KR100879206B1 - 변형 흐름식 표면 플라즈몬 공명 바이오센서를 이용한실시간 병원성 미생물 검출 방법 - Google Patents

변형 흐름식 표면 플라즈몬 공명 바이오센서를 이용한실시간 병원성 미생물 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 i) 병원성 미생물과 이에 대한 항체를 회분식으로 면역 반응시키는 단계; ii) 상기 항체와 결합된 병원성 미생물을 선택적 분리하는 단계; 및 iii) 상기 항체와 결합된 병원성 미생물을 흐름식 표면 플라즈몬 공명(SPR)시스템 칩 상에 실시간으로 결합시키는 단계를 포함하는, 변형 흐름식 SPR 바이오센서를 이용하는 병원성 미생물의 실시간 검출 방법에 관한 것이다.
흐름식 SPR시스템 칩, 회분식 면역 반응, 바이오틴-스트렙트아비딘 결합

Description

변형 흐름식 표면 플라즈몬 공명 바이오센서를 이용한 실시간 병원성 미생물 검출 방법{METHOD OF REAL TIME DETECTION OF PATHOGENIC MICROORGANISM USING THE MODIFIED FLOW TYPE SURFACE PLASMON RESONANC BIOSENSOR}
도 1a는 병원성 미생물 검출을 위한 기존의 흐름식 SPR 바이오센서(flow type SPR biosensor)의 개념도이다.
도 1b는 본 발명에서 개발된 변형 흐름식 SPR 바이오센서(modified flow type SPR biosensor)의 개념도이다.
도 2는 수인성 병원균 크립토스포리디움 파르붐(Cryptosporidium parvum) 난포낭(oocyst)의 실시간 검출을 위하여 변형 흐름식 SPR 바이오센서에서 병원균 검출 결과를 SPR 센서그램(sensorgram)의 변화로 도시한 그래프이다.
도 3은 수인성 병원균 크립토스포리디움 파르붐 난포낭의 실시간 검출에서 기존의 흐름식 SPR 바이오센서와 본 발명의 변형 흐름식 SPR 바이오센서에 의한 검출 한계능을 비교하여 도시한 그래프이다.
본 발명은 병원성 미생물의 실시간 검출을 위한 변형 흐름식 SPR 바이오센서를 이용하는 병원성 미생물의 실시간 검출 방법에 관한 것으로, 기존의 흐름식 SPR 센서에서 면역 반응과 표면 결합 반응을 분리시켜서 실시간 SPR 센서의 병원성 미생물 검출 한계능을 증대시키는 것에 관한 것이다.
산업이 발달함에 따라 다양한 환경오염 사고로부터 인류가 노출되면서 건강과 위생상의 심각한 문제에 직면하기에 이르렀다. 여러 가지 환경오염 사고 중 식수에서 빈번히 발생하고 있는 문제는 바로 병원성 미생물에 의한 감염사고이다. 과거와 비교하여 수인성 전염병의 감염사고가 현저히 줄어들고 있으나, 아직 세계 어느 나라에서도 수인성 전염병을 근절하지는 못하고 있는 실정이다. 수인성 전염병에 의한 오염이 심각한 문제를 일으키는 점은 바로 단기간에 있어서 그 유해효과가 나타난다는 점이다. 화학물질에 의해 수질오염사고가 발생할 경우, 오랜 세월에 걸쳐 누적되어 나타나는 만성적인 질병을 유발하게 되는 반면, 수인성 병원균에 의한 오염사고는 급성질병을 유발하여 단기간에 결과가 나타나고 2차 감염에 의한 확산의 우려가 있기 때문에 예방이 매우 중요하다. 따라서 수질 내에 존재하는 병원성 미생물의 존재여부를 미리 검출할 수 있다면, 이러한 수인성 질병을 미연에 방지할 수 있을 것으로 기대된다.
