KR102550375B1 - 바이오 센서 및 그 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 출원은 표적 물질의 검출 민감도가 향상된 바이오 센서에 관한 것이다. 본 출원은 또한 검출 민감도가 향상된 바이오 센서의 제조 방법에 관한 것이다. 본 출원은 또한 상기 바이오 센서를 이용한 표적 물질 검출 방법에 관한 것이다.

Description

바이오 센서 및 그 제조 방법{Biosensor and Preparation Method There of}
본 출원은 바이오 센서 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
면역분석법은 항원-항체 결합 반응을 기반으로 하는 분석방법이다. 상기 면역 분석법 중 대표적인 형태는 효소결합면역흡착제 검정법(Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)으로서 가장 보편적으로 사용되어온 면역진단 방법이다.
상기 효소결합면역흡착제 검정법은 일반적으로 표면 처리된 기판에 항체를 고정하여 표적 물질을 검출한다. 한편 기판의 표면 처리 방법은 표면에 처리될 물질이 포함된 용액에 기판을 담그는 액상 공정이 이용된다. 그러나 액상 공정의 경우 수행하기 쉽다는 장점이 있는 반면, 기판의 표면 처리가 다소 불균일하게 이루어지고 처리된 물질의 밀도가 낮다는 단점을 지닌다. 그 결과 기판에 고정시킨 항체의 밀도가 낮아지고 불균일하여 바이오 센서의 표적 물질의 검출 민감도가 저하되는 문제가 있었다.
이에, 표적 물질의 검출 민감도가 향상된 바이오 센서가 요청된다.
본 출원의 목적은 표적 물질의 검출 민감도가 향상된 바이오 센서를 제공하는 것이다. 본 출원의 또 따른 목적은 검출 민감도가 향상된 바이오 센서의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에서 언급하는 물성 중에서 측정 온도가 그 결과에 영향을 미치는 경우에는, 특별히 달리 규정하지 않는 한, 해당 물성은 상온에서 측정한 물성이다. 용어 상온은 가온되거나 감온되지 않은 자연 그대로의 온도로서 통상 약 10°C 내지 30°C의 범위 내의 한 온도 또는 약 23°C 또는 약 25°C 정도이다. 또한, 본 명세서에서 특별히 달리 언급하지 않는 한, 온도의 단위는 ℃이다.
본 명세서에서 언급하는 물성 중에서 측정 압력이 그 결과에 영향을 미치는 경우에는, 특별히 달리 규정하지 않는 한, 해당 물성은 상압에서 측정한 물성이다. 용어 상압은 가압되거나 감압되지 않은 자연 그대로의 온도로서 통상 약 1 기압 정도를 상압으로 지칭한다.
본 출원에 관한 일예에서, 본 출원은 표적 물질 검출용 바이오 센서에 관한 것이다.
본 출원의 바이오 센서는 기재; 상기 기재의 일면에 형성된 지지층; 및 지지층에 고정되는 제 1 항체를 포함하고, 상기 기재의 일면에 형성된 지지층은 기상 증착법에 의해 형성된 자가조립단층(self-assembled monolayer)이다.
하나의 예로서, 상기 기재는 특별히 제한되지 않으며, 일예로 고분자 기판, 금속 기판, 금속 산화물 기판 또는 유리 기판일 수 있다.
상기 고분자 기판은 일예로 폴리카보네이트(Polycarbonate), 폴리메틸 메타아크릴레이트(polymethyl methacrylate; PMMA) 또는 폴리프로필렌(Polypropylene) 기판을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 금속 기판은 일예로, 알루미늄, 철 또는 금 기판을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 금속 산화물 기판은 Al2O3, ZnO, Fe3O4, ZrO2, TiO2, SnO 또는 ITO(Indium Tin Oxide) 기판을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 유리 기판으로는 석영 유리(Quartz glass), 소다 석회 유리(Soda-lime glass), 붕규산 유리(borosilicate glass), 크리스탈 유리(crystal glass), 규산알루미늄 유리(aluminosilicate glass) 또는 산화저마늄 유리(germanium-oxide glass) 기판을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
하나의 예로서, 상기 지지층은 기재의 일면에 형성될 수 있다.
기재의 일면에 지지층을 형성하는 방법은 기상 증착 방법에 의할 수 있으며, 구체적으로는 후술하는 분자층증착(Molecular layer Deposition; MLD)방법으로 형성할 수 있다.
하나의 예로서 지지층에 고정되는 제 1 항체는 특별히 제한되지 않으며, 검출하고자 하는 표적 물질을 고려하여 적절한 항체가 선택될 수 있다.
