JPH10267930A - 表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ及びその製造方法 - Google Patents
表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ及びその製造方法Info
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- JPH10267930A JPH10267930A JP9073646A JP7364697A JPH10267930A JP H10267930 A JPH10267930 A JP H10267930A JP 9073646 A JP9073646 A JP 9073646A JP 7364697 A JP7364697 A JP 7364697A JP H10267930 A JPH10267930 A JP H10267930A
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- measurement chip
- plasmon resonance
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 透明基板、該透明基板上に配置される金
属膜、該金属膜上に配置される有機ケイ素膜、及び該有
機ケイ素膜上に配置される生理活性物質を備えているこ
とを特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測
定チップ及びその製造方法。 【効果】 製造が容易であり、また、固定化する生理活
性物質が少量であっても、良好な感度で測定対象物質を
測定することのできる表面プラズモン共鳴バイオセンサ
ー用測定チップを提供する。
属膜、該金属膜上に配置される有機ケイ素膜、及び該有
機ケイ素膜上に配置される生理活性物質を備えているこ
とを特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測
定チップ及びその製造方法。 【効果】 製造が容易であり、また、固定化する生理活
性物質が少量であっても、良好な感度で測定対象物質を
測定することのできる表面プラズモン共鳴バイオセンサ
ー用測定チップを提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は表面プラズモン共鳴
バイオセンサー用測定チップ及びその製造方法に関す
る。
バイオセンサー用測定チップ及びその製造方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】現在、臨床検査等で免疫反応を利用した
測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や
標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすること
なく、リガンドの変化を高感度に検出することのできる
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用した免疫センサー
が使用されている。
測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や
標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすること
なく、リガンドの変化を高感度に検出することのできる
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用した免疫センサー
が使用されている。
【０００３】このような表面プラズモン共鳴を利用した
測定装置（表面プラズモン共鳴バイオセンサー）で一般
的に使用される測定チップは、図２に示すような構造を
有する。即ち、ガラス基板１'上に成膜された金属膜２'
の上に、多孔性材料５が形成されており、この多孔性材
料５の表面及び内部に酵素、抗体等の生理活性物質４'
が担持又は固定されている。この多孔性材料５として
は、例えば合成繊維、天然繊維、無機繊維等からなる織
物、編物、不織布や、多孔性の無機又は有機材料などが
使用される（特開平3-164195号公報参照）。また、市販
品（BIAcore 2000用，ファルマシアバイオセンサー社
製）では、この多孔性材料５としてカルボキシメチルデ
キストランが用いられている。
測定装置（表面プラズモン共鳴バイオセンサー）で一般
的に使用される測定チップは、図２に示すような構造を
有する。即ち、ガラス基板１'上に成膜された金属膜２'
の上に、多孔性材料５が形成されており、この多孔性材
料５の表面及び内部に酵素、抗体等の生理活性物質４'
が担持又は固定されている。この多孔性材料５として
は、例えば合成繊維、天然繊維、無機繊維等からなる織
物、編物、不織布や、多孔性の無機又は有機材料などが
使用される（特開平3-164195号公報参照）。また、市販
品（BIAcore 2000用，ファルマシアバイオセンサー社
製）では、この多孔性材料５としてカルボキシメチルデ
キストランが用いられている。
【０００４】しかしながら、測定対象物と実質的にかつ
効率的に相互作用する生理活性物質４'は、多孔性材料
５の表面に存在するものだけであるため、多孔性材料５
の内部に担持又は固定されている生理活性物質４'は有
効に機能せず、その分感度が低下することとなる。
効率的に相互作用する生理活性物質４'は、多孔性材料
５の表面に存在するものだけであるため、多孔性材料５
の内部に担持又は固定されている生理活性物質４'は有
効に機能せず、その分感度が低下することとなる。
【０００５】また、生理活性物質４'を金属膜２'に固定
化する方法として、ＬＢ（Langmuir-Blodgett ）法が用
いられる場合もあるが（特開平5-288672号公報参照）、
ＬＢ膜と金属膜との結合が弱く、ＬＢ膜が生理活性物質
と共に脱落するという問題がある。
化する方法として、ＬＢ（Langmuir-Blodgett ）法が用
いられる場合もあるが（特開平5-288672号公報参照）、
ＬＢ膜と金属膜との結合が弱く、ＬＢ膜が生理活性物質
と共に脱落するという問題がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、固定
化する生理活性物質が少量であっても、良好な感度が得
られ、かつ製造が容易な表面プラズモン共鳴バイオセン
サー用の測定チップを提供