현재 병원성 미생물의 검출 및 감시 방법으로 면역 형광법, 특히 ELISA 법과 PCR 증폭을 통한 유전자 검출법 등이 다양한 응용 원리를 기반으로 하여 많이 개발되고 있으며, 이미 상용화된 제품도 다량 존재한다. 그러나 이러한 방법들은 현재까지 병원성 미생물 방법 중에서 검출능은 우수한 편이나 시료의 전 처리 및 장시간의 면역 반응 등의 단점이 존재하여 새로운 형태의 병원성 미생물 검출 면역 센 서의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
기존 병원성 미생물 센서들의 단점을 극복하고자 최근 많은 연구자들에 의해 실시간 검출 및 비표지 센서(label-free sensor) 기능을 지닌 표면 플라즈몬 공명(Surface plasmon resonance) 시스템을 이용한 병원성 미생물 검출용 센서들이 활발히 개발되고 있다.
특히 SPR 센서 기술은 단백질과 같은 생체물질이 센서 표면에 결합될 경우 신호 변화를 일으키는 현상을 이용하여 바이오센서 및 바이오칩 측정방법으로 많이 이용되고 있다(문헌[Nice, E.C. and Catimel, B., BioEssay, 1999, 21, 339-352]). 표면 플라즈몬이란 금속 표면과 같은 도체 표면을 따라서 전파되는 자유전자의 양자화된 진동이다. 이와 같은 표면 플라즈몬은 프리즘과 같은 유전매체를 지나 유전 매체의 임계각 이상의 각도로 금속박막에 입사하는 입사광에 의해 여기되며, 일정한 각도에서 공명을 일으킨다. 이러한 SPR이 일어나는 입사각, 즉 공명각은 금속 박막에 근접한 물질의 굴절률 변화에 민감하다. SPR 센서는 이러한 성질을 이용하여 금속 박막에 근접한 물질, 즉 시료의 굴절률 변화로 부터 시료의 정량 분석, 정성 분석 및 박막인 시료의 두께를 측정하는데 이용된다. 이러한 SPR 센서는 전통적인 면역분석법에 비해 다음과 같은 여러 가지 장점을 가진다. 첫째, 특이성(specificity)면에서 기존의 면역분석법은 측정을 위해 특정한 표지물질(발광체 또는 형광체)이나 이차 항체(secondary antibody)를 사용해야 하는데, 그로 인해 측정 대상 시료의 활성이나 본래 성질이 변질되는 현상이 초래되었다. 하지만 SPR 센서는 특정물질의 표지나 전처리가 필요하지 않기 때문에 측정대상 시료 고유의 성질을 유지하면서 측정을 할 수 있다는 장점이 있다. 둘째, 감도(sensitivity)면에서 전통적인 면역분석법은 단백질 기준으로 그 검출한계가 보통 수 십 ng에서 수 ug 단위에 불과하지만, SPR 센서는 수 pg 단위까지 검출이 가능한 뛰어난 감도를 가지고 있다. 셋째, 측정 시간 면에서 전통적인 면역분석법은 시료의 전처리를 시작으로 해서 보통 짧게는 몇 시간, 길게는 며칠 이상이 지나야 그 결과를 얻을 수 있었다. 하지만 SPR 센서는 시료의 특별한 전처리가 필요 없기 때문에 수 분 내지 수 십분 내에 그 결과를 얻을 수 있는 신속성을 가지고 있다. 마지막으로 분석절차의 간소화 (simplicity)이다. 보통의 면역분석법은 고도로 숙련된 인력이 필요하며, 실험 절차상으로도 복잡한 시료 전처리 단계가 포함되어 있다. 하지만 SPR 센서는 시료의 센서 칩 상으로의 주입 하나로 그 결과를 얻을 수 있다는 점에서 종래의 면역분석법에 비해 분석절차 면에서 상당히 간소하다는 장점이 있다.
그러나, 병원성 미생물을 검출하기 위한 면역 반응은 단백질간의 상호 면역 반응과는 달리 그 면역 반응 속도가 느리고, SPR의 신호 증폭 특성상 검출 신호가 약하게 측정되어 기존의 단백질 검출용 SPR 센서와 같은 흐름식 방식을 적용하여 병원성 미생물 검출용 센서로 사용하기에는 어려움이 있었다. 그로 인해 현재 개발된 대부분의 병원성 미생물 검출용 SPR 센서는 흐름식 방식이 아닌 회분식 방식을 따르고 있으며, 결국 이러한 회분식 센서 방식의 적용은 앞서 언급한 SPR 센서의 큰 장점중의 하나인 짧은 분석 시간에 의한 검출의 신속성 실현에 문제점을 가지고 있다. 따라서 기존 병원성 미생물 검출용 SPR 센서에 신속성을 부여하여 실시간 검출용 SPR 센서로 사용하기 위해서는 변형된 흐름식 SPR 센서 시스템을 이용 한 검출 방법이 제시되어야 할 것이다.
