KR100558185B1

KR100558185B1 - Ｓｐｒ를 이용한 단백질 정량법

Info

Publication number: KR100558185B1
Application number: KR1020020030285A
Authority: KR
Inventors: 조용구; 김현정; 김정미
Original assignee: 주식회사 바이오메드랩
Priority date: 2001-09-21
Filing date: 2002-05-30
Publication date: 2006-03-10
Also published as: KR20030025787A

Abstract

본 발명은 SPR를 이용한 단백질 정량법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 시료내 알파페토단백질, 융모고나도트로핀 또는 언컨쥬게이티드 에스트리올을 표면 플라즈몬 공명 으로 정량함으로써 특정질병 또는 다운증후군의 발병가능성을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 태아의 건강을 확인할 수 있다.

면역측정법, SPR, 다운증후군, 알파페토단백질, 융모고나도트로핀, 언컨쥬게이티드 에스트리올, 자기 조립 단분자층, Spreeta

Description

ＳＰＲ를 이용한 단백질 정량법{METHOD OF QUANTITATIVELY MEASURING PROTEIN USING SURFACE PLASMON RESONANCE}

도 1은 SAM이 형성된 표면 플라즈몬 층에 항체를 주입하였을 때 굴절지수변화를 타낸 그래프이고,

도 2는 hCG 항체를 포함하는 표면 플라즈몬 층에 hCG를 반응시켰을 때 굴절지수변화를 나타낸 그래프이고,

도 3은 hCG 항체를 포함하는 표면 플라즈몬 층에 혈청을 반응시켰을 때 굴절지수변화를 나타낸 그래프이고,

도 4는 AFP 항체를 포함하는 표면 플라즈몬 층에 AFP를 포함하는 PBS-T를 반응시켰을 때 굴절지수변화를 나타낸 그래프이고,

도 5는 항원-항체 결합이 이루어진 표면 플라즈몬 층에 BSA 폴리클로날 항체를 더욱 결합시켰을 때 증폭된 굴절지수변화를 나타낸 그래프이다.

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 SPR를 이용한 단백질 정량법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 시 료내 알파페토단백질, 융모고나도트로핀, 또는 언컨쥬게이티드 에스트리올을 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)으로 정량하여 특정질병 또는 다운증후군을 진단하는 방법에 관한 것이다.

[종래기술]

단백질의 농도를 측정방법으로는 효소면역측정법(Enzyme Immunoassay, EIA), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 및 방사면역측정법(Radioimmunoassay, RIA)이 있다. 이러한 방법들은 대부분 샌드위치 분석방식을 택하며, 높은 민감도 (sensitivity)를 가지나 여러 개의 샘플을 모아야 실험의 수행이 가능하며, 시간이 오래 걸리고 여러 단계의 지루한 과정을 거쳐야 한다는 단점이 있다. 또한 가장 민감도(sensitivity)가 높은 방사면역측정법은 경우 방사능 물질에 의한 위험이 문제가 된다.

최근 광학적 센서를 사용하여, 분자간의 상호 작용을 복잡한 전처리 과정 없이 실시간으로 관측할 수 있게 됨에 따라 각종 간섭계(Schlatter, D., Barner, R., Fattinger, C.H., Huber, H., Hubscher, J., Hurst, J., Koller, H., Mangold, C., Muller, F. Biosen. Bioelec. 8: 109-116 (1993); Schneider, B.H., Edwards, J.G., Hartman, N.F. Clin. Chem. 43:1757-1763 (1997)), 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance; 이하 'SPR'이라 함)을 이용한 장치(Lundstrom, I. Biosen. Bioelec. 9:725-736 (1994); Buckle, P.E., Davies, R.J., Kinning, T., Yeung, D., Edwards, P.R., Pollard-Knight, D., Lowe, C.R., Biosen. Bioelec. 8:355-363 (1993); Fattinger, C.H., Mangold, C.,Gale, M.T., Schutz, H., Opt. Eng. 34:2744-2753 (1995))가 개발되었다. 이런 광학적 장치들은 모두 분자간의 상호작용에 따른 굴절률의 변화를 측정하여, 전혈(whole blood), 혈청(serum) 등의 샘플 내에 있는 핵산, 단백질 등을 정량할 수 있으며, 상호 작용의 동역학 변수(kinetic parameter)들도 측정할 수 있어 기존의 EIA나 ELISA, RIA 등의 방법을 대체할 기술로 주목받고 있다.

