 (1988)). Diese
Faktoren führen
zur Entstehung einer enormen Heterogenität von in vivo gefundenen Kohlenhydrat-Strukturen,
was deren Analyse erschwert hat. in manchen Fällen ist es jedoch gezeigt
worden, dass die relative Konzentration der verschiedenen Formen bei
bestimmten Gesundheits- und
Krankheitszuständen
auf spezifische Art und Weise schwankt. Das erklärt zum Beispiel auch, warum
Glycosylierungsmuster von natürlichen
Glycoproteinen durch physiologische Veränderungen wie z.B. Schwangerschaft
und auch Krankheiten wie z.B. rheumatoide Arthritis beeinflusst
werden können.
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Außerdem ist
es bekannt, dass die Interaktion zwischen einzelnen Monosacchariden
und CRDs zu schwach ist, um für
die Affinitäten
verantwortlich zu sein, die Lectine für Glycoproteine haben. Die
oligomeren Lectine (multivalent) führen zu einer Anhäufung von
Kohlenhydrat-Erkennungsdomänen (CRDs),
was sowohl die Spezifität
als auch die Affinität
für mehrfach
verzweigte Oligosaccharide erhöht. Während man
diese Effekte nicht gut versteht, ist es klar, dass die Dichte von
CRD eine biologische Bedeutung hat. Somit ist diese ein weiterer
Parameter, der in der Erfindung verwendet werden kann, um den Informationsgehalt
des Assays weiter zu erhöhen. Dies
würde darauf
hindeuten, dass Lectine nützlich sein
könnten,
um Veränderungen
im Gesamtzustand von komplexen biologischen Proben zu verfolgen. Diese
Fülle an Diversität stellt
eine fast unbegrenzte Bandbreite von Sensorelementen bereit, aus
denen man auswählen
kann.
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Man
nimmt an, dass die Multivalenz von Lectinen für Kohlenhydrate wichtig für deren
biologische Aktivität
ist. Demnach würde
ein Ziel der Erfindung in der Anwendung von Dichtegradienten von
Lectinen auf Oberflächen
in kontinuierlichen und diskontinuierlichen ebenso wie in homogenen
und heterogenen Formaten zur Unterscheidung von Proben bestehen. Dies
würde ein
einzigartiges Werkzeug zum Erlangen eines grundlegenden Verständnisses
des Effekts der Dichte der Bindungsstellen auf den Erkennungsprozess
zur Verfügung
stellen.
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Fachleuten
stehen Methoden zur Verfügung, Reflektometrie,
Ellipsometrie oder SPR für
Scanning- und Bildgebungsverfahren anzupassen. Diese würde auch
einen zusätzlichen
Assayparameter zur Verfügung
stellen und so den Informationsgehalt der Lectin-Affinitäts-Arrays
steigern und dadurch deren Fähigkeit
zur Unterscheidung von komplexen Proben verbessern.
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Diagnostische
Assaystrategien. Auf Immunassays basierende Diagnostika beherrschen
derzeit den Markt, nichtsdestotrotz bieten Lectine einige Vorteile
gegenüber
herkömmlichen
Immunoassays. Lectine sind auf den meisten Lebensformen vorhanden und,
noch wichtiger, sind in Lebensformen wie z.B. Pflanzen, Mikroorganismen
und Viren zu finden, die keine Immunglobuline synthetisieren. Die
biologische(n) Funktion(en) von Lectinen gehen denen des Immunsystems
klar voran, von denen viele derzeit unbekannt sind. Demnach werden
diese Sensorelemente für
Identifizierungs- und Klassifizierungszwecke nützlicher sein. Die umfangreichen
Homologien, die man zwischen verschiedenen Klassen von Lectinen
beobachtet, zeigen, dass diese Proteine durch die ganze Evolution
hindurch konserviert worden sind und liefern einen starken Hinweis
darauf, dass sie (eine) wichtige Funktion(en) in der Biologie haben.
Ein anderer Unterschied besteht darin, dass Lectine strukturell
unterschiedlich sind, wohingegen Antikörper strukturell ähnlich sind.