본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 변형된 흐름식 SPR 바이오센서를 이용하여 병원성 미생물을 실시간 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 병원성 미생물을 실시간으로 검출하는 방법으로서, i) 병원성 미생물과 이에 대한 항체를 회분식으로 면역 반응시키는 단계; ii) 상기 항체와 결합된 병원성 미생물을 선택적 분리하는 단계; 및 iii) 상기 항체와 결합된 병원성 미생물을 흐름식 표면 플라즈몬 공명(SPR) 시스템 칩 상에 실시간으로 결합시키는 단계를 포함하는, 변형 흐름식 SPR 바이오 센서를 이용하는 병원성 미생물의 실시간 검출 방법을 제공한다. 이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 변형 흐름식 SPR 바이오센서을 이용하여 병원성 미생물을 실시간으로 검출하기 위한 방법에 관한 것이다. 병원성 미생물 검출하기 위하여 SPR 센서의 가장 큰 특징이자 장점인 비 표지형 실시간 검출을 흐름식 SPR 센서 시스템을 기본형으로 하여 본 발명의 기술을 적용하였다. 미생물 검출에 있어서 흐름식 SPR 센서는 비 표지형 실시간 검출의 장점을 가질 수 있으나, 다른 병원성 미생물 검출용 센서들에 비하여 그 측정원리로 인하여 병원성 미생물의 검출능력 또는 측정 한계의 단점을 가진다. 즉 병원성 미생물과 이에 대한 항체 사이의 면역 반응은 단 백질간의 일반적인 상호 면역 반응과는 달리 그 면역 반응 속도가 느리고, SPR의 신호 증폭 특성상 검출 신호가 약하게 측정되어 기존의 단백질 검출용 SPR 센서와 같은 흐름식 방식을 적용하여 병원성 미생물 검출을 위한 센서로 사용하기에는 어려움이 있다. 따라서 본 발명에서 이러한 흐름식 SPR 센서의 문제점을 극복하여 실시간 병원성 미생물 검출용 SPR 센서로서 병원성 미생물의 면역 반응 효율 및 칩 표면상의 결합 효율을 증대시킨 변형 흐름식 SPR 바이오센서를 이용한 상기 미생물의 검출 방법을 개발하였다.
통상의 병원성 미생물 검출용 흐름식 SPR 바이오센서 시스템의 구성 (도 1a)은 SPR 측정용 금 박막 칩 표면위에 최적의 리간드를 표면에 형성하고, 그 위에 병원성 미생물에 특이적 면역 반응성을 지닌 항체를 고정화시켜서 최종 표면을 형성한다. 그리고 나서 미생물이 포함된 시료를 흐름식으로 연속 주입하여 칩 표면을 통과하는 동안 칩 표면의 항체와 시료중의 병원성 미생물 세포 표면의 항원에 대한 면역 반응이 일어나고 그 항원-항체 결합에 의해 병원성 미생물들이 칩 표면에 결합된다. 이때 SPR 신호 (RU 값)가 증가하게 되고 이를 증폭하여 미생물을 검출한다. 그러나 이 과정에서 표면에 고정화된 항체보다 시료의 병원성 미생물 크기가 상대적으로 훨씬 크므로 SPR 시스템의 유체 흐름 속에서 면역 반응에 의한 미생물의 항체에 대한 결합 효율이 낮게 나타난다. 결국 비효율적 면역 반응 및 표면 고정화로 인하여 병원성 미생물의 검출 한계는 높은 수준으로 형성될 수밖에 없다.