SPR 현상을 이용한 센서의 경우 Biacore AB 사(Uppsala, Sweden)의 BIAcore 장치를 비롯한 다양한 장치들이 단백질간의 결합이나 DNA간 또는 리셉터와 리간드간의 결합을 관찰하는 데 널리 쓰이고 있다.(Schuch P., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:541(1997); Lofas S., Pure Appl. Chem. 67:829(1995); Malmqvist M., Nature 361:186(1993); Mann D.A., Kanai M., Maly D. J., Kiessling L. L., J. Am. Chem. Soc. 120:10575 (1998); Corr M., Slanetz A. E., Boyd L. F., Jelonek M.T., Khilko S., Al-Ramadi B. K., Kim Y. S., Maher S. E., Bothwell A. L. M., Margulies D. H., Science 265:946(1994); Rao J., Yan L., Xu B., Whitesides G. M., J. Am. Chem. Soc. 121:2629(1999); LeBlanc J. F., McLane K. E., Parren W. H. I., Burton D. R., Ghazal P., Biochemistry 37:653(1998)) 기존의 SPR을 이용한 장치는 표면 플라즈몬 층인 금속막이 유리 프리즘의 평평한 면에 존재하고, 편광이 프리즘을 통하여 금속막 표면에 적용되어 프리즘 외부로 반사되는 빛의 세기를 측정하여 공명각을 구한다. 이러한 방식은 고도의 정밀성과 정확한 측정을 위한 최적의 장치들이 각각 필요하다. 이에 장치들이 비용이 비싸고, 대형이라 이동이 불가능할 뿐만 아니라 실험실 수준에서 만들어진 것이므로 상 용화에는 문제가 있다.

한편, 알파페토단백질(alpha-fetoprotein; 이하 'AFP'라 함)는 간암(hepatocellular cancer) 및 난황낭암(yolk sac tumor)의 표지 물질로, 이런 종양을 가진 환자는 혈액내 AFP의 양이 정상인에 비하여 현저히 증가하는 것으로 알려져 있다.(Chen, D.S., Sung, J.L., Cancer 40:779-783 (1977); Knight, G.J, Methods in clinical chemistry, Chapter 62, Pesce, A.J., Kaplan, L.A. eds. Mosby-Year Book Inc., 459-465 (1987))

융모고나도트로핀(human chorionic gonadotropin; 이하 'hCG'라 함)은 태반의 합포체영향세포(syncytiotrophoblastic cell)에서 정상적으로 분비되는 호르몬으로, 체내에서 hCG(Non-nicked hCG), hCGn(nicked hCG), hCGβ(non-nicked free β subunit), hCGβcf(free β core factor), hCGα(free α subunit) 등의 다양한 형태로 발견된다.(Alfthan, H., Stenman, U. H., Mol. Cell Endocrin. 125:107-120 (1996)) 다양한 형태의 융모고나도트로핀의 농도는 질병에 따라 차이가 있어,(Alfthan, H., Stenman, U. H., Mol. Cell Endocrin. 125:107-120 (1996)) 질병 표시자로 이용되고 있다.

다운 증후군 태아를 임신한 경우, 산모의 혈청내 AFP의 양은 감소하고, hCG 및 hCGβ의 양은 증가하는 것으로 알려져 있으며,(Merkatz, I.R., Nitowsky, H.M., Macri, J.N., Johnson, W.E., Am. J. Obest. Gynecol. 148:886-894 (1984); Bogart, M.H., Pandian, M.R., Jones, O.W., Prenat. Diagn. 7:623-630 (1987); Spencer, K., Muller, F., Aitken, D.A., Prenat. Diagn. 17:31-37 (1997)) AFP 및 hCG(hCGβ)를 정량하기 위하여 더블테스트(double test) 또는 언컨쥬게이티드 에스트리올(unconjugated estriol; uE3)까지 정량하는 트리플 테스트가 표준 검사법으로 널리 이용되고 있다.

또한 18번 염색체가 3배체로 있는 태아를 임신한 경우에도 산모의 형청내 AFP 및 uE3의 농도가 감소하지만, 다운 증후군의 경우와는 달리 hCG의 농도는 낮은 것으로 알려져 있다.(Canik, J.A., Palomaki, G.E., Osthanondh, R., Prenat. Diagn. 10:546-548 (1990))

따라서, 상기와 같은 특정 질병의 정확한 진단을 위해서, 특정 질병에 관계되는 단백질, 특히 알파페토단백질, 융모고나도트로핀 및 언컨쥬게이티드 에스트리올의 혈중 농도를 간단하고 높은 민감도로 측정할 수 있는 방법이 요구되는 실정이다.