Diese strukturelle Diversität
würde eine
entsprechende Diversität
von Stabilitäten
zur Folge haben, welche die Flexibilität des Assayformats erhöhen würde (Antikörper neigen aufgrund
ihrer strukturellen Ähnlichkeit
dazu, unter ähnlichen
Bedingungen zu denaturieren). Somit kombinieren Lectine die Multivalenz
von Antikörpern mit
der strukturellen Diversität
von Enzymen. Es gibt auch andere Proteine, die Kohlenhydrate binden,
wie z.B. diejenigen, die am Kohlenhydrat-Metabolismus und am Zuckertransport beteiligt
sind. Im Allgemeinen binden diese Proteine nur ein Kohlenhydrat
und dienen recht unterschiedlichen Zwecken als Lectine.
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Der
Nachweis von bestimmten Antigenen, Haptenen und ähnlichen Stoffen in Körperflüssigkeiten
wie z.B. Blut, Serum, Sputum, Urin und dergleichen ist von zentraler
Bedeutung sowohl in der Forschung als auch in klinischen Umgebungen.
Der Nachweis solcher Liganden kann häufig mit verschiedenen Krankheitszuständen in
Korrelation gebracht werden und ist demzufolge von großer Bedeutung bei
der Diagnose und um ein grundlegendes Verständnis in Bezug auf die Krankheitsgenese
zu erlangen, ebenso wie die Wirksamkeit von therapeutischen Behandlungen
zu verfolgen. Die beträchtliche und
weiter zunehmende Fähigkeit,
Krankheiten zu diagnostizieren und zu behandeln hat zu einer explosionsartigen
Zunahme der Nachfrage nach diagnostischen Tests geführt. Und
während
die Kosten pro Assay verringert worden sind, ist die Zahl der Tests
dramatisch gestiegen. Dies ist zum Teil auf die steigende Zahl von
Tests zurückzuführen, die
verfügbar
sind, und zum Teil auf das Bedürfnis
von Medizinern, in der Lage zu sein, ihre Handlungen für den Fall
zu rechtfertigen, dass rechtliche Schritte (Klagen wegen Kunstfehlern)
gegen sie eingeleitet werden.
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Demzufolge
werden andauernd verbesserte Methoden zum Nachweis von Liganden
in wässrigen Lösungen gesucht.
Speziell handelt es sich bei solchen bevorzugten Methoden oder Assays
um solche, die schneller sind, eine größere Flexibilität aufweisen,
einfacher durchzuführen
und herzustellen sind, sowie niedrige Herstellungskosten aufweisen.
Darüber
hinaus gibt es einen zunehmenden Bedarf an Strategien, welche die
Zeit verringern, die notwendig ist, um diagnostische Assays für solche
Agenzien wie HIV und Rinderwahnsinn (BSE) zu entwickeln. Steigende
Gesundheitskosten machen die Entwicklung von neuen, schnellen und
wirksameren diagnostischen Strategien notwendig.
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Im
Allgemeinen basieren Immunoassays auf der immunologischen Reaktion
zwischen Proteinen wie z.B. Antikörpern, Antikörperfragmenten
oder sogar künstlich
hergestellten Elementen, die Antikörper-Bindungsstellen simulieren,
wie z.B. Peptide, Matrizenpolymere und dergleichen (hier nachfolgend als
Antikörpererkennung
bezeichnet) und dem Stoff, für
den sie spezifisch sind, dem Liganden. Immunologische Reaktionen
sind durch ihre hohe Spezifität
gekennzeichnet, und dementsprechend sind zahlreiche Systeme entwickelt
worden, um sich diese Eigenschaft zunutze zu machen. Das Ziel ist,
einen bestimmten Zustand mit absoluter Spezifität zu diagnostizieren, wobei
so wenige Assays wie möglich
eingesetzt werden.
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In
dem herkömmlichen
heterogenen Vorwärts-Assay
wird ein Antikörper
auf einer Festphase wie z.B. Mikropartikeln, Vertiefungen von Mikrotiterplatten,
Stäbchen
und dergleichen immobilisiert. Die Probe wird dann mit dem immobilisierten
Antikörper in
Kontakt gebracht und der Ligand bindet, sofern er in der Probe vorliegt.