구체적으로 표적 물질과 결합할 수 있는 결합 부위(binding site)를 가지는 항체가 제 1 항체로 선택될 수 있다. 따라서 검출하고자 하는 표적 물질에 따라서 제 1 항체가 달라질 수 있다. 한편, 제 1 항체의 유형은 특별히 제한되지 않으며, 일예로 IgE, IgD 또는 IgG일 수 있다.
상기 용어 표적 물질은 항체의 결합부위(binding site)와 결합이 가능한 물질로 항원을 의미 할 수 있다.
하나의 예로서, 기재의 일면에 형성된 지지층은 기상 증착법에 의해 형성된 자가조립단층(self-assembled monolayer)일 수 있다. 일반적으로 자가조립단층(self-assembled monolayer)은 특정 효소나 인자(foctor)의 도움 없이 흡착에 의해 표면 상에 자발적으로 형성된 분자 집합체를 의미한다. 따라서 본 출원에서 자가조립단층(self-assembled monolayer)은 흡착에 의해 기재의 일면상에 자발적으로 형성된 분자 집합체를 의미할 수 있다. 바이오 센서의 지지층을 자가조립단층(self-assembled monolayer; SAM)으로 하는 경우, 지지층에 제 1 항체를 균일하게 부착시키는데 유리하다.
하나의 예로서, 본 출원의 바이오 센서는 흡광도가 하기 일반식 1을 만족할 수 있다.
[일반식 1]
Ab ≥ 0.15
상기 일반식 1에서, Ab는 제 1 항체가 고정된 지지층에 20ng/mL 내지 40ng/mL의 표적 물질이 포함된 용액 100μL를 접촉시키고, 그 후 상기 표적 물질과 결합 가능하고 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)와 반응하는 효소가 결합된 제 2 항체 및 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)를 접촉시킨 후 자외선가시광선분광기(UV-Vis spectrophotometer)를 이용하여 측정한 최대 흡수 파장에서의 흡광도(Absorbance)이다.
상기 일반식 1에서, 제 1 항체가 고정된 지지층의 면적은 가로 약 8cm 세로 약 2cm인 것을 이용할 수 있다.
상기 일반식 1에서, 20ng/mL 내지 40ng/mL이란 일예로 약 20ng/mL 22ng/mL, 24ng/mL, 26ng/mL, 28ng/mL, 30ng/mL, 32ng/mL, 34ng/mL, 36ng/mL, 38ng/mL 또는 약 40ng/mL를 의미할 수 있다.
상기 일반식 1에서, 표적 물질이 포함된 용액은 인산완충 식염수(Phosphate-buffered saline:PBS)를 이용할 수 있다.
상기 일반식 1에서, 표적 물질을 접촉시킨 때부터 약 50 분 내지 약 70 분이 경과한 임의의 한 시점, 예를들어 시험물질을 접촉 시킨 때로부터 약 55 분, 약 60분 또는 약 65 분이 경과한 시점까지 반응 시킨 후, 상기 표적 물질과 결합 가능하고 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)와 반응하는 효소가 결합된 제 2 항체를 접촉 시킬 수 있다.
한편, 제 2 항체를 접촉시키기 전에 제 1 항체와 결합하지 않은 표적물질을 포함하는 용액을 제거하기 위해 세척과정을 수행할 수 있다. 세척과정은 특별히 제한되지 않으며 공지의 세척 용액을 이용하여 세척 할 수 있다. 일예로 상기 세척 용액은 PBS(Phosphate-buffered saline)-Tween을 이용할 수 있다.
상기 일반식 1에서, 표적 물질과 결합 가능하고 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)와 반응하는 효소가 결합된 제 2 항체는 특별히 제한되지 않으며, 검출하고자 하는 표적 물질을 고려하여 적절한 항체가 선택될 수 있다. 구체적으로 제 1 항체와 결합된 표적 물질과 결합할 수 있는 결합 부위(binding site)를 가지는 항체가 제 2 항체로 선택될 수 있다. 따라서 제 2 항체의 결합 부위는 제 1 항체와 결합된 표적 물질과 반응하여 결합될 수 있다. 한편, 상기 제 2 항체는 제 1 항체와 결합된 표적 물질과 충분히 반응할 수 있을 정도의 양을 접촉 시킬 수 있다. 예를 들어 1μg/mL의 제 2 항체가 포함된 용액 약 100μL를 접촉 시킬 수 있다. 상기 제 2 항체의 유형은 특별히 제한되지 않으며, 일예로 IgE, IgD 또는 IgG일 수 있다.
한편, 제 2 항체에 결합된 효소는 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)와 반응할 수 있는 공지의 효소가 이용될 수 있다. 일예로 상기 효소는 겨자무과산화효소(Horseradish peroxidase; HRP)일 수 있다.