본 발명은 단백질을 SPR방법으로 정량할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한 혈중 알파페토단백질, 융모고나도트로핀 또는 언컨쥬게이티드 에스트리올을 쉽고 간단하게 정량할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 혈중 알파페토단백질, 융모고나도트로핀 또는 언컨쥬게이티드 에스트리올을 정량하여 다운증후군을 진단할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 표면 플라즈몬 층에 화합물을 반응시켜 자기 조립 단분자층(self assembled monolayer)을 형성하는 단계, (b) 목적 단백질에 대한 항체를 상기 자기 조립 단분자층에 고정시키는 단계, (c) 상기 고정된 항체에 목적 단백질을 포함하는 시료를 반응시키는 단계, (d) 표면 플라즈몬 층에 광을 조사하고, 굴절지수변화를 측정하는 단계 및 (e) 표준화된 목적 단백질의 양에 대한 굴절지수변화 관계를 이용하여 목적 단백질의 양을 환산하는 단계를 포함하는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 단백질 정량방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 자기 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance; 이하 'SPR'라 함) 현상을 이용하여 시료내 목적 단백질의 함량을 측정하는 방법에 관한 것이다.

굴절률이 서로 다른 두 투명한 매질의 경계면에서 높은 굴절률을 가진 매질로부터 들어오는 광의 일부분은 반사가 되고 부분적으로는 굴절이 된다. 그러나 어떤 특정한 입사각(두 매질의 굴절률 비로 결정이 됨)이상에서는 모든 광은 다른 매질로 굴절되지 않고 전부 반사된다. 이때 비록 모든 광은 반사가 되지만 소실파(Evanescent wave)라고 불리는 전자기파 성분이 굴절률이 낮은 매질로 한 파장 정도의 매우 짧은 거리만큼 파고 들어 간다. 만일 두 매질 사이가 매우 얇은 금속으로 코팅이 되어 있고, 입사광이 편광이며 단색광일 경우, 특정한 입사각도에서의 반사되는 광은 그 광 밀도가 현저히 줄어드는 현상이 발생한다. 이러한 현상을 SPR이라고 부르고 이때 입사각을 SPR각이라 부른다. SPR각은 전자기파가 파고 드는 용액의 굴절률에 따라 달라진다. 이러한 SPR 현상을 감지하는 광학 장치를 이용하여 표면 플라즈몬 층의 굴절률 변화를 연속적으로 관찰할 수 있다. 굴절률은 완충액이 바뀜에 따라 변하지만, 표면 플라즈몬 층의 질량 변화에 따라서도 달라진다.

목적 단백질을 항원으로 하여, 이를 검출할 수 있는 항체를 제조한 후, 항체를 표면 플라즈몬 층(Surface Plasmon Layer)에 고정한 다음 시료와 반응시켜 면역반응을 유도한다. 편광을 센서에 조사하여 굴절지수변화(△Refractive index unit;△RIU)를 측정함으로써 시료내 항원의 함량을 구한다. 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체 모두 가능하며, 폴리클로날 항체가 더욱 바람직하다. 또한 표면 플라즈몬 층에 폴리클로날 항체를 고정하고, 항원을 결합시킨 후 다시 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 반응시키면, 항체-항원 복합체에 결합하여 굴절지수변화를 크게 증폭시킬 수 있다.

또한 굴절지수변화를 크게 하기 위하여 신호를 증폭하기 위한 물질을 먼저 시료내 항원에 반응시킨 후 상기 신호를 증폭하기 위한 물질과 결합된 항원을 표면 플라즈몬 층상에 고정된 항체에 반응시킬 수 있다.

상기 신호를 증폭하기 위한 물질로는 항체 및 금속 또는 유기 무기물질로 이루어진 입자가 부착된 항체를 사용할 수 있다. 항체로는 항원에 대한 모노클로날, 폴리클로날 항체를 5-100 ug/ml를 사용하거나, 바람직하게는 5-20 ug/ml를 사용한다.

금속 또는 유기, 무기 물질로 이루어진 입자가 부착된 항체는 모노클로날 또 는 폴리클로날 항체에 금속 또는 유기 물질로 이루어진 입자를 부착한 것이다. 입자는 직경 1-200 nm로, 바람직하게는 1-50 nm가 좋다. 금속 입자의 경우에는 금, 은, 구리, 알루미늄 또는 이들의 합금이 바람직하며, 알루미나, 타이타니아 등과 같은 산화물도 가능하다. 가장 바람직하게는 금이다. 유기 물질의 경우에는 고분자로서, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴릭에시드, 폴리메틸메타크릴레이트 또는 이들의 유도체이다. 무기 물질의 경우에는 유리, 실리카, 실리콘 고분자 등 있다. 이러한 입자들은 공유 결합, 수소 결합, 정전기적 인력 등을 사용하여 항체에 부착할 수 있다.