Der gebundene Stoff wird mit Hilfe einer direkt oder indirekt damit
assoziierten Funktionseinheit nachgewiesen und quantifiziert. Zu solchen
nachweisbaren Funktionseinheiten gehören fluoreszente Moleküle, chemilumineszente
Moleküle, Enzyme,
Isotope, Mikropartikel und dergleichen. Es sind viele Varianten
entwickelt worden, wie z.B. Kompetition, indirekte Kompetition und
dergleichen. Fachleuten stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, um
die Menge eines gebundenen Stoffes mit Hilfe dieser Assays zu quantifizieren.
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Zusätzlich zu
Immunoassays stehen andere diagnostische Assays zur Verfügung, die
auf derselben Nachfrage nach absoluter Spezifität basieren, die eine weite
Bandbreite von Erkennungselementen wie z.B. Proteine (Lectine, Rezeptoren
und dergleichen), Nucleinsäuren,
Kohlenhydrate, Lipide und/oder synthetische/konstruierte biomimetische Verbindungen
und dergleichen einsetzen. Es ist auch eine weite Bandbreite von
Basistechniken entwickelt worden, einschließlich (aber nicht beschränkt auf) Mikroskopie,
Chromatographie und Elektrophorese, um Krankheiten spezifisch zu
identifizieren.
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Es
ist ein Ziel dieser Erfindung, eine Assaystrategie zur Unterscheidung
von Proben bereitzustellen, die auf einem Array von Sensorelementen
mit niedriger Spezifität
beruht, um den Informationsgehalt des diagnostischen Assays zu erhöhen. Diese Assaystrategie
ist in der Lage, geringfügige
Veränderungen
zu unterscheiden und ermöglicht
somit eine frühe
Identifizierung von Veränderungen
im Gesundheitszustand, die von entscheidender Bedeutung sein können. In
manchen Fällen
werden die Sensorelemente anwendbar sein, die in herkömmlichen
Assays verwendet werden. In den meisten Fällen wird jedoch die Spezifität dieser
Reagenzien zu hoch sein um deren Verwendung zu gestatten. Demzufolge werden
neue Screening-Prozeduren
entwickelt, um Reagenzien mit einer geeigneten Kombination von Affinität und Spezifität zu isolieren.
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Die
Assaystrategie kann auf eine weite Bandbreite von Anwendungen ausgedehnt
werden, bei denen eine Unterscheidung von komplexen Proben erforderlich
ist, einschließlich
aber nicht beschränkt
auf die Identifizierung von Krankheiten, die Identifizierung von
Veränderungen,
die in dem Wirt (einschließlich
aber nicht beschränkt
auf Menschen, Tiere, Pflanzen und Mikroorganismen) von der Krankheit
selbst verursacht werden. Komplexe Proben, die biologisches Material
und/oder Abbauprodukte enthalten, einschließlich aber nicht beschränkt auf
Lebensmittel wie Getränke,
Trockenfutter und dergleichen (einschließlich aber nicht beschränkt auf Qualitätskontrolle,
für den
Nachweis von unerwünschtem
mikrobiellem Wachstum, Frische, physischen Schäden), ebenso wie die Kontrolle
von Umweltproben auf mikrobielle Flora (einschließlich aber nicht
beschränkt
auf den Gehalt an und die Zusammensetzung von Mikroben), Schadstoffe
und deren Abbauprodukte in Luft-, Boden- und Wasserproben. Diese
Strategie und darauf basierende Assays könnten auch dazu verwendet werden,
Fermentationsprozesse zu überwachen,
einschließlich
aber nicht beschränkt
auf Joghurt, Bier, Wein und dergleichen, Nährlösungen, ebenso wie bei Fermentationsprozessen,
in denen Produkte wie z.B. biologische Verbindungen erzeugt werden,
die durch mikrobielle Prozesse hergestellt werden, wie z.B. Insulin
aus genetisch veränderten
Bakterien und dergleichen, ebenso wie Gewürze, die zum Würzen und
dergleichen hergestellt werden, ebenso wie Fermentationsprozesse, die
bei der Herstellung von Tierfutter eingesetzt werden.
