CN101561393A - 用表面等离子共振技术检测人血清肿瘤标志物的方法以及其中使用的芯片 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表面等离子共振技术在人血清肿瘤标志物检测中的用途，具体而言，本发明涉及将SPR技术用于人血清肿瘤标志物的临床检测和诊断。由此实现了多种血清肿瘤标志物的同时检测，并且显著提高了检测灵敏度及临床检测线性范围。另外，本发明也提供了可用于上述方法的SPR生物传感器芯片。

Description

用表面等离子共振技术检测人血清肿瘤标志物的方法以及其中使用的芯片

发明领域

本发明属于人血清肿瘤标志物检测领域。具体的，涉及一种用表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)检测人血清肿瘤标志物的方法，具体而言，本发明涉及将SPR技术用于人血清肿瘤标志物的临床检测和诊断。由此实现了多种血清肿瘤标志物的同时检测，并且显著提高了检测灵敏度及临床检测线性范围的方法。本发明也涉及用于上述方法的改良的SPR生物传感器芯片，以及包含该芯片和核酸探针的试剂盒。

背景技术

表面等离子体共振技术(SPR)是利用在金属膜/液面界面，由光的全反射引起的物理光学现象来分析分子间相互作用的技术。SPR仪由自动采样机械手、高分辨率的CCD照相仪和上面布有一个或多个流池的镀金或镀银SPR生物传感器芯片构成。SPR技术在检测、分析生物分子间的相互作用等方面得到广泛的应用。

SPR技术利用了能够在某些金属(特别是金、银)界面上激发产生的表面等离子波。当入射光以大于临界角的角度入射到金属界面上时，发生全反射，在合适的角度下，入射光的平行矢量与表面等离子波的频率相匹配时，发生共振，能量从入射光转移到表面等离子波中，反射光的反射率表现出急剧衰减(反射光强度最低时所对应的入射角称为“共振角”)。发生共振时的入射角或波长高度依赖于金属表面近表面的折射率。表面上的生物分子的结合会改变此处的折射率，从而引起发生共振的入射角的变化。

通过监测共振角的变化，可以实现实时检测传感芯片表面的生物分子间的相互作用。传统的SPR传感器测量完整的SPR曲线作为入射光角度或者波长的函数，这种模式应用广泛，但通量较低。而高通量的SPR仪可以通过成像系统实现同时检测成千上万个生物分子的相互作用。一个典型的SPR成像装置包括一个p偏振光源和一个随后接收来自SPR生物传感芯片的反射光的探测器。CCD照相仪以成像的方式来收集反射光强度。SPR成像检测以固定入射角的方式来检测时，光强度变化与由生物分子结合到表面后引起的折射率变化成比例。结果，引起的光暗度与结合到探测区的物质的量有关。另外影响SPR成像系统灵敏度的一个因素是光源强度。来自金属表面的信号强度与入射光强度成线性比例，因此相对于发光二极管和卤素灯，优先选择激光光源。

SPR仪是一种光学传感器，可以通过检测金膜近表面折射率的变化来检测金属表面生物分子的结合。对金属-水界面的探测深度在100-1000nm以内，这使得SPR成为一种比较理想的研究固定的生物分子与溶液中分析物质相互作用的工具。相对于传统技术如基于荧光或ELISA的技术，SPR技术有如下几个优点：1 因为检测的是折射率，所以分析物质无需任何标记(如放射性或荧光标记)而直接用于检测；2 检测能够实时进行，可以让用户收集动力学数据；3 SPR是一项通用技术，能够检测宽范围的具有不同分子量和亲和力的分析物质。因此，SPR技术是一种研究生物分子相互作用的有力工具。至今，在研究领域内，SPR技术已经用于研究蛋白-肽相互作用、蛋白-DNA相互作用，DNA杂交等。但目前SPR方法还未有用于临床检测及诊断的报道。

恶性肿瘤严重危害人类的健康，近年来多种恶性肿瘤的发病率及发病绝对人数皆有不断升高的趋势，并趋于年轻化。血液肿瘤标志物的检测是肿瘤诊断的常用方法之一，对于恶性肿瘤的诊断、疗效的观察、病情进展的判断和复发的监测等皆有一定的临床应用价值，并具有简便无创、测定结果定量客观、可重复测定以便动态监测、费用相对低廉等优点。