상기 일반식 1에서, 상기 제 2 항체를 접촉 시킨 때부터 약 50분 내지 약 70 분이 경과한 임의의 한 시점, 예를 들어 제 2 항체를 접촉 시킨 때로부터 약 55 분, 약 60분 또는 약 65 분이 경과한 시점까지 반응 시킨 후, TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)를 접촉 시킬 수 있다. 한편, 상기 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)는 약 100μL(0.1 mg/mL)를 접촉 시킬 수 있다.
상기 일반식 1에서, 흡광도의 측정은 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)를 접촉 시킨 때로부터 10분 내지 20분이 경과한 임의의 한 시점, 예를 들어 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)를 접촉 시킨 때로부터 약 12분, 13분, 14분, 15분, 16분, 17분 또는 18분이 경과한 시점까지 반응 시킨 후 자외선가시광선분광기(UV-Vis spectrophotometer)를 이용하여 측정할 수 있다.
상기 일반식 1에서, 흡광도(Ab)는 다른 예로 약 0.16 이상, 0.17 이상 또는 약 0.18 이상일 수 있으며, 상한은 특별히 제한되지 않으나 약 0.3 이하, 0.29 이하, 0.28 이하 또는 약 0.27이하일 수 있다.
상기와 같은 범위의 흡광도는 TMB와 반응하는 제 2 항체에 고정된 효소의 양이 많다는 것을 의미하고, 이는 제 1 항체와 결합된 표적 물질이 많다는 것을 의미한다. 또한, 이는 지지층에 고정된 제 1 항체의 밀도가 높다는 것을 의미할 수 있다. 따라서 상기 범위의 흡광도를 가지는 바이오 센서는 표적 물질의 검출 민감도가 높다.
하나의 예로서, 상기 바이오 센서의 흡광도는 표적 물질 0.6ng/mL 내지 1.0ng/mL 범위의 농도에서 의존적일 수 있다. 구체적으로 0.6ng/mL 내지 1.0ng/mL 범위에서 표적 물질의 농도가 증가하면, 흡광도도 증가된다. 따라서, 본 출원의 바이오 센서는 상기와 같은 매우 낮은 농도 범위의 표적물질도 정량적으로 검출할 수 있다.
하나의 예로서, 상기 기재의 일면에 형성된 지지층을 형성하는 지지층의 형성재료는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다.
[화학식 1]
A(R1)p(OR2)q(R3NH2)r
상기 화학식 1에서 A는 탄소 원자, 규소 원자 또는 게르마늄 원자이고, R1 또는 R2는 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 5의 알킬기이며, R3는 탄소수 1 내지 12의 알킬기 또는 페닐기이고, p는 0 내지 2의 정수이고, r 또는 q는 각각 독립적으로 1 내지 3의 자연수이며, 상기 p, q 및 r의 합은 4를 만족한다.
상기 화학식 1에서, R1 또는 R2은 다른 예로 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 4의 알킬기 또는 탄소수 1 내지 3의 알킬기일 수 있다.
상기 화학식 1에서, R3는 다른 예로 탄소수 1 내지 10, 탄소수 1 내지 8, 탄소수 1 내지 6 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기이거나 또는 페닐기일 수 있다.
상기 화학식 1에서, p는 0, 1 또는 2의 정수 일 수 있다.
상기 화학식 1에서, r 또는 q는 각각 독립적으로 1, 2 또는 3의 자연수 일 수 있다.
상기 화학식 1에서, p, q 및 r의 합은 4를 만족한다. 즉 p+q+r=4를 만족한다.
하나의 예로서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 그 종류는 특별히 제한되지 않으나, 일예로 (4-아미노부틸)트리에톡시실란, (4-아미노부틸)트리메톡시실란, 아미노페닐트리에톡시실란, 아미노페닐트리메톡시실란, (3-아미노프로필)트리메톡시실란, (3-아미노프로필)트리에톡시실란 또는 (3-아미노프로필)디메틸에톡시실란일 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 이용하여 지지층을 형성하는 경우, 지지층의 일면에 자가조립단층을 형성하는데 유리하다.
하나의 예로서, 상기 기재의 일면에 형성된 지지층의 밀도는 800개/㎛2 내지 2,000 개/㎛2 일 수 있다. 다른 예로 약 850개/㎛2 이상, 900개/㎛2 이상, 950개/㎛2 이상, 1,000개/㎛2 이상 또는 약 1,100개/㎛2 이상일 수 있다. 상한은 특별히 제한되지 않으나 약 1,900개/㎛2 이하, 1,800개/㎛2 이하, 1,700개/㎛2 이하 또는 약 1,900개/㎛2 이하일 수 있다. 상기 범위내의 밀도를 가지는 지지층은 제 1 항체를 높은 밀도로 지지층에 고정시킬 수 있다. 따라서 상기와 같은 밀도 범위를 가지는 지지층을 포함하는 바이오 센서는 제 1 항체를 높은 밀도로 지지층에 고정시킬 수 있어, 바이오 센서의 측정 민감도를 향상 시킬 수 있다.