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Heutige
diagnostische Testansätze,
die dazu verwendet werden, den allgemeinen Gesundheitszustand zu
bestimmen, wie z.B. Hämoglobin,
Blutdruck und dergleichen, liefern nur beschränkte Information. Und obwohl
diese Tests nützliche
Information in Bezug auf den allgemeinen Gesundheitszustand liefern, liefern
sie weder ausreichende Information, um Krankheiten zu identifizieren
noch sind sie sensitiv genug, um geringfügige Veränderungen nachzuweisen, die
für einen
frühen
Krankheitsnachweis erforderlich sind. Es gibt daher einen Bedarf,
neue Strategien zur Identifizierung von Krankheitszuständen zu entwickeln,
die Informationen darüber
liefern, an welcher Klasse von Erkrankungen der Patient leidet,
um die Zahl von spezifischen Tests zu verringern, die durchgeführt werden
müssen:
Ein
anderes Ziel der Erfindung ist es, eine Strategie und Assays für verbesserte
Methoden bereitzustellen, um den allgemeinen Gesundheitszustand
zu überwachen,
um Bemühungen
zu unterstützen,
Erkrankungen frühzeitig
zu identifizieren und es dadurch zu ermöglichen, dass die Behandlung
zu einem früheren
Stadium beginnt als es sonst möglich gewesen
wäre. Es
ist gezeigt worden, dass eine frühe
Behandlung von Krankheiten die Kosten für die Gesundheitsversorgung
verringert. Diese Strategie würde
auch in Modellen zur vorbeugenden Gesundheitsversorgung nützlich sein.
Eine ähnliche
Situation liegt beim Testen von Lebensmitteln und von Umweltfaktoren
vor.
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Diese
diagnostische Strategie, die auf der Verwendung von eigenständigen Erkennungselementen
mit breiter Erkennungsspezifität
in Kombination mit einer Computer-basierten künstlichen neuronalen Netzwerk-Datenanalyse
beruht, kann auch mit eigenständigen
biomimetischen Erkennungselementen mit geeigneter Spezifität (Signal-Rausch-Verhältnis) verwendet
werden. Diese könnten
mit Hilfe von herkömmlichen
Matrizenverfahren und dergleichen aus modifiziertem biologischem
Material oder aus polymeren Materialien hergestellt werden. Diese Ausführungsform
der Erfindung wäre
besonders nützlich
bei Anwendungen, die Assaybedingungen erfordern, die die Bindungsaffinität und/oder
-spezifität
herkömmlicher
biologischer Sensorelemente zerstören oder drastisch verringern
würden,
einschließlich
aber nicht beschränkt
auf organische Lösungsmittel,
hohe oder niedrige Temperatur, saure oder basische Lösungen und
Salze.
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Diese
Nachweismethoden erfordern gut reproduzierbare Hochdichteimmobilisierungsverfahren
für ebene
Oberflächen
wie z.B. Silconwafer oder Flachglas. Andere mit diesen Nachweismethoden verträgliche Oberflächen umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf, Plastik-, Silikon-, Mika- und Glasoberflächen, sowohl metallbeschichtet
als auch unbeschichtet. Standardimmobolisierungsprotokolle ergaben
auf Grund von nicht ausreichenden Signal-Rausch-Verhältnissen
eine schlechte Gesamtreproduzierbarkeit. Es wurde eine Methode entwickelt, die
eine Hochdichteimmobilisierung von Biomolekülen mit einer hohen Beibehaltung
der biologischen Aktivität
erlaubte, während
die unspezifische Bindung minimiert wurde. Die erhöhte Sensitivität und die
verminderte unspezifische Bindung, die erreicht wurden, steigerten
das Signal-Rausch-Verhältnis, was
für diese
Assaystrategie entscheidend war. Wir glauben nun, dass die fast
100%-ige Oberflächenbedeckung
eine direkte Interaktion mit der Metalloberfläche verhindert und eine im
Wesentlichen homogene Interaktionsmatrix zur Verfügung stellt
und die Oberflächendichten
maximiert.
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Die
Strategie könnte
dazu eingesetzt werden, komplexe Proben von anderen Quellen zu unterscheiden,
einschließlich
aber nicht beschränkt
auf Blut, Serum, Speichel, Sputum, Urin und dergleichen, und somit
komplexe Korrelationen mit bekannten Referenzstandards ermöglichen
(mit Hilfe von Mustererkennungsprogrammen). Umweltproben wie z.B.