이러한 흐름식 SPR 센서의 구조적 문제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 항체와 병원성 미생물간의 면역 반응과 미생물의 SPR 칩 상 고정화 단계를 각각 분리하여 변형 흐름식 SPR 바이오센서 시스템 (도 1b)을 이용한 미생물의 검출 방법을 제공한다. 즉 이동상의 흐름 내에서 이루어졌던 병원성 미생물과 이에 대한 항체의 면역 반응을 십여 분의 짧은 시간동안 시험관 환경내에서 회분식으로 실시하고, 차수막(cut-off membrane) 필터를 이용하여 항체 결합된 병원성 미생물을 선택적 분리한 후에, 상기 항체와 결합된 병원성 미생물을 흐름식 SPR 시스템의 칩 상에 실시간으로 결합시켜서 최종적으로 시료의 검출 신호로 병원성 미생물을 검출한다.
일 구체예에서, 상기 병원성 미생물에 대한 특이적 항체는 바이오틴이 결합되어 있고, 선택적 분리 단계는 항체와 결합된 병원성 미생물을 차수막(cut-off membrane) 필터를 이용하여 선택적으로 분리할 수 있으며, 상기 흐름식 SPR 시스템 칩 표면은 스트렙트아비딘의 연속 주입을 통하여 스트렙트아비딘 층이 형성되고, 항체와 결합된 병원성 미생물은 흐름식 SPR 시스템의 스트렙트아비딘 칩 표면상에서 바이오틴-스트렙트아비딘 반응을 통해 결합된다. 이러한 바이오틴-스트렙트아비딘 결합은 결합 친화도가 매우 높은 것으로 알려진 대표적 짝 물질로서 다양한 생물학적 분석 방법에서 널리 사용되고 있다. 즉 상대적으로 느린 특성을 가지는 면역 반응에 의한 미생물의 칩 표면상 고정화를 높은 친화성을 지닌 바이오틴-스트렙트아비딘 결합을 이용함으로써 흐름식 SPR 시스템에서 칩 상에서 발생되는 SPR 신호를 실시간 및 연속적으로 수집하여 병원성 미생물 검출 신호로 사용할 수 있다. 이러한 방법은 미생물의 SPR 칩 표면상에 고정화 효율을 높이고, 최종적으로 현저하게 증가된 SPR 신호를 획득할 수 있게 한다.
일 구체예에서, 검출 표적 병원성 미생물에 따라서 면역 반응의 조건(반응온도, 반응시간 등) 및 차수막(cut-off membrane) 필터의 조건(공극 크기 등)을 변경시킬 수 있다.
또한, 일 구체예에서, 변형 흐름식 SPR 바이오센서를 통하여 수인성 병원균을 실시간으로 검출할 수 있고, 상기 수인성 병원균은 크립토스포리디움(Cryptosporidium parvum) 균을 포함한다.
또한, 일 구체예에서, 변형 흐름식 SPR 바이오센서를 통하여 병원성 바이러스를 실시간으로 검출할 수 있고, 상기 병원성 바이러스는 헤르페스바이러스, 폭스바이러스, 간염바이러스, 피코르나바이러스, 로타바이러스, 인플루엔자바이러스, 파라믹소바이러스, 풍진바이러스, 광견병 바이러스, 지발바이러스, 종양바이러스 및 HIV 바이러스로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 일 구체예에서, 변형 흐름식 SPR 바이오센서를 통하여 미생물의 개체수를 정량화할 수 있다.
일 구체예에서, 상기에서 상술한 병원성 미생물 검출용 흐름식 및 변형 흐름식 SPR 바이오센서 시스템에 사용된 SPR 측정용 금 박막 칩의 표면에 금 코팅된 유리 표면위에 티올 말단기 (thiol terminated group, -SH)의 자기 조립단 분자막 (self assembled monolayer)을 형성시키고, 그 위에 항체 또는 검출 표적물 등의 생물 관련 분자 물질들을 결합시킬 수 있는 리간드 물질 (특히 스트렙트아비딘)을 고정화시킬 수 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
여러 가지 병원성 미생물 중에서 특히 크립토스포리디움 파르붐(Cryptosporidium parvum, 미국 Waterborne Inc.로부터 구매, Cat. No. P102C)은 정수 공정상의 소독 과정에서도 난포낭 형태로 변환되어 높은 소독 저항성을 가진다. 따라서 보다 철저한 수질 관리가 필요한 수인성 병원균으로 판단되므로, 크립토스포리디움의 검출을 본 발명의 우선 실시예로 선정하였다.