상기 기재의 일면에 형성된 지지층의 밀도를 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 일예로 EDC 커플링을 이용하여 비오틴(Biotin)을 지지층에 결합시키고, 20nm 금 나노 입자가 결합된 Streptavidin와 상기 비오틴의 선택적으로 흡착되는 성질을 이용하여, SEM으로 지지층의 흡착 밀도를 측정할 수 있다.
본 출원은 또한 바이오 센서의 제조 방법에 관한 것이다. 한편, 본 출원의 바이오 센서의 제조 방법에 사용되는 기재, 지지층을 형성하는 지지층의 형성재료 및 지지층에 고정되는 제 1 항체는 전술한 기재, 지지층의 형성재료 및 제 1 항체를 이용할 수 있다.
본 출원의 바이오 센서의 제조 방법은 기재의 일면에 기상 증착법으로 자가조립단층(self-assembled monolayer)인 지지층을 형성하는 제 1 단계; 상기 지지층에 제 1 항체를 고정 시키는 제 2 단계;를 포함한다.
하나의 예로서, 제 1 단계에서 기재의 일면에 자가조립단층(self-assembled monolayer)인 지지층을 형성하는 방법은 기상 증착방법으로 형성할 수 있다. 구체적으로는 분자층증착(Molecular layer Deposition; MLD)으로 기재의 일면에 지지층을 형성할 수 있다.
상기 분자층 증착(Molecular layer Deposition)은 도 1과 같이 구성된 분자층 증착 장치(1)를 이용하여 수행될 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이 분자층 증착 장치(1)는 반응 챔버(10), 반응조(30), 반응 챔버와 반응조를 연결하는 가스 연결관(40), 반응 챔버의 압력을 조절하는 진공 펌프(50), 반응조의 온도를 조절하는 제 1 열원(20), 반응 챔버의 온도를 조절 하는 제 2 열원(60), 반응 챔버(10)로 유입되는 기화된 지지층의 형성 재료의 유입량을 조절하는 가스 연결관(40)에 마련된 제 1 밸브(70), 반응 챔버(10)의 압력을 조절하는 진공펌프(50)에 마련된 제 2 밸브(80) 및 반응 챔버(10)의 압력을 상압으로 조절하기 위한 제 3 밸브(90)를 포함할 수 있다.
우선, 상기 분자층 증착 장치(1)의 반응 챔버에 기재를 안착시키고, 반응조에는 지지층의 형성 재료를 충전할 수 있다.
그 후, 상기 반응조(30)에 마련된 제 1 열원(20)으로 반응조(30)의 온도를 지지층의 형성 재료의 비점 보다 높은 온도로 조절할 수 있고, 예를 들어, 반응조(30)의 온도를 50℃ 내지 500℃의 온도 범위로 조절할 수 있다. 상기 제 1 열원(20)은 특별히 제한되지 않으나, 일예로 전기히터일 수 있다. 상기 제1 열원(20)은 반응조(30)의 온도를 상기 반응조(30)에 채워진 지지층의 형성 재료의 비점보다 높은 온도로 조절함으로써, 지지층의 형성 재료를 기화시킬 수 있다. 기화된 지지층의 형성 재료는 가스 연결관(40)을 통하여 반응 챔버(10)로 유입될 수 있다. 이때 제 1 밸브(70)는 밸브의 개폐시간을 조절하여 기화된 지지층의 형성 재료의 유입량을 조절할 수 있다. 일예로 반응조에서 기화된 지지층의 형성 재료를 가스 연결관을 통하여 반응 챔버에 유입되도록 제 1 밸브를 약 40초 내지 약 80초 동안 개방하여 기화된 지지층의 형성 재료의 유입량을 조절 할 수 있다. 제 1 밸브의 개방 시간이 짧으면 기재에 지지층이 충분한 밀도를 가지고 증착되지 않을 수 있으며, 개방 시간이 길면 반응 챔버에 유입되는 기화된 지지층의 형성 재료가 많아져서 지지층의 형성 재료가 낭비될 수 있다.