Luft, Boden, Wasser und dergleichen, Lebensmittel und dergleichen
ebenso wie künstliche
Stoffe, für
die sich geeignete Sensorelemente finden lassen, könnten mit
dieser Strategie analysiert werden, d.h. es lassen sich für die zur
Debatte stehenden Proben ausreichende Signal-Rausch-Verhältnisse
erhalten. Derzeit gibt es keinen analytischen Ansatz, der Proben
so schnell oder so kostengünstig
unterscheiden kann. Ein wichtiges Ziel der Erfindung besteht in
der Fähigkeit
der Strategie, derzeit unbekannte Erkennungsfunktionen auszunutzen,
die in den Erkennungselementen vorliegen.
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Wir
haben keinen Versuch unternommen, die an die Lectin-Arrays gebundenen
Stoffe zu identifizieren, aber es stehen Fachleuten verschiedene Methoden
zur Identifizierung von Biomolekülen
zur Verfügung,
um diese Art von Untersuchung durchzuführen. Obwohl es nicht das hauptsächliche
Ziel der Erfindung ist, kann es sich als nützlich erweisen, um das Wesen
der Veränderungen
zu verstehen, die aufgetreten sind, die bei der Entwicklung von
Therapien und/oder der Entwicklung von Arzneimitteln helfen können. Darüber hinaus
kann auch jedes Erkennungselement in diesem System eingesetzt werden, das
die von dieser Assaystrategie benötigten Eigenschaften zeigt,
einschließlich
aber nicht beschränkt auf
Biomoleküle
wie z.B. Proteine, Lipide, Kohlenhydrate und Nucleinsäuren, modifizierte
Biomoleküle wie
z.B. gentechnologisch hergestellte, chemisch modifizierte und dergleichen,
ebenso wie synthetische Moleküle,
die bei der molekularen Erkennung eingesetzt werden, wie z.B. Cyclodextrane,
Matrizenpolymere und geprägte
Polymere und dergleichen. Ein anderes Ziel der Erfindung besteht
in dem kombinierten Ansatz, der verwendet wird um die Biomoleküle zu immobilisieren
und bezieht spezielle Oberflächen
(Gold), hydrophobes Dickschichffilmbemustern, sich selbst aufbauende
langkettige Thiole mit terminalen Kohlensäuregruppen und ein empirisch
bestimmtes EDC/NHS-Immobilisierungsprotokoll
ein. Obwohl diese alle einzeln eingesetzt worden sind, gibt es kein
Immobilisierungsprotokoll, das diese verschiedenen Techniken in
einem einzigen einheitlichen Protokoll kombiniert.
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Es
sind zahlreiche Patente offenbart worden, die eine weite Bandbreite
von biologischen Sensorelementen für diagnostische und therapeutische
Zwecke einsetzen, wie z.B.
WO
95/29692 ,
WO 95/15175 ,
WO 95/28962 ,
WO 95/07462 , das
kanadische Patent Nr. 2,133,772 ,
U.S. Patent Nr. 4,289,747 ,
U.S. Patent Nr. 4,389,392 ,
U.S. Patent Nr. 4,298,689 und
WO 95/26634 . Alle diese
Schriftstücke
verwenden die einzigartige Spezifität eines Sensorelements, sei
es ein Antikörper
oder ein Lectin, um eine einzelne Krankheit (oder Gruppen von nahe
verwandten Krankheiten) zu identifizieren. Es werden beträchtliche
Versuche unternommen, um die spezifische Reaktion zu erhöhen und
die unspezifischen Reaktionen zu vermindern, im scharfen Gegensatz
zu der hier beschriebenen Erfindung.
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Das
Patent
WO 92/19975 beschreibt
ein Verfahren zur Markierung von Glycoproteinen mit einem fluoreszenten
Molekül
in einem komplexen Gemisch unter Verwendung eines Kohlenhydrat-spezifischen Markierungsreagenzes.
Dieses Gemisch von markierten Proteinen wird aufgetrennt und das
Bandenmuster mit Hilfe von Mustererkennungsmethoden analysiert.
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Unsere
Erfindung hat mehrere Vorteile gegenüber dieser Erfindung. Erstens
sind keine Trennungsschritte enthalten, was die Zeit, den Arbeitsaufwand,
die Kosten und die Komplexität
des Assays verringert. Zweitens werden keine Erkennungselemente
verwendet, was die Flexibilität
des Assays einschränkt.