肿瘤标志物是癌细胞生长过程中产生的一种或几种正常情况下没有的或含量很低的特异性物质，或是宿主细胞因癌细胞入侵而过量产生的正常细胞组分。肿瘤标志物存在于组织、细胞、血液或体液中，可用生物化学、免疫学或分子生物学方法对其进行定性或定量检测，目前最常用的是酶联免疫吸附法(ELISA)和放射免疫分析法(RIA)。传统的肿瘤标志物检测方法操作繁琐，需要标记，多数不能同时检测多种肿瘤标志物。

与此相对，SPR技术能够提供非标记，高通量和在线的平行分析。鉴于这种现状，申请人首次将SPR技术应用于血清肿瘤标志物的临床检测及诊断。具体而言，申请人利用SPR技术对多种血清肿瘤标志物同时进行检测，针对每一种血清肿瘤标志物选择特异的单克隆抗体。同时申请人采用改进了的SPR传感芯片的包被技术和反应液的成分，显著提高了检测灵敏度及临床检测线性范围，使得临床应用SPR技术检测血液肿瘤标志物成为可能。通过不断的研究，申请人已经对CEA，CA125，CA19-9，CA242，CA15-3，CA724，CA50，AFP，Cyfre21-1，HCG，β-HCG，TPA，Fer，NSE，PSA，f-PSA，SCCA等多种肿瘤标志物进行了有效的检测。本发明的方法和芯片对肿瘤筛选和病程监测及指导治疗非常有用。进而，申请人首次发现可以将SPR作为同时检测多种肿瘤标志物的强有力工具。

附图说明

图1.PSA测定时的标准曲线，横坐标为PSA的浓度，纵坐标为对应的SPR检测的信号结果。

图2.HCG测定时的标准曲线，横坐标为HCG的浓度，纵坐标为对应的SPR检测的信号结果。

具体实施方式

本发明提供了下述检测人血清肿瘤标志物的SPR生物传感器芯片和使用表面等离子共振技术检测人血清肿瘤标志物的方法。

1.一种用于检测人血清肿瘤标志物的SPR生物传感器芯片，该芯片基质为玻璃片，玻璃片表面镀有金属膜，金属膜表面经化学修饰形成巯基烃类单分子层，并且巯基烃类的末端官能团与葡聚糖相连。

2.1的SPR生物传感器芯片，其中所述金属膜由选自铜、银、铝和金的金属构成，优选为金。

3.1或2的SPR生物传感器芯片，其中巯基烃类选自分子式为HS(CH₂)_mR和HS(CH₂)_nR’的混合巯基烃类、分子式为R(CH₂)_mS-S(CH₂)_nR’的不对称双烃基二硫化物和分子式为R(CH₂)_mS(CH₂)_nR’的不对称双烃基硫化物，其中n和m代表亚甲基单位的数目，其为8-16的整数，R和R’代表烃链的末端，其为-CH₃、-OH、-COOH或NH₂。

4.3的SPR生物传感器芯片，其中巯基烃类为巯基十一醇和巯基十六醇的混合巯基烃类、(CH₂)₁₁OH-S-S-(CH₂)₁₆OH或(CH₂)₁₁OH-S-(CH₂)₁₆COOH。

5.制备2所述的SPR生物传感芯片的方法，包括：

i.使用适当浓度的环氧氯丙烷与SAM反应生成环氧化合物；

ii.用葡聚糖溶液与固定了环氧氯丙烷的传感芯片表面反应形成葡聚糖修饰的表面；

iii.将前述修饰的芯片浸入适当浓度的溴乙酸溶液中反应使葡聚糖表面羧甲基化；

iv.把NHS和EDC的混合水溶液注射到葡聚糖修饰的传感芯片上进行表面活化；

v.在测试通道注入肿瘤标志物捕获物质，阴性对照通道注入阴性对照，联接配体，

vi.封闭活性位点。

6.一种使用表面等离子共振技术检测人血清肿瘤标志物的方法，包括步骤：

(1)用反应缓冲液处理血清样品；

(2)使反应缓冲液处理的血清样品流过包被肿瘤标志物单抗或配体的权利要求1的SPR生物传感器芯片表面，当生物大分子间发生特异性结合时可以引起传感器芯片表面折射率的改变；

(3)用SPR测定混合物流过芯片之前和之后相应流池的信号差值；和(4)根据上述信号差值，利用参考标准品绘制标准曲线而对血清肿瘤标志物进行定量检测。

7.6所述的方法，其中所述反应缓冲液含有但不限于：1％-10％小牛血清或牛血清白蛋白溶液，0.1-10mg/ml羧甲基葡聚糖溶液和含有1-10ug/ml胶体金标记的单克隆抗体。