한편, 상기 반응 챔버에 마련된 제 2 열원(60)으로 반응 챔버의 온도를 약 40 ℃ 내지 약 200 ℃ 범위로 조절할 수 있다. 상기 제 2 열원(60)은 전술한 전기 히터와 동일한 종류의 전기 히터일 수 있다. 상기 제2 열원(60)은 반응 챔버(10) 내에서 기화된 지지층의 형성 재료가 증착되는 동안 반응 챔버(10)에 고온의 온도를 제공하는 역할을 수행하며, 상기 고온의 온도는 상기 지지층의 형성 재료의 종류 및 원하는 지지층의 흡착 밀도를 고려하여 상기 온도 범위 내에서 적절히 선택될 수 있다. 한편, 지지층의 형성 재료의 증착은 약 10 분 내지 약 60 분 동안 수행될 수 있다. 상기 범위 내로 증착을 수행하는 경우 기재 상에 높은 밀도를 가지면서도 시간 낭비 없이 효율적으로 지지층을 자가조립단층(self-assembled monolayer)으로 증착할 수 있다.
상기 반응 챔버(10)의 압력은 진공 펌프(50) 및 진공 펌프에 마련된 제 2 밸브(80)에 의해 조절 될 수 있다. 상기 제 2 밸브가 개방되는 경우, 반응 챔버(10)의 내부에 음압이 걸릴 수 있다. 상기 제 2 밸브(80)는 기재(11)에 지지층의 형성 재료가 증착 되기 전에는 반응 챔버(10)의 내부가 진공 분위기가 되도록 개방될 수 있다. 또한, 제 1 밸브가 개방되어 기화된 지지층의 형성 재료가 반응 챔버(10)로 유입되는 동안 상기 제 2 밸브(80)는 잠길 수 있다.
또한, 제 3 밸브(90)에 의해서도 반응 챔버(10)의 압력이 조절될 수 있다. 예를 들어, 상기 반응 챔버(10)의 내부를 진공 분위기로 유지하기 위하여 제3 밸브(90)는 잠길 수 있다. 한편, 상기 제3 밸브(90)가 개방되는 경우 반응 챔버(10)의 압력이 상압으로 조절될 수 있다. 구체적으로, 지지층이 형성된 기재(11)를 반응 챔버(10)의 외부로 꺼낼 때, 제3 밸브(90)를 개방하여, 반응 챔버(10)의 압력을 상압으로 조절할 수 있다. 상기와 같이, 제3 밸브(90)를 개방하여 반응 챔버(10)의 압력을 상압으로 조절함으로써, 기재(11)에 증착되지 않고 남은 지지층의 형성 재료를 반응 챔버(10)로부터 효과적으로 제거할 수 있다.
상기와 같은 분자층증착으로 지지층을 기재의 일면에 증착하는 경우에, 높은 밀도를 가지는 자가조립단층(self-assembled monolayer)인 지지층이 증착될 수 있다. 따라서 상기 지지층을 포함하는 바이오 센서는 표적 물질의 검출 민감도가 향상될 수 있다.
하나의 예에서, 제 2 단계에서 지지층에 제 1 항체를 고정시키는 방법은, 연결 매체를 통하여 지지층에 고정시킬 수 있다. 구체적으로 지지층에 연결매체를 결합시키고, 그 후에 제 1 항체를 연결 매체에 결합시켜, 제 1 항체를 지지층에 고정 시킬 수 있다.
상기 연결매체는 특별히 제한되지 않으나, 일예로, 글루타르알데히드(Glutaraldehyde) 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르(1,4-Butanediol diglycidyl ether), N,N'-디숙신이미딜 카보네이트(N,N'-Disuccinimidyl carbonate) 또는 p-페닐렌 디이소시안산염(p-phenylene diisocyanate) 일 수 있다.
지지층에 연결 매체를 결합 시키는 방법은 특별히 제한되지 않으며 공지의 방법에 의하여 결합시킬 수 있다. 일 구체예로서 p-페닐렌 디이소시안산염(p-phenylene diisocyanate)을 포함하는 용액과 반응 시켜 지지층에 연결 매체를 결합시킬 수 있다.
한편, 제 1 항체를 연결 매체에 결합시키는 방법은 특별히 제한되지 않으며 공지의 방법에 의하여 부착 시킬 수 있다. 일 구체예로서, 제 1 항체를 포함한 용액을 연결 매체가 형성된 기재에 접촉시켜 연결매체와 제 1 항체가 반응하도록하여 제 1 항체를 연결 매체에 부착시킬 수 있다.
본 출원은 또한, 표적 물질 검출 방법에 관한 것이다. 본 출원의 표적 물질 검출 방법은 바이오 센서에, 표적 물질을 포함하는 시험 대상 물질, 기질과 반응하는 효소가 고정된 제 2 항체 및 기질을 접촉시키는 제 1 단계 및 상기 바이오 센서에 접촉시킨 기질의 변화를 측정하는 제 2 단계를 포함한다. 하나의 예로서, 상기 바이오 센서는 전술한 바이오 센서를 이용 할 수 있다. 따라서 표적물질의 검출 민감도가 향상될 수 있다. 즉, 미량의 표적 물질도 높은 민감도로 검출할 수 있다.