Drittens ist die Analyse von bekannten und unbekannten Bindungsfunktionen
nicht möglich,
da keine Erkennungselemente verwendet werden. Und schließlich kann
der Assay nicht erweitert werden, was die Fähigkeit des Assays einschränkt, die
Mustererkennungsprogramme voll auszunutzen.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1a Schematische Übersicht über die
Immobilisierungsprozedur unter Verwendung von 8 Sensorfeldern.
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1b Schematische Übersicht über die
Immobilisierungsprozedur unter Verwendung von 2 × 96 Sensorfeldern.
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2 Schema
des Festwinkel-Scanning-Ellipsometers
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3 Tabelle
der Reaktionen von Tierseren
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4 Tabelle
der Reaktionen von gesunden gegenüber kranken Menschen
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Beispiel 1
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Es
war sehr schwierig, Schnittstellen zwischen diesen biologischen
Sensorelementen und der auf der Oberflächenmasse basierenden Bildgebungstechnologie
zu schaffen. Standardimmobilisierungsprotokolle hatten eine schlechte
Gesamtreproduzierbarkeit zur Folge und veranlassten uns, ein hoch
spezialisiertes Protokoll zu entwickeln, Oberflächenmusterungs- und Immobilisierungstechnologien zu
kombinieren (1). Das integrierte Assayformat kombiniert
Dickschichtfilm-Oberflächenmusterung, sich
selbst aufbauende Einzelschichten, effiziente Kopplungschemie und
das Biotin-Streptavidin. Die Prozedur verwendet eine proprietäre Dickschichtdrucktinte
auf Teflonbasis (Cell-line, USA), um auf Gold-beschichteten Silikonwafern
oder Gold-beschichtetem Glas auf den exponierten Goldoberflächen Muster
aufzubringen, kombiniert mit sich selbst aufbauenden langkettigen
Thiolalkanen mit Carboxyl-Enden.
Polierte Silikonwafer (Wacker Chemie, Deutschland) oder Glas wurden
wie beschrieben (Mårtensson,
J., Arwin, H. Interpretation of spectroscopic ellipsometric data
an Protein layers an gold including substrate-layer interactions.
Langmuir 11: 963-968 (1995)) mittels Aufdampfung mit Gold beschichtet.
Diese Oberflächen
wurden dann mit einer proprietären
hydrophoben Beschichtung unter Verwendung einer Dickschichttechnologie
(Cell-line, USA) gemustert. Die hydrophobe Dickschichtmusterung
vereinfachte die Lokalisierung der verschiedenen Reagenzien außerordentlich,
was zu einer dramatischen Verbesserung in der Gesamt-Reproduzierbarkeit
des Assayprotokolls führte.
Die Wafer wurden einer Ultraschallbehandlung in EtOH unterzogen
bevor sie mit HS-(CH2)16-COOH
(1 mM in EtOH) behandelt wurden. Die Oberflächen wurden mit EtOH gespült, dann
einer Ultraschallbehandlung in EtOH unterzogen und schließlich nochmals
in EtOH gespült.
Die Oberfläche
wurde dann für
60 Minuten bei Raumtemperatur mit NHS (0,2 M) und EDC (0,8 M) in
destilliertem Wasser aktiviert. Die Oberfläche wurde kurz mit destilliertem
Wasser gespült
und mit Stickstoffgas trocken geblasen. Es wurde Aminobiotin (Molecular
Probes, USA) hinzugefügt
(1 mM in 100 mM Carbonatpuffer, pH 8,5) und für 60 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert. Nach kurzem Spülen der
Oberfläche
mit destilliertem Wasser wurde 50 μg/ml Streptavidin (Molecular
Probes) in HBST (150 mM NaCl, 0,1% Tween-20 und 20 mM HEPES, pH 7,4)
hinzugefügt
und 30 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Oberfläche wurde
gewaschen und 50 μg/ml
(verdünnt in
HBST) des biotinylierten Biomoleküls der Wahl wurden auf die
geeignete [Oberfläche] aufgebracht
und für
60 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Eine Übersicht ist in 1 gezeigt.