병원성 미생물 검출용 변형 흐름식 SPR 바이오센서 시스템 (도 1b)에 사용된 SPR 측정용 금 박막 칩의 표면은 금 표면위에 혼합 알칸티올 용액을 이용하여 자기조립단분자막을 형성하여 제조하였고, 제조된 칩을 흐름식 SPR 센서 시스템에 설치하였다.
크립토스포리디움 난포낭 시료를 각각 102 개체/㎖, 103 개체/㎖, 104 개체/㎖ 및 106 개체/㎖ 농도로 준비하였으며, 각각의 크립토스포리디움 시료들을 크립토스포리디움 항체 (Waterborne Inc, USA)들과 면역 반응시키기 위하여 37℃ 환경에서 30 분간 배양하였다. 이때 크립토스포리디움 항체들은 바이오틴이 접합된 바이오틴-항체를 사용하였다. 면역 반응이 완료된 후, 공극 크기 0.2 ㎛의 차수막 필터(미국 Millipoer 사로부터 구매, Cat. No. UFC30GV25, 친수성 폴리비닐리덴 플루오라이드)를 이용하여 시료들을 5 분간 원심분리하여 면역 반응에 관여하지 않은 항체들을 제거하고 바이오틴-항체가 접합된 크립토스포리디움 세포들만을 획득하였다.
면역 반응이 완료된 크립토스포리디움 세포들을 흐름식 SPR 센서 시스템에서 검출하기 위해 우선 바이오틴의 리간드인 스트렙트아비딘을 흐름식 시스템 내에서 고정화시켰다. 이때 스트렙트아비딘을 5 ㎕/min의 속도로 14분간의 주입하여 칩 표면에 고정화시켰다. 효과적으로 형성된 스트렙트아비딘 표면상에 제조된 바이오틴-항체 접합 크립토스포리디움 시료들을 2 ㎕/min의 속도로 10분간의 주입하여 칩 표면에서의 결합을 유도하였고, 이때 얻어진 SPR 신호를 통해 크립토스포리디움 세포들의 검출을 확인할 수 있었으며(도면 2), 또한 이의의 정량화도 실현할 수 있었다 (도면 3).
비교예
병원성 미생물 검출용 흐름식 SPR 바이오센서 시스템 (도 1a)을 이용하여 크립토스포리디움 세포들의 검출을 시도하였다. SPR 시스템에 사용된 금 박막 칩의 표면 형성 및 제조된 칩의 설치 방법은 실시예 1과 동일하게 하였다. 비교 실험에 사용할 크립토스포리디움 난포낭을 각각 106 개체/㎖, 107 개체/㎖ 및 108 개체/㎖ 농도로 준비하고, 면역 검출에 사용한 크립토스포리디움 항체는 실시예 1과 동일한 것을 사용하였다.
크립토스포리디움 항체와의 면역 반응을 통한 크립토스포리디움 세포들을 흐름식 SPR 센서 시스템에서 검출하기 위하여, 바이오틴 접합된 항체의 리간드인 스트렙트아비딘의 표면을 실시예 1과 동일한 방법으로 흐름식 시스템 내에서 고정화시켰다. 효과적으로 형성된 스트렙트아비딘 표면위에 제조된 바이오틴-항체를 5 ㎕/min의 속도로 10분간의 주입하여 고정화시켰다. 마지막으로 농도별 크립토스포리디움 시료들을 2 ㎕/min의 속도로 10분간의 주입하여 칩 표면에서의 면역 결합을 유도하였고, 이때 얻어진 SPR 신호를 통해 크립토스포리디움 세포들의 검출능을 분석하였다 (도면 3).
상기 실시예 1 및 비교예 1의 방법에 따른 크립토스포리디움 세포들의 검출 결과를 도 3에 각각 상세히 비교하여 나타내었다. SPR 센서 시스템을 이용한 크립토스포리디움 세포들의 실시간 검출에서 기존의 단백질 분석에서 널리 사용되는 흐름식 SPR 센서 시스템에 비해 본 발명에서 제시된 변형 흐름식 SPR 센서 시스템이 크립토스포리디움 세포들의 검출능을 크게 향상시킬 수 있음을 알 수 있다. 또한 현재 많이 제시되고 있는 회분식 미생물 검출 SPR 센서의 미생물 검출 한계와 비교했을 때, 본 발명의 센서 기술은 동일한 수준의 검출능을 나타낼 뿐만 아니라 앞에서 제시한 흐름식 SPR 센서 시스템의 장점들을 그대로 유지할 수 있는 병원성 미생물 검출 방법임을 알 수 있다.