본 발명의 굴절지수변화를 측정하는 방법은 통상의 SPR을 이용한 방법으로 수행가능하며, 바람직하기로는 휴대가능한 장치내에 표면 플라즈몬 층(surface Plasmon Layer), 광원(Light Emitting Diode; 이하 'LED'라 함)), 반사거울, 검출기(photodiode array)를 모두 포함한 장치이다. 광원은 800 내지 850 nm의 파장으로 조사하나, 파장범위는 조절되어질 수 있다. 상기 LED 및 검출기는 하나의 반도체내에 존재하며, 반도체내의 정보는 디지털 신호처리기를 통하여 컴퓨터로 굴절지수 변화로 출력될 수 있다. 굴절지수는 온도에 의해 달라지므로, 상기 반도체 상에 온도센서를 더욱 포함시켜, 온도에 따른 굴절지수를 보정하는 것이 바람직하다. 대표적인 SPR 장치로는 텍사스기계에서 개발한 Spreeta^TM(US 6191847, US 611652, US 611248, US 5946083, US 5912456, US 5898503)가 있다. 상기 Spreeta^TM는 광학적 기능을 가지는 일종의 반도체(semiconductor based optoelectronic device)로, LED를 광으로 사용하며, 포토다이오드 어레이(liner silicon photodiode array), 온도감지기, 내부는 에폭시 조성물로 이루어져 있다.

본 발명에서 정량가능한 단백질, 즉 목적 단백질은 항원-항체 반응을 이용 가능한 모든 단백질을 포함하며, 바람직하게는 특정 질병에 따른 혈액 또는 뇨 등에 존재하는 농도가 달라져 정량된 단백질 양으로 특정 질병의 진단에 이용가능한 것이다. 더욱 바람직한 단백질은 알파페토단백질(alpha-fetoprotein; 이하 'AFP'라 함), 융모고나도트로핀(human chorionic gonadotropin; 이하 'hCG'라함) 또는 언컨쥬게이티드 에스트리올(unconjugated estriol; uE3)이다.

AFP는 각종 질병에 따라 표 1과 같이 다른 농도 분포를 보인다.(서일택, 임상 핵의학 검사 기술학, 고려의학)

혈중 알파페토단백질의 농도 (ng/ml)	가능 질병
0-10	건강인
10-100	급성, 만성 간염의 20%, 간경변의 35%, 임신
100-400	간경변의 15%, 임신 32주경
400-900	간세포암, 일부 위암, 소아간염, 선천성 담도폐쇄증

hCG는 하기 표 2와 같이 질병에 따라 증가되는 hCG의 형태(hCG, hCGn, hCGβ, hCGβcf, hCG)가 알려져 있다.

증상	농도가 증가하는 hCG의 형태
임신	hCG, hCGβ, hCGα, hCGβcf
다운증후군인 태아의 임신	hCG, hCGβ
Choriocarcinoma	hCG, hCGβ
Testicular cancer	hCG, hCGβ, hCGα
췌장암, 위암, 간암, 폐암	hCG, hCGβ, hCGβcf(뇨)

정상인 여성 및 남성의 경우, 혈청 내 hCG 및 hCGβ의 농도 분포는 표 3과 같으며,(Alfthan, H., Haglund, C., Dabek, J., Stenman, U. H., Clin. Chem 38:1981-1987 (1992)) 정상인 여성의 경우, 임신 주기에 따른 hCG의 혈중농도는 하기 표 4와 같이 차이가 있다.(서일택, 임상 핵의학 검사 기술학, 고려의학)

	여성		남성
나이	<50	≥50	<50	≥50
혈청내 hCG	0.32 ng/ml	0.59 ng/ml	0.08 ng/ml	0.23 ng/ml
혈청내 hCGβ	0.036 ng/ml	0.044 ng/ml	0.042 ng/ml	0.047 ng/ml

임신 주기	융모고나도트로핀의 농도
1	2-6 ng/ml
2	40-100 ng/ml
3	200-600 ng/ml
4	1,000-2,000 ng/ml
2-3개월	2,000-20,000 ng/ml
5개월	1,000-10,000 ng/ml
7개월	400-3,000 ng/ml

uE3는 대표적인 에스트로겐으로 태아와 태반 부근에서 합성되어 태반을 통해 산모의 혈액 속으로 유입된다. 산모의 혈액 내로 들어온 uE3는 대략 1시간 내에 분해되어 사라지므로 태아의 상태를 검사하는 표지 단백질로 이용되고 있다. 특히 다운 증후군을 가진 태아를 임신한 경우에 혈액 내 uE3의 농도가 정상적인 임산부에 비해 낮은 것으로 알려져 있다.(Canick, J.A., Knight, G.J., Palomaki, G.E., Haddow, J.E., Cuckle, H.S., Wald, N.J. Br. J. Obstet. Gynaecol. 95:330-333 (1988))