8.6所述的方法，其中在将所述的血清样品和反应缓冲液用于SPR仪器反应时，采用静止或流动反应，流动反应时样品流速为5-50ul/min。

9.6所述的方法，所述步骤在温度为25℃的条件下进行。

10.6所述的方法，其中所述的用反应缓冲液处理血清样品是指抽取人静脉血，室温以1200转速离心10分钟，取上清液，用反应缓冲液将血清配制成上样液注入芯片进行检测。

11.6所述的方法，该方法用于同时检测多种血清肿瘤标志物，包括以下步骤：

(i)提供SPR系统，包括根据权利要求1-4所述的SPR生物传感器芯片，其包被有肿瘤标志物单抗和阴性对照蛋白；

(ii)提供一系列不同浓度的参考标准品，在与待测物质相同的条件下用(i)的系统制作标准曲线；

(iii)在SPR系统进样品之前记录一个SPR基线值，反应结束之后再记录一个SPR响应值，以反应前后的差值为待测血清肿瘤标志物的信号值；

(iv)根据标准曲线，得到每一反应信号值对应的浓度值。

具体地，一方面，本发明为了实现使用表面等离子共振技术(SPR)对多种肿瘤标志物进行同时检测，将肿瘤标志物特异单克隆抗体(如抗体等)包被在SPR传感芯片上，血液样品流过传感芯片表面，分子间发生特异性结合时可引起传感芯片表面折射率的改变，从而导致SPR信号的改变，通过检测SPR信号改变对血液肿瘤标志物进行定性，定量检测。

另一方面，本发明在反应缓冲液中加入胶体金标记的抗体，从而进一步提高了SPR检测灵敏度及检测范围。具体地，在反应缓冲液中含有1％-10％BSA(重量百分比)溶液和0.1-10mg/ml的羧甲基葡聚糖钠溶液及1-10ug/ml胶体金标记的放大抗体，此种缓冲液极大提高信噪比，降低非特异反应。其中BSA溶液的浓度优选为2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％；羧甲基葡聚糖钠溶液的浓度优选为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/ml；胶体金标记的放大抗体的浓度优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10ug/ml。

另一方面，本发明提供了一种SPR传感芯片，该芯片最内层为玻璃，玻璃表面镀上金属膜(可以是铜膜，银膜，铝膜或者金膜)形成裸金片。用强氧化剂或者等离子刻蚀法清洗裸金片，然后用超纯水和除气的乙醇清洗表面，接着将洁净的裸金片浸入巯基烃类化合物的乙醇溶液中，在洁净的金表面上形成巯基烃类的单种成分或混合成分的自组装单分子层(SAMs)。在合适的条件下用葡聚糖修饰SAMs表面暴露的的末端官能团(-OH，-COOH)。本发明中，申请人用环氧活化方法联接葡聚糖。具体讲，使用环氧氯丙烷与十一醇反应，生成环氧化合物，然后用葡聚糖与固定了环氧氯丙烷的传感器芯片表面反应，形成葡聚糖修饰的表面。为了能够更好的与配体反应，可通过使前面修饰的芯片与溴乙酸溶液反应将葡聚糖表面羧甲基化。将NHS和EDC的水溶液通过葡聚糖修饰的传感芯片，使SAMs表面的末端官能团重新暴露出来，从而使芯片表面被活化。注射PH值为弱酸性的特异单克隆抗体的醋酸缓冲液，以此反应来联接配体，最后以弱碱性的乙醇胺溶液封闭残存的活性位点。

一方面，经反应缓冲液处理的血液样品注入传感芯片表面，反应在SPR仪上进行，反应液包含放大信号和降低非特异反应的成分，反应温度25℃恒温。反应方式有两种：静止相和流动反应。静止反应即将上样液通到芯片上以后，上样液静止不流动。流动反应即上样液以5-50ul/min的流速流过芯片表面完成。反应后可使系统缓冲液以大于40ul/min的流速洗涤芯片表面清除非特异结合。反应信号以SPR角毫度(m°)或响应单元(RU)为单位，所有结果均为扣除阴性对照检测信号后的值。