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Ein
anderes Ziel der Erfindung ist der kombinierte Ansatz, der verwendet
wird, um die Biomoleküle
zu immobilisieren und umfasst spezielle Oberflächen (Gold), hydrophobe Dickschichtfilmmusterung, sich
selbst aufbauende langkettige Thiole mit terminalen Carboxylgruppen
und ein empirisch bestimmtes EDC/NHS-Immobilisierungsprotokoll.
Obwohl diese alle einzeln eingesetzt worden sind, gibt es kein Immobilisierungsprotokoll,
das diese verschiedenen Techniken in einem einzigen einheitlichen
Protokoll kombiniert.
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Die
Immobilisierungsprozedur wurde empirisch optimiert, indem die Menge
von radioaktiv markiertem Streptavidin oder menschlichem Serumalbumin
quantifiziert wurde. SA und HSA wurden mit Hilfe von 35S-Protein-Markierungsreagenz
(SLR) gemäß den Vorschriften
des Herstellers (Amersham, Vereinigtes Königreich) radioaktiv markiert.
Für die
Doppelmarkierung wurde HSA zuerst schwach mit Biotin markiert, dialysiert
und anschließend
mit SLR markiert. Markiertes Protein (gewöhnlich 107 cpm/μg Protein)
wurde mit unmarkiertem Protein verdünnt und zu den Vertiefungen
hinzugegeben. Die Menge an immobilisiertem Material wurde mit Hilfe
eines Fuji Phosphoimagers quantifiziert. Das Protokoll war sehr gut
reproduzierbar (n = 10, S.D. = 5%). Berechnungen der Oberflächendichte
und andere Indizien weisen darauf hin, dass SA als dichtes Monolayer
auf der Oberfläche
vorliegt. AFM und ellipsometrische Experimente zeigen an, dass die
Oberfläche
extrem gleichmäßig ist.
Darüber
hinaus haben wir mit Hilfe der Radiomarkierungsdaten berechnet,
dass die Packungsdichte von SA 60.000 SA/mm2 beträgt. Das
ist 20% höher
als die theoretische Packung von 50.000 SA/mm2 und
kann auf die Rauheit der in diesen Experimenten verwendeten Goldoberflächen zurückgeführt werden.
Eine Goldkorngröße von 20
nm (ermittelt durch Rasterkraftmikroskopie der Oberflächen) entspricht
einem zugänglichen
Bereich von 70.000 SA/mm2. Eine sehr gut
reproduzierbare Immobilisierung ist unbedingt erforderlich, um eine
ausreichende Reproduzierbarkeit des Assays zu erreichen und um die
Effekte von CRD-Dichtegradienten
zu untersuchen.
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Dieses
Protokoll wurde verwendet, um ein Muster von acht biotinylierten
Lectinen auf ein Array aufzubringen: Canavalia ensiformis, Bandeiraea
simplicifolia BS-1, Arachis hypogaea, Phytolacca americana, Phaseolus
vulgaris pha-e, Artocarpus integrifolia, Triticum vulgaris, Pisum
sativum. Vereinigte Seren von Schaf, Ziege, Schwein und Mensch (DAKO, Dänemark)
wurden 1:4 in HBST verdünnt
und 5 μl wurden
zu jeder Vertiefung hinzugefügt.
Nach einer Übernachtinkubation
bei 4° C
wurden die Proben mit Puffer und dann kurz mit destilliertem Wasser
gewaschen (um überschüssige Salze
zu entfernen, welche die ellipsometrischen Messungen störten). Die Proben
wurden dann auf den XY-Messtisch eines Scanning-Festwinkel-Ellipsometers
platziert, das am Labor für
Angewandte Physik gebaut worden war (Arwin, H., Lundström, I. Surface
oriented optical methods for biomedical analysis. Methods in Enzymology
137: 366-381 (1988); Jin, G., Tengvall, P., Lundström, I., Arwin,
H. Applications of imaging ellipsometry for antigen-antibody binding
studies. Anal. Biochem., im Druck (1995). Der Apparat bestand aus
einem Diodenlaser mit einer Wellenlänge von 670 nm (helles Griot,
Schweden), der mit einer Blende, Polarisatoren und einem Mehrschicht-Lambdaviertelplättchen ausgestattet
war, die auf eine solche Weise angeordnet waren, dass linear polarisiertes
Licht in einem geeigneten Winkel auf die Probenoberfläche fiel.