이상의 설명은 본 발명을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 실시예들은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 사상과 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
이상에서 설명한 것과 같이, 본 발명은 비 표지형 실시간 검출 (non-labeled real time detection)법으로서 기존의 흐름식 SPR 센서 시스템을 이용한 미생물의 검출방법와 비교해 볼때, 변형 흐름식 SPR 센서 시스템을 이용하여 낮은 농도의 크립토스포리디움(Cryptosporidium parvum) 균을 포함하는 수인성 병원균의 검출능을 크게 향상시킬 수 있었다.

Claims (15)

  1. 수질 내에 존재하는 병원성 미생물을 실시간으로 검출하는 방법으로서,
    i) 상기 병원성 미생물과 이에 대한 항체를 회분식으로 면역 반응시키는 단계;
    ii) 상기 항체와 결합된 병원성 미생물을 선택적으로 분리하는 단계; 및
    iii) 상기 항체와 결합된 병원성 미생물을 흐름식 표면 플라즈몬 공명(SPR)시스템 칩 상에 실시간으로 결합시키는 단계를 포함하는, 변형 흐름식 SPR 바이오센서를 이용하는 병원성 미생물의 실시간 검출 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 병원성 미생물에 대한 특이적 항체가 바이오틴 접합됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 ii) 단계가 차수막(cut-off membrane) 필터를 이용함을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 흐름식 SPR 시스템 칩 표면이 스트렙트아비딘의 연속 주입을 통하여 스트렙트아비딘 층이 형성됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 항체와 결합된 병원성 미생물이 흐름식 SPR 시스템의 스트렙트아비딘 칩 표면상에서 바이오틴-스트렙트아비딘 반응을 통해 결합됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 결합된 병원성 미생물의 흐름식 SPR 시스템에서 칩 상에서 발생되는 SPR 신호를 실시간 및 연속적으로 수집하여 병원성 미생물 검출함을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 검출 표적 병원성 미생물에 따라서 반응온도, 반응시간 및 차수막(cut-off membrane) 필터의 공극 크기를 변경함을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 변형 흐름식 SPR 바이오센서 시스템이 SPR 측정용 금 박막 칩의 표면을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 금 박막 칩의 표면에 금 코팅된 유리 표면위에 티올 말단기(thiol terminated group, -SH)의 자기 조립단 분자막(self assembled monolayer)이 형성되고, 이 위에 스트렙트아비딘이 고정화됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 삭제
  11. 제 1항에 있어서, 병원성 미생물이 크립토스포리디움 파르붐(Cryptosporidium parvum)임을 특징으로 하는 방법.
  12. 삭제
  13. 수질 내에 존재하는 병원성 바이러스를 실시간으로 검출하는 방법으로서,
    i) 상기 병원성 바이러스와 이에 대한 항체를 회분식으로 면역 반응시키는 단계;
    ii) 상기 항체와 결합된 병원성 바이러스를 선택적으로 분리하는 단계; 및
    iii) 상기 항체와 결합된 병원성 바이러스를 흐름식 표면 플라즈몬 공명(SPR)시스템 칩 상에 실시간으로 결합시키는 단계를 포함하는, 변형 흐름식 SPR 바이오센서를 이용하는 병원성 바이러스의 실시간 검출 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 병원성 바이러스가 헤르페스바이러스, 폭스바이러스, 간염바이러스, 피코르나바이러스, 로타바이러스, 인플루엔자바이러스, 파라믹소바이러스, 풍진바이러스, 광견병 바이러스, 지발바이러스, 종양바이러스 또는 HIV 바이러스로 구성된 군 중의 하나로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항 또는 제 13항에 있어서, 검출방법은 병원성 미생물 또는 병원성 바이러스의 개체수를 정량화함을 특징으로 하는 방법.
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