另一方面，在SPR检测中固相配体的包被难达到各芯片之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。以检测物的浓度为横坐标，以信号差值为纵坐标，将各信号值进行线性回归，即标准曲线。进样品之前记录一个SPR基线值，反应之后再记录一个SPR基线值，反应前后的差值为某种血清肿瘤标志物的信号值。根据标准曲线，得到每一反应信号值对应的浓度值。所有结果均为扣除阴性对照检测信号后的值。

实施例

下面使用实例对本发明进行更直观详细的描述，但并不限制本发明的范围。

实施例一：传感芯片的制备

(一)直接偶联传感芯片的制备

1，传感芯片的葡聚糖修饰

a).裸金片的清洗

首先用强氧化剂(H₂SO₄:H₂O₂)或者等离子刻蚀法清洗裸金片，然后用超纯水和除气的乙醇清洗表面，之后以纯氮气流吹干。

b).自组装单分子层(SAMs)的制备

在洁净的金表面上形成巯基烃类的单种成分或混合成分的自组装单分子层(SAMs)，这种方式已经广泛用于化学或生物传感芯片的修饰。

在金表面制备SAMs的过程是：将洁净的裸金片浸入含1～10mM巯基烃类化合物的乙醇溶液中，室温下孵育12～18hr。

混合单分子层的合成有3个简便方法：

(1)混合烃基硫醇(HS(CH₂)_nR+HS(CH₂)_nR′)从溶液中的共吸附。

(2)不对称双烃基二硫化物(R(CH2)_mS-S(CH2)_nR’)的吸附。

(3)不对称双烃基硫化物(R(CH2)_mS(CH2)_nR’)的吸附，这儿n和m代表亚甲基单位的数目，R代表烃链的末端(-CH₃，-OH，-COOH，NH₂等)。

c).自组装单分子层(SAMs)的葡聚糖修饰

自组装单分子层形成后的修饰方法非常重要，因为这关系到表面是否能够有效引入具有生物学意义的复杂配基和大分子。在合适的反应条件下，SAMs表面暴露的的末端官能团(-OH，-COOH)，先联接反应中间体葡聚糖，然后再联接到配体分子上。

本发明中，申请人用环氧活化方法联接葡聚糖。具体讲，使用～1mol·L^-1环氧氯丙烷与十一醇反应4h，生成环氧化合物，然后用300mg/ml的葡聚糖与固定了环氧氯丙烷的传感表面在25℃下反应20h，形成葡聚糖修饰的表面。为了能够更好的与配体反应，葡聚糖表面需要羧甲基化：将前面修饰的芯片浸入1mol·L^-1溴乙酸溶液中反应16h即可。

2.肿瘤标志物单克隆抗体及阴性对照蛋白包被

在葡聚糖修饰的传感芯片上进行抗体的固定：把70ul含50mM NHS和200mM EDC的水溶液注射到葡聚糖修饰的传感芯片上进行表面活化后，再注射含有10-100ug/ml单克隆抗体(10mM，pH4.75)，阴性对照通道注入阴性对照蛋白(小鼠IgG10-100ug/ml)的醋酸钠缓冲液(10mM，pH4.75)，以此反应来联接配体，最后以70ul 1M乙醇胺溶液(pH 8.6)封闭残存的活性位点。

(二)间接偶联(生物素标记)传感芯片的制备

1.传感芯片的葡聚糖修饰。同上

2.链霉亲和素(SA)包被

在葡聚糖修饰的传感芯片上进行SA的固定：把70ul含50mM NHS和200mM EDC的水溶液注射到葡聚糖修饰的传感芯片上进行表面活化后，再注射含有40-200ug/ml SA的醋酸缓冲液(10mM，pH4.5)，以此反应来联接配体SA，最后以70ul 1M乙醇胺溶液(pH 8.6)封闭残存的活性位点。

3.生物素标记的单抗及阴性对照蛋白联接

反应在SPR仪上进行，分别以流速5ul/min注入100ul溶解在缓冲液(PBS)中的生物素标记的单抗(10-100ug/ml)及阴性对照蛋白(小鼠IgG10-100ug/ml)与传感芯片表面包被的链霉亲和素进行反应，这样生物素标记的蛋白就连接到了芯片上，可以在SPR仪器上进行下一步的样品检测。