하나의 예로서, 제 1 단계에서 표적 물질을 포함하는 시험 대상 물질은 특별히 제한되지 않으며, 일예로 인체로부터 유래된 것일 수 있다. 일 구체예로서 상기 시험 대상 물질은 땀, 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 타액, 눈물, 콧물 또는 소변 등일 수 있다. 상기와 같은 시험 대상 물질은 시험 대상 물질에 포함되어 있는 표적 물질의 농도 등을 고려하여 적절히 선택될 수 있다. 한편, 상기 표적 물질은 항체의 결합부위(binding site)와 결합이 가능한 물질인 항원을 의미 할 수 있다.
하나의 예로서, 제 1 단계에서 기질과 반응하는 효소가 고정된 제 2 항체 및 기질은 전술한 제 2 항체 및 기질과 동일한 것을 이용할 수 있다.
하나의 예로서, 제 1 단계에서 표적 물질을 포함하는 시험대상 물질, 기질과 반응하는 효소가 고정된 제 2 항체 및 기질은 순차적으로 바이오 센서에 접촉 시킬 수 있다. 구체적으로 바이오 센서에 표적 물질을 포함하는 시험 대상 물질을 접촉 시키고, 그 후 기질과 반응하는 효소가 고정된 제 2 항체를 상기 바이오 센서에 접촉 시키며, 마지막으로 기질을 상기 바이오 센서에 접촉 시킬 수 있다.
한편, 제 1 단계에서 표적 물질을 포함하는 시험 대상 물질을 바이오 센서에 접촉 시킨 후에 상기 바이오 센서를 세척하는 세척 과정이 포함될 수 있다. 또한, 기질과 반응하는 효소가 고정된 제 2 항체를 바이오 센서에 접촉 시킨 후에 상기 바이오 센서를 세척하는 세척 과정이 포함될 수 있다. 상기와 같은 일련의 세척 과정을 통해 표적 물질의 검출 정확도를 향상 시킬 수 있다.
상기 제 2 단계에서 기질의 변화를 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 일예로 광학적 방법으로 기질의 변화를 측정할 수 있다. 구체적으로 제 2 항체와 결합된 효소와 반응하여 발색하는 발색체를 기질로 사용하는 경우, 상기 발색체의 흡광도를 측정함으로써 제 2 항체에 고정된 효소에 의한 기질의 변화를 측정할 수 있다. 한편, 흡광도의 측정은 특별히 제한되지 않으나 공지의 분광 광도계(spectrophotometer)를 이용하여 측정할 수 있다.
상기와 같은 광학적 방법으로 기질의 변화를 측정함으로써 표적 물질의 정량 분석이 가능할 수 있다. 구체적으로 표적 물질의 함량에 따른 흡광도(이하, '표준 흡광도'라고 호칭할 수 있다.)를 측정하여 데이터를 구축할 수 있다. 상기 구축된 데이터의 표준 흡광도와 시험대상 물질의 흡광도를 비교하여, 시험대상 물질에 포함되어 있는 표적 물질의 함량을 파악 할 수 있다.
본 출원의 일예에 따르면, 표적 물질의 검출 민감도가 향상된 바이오 센서가 제공된다. 또한, 표적 물질의 검출 민감도가 향상된 바이오 센서의 제조 방법이 제공된다. 또한, 상기 바이오 센서를 이용한 표적 물질 검출 방법이 제공된다.
도 1은 바이오 센서의 제조 방법에 이용될 수 있는 예시적인 기상 증착 장치를 나타내는 개념도이다.
도 2는 실시예의 바이오 센서를 제작하는 일련의 과정을 보여주는 예시적인 개념도이다.
도 3는 실시예를 통하여 제조된 바이오 센서를 이용하여 표적 물질의 농도에 따른 자외선가시광선분광기(UV-Vis spectrophotometer)를 이용하여 측정한 최대 흡수 파장(약 450nm파장)에서의 흡광도(Absorbance)를 보여주는 그래프이다.
도 4는 비교예를 통하여 제조된 바이오 센서를 이용하여 표적 물질의 농도에 따른 자외선가시광선분광기(UV-Vis spectrophotometer)를 이용하여 측정한 최대 흡수 파장(약 450nm파장)에서의 흡광도(Absorbance)를 보여주는 그래프이다.
이하 실시예를 통하여 본 출원을 구체적으로 설명하지만, 본 출원의 범위가 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
흡광도 측정
실시예 및 비교예를 통하여 제조된 바이오 센서를 1% PBS 및 0.05% Tween 20으로 4회 세척하고, 1% BSA(bovine serum albumin)로 1시간 동안 Blocking 후 4회 세척하였다.