정상적인 산모의 경우 임신 주수에 따라 혈액내 uE3의 농도는 아래 표 5와 같다(Katagiri, H., Distler, W., Freeman, R.K., Goebelsmann, U., Amer. J. Obstet Gynecol. 124:272-280, (1976); Buster, J.F., Sakakaini, J., Kilam, A.P., and Scragg, W.H., Amer. J. Obstet. Gynecol. 125:672 (1976)).

임신 주수	예상 농도 (ng/mL)	임신 주수	예상 농도 (ng/mL)
12	0.3 - 1.0	22-23	2.7 - 16
13	0.3 - 1.1	24-25	2.9 - 17
14	0.4 - 1.6	26-27	3.0 - 18
15	1.0 - 4.4	28-29	3.2 - 20
16	1.4 - 6.5	30-31	3.6 - 22
17	1.5 - 6.6	32-33	4.6 - 23
18	1.6 - 8.5	34-35	5.1 - 25
19	1.9 - 11	36-37	7.2 - 29
20	2.1 - 13	38-39	7.8 - 37
21	2.6 - 14	40-42	8.0 - 39

따라서, 혈내 또는 뇨내의 AFP, hCG, uE3를 정량하여 특정 질병에 대하여 진단용도로 활용가능하다.

목적 단백질에 대한 항체를 표면 플라즈몬 층에 고정하는 방법은 (a) 표면 플라즈몬 층의 금 표면에 자기 조립 단분자층(Self Assembled Monolayer; 이하 'SAM'이라 함)을 형성할 수 있는 화합물을 반응시켜 SAM을 형성하는 단계 및 (b) 상기 SAM에 항체를 고정하는 단계를 포함한다.

상기 SAM은 표면 플라즈몬 층에 항체를 고밀도로 집적시키는 링커로 작용하며, 3차원적인 구조를 가져 항체의 결합 표면적이 넓다. SAM을 형성시키는 화합물은 통상의 물질을 사용할 수 있으며, 티올(thiol)기와 카르보이미드(carboimide)를 포함하는 화합물, 티올기와 아세트 산기를 포함하는 화합물 및 캘릭스아렌 유도체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

캘릭스아렌 유도체는 금 표면상에 SAM을 형성할 수 있는 기능기로 티올기를 가지며, 단백질 또는 아미노산의 양이온 특히 아민기(-NH₃ ⁺)를 특이적으로 인식할 수 있는 크라운 고리를 포함한다. 상기 크라운 고리는 기존에 바이오물질을 화학적인 결합에 의하여 고정시키는 방법과 달리 분자인식작용중 하나인 다중이온 인식 작용을 이용하여 양이온성 물질을 표면 플라즈몬 층에 고정시킨다. 따라서, 바이오물질의 화학적 처리나 변화없이 고정할 수 있으며, 대부분의 항원, 항체 및 효소 등의 단백질은 단백질 활성위치 반대편에 아민기 등의 양이온이 분포하므로 배향성 문제를 해결할 수 있다.

대표적인 SAM 형성 화합물은 머캅토헥사데카노익산(1,6-mercaptohexadecanoic acid), 머캅토운데카노익 산(mercaptoundecanoic acid), 머캅토헥사데실아민(1,6-mercaptohexadecylamine) 등이 있으며, 캘릭스아렌 유도체의 대표적인 예로 화학식 1의 캘릭스[4]아렌-비스크라운(calix[4]aren-crown)-4, 화학식 2의 캘릭스[4]아렌-크라운-5 및 화학식 3의 캘릭스[4]아렌-크라운-6이 있다.

(화학식 1)

(상기 화학식 1에서, R1 내지 R4는 각각 -CH₂SH이거나, R1 내지 R4 중 2개가 서로 결합하여 각각 -CH₂-S-S-CH₂- 기를 형성할 수 있다.)

(화학식 2)

(상기 화학식 2에서,

n은 1이고,

R1 내지 R4는 각각 -CH₂SH 또는 R1 및 R3은 각각 -CH₂SH이고, R2 및 R4는 각각 H이고,

R5 및 R6은 각각 H, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 이소부틸로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다.)