实施例二：样本检测过程

1.试剂准备

系统缓冲液：HBS-EP，PBS  PH7.4，保存于4度冰箱。经除气、0.22um滤器过滤。

标准品制备：先用零值血清配置高浓度的标准品，然后根据实验系统的要求，用零值血清将高值血清稀释至应有的浓度，制成符合预定要求的，由不同浓度组成的系列标准品。

反应缓冲液：10％BSA，2mg/ml羧甲基葡聚糖钠，1-10ug/ml胶体金标记的抗体。经除气、0.22um滤器过滤。

2.在SPR仪上进行检测

反应在SPR仪上进行，流速5ul/min，温度25℃。先检测一组标准品(5个浓度)，反应信号以SPR角毫度(m°)为单位，以扣除阴性对照检测信号后的值作为结果。根据反应信号绘制标准曲线，每次检测后用甘氨酸-盐酸(PH1.5-3.0)再生芯片表面，流速不低于40ul/min。

将血清与反应缓冲液(5％BSA，1mg/ml羧甲基葡聚糖，5ug/ml胶体金标记抗体)依照一定比例(1∶5-1∶10)混合，孵育30min，取100ul注入传感器芯片表面。然后以大于40ul/min流速注入一定体积的洗涤液(不含样本的盐溶液或水，本步骤为备选)，进行反应后的洗涤。也可不洗脱。反应信号以SPR角毫度(m°)为单位。根据标准曲线，得到与每一反应信号值对应的浓度值。所有值均为扣除阴性对照检测信号后的值。

具体试验步骤

实例1

a)配体包被

激活芯片表面：注入新鲜配制的0.2M EDC/0.05M NHS 5ul/min30min。升高20毫度。

配体包被：注入20ug/ml PSA单克隆抗体溶于10mM醋酸钠缓冲溶液(PH4.75)5ul/min 30min。升高1100毫度。

封闭：注入1M乙醇胺盐酸5μl/min 30min。降低100毫度。

最终包被量为1000毫度。

b)检测物分析

绘制标准曲线：读取系统缓冲液基线，然后分别注入100μl 0，0.625，2.5，5，25，250μg/L的PSA Ag的五个标准品，注入标准品至反应结束后3分钟读取系统缓冲液基线，计算两者差值得到与标准品浓度对应的毫度值，绘制标准曲线，如图1所示。

检测样品：读取系统缓冲液基线，然后注入100μl处理后的HCG阳性血清样品，注入样品至反应结束后3分钟读取系统缓冲液基线，计算两者差值得到与样品浓度对应的毫度值

实例2：

a)配体包被

激活芯片表面：注入新鲜配制的0.2M EDC/0.05M NHS 5ul/min30min。升高20毫度。

配体包被：注入20ug/ml HCG单克隆抗体溶于10mM醋酸钠缓冲溶液(PH4.75)5ul/min 30min。升高1100毫度。

封闭：注入1M乙醇胺盐酸5μl/min 30min。降低100毫度。

最终包被量为1000毫度。

b)检测物分析

绘制标准曲线：读取系统缓冲液基线，然后分别注入100μl 0，2.5，5，10，20，40μg/L的HCG Ag的六个标准品，注入标准品至反应结束后3分钟读取系统缓冲液基线，计算两者差值得到与标准品浓度对应的毫度值，绘制标准曲线，如图2所示。

检测样品：读取系统缓冲液基线，然后注入100μl处理后的HCGAg血清样品，注入样品至反应结束后3分钟读取系统缓冲液基线，计算两者差值得到与样品浓度对应的毫度值

3.结果判读

读取扣除阴性对照系统缓冲液基线，然后注入样品至反应结束后3分钟读取扣除阴性对照系统缓冲液基线，计算两者差值得到与样品浓度对应的毫度值。根据标准曲线，得到每一反应信号值对应的浓度值。所有结果均为扣除阴性对照检测信号后的值。

附录

简写        英文名称                              中文名称

AFP         Alpha fetoprotein                     α胎儿蛋白

Calcitonin  Calcitonin                            降钙素

CA125       Carbohydrate antigen 125              糖链抗原125

CA19-9      Carbohydrate antigen 19-9             糖链抗原19-9

CA242       Carbohydrate antigen 242              糖链抗原242

CA15-3      Carbohydrate antigen 15-3             糖链抗原15-3

CA724       Carbohydrate antigen 724              糖链抗原724

CA50        Carbohydrate antigen 50               糖链抗原50

CEA         Carcinoembryonic antigen              癌胚抗原

Cyfre21-1   Fragment of cytokeratin               细胞角蛋片段

E3          Estrogen3                             雌激素3

Fer         Ferritin                              铁蛋白

β-HCG      Bata-human chorionic gonadotrophin    β-人绒促性素

NSE         Neuron specific enolase               神经元特异性烯醇酶

PAPP-A      Pregnant associate plasma protein A   妊娠伴随血浆蛋白A

PSA         Prostatic Specific Antigen            前列腺特异性抗原

f-PSA       free Prostatic Specific Antigen       游离前列腺特异性抗原

SCCA        Squamous cell carcinoma antigen       鳞状上皮细胞癌抗原

TPA         Tissue polypeptide antigen            组织多肽抗原

参考文献：

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Claims (11)