그 후, 표적 물질로 IgE(NIBSC, 11/234)(20 ng/mL) 약 100μL를 첨가하고 1 시간 반응 시킨 후 4회 세척 하고, 제 2 항체로 HRP(Horseradish peroxidase)가 고정된 Anti-human IgE 항체(제조사:고마바이오텍사, 제품명:IgE, Anti-Human, HRP)(1μg /mL)를 약 100μL 첨가하고 1 시간 반응 후 4회 세척 하였다. 그 다음, 기질로 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)(0.1 mg/mL) 약 100μL를 첨가하고 15분 반응 후 2M의 H2SO4 약 100μL를 첨가하였다.
그 후, 자외선가시광선분광기(UV-Vis spectrophotometer)(Agilent, Cary 8454)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
실시예
바이오 센서의 형성 재료
기재: 기재로는 유리 기판(8cm x 2cm)(세원테크, Soda-lime glass)을 사용하였다.
지지층의 형성 재료: (3-아미노프로필)트리메톡시실란(APTMS)(Sigma-Aldrich, 281778)을 사용하였다.
연결매체: p-페닐렌 디이소시안산염(p-phenylene diisocyanate)(Sigma-Aldrich, 258555)를 사용하였다.
제 1 항체: Anti-human IgE 항체(ThermoFisher Scientific 사, A18797)를 사용하였다.
바이오 센서의 제조
기재에 지지층 형성:
도 1과 같이 구성된 기상 증착 장치의 반응 챔버에 유리 기판을 안착시키고, 제 2 밸브를 개방하여 반응 챔버를 진공 분위기로 조성하고, 제 2 열원을 이용하여 반응 챔버의 온도를 약 100℃로 유지하였다. 또한, 지지층의 형성재료인 (3-아미노프로필)트리메톡시실란(APTMS)을 반응조에 채운 후 제 1 열원을 사용하여 반응조의 온도를 100℃로 가열함으로써, APTMS를 기화시켰다. 상기 기화된 APTMS가 반응 챔버로 유입도되록 제 1 밸브를 약 60 초 동안 개방하고, 다시 제 1 밸브를 잠근 후 10 분간 유지하여 유리 기판에 APTMS를 증착시켜 자가조립단층(self-assembled monolayer)인 지지층을 형성하였다.
상기 제 2 밸브를 개방하고, 반응 챔버의 온도를 상온으로 낮췄다. 그 후 제 2 밸브를 잠그고 제 3 밸브를 개방하여 반응 챔버의 압력을 상압으로 변환한 후 반응 챔버로부터 지지층이 형성된 기재를 수집하였다.
지지층에 제 1 항체 고정:
상기 지지층이 형성된 유리 기판에 0.2% p-페닐렌 디이소시안산염(p-phenylene diisocyanate) 용액(in DMF/Pyridine 9:1)에 2시간 동안 담지 하였다.
그 후, 상기 제 1 항체(1μg/mL) 약 100μL를 1시간 동안 반응시켜 상기 항체를 지지층에 고정 시켰다.
도 2는 실시예의 바이오 센서를 제작하는 일련의 과정을 보여주는 예시적인 개념도이다. 상기와 같은 방법으로 제조된 실시예의 바이오 센서를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
비교예
바이오 센서의 형성 재료
실시예 1과 동일한 기재, 지지층의 형성재료 및 제 1 항체를 사용하였다.
바이오 센서의 제조
기재에 지지층 형성:
유리 기판을 액상 증착 방법을 이용하여 상기 유리 기판에 지지층을 형성하였다. 구체적으로 상기 유리 기판을 지지층의 형성재료인 1% (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTMS)이 포함된 에탄올에 약 2 시간 담지 하여 기재에 지지층을 형성하였다. 그 후, 에탄올로 약 10초간 세척하여 지지층이 형성된 기재를 수집하였다.
지지층에 제 1 항체 고정:
실시예와 동일한 방법으로 지지층에 제 1 항체를 고정하였다.
상기와 같은 방법으로 제조된 비교예의 바이오 센서를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
평가 결과
도 3은 실시예를 통하여 제조된 바이오 센서를 이용하여 표적 물질의 농도에 따른 자외선가시광선분광기(UV-Vis spectrophotometer)(경로 길이: 1 cm)를 이용하여 측정한 최대 흡수 파장(약 450nm파장)에서의 흡광도(Absorbance)를 보여주는 그래프이고, 도 4는 비교예를 통하여 제조된 바이오 센서를 이용하여 표적 물질의 농도에 따른 자외선가시광선분광기(UV-Vis spectrophotometer)(경로 길이: 1 cm)를 이용하여 측정한 최대 흡수 파장(약 450nm파장)에서의 흡광도(Absorbance)를 보여주는 그래프이다.