Das reflektierte Licht wurde mit einer Photodiode gemessen. Es wurde
ein Computer eingesetzt, um die Position der Probe zu kontrollieren
und um die von der Photodiode erhaltenen Daten zu speichern. Die
Größe des Lichtpunkts
von dem Laser war im Bereich von 1 mm2,
was somit die maximale Auflösung festlegte.
Die Verteilung und die Menge von Proteinen, die an der Oberfläche adsorbiert
waren, konnte dann bestimmt oder durch Scannen der Probe visualisiert
werden. Das Gerät
ermöglichte
Scanareale bis zu einer Größe von 20 × 20 mm
mit einer Auflösung von
bis zu 200 × 200
Pixeln. Die experimentelle Anordnung ist schematisch in 2 gezeigt.
Die aus den Experimenten erhaltenen Rohwerte wurden mit dem Bildverarbeitungsprogramm
Transform (Spyglass, U.S.A.) oder NIH Image bearbeitet um die Daten
zu quantifizieren.
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Die
von einem solchen Experiment erhaltenen Daten sind in 3 gezeigt.
Diese Daten stellten die Eingabewerte eines dreilagigen künstlichen
neuronalen Netzwerks dar, das aus 8 Knoten bestand, die den 8 Lectinen
entsprachen. Im ersten Lauf waren die unbearbeiteten Rohdaten die
Eingabewerte, und Training führte
schnell zu Konvergenz, das heißt, das
Netz war in der Lage, zwischen den Proben zu unterscheiden.
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Beispiel 2
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In
diesen Studien wurden Serumproben von kranken gegenüber gesunden
Menschen untersucht, wobei dasselbe Array von acht biotinylierten
Lectinen eingesetzt wurde: Canavalia ensiformis, Bandeiraea simplicifolia
BS-1, Arachis hypogaea, Phytolacca americana, Phaseolus vulgaris
pha-e, Artocarpus integrifolia, Triticum vulgaris, Pisum sativum.
In diesem Fall wurden mit ungemustertem Gold (50 nm dickes Gold,
das durch Sputtering aufgedampft war) beschichtete Glasoberflächen (0,3
mm dickes Glas) im Wesentlichen wie vorstehend beschrieben bis zur und
einschließlich
der Kopplung von Aminobiotin hergestellt. Die Oberflächen wurden
dann in den BIACore von Pharmacia Biosensor eingesetzt. Die Laufbedingungen
waren 2 μl/min
bei 25°C
und der Laufpuffer war HBST. Die Bindung von SA und biotinylierten Lectinen
wurde durchgeführt,
indem nacheinander 4 μl
von einer 50 μg/ml
Lösung
von jedem injiziert wurden.
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Die
menschlichen Seren wurden von der Abteilung für Infektionskrankheiten am
Lunds University Hospital bezogen. Die Referenzseren wurden von gesunden
Freiwilligen genommen (20 Probanden). Die Serumproben von kranken
Menschen (8 Probanden) waren alle als klinische bakterielle Infektionen aufweisend
identifiziert. Die Seren wurden 4:1 mit HBST verdünnt und
30 μl wurden
injiziert. Nach Beendigung der Injektion wurde ein Wert in Referenzeinheiten
(RU) genommen. Die Oberfläche
wurde bis zum Biotin regeneriert, indem Regenerierungslösungen injiziert
wurden. SA und biotinyliertes Lectin wurden dann nacheinander injiziert,
um die nächste Bindungsstudie
zu beginnen. Dieser Prozess wurde wiederholt, bis alle der Serumproben
mit allen acht Lectinen analysiert worden waren. Die Ergebnisse von
einem solchen Experiment sind in 4 gezeigt. Sieben
der acht kranken Probanden können
eindeutig als krank identifiziert werden, wenn sie mit den gesunden
Referenz-Serumproben verglichen werden.
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Wir
hatten ursprünglich
vor, für
diese Studien Antikörper
zu verwenden. Wir waren jedoch nicht in der Lage, monoclonale Antikörper mit
einer geeigneten Kombination von Affinität und Spezifität zu finden. Dies
könnte
auf die Screening-Prozeduren zurückzuführen sein,
die verwendet wurden, um diese Antikörper zu selektieren, oder möglicherweise
auf die Unterdrückung
von breit kreuzreagierenden Antikörpern.