(화학식 3)

(상기 화학식 3에서,

n은 2이고,

R5 및 R6은 각각 H, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 이소부틸로 이루어진 군으로부턴 선택된 것이다.)

본 발명의 hCG, AFP 및 uE3 정량하는 방법은 통상의 면역분석방법에 사용되는 완충액, 방법으로 실시하는 것이 바람직하며, 광학적 센서를 이용하여 굴절지수변화를 측정하여 정량한다. 이때 정량된 항원을 반응시켜 굴절지수변화를 표준화하고, 시료를 반응시킨 후 굴절지수변화를 표준지수에 대입하여 양을 환산한다.

hCG, AFP 및 uE3는 특정 질병 별 혈 또는 뇨내 농도가 공지되어 있고, 특이 다운증후군태아를 임신하였을 때 나타나는 농도가 공지되어 있으므로, 특정질병의 발병 가능성을 진단할 수 있고, 태아의 건강을 확인할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 표면 플라즈몬 층에 SAM 형성

SPR을 이용한 장치로 스프리타(Spreeta^TM, Texas Instruments, Dallas)를 이용하였고, 상기 스프리타는 광원(LED), 편광기(polarizer), 반사거울, 포토다이오드 어레이(Photodiode array)와 표면 플라즈몬 층(surface plasmon layer)으로 구성되어 있고, 플로우셀(flow cell)은 용액을 표면 플라즈몬 층으로 흘려주고, 배출 되는 장치로 탈, 부착할 수 있다. 포토다이오드 어레이 및 광원은 반도체상에 존재하여 반도세에 집적되는 정보는 디지털 신호처리(Digital signal processing; DSP) 보드를 사용해 데스크탑이나 노트복등의 개인컴퓨터와 연결하여 굴절지수변화를 측정할 수 있다.

금 표면을 세척하는 과정을 수행하였다. 0.1 % 트리톤X-100(Sigma)과 0.1 M NaOH 용액을 10분 이상 흘려주어 금 표면을 세척하였고, 질소를 흘려주어 건조시켰다. 피란하용액(황산:과산화수소 = 1:1, vol)에 금 표면을 10분 이상 담가두고, 3차 증류수로 충분히 세척하여 질소로 건조시켰다. 플로우 셀을 스프리타에 조립한 후, 완충액(0.1 % 트리톤 X-100 + 0.1 M NaOH)과 3차 증류수를 10분씩 번갈아 3차례 흘려주었고, DMF를 10분간 흘려주었다. 이 때 모든 유속은 50 ㎕/min으로 하여, 금 표면상에 SAM을 형성시켰다.

세척된 금 표면에 SAM을 형성하기 위한 실험을 수행하였다. Prolinker^TM B(Cre-B, Proteogen, 한국)를 DMF (N,N-Dimethylformamide, Sigma)에 1.5 mM의 농도로 녹이고, 주사기펌프(syringe pump, 건아 메카트로닉스)로 스프리타의 플로우셀에 7 ㎕/min 유속에, 약 30분간 흘려주었다. 이때 상기 용액이 금 표면에만 닿도록 하였다. 그 후 흐름을 멈춘 상태에서 30분간 방치한 다음, DMF를 10분간 50 ㎕/min로 흘려주었다. 플로우셀을 분리하고 3차 증류수를 흘려주어 세척하고, 질소로 건조시켰다.

실시예 2: 침지방법으로 표면 플라즈몬 층에 SAM 형성

스프리타에서 표면 플라즈몬 층부분을 이탈시켜 상기와 동일한 방법으로 금표면을 세척하였고, 1.5 mM의 prolinker^TMB(Proteogen, 한국)를 포함하는 DMF (N,N-Dimethylformamide, Sigma)용액에 30분간 침지하였다. 이후 DMF, 3차 증류수로 세척하고, 질소로 건조시킨 다음 스프리타에 부착하였다.

실시예 3: 항체의 고정

실시예 1에서 형성된 SAM에 AFP 또는 hCG 항체를 고정하였다.

플로우셀을 조립하고, PBS-Triton(0.1% Triton X-100 + Phosphate-buffered saline)로 10분이상 세척하고, PBS 용액을 약 10분간 흘려주었다. 제조한 항체(AFP 항체: Sigma 사에서 구입, hCG 항체: Calbiochem사에서 구입)는 PBS에 50 ㎍/ml으로 녹여 30 ㎕/min의 유속으로 흘려주면서, 굴절지수 변화를 측정하였다.