상기 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 실시예에서 제조한 바이오 센서의 흡광도를 분석한 결과, 표적 물질 20ng/mL 에서 흡광도가 약 0.175로 높게 나타났다. 그러나, 비교예에서 제조된 바이오 센서의 흡광도를 분석한 결과, 표적 물질 20ng/mL 에서 흡광도가 약 0.08로 낮게 나타났다. 이를 통해 실시예에서 제조된 바이오 센서의 검출 민감도가 비교예에서 제조된 바이오 센서의 검출 민감도 보다 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다.
10: 반응 챔버
11: 기재
20: 제 1 열원
30: 반응조
40: 가스 연결관
50: 진공펌프
60: 제 2 열원
70: 제 1 밸브
80: 제 2 밸브
90: 제 3 밸브

Claims (10)

  1. 기재의 일면에 기상 증착법으로 자가조립단층(self-assembled monolayer)인 지지층을 형성하는 제 1 단계;
    상기 지지층에 제 1 항체를 고정시키는 제 2 단계를 포함하는 바이오 센서의 제조 방법으로서,
    상기 지지층은 분자층 증착(Molecular layer Deposition)으로 기재의 일면에 형성되고,
    상기 분자층 증착은 분자층 증착 장치를 이용하여 수행되며,
    상기 분자층 증착 장치는 반응 챔버, 반응조, 반응 챔버와 반응조를 연결하는 가스 연결관, 반응 챔버의 압력을 조절하는 진공 펌프, 반응조의 온도를 조절하는 제 1 열원, 반응 챔버의 온도를 조절하는 제 2 열원, 반응 챔버로 유입되는 기화된 지지층의 형성 재료의 유입량을 조절하는 가스 연결관에 마련된 제 1 밸브, 반응 챔버의 압력을 조절하는 진공펌프에 마련된 제 2 밸브 및 반응 챔버의 압력을 상압으로 조절하기 위한 제 3 밸브를 포함하는 바이오 센서의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 흡광도(Absorbance)가 하기 일반식 1을 만족하는 바이오 센서의 제조 방법:
    [일반식 1]
    Ab ≥ 0.15
    상기 일반식 1에서, Ab는 제 1 항체가 고정된 지지층에 20ng/mL 내지 40ng/mL의 표적 물질이 포함된 용액 100μL를 접촉시키고, 그 후 상기 표적 물질과 결합 가능하고 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)와 반응하는 효소가 결합된 제 2 항체 및 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)를 접촉시킨 후 자외선가시광선분광기(UV-Vis spectrophotometer)를 이용하여 측정한 최대 흡수 파장에서의 흡광도(Absorbance)이다.
  3. 제 1 항에 있어서, 바이오 센서의 흡광도는 0.6ng/mL 내지 1.0ng/mL 범위에서 표적 물질의 농도가 증가하면 흡광도가 증가하는 바이오 센서의 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 기재는 고분자 기판, 금속 기판, 금속 산화물 기판 또는 유리 기판인 바이오 센서의 제조 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 기재의 일면에 형성된 지지층의 형성 재료는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 바이오 센서의 제조 방법:
    [화학식 1]
    A(R1)p(OR2)q(R3NH2)r
    상기 화학식 1에서 A는 탄소 원자, 규소 원자 또는 게르마늄 원자이고, R1 또는 R2는 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 5의 알킬기이며, R3는 탄소수 1 내지 12의 알킬기 또는 페닐기이고, p는 0 내지 2의 정수이고, r 또는 q는 각각 독립적으로 1 내지 3의 자연수이며, 상기 p, q 및 r의 합은 4를 만족한다.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 (4-아미노부틸)트리에톡시실란, (4-아미노부틸)트리메톡시실란, 아미노페닐트리에톡시실란, 아미노페닐트리메톡시실란, (3-아미노프로필)디메틸에톡시실란, (3-아미노프로필)트리메톡시실란 또는 (3-아미노프로필)트리에톡시실란인 바이오 센서의 제조 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 기재의 일면에 형성된 지지층의 제 1 항체의 밀도는 800개/㎛2 내지 2,000 개/㎛2 인 바이오 센서의 제조 방법.
  8. 삭제
  9. 제 1 항에 있어서, 제 1 단계에서 지지층의 형성은 40 ℃내지 200 ℃온도에서 수행하는 바이오 센서의 제조 방법.
  10. 바이오 센서에, 표적 물질을 포함하는 시험 대상 물질, 기질과 반응하는 효소가 고정된 제 2 항체 및 기질을 접촉시키는 제 1 단계; 및
    상기 바이오 센서에 접촉시킨 기질의 변화를 측정하는 제 2 단계를 포함하는 표적 물질 검출 방법으로서,
    상기 바이오 센서는 제 1 항의 제조 방법에 따라 제조된 바이오 센서인 표적 물질 검출 방법.
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