1.一种用于检测人血清肿瘤标志物的SPR生物传感器芯片，该芯片基质为玻璃片，玻璃片表面镀有金属膜，金属膜表面经化学修饰形成巯基烃类单分子层，并且巯基烃类的末端官能团与葡聚糖相连。

2.权利要求1的SPR生物传感器芯片，其中所述金属膜由选自铜、银、铝和金的金属构成，优选为金。

3.权利要求1或2的SPR生物传感器芯片，其中巯基烃类选自分子式为HS(CH₂)_mR和HS(CH₂)_nR’的混合巯基烃类、分子式为R(CH₂)_mS-S(CH₂)_nR，的不对称双烃基二硫化物和分子式为R(CH₂)_mS(CH₂)_nR，的不对称双烃基硫化物，其中n和m代表亚甲基单位的数目，其为8-16的整数，R和R’代表烃链的末端，其为-CH₃、-OH、-COOH或NH₂。

4.权利要求3的SPR生物传感器芯片，其中巯基烃类为巯基十一醇和巯基十六醇的混合巯基烃类、(CH₂)₁₁OH-S-S-(CH₂)₁₆OH或(CH₂)₁₁OH-S-(CH₂)₁₆COOH。

5.制备权利要求2所述的SPR生物传感芯片的方法，包括：

i.使用适当浓度的环氧氯丙烷与SAM反应生成环氧化合物；

ii.用葡聚糖溶液与固定了环氧氯丙烷的传感芯片表面反应形成葡聚糖修饰的表面；

iii.将前述修饰的芯片浸入适当浓度的溴乙酸溶液中反应使葡聚糖表面羧甲基化；

iv.把NHS和EDC的混合水溶液注射到葡聚糖修饰的传感芯片上进行表面活化；

v.在测试通道注入肿瘤标志物捕获物质，阴性对照通道注入阴性对照，联接配体，

vi.封闭活性位点。

6.一种使用表面等离子共振技术检测人血清肿瘤标志物的方法，包括步骤：

(1)用反应缓冲液处理血清样品；

(2)使反应缓冲液处理的血清样品流过包被肿瘤标志物单抗或配体的权利要求1的SPR生物传感器芯片表面，当生物大分子间发生特异性结合时可以引起传感器芯片表面折射率的改变；

(3)用SPR测定混合物流过芯片之前和之后相应流池的信号差值；和(4)根据上述信号差值，利用参考标准品绘制标准曲线而对血清肿瘤标志物进行定量检测。

7.权利要求6所述的方法，其中所述反应缓冲液含有但不限于：1％-10％小牛血清或牛血清白蛋白溶液，0.1-10mg/ml羧甲基葡聚糖溶液和含有1-10ug/ml胶体金标记的单克隆抗体。

8.权利要求6所述的方法，其中在将所述的血清样品和反应缓冲液用于SPR仪器反应时，采用静止或流动反应，流动反应时样品流速为5-50ul/min。

9.权利要求6所述的方法，所述步骤在温度为25℃的条件下进行。

10.权利要求6所述的方法，其中所述的用反应缓冲液处理血清样品是指抽取人静脉血，室温以1200转速离心10分钟，取上清液，用反应缓冲液将血清配制成上样液注入芯片进行检测。

11.权利要求6所述的方法，该方法用于同时检测多种血清肿瘤标志物，包括以下步骤：

(i)提供SPR系统，包括根据权利要求1-4所述的SPR生物传感器芯片，其包被有肿瘤标志物单抗和阴性对照蛋白；

(ii)提供一系列不同浓度的参考标准品，在与待测物质相同的条件下用(i)的系统制作标准曲线；

(iii)在SPR系统进样品之前记录一个SPR基线值，反应结束之后再记录一个SPR响应值，以反应前后的差值为待测血清肿瘤标志物的信号值；

(iv)根据标准曲线，得到每一反应信号值对应的浓度值。

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