도 1은 금 표면에 항체를 반응시키는 시간에 따른 굴절율 변화를 관찰한 것으로, 시간에 따른 굴절지수 변화가 거의 나타나지 않는 45분 때의 데이터로 보아 이 시간 이내에 항체가 대부분 고정됨을 알 수 있다. 이후 PBS-T(0.01 % Triton X-100+PBS)용액으로 금표면을 세척하면서 굴절지수 변화를 측정한 결과, 10분간 금 표면을 세척하여 비특이적으로 고정된 항체가 제거됨을 볼 수 있었다. 금 표면은 질소로 말려 보관하거나 바로 정량 실험에 사용하였다.

실시예 4: hCG 농도별 굴절률 변화

실시예 3에서 제조한 hCG 항체가 고정된 스프리타에 정량된 hCG를 반응시켜 hCG 농도별 굴절지수 변화를 관찰하였다.

스프리타의 금표면에 hCG가 포함된 PBS-T 용액을 15분 정도 흘려주었다. 그 후, hCG가 포함된 PBS-T 용액을 30 ㎕/min의 유속으로 흘려주었다. PBS-T는 비특이적 항원-항체결합을 감소시킨다. hCG의 농도별(5 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml, 80 ng/ml, 160 ng/ml)로 흘려주어 시간에 따른 굴절지수 변화의 크기를 측정하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 반응시킨 hCG 양이 증가함에 따라 굴절지수 변화가 증가함을 볼 수 있었다.

실시예 5: 혈액내 hCG 함량측정

23세의 남성에게서 혈액을 채취하고, 원심분리하여 혈청을 분리하였고, PBS-T 용액에 1:100의 농도로 희석하였다. 이 희석액은 실시예 3에서와 동일한 방법으로 hCG 항체가 고정된 금표면에 흘려주고 시간에 따른 굴절률 변화의 크기를 측정하였다. 또한 남자의 혈청내에는 hCG의 함량이 매우 낮아 인위적으로 40 ng/ml의 hCG를 첨가한 후 굴절지수 변화를 측정하였다.

도 3은 시료를 hCG 항체가 고정된 금 표면에 반응시킨 후 시간에 따른 굴절지수변화를 나타낸 그래프이다. 도 3의 그래프에서 혈청내 hCG을 첨가였을 때 굴절지수변화가 증가함을 알 수 있다.

실시예 6: 혈액내 AFP 함량 측정을 위한 표준지수측정

혈청은 PBS-T 용액에 1:100의 농도로 희석하여 사용하므로, PBS-T 완충액상의 AFP양에 따른 굴절지수변화를 측정하여 표준화하였다.

도 4는 AFP 항체가 고정된 표면 플라즈몬 층에 AFP를 포함하는 PBS-T 용액을 반응시킨 다음 굴절지수변화를 나타낸 그래프이다. 그 결과 AFP의 농도에 따른 굴절지수변화를 표준화할 수 있었고, 혈청을 사용하였을 때 나타나는 굴절지수변화를 상기 도 4에 대입하여 혈청내 AFP를 정량할 수 있다.

실시예 7: 폴리클로날 BSA 항체를 이용한 굴절율 변화 측정

표면 플라즈몬 층상에 항원항체 결합에 폴리클로날 항체를 더욱 결합시켰을 때 굴절지수 변화를 확인하였다. 폴리클로날 항체는 항원을 인지하여 결합하는 부위가 다수로 존재하고, 분자량이 크므로 굴절지수변화에 민감하게 작용할 것으로 여겨졌다.

실시예 3과 동일한 방법으로 폴리클로날 BSA 항체를 금 표면에 고정하였고, BSA가 0.1 ng/ml의 농도로 포함된 PBS-T 용액을 30 ㎕/min의 유속으로 흘려주었다. 이 때, 거의 측정 신호가 나타나지 않는다. 그 후, 50 ㎍/ml의 농도로 녹인 폴리클로날 BSA 항체를 30 ㎕/min의 유속으로 흘려주어 항체-항원-항체 결합을 유도하였다. 시간에 따른 굴절지수변화를 측정한 결과 도 5의 그래프를 산출할 수 있었다.

도 6의 그래프에서 거의 변화가 없는 선은 항원-항체반응만을 한 것의 결과이고, 증가를 나타내는 선은 항체-항원-항체반응을 유도한 것의 결과이다. 즉, 폴리클로날 항체로 더욱 반응시킴으로써 굴절지수변화를 10배 정도 증폭시킬 수 있었다. 이러한 증폭은 시료내 미량의 항원을 정량하는 경우 유용한 방법으로 이용가능하다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명은 SPR을 이용한 정량법은 쉽고 간편하게 목적 단백질을 정량할 수 있고, 혈내 또는 뇨내의 특정 단백질, 특히 알파페토단백질, 융모고나도트로핀 또는 언컨쥬게이티드 에스트리올의 농도를 확인하여 특정질병의 발병 가능성을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 태아의 건강을 확인할 수 있다.

Claims

(a) 자기 조립 단분자층을 형성할 수 있는 티올(thiol)기 및 양이온을 인식하는 크라운 고리를 포함하는 자기 조립 단분자층(self assembled monolayer) 화합물을 표면 플라즈몬 층에 반응시켜 자기 조립 단분자층을 형성하는 단계;

(b) 알파페토단백질, 융모고나도트로핀 및 언컨쥬게이티드 에스트리올로 이루어진 군으로부터 선택된 다운 증후군 표지 단백질에 대한 항체를 상기 자기 조립 단분자층에 고정시키는 단계;

(c) 상기 고정된 항체에 알파페토단백질, 융모고나도트로핀 및 언컨쥬게이티드 에스트리올로 이루어진 군으로부터 선택된 다운 증후군 표지 단백질을 포함하는 시료를 반응시키는 단계;

(d) 표면 플라즈몬 층에 광을 조사하고, 굴절지수변화를 측정하는 단계; 및

(e) 알파페토단백질, 융모고나도트로핀 및 언컨쥬게이티드 에스트리올로 이루어진 군으로부터 선택된 표준화된 다운 증후군 표지 단백질의 양에 대한 굴절지수변화 관계를 이용하여 시료 중 다운 증후군 표지 단백질의 양을 환산하는 단계;

를 포함하는 다운 증후군 표지 단백질의 정량 방법.
제 1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 자기 조립 단분자층(self assembled monolayer) 화합물은 화학식 1로 표시되는 캘릭스[4]아렌-비스크라운(calix[4]aren-crown)-4, 화학식 2로 표시되는 캘릭스[4]아렌-크라운-5 및 화학식 3으로 표시되는 캘릭스[4]아렌-크라운-6으로 이루어진 군에서 선택된 단백질 정량방법;

(화학식 1)

상기 화학식 1에서, R1 내지 R4는 각각 -CH₂SH이거나, R1 내지 R4 중 2개가 서로 결합하여 각각 -CH₂-S-S-CH₂- 기를 형성할 수 있고,

(화학식 2)

상기 화학식 2에서,

n은 1이고,

R1 내지 R4는 각각 -CH₂SH 또는 R1 및 R3은 각각 -CH₂SH이고, R2 및 R4는 각각 H이고,

R5 및 R6은 각각 H, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 이소부틸로 이루어진 군으로부터 선택되며,

(화학식 3)

상기 화학식 3에서,

n은 2이고,

R1 내지 R4는 각각 -CH₂SH 또는 R1 및 R3은 각각 -CH₂SH이고, R2 및 R4는 각각 H이고,

R5 및 R6은 각각 H, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 이소부틸로 이루어진 군으로부터 선택됨.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 광은 LED(Light Emitting Diode)광원으로부터 발생된 800-850 nm의 파장을 조사하고, 포토다이오드 어레이(Photodiode array)로 반사광 을 검출하는 것인 단백질 정량방법.
제 4항에 있어서, 상기 LED 및 포토다이오드 어레이는 하나의 반도체 칩상에 구비되는 것인 단백질 정량방법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체인 것인 단백질 정량방법.
제 1항에 있어서, 상기 (c) 단계 이후에 신호를 증폭하기 위한 물질을 표면 플라즈몬 층에 반응시키는 단계를 더욱 포함하며, 상기 신호를 증폭하기 위한 물질은 알파페토단백질, 융모고나도트로핀 및 언컨쥬게이티드 에스트리올로 이루어진 군으로부터 선택된 다운 증후군 표지 단백질에 대한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체에서 선택된 단백질 정량방법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 (c) 단계이전에 시료에 신호를 증폭하기 위한 물질을 첨가하여 시료내 존재하는 목적단백질에 반응시키는 단계를 더욱 포함하며, 상기 신호를 증폭하기 위한 물질은 알파페토단백질, 융모고나도트로핀 및 언컨쥬게이티드 에스트리올로 이루어진 군으로부터 선택된 다운 증후군 표지 단백질에 대한 항체; 및 금속, 유기물질 및 무기물질로 이루어진 군에서 선택된 입자가 부착된 알파페토단백질, 융모고나도트로핀 및 언컨쥬게이티드 에스트리올로 이루어진 군으로부터 선택된 다운 증후군 표지 단백질에 대한 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 정량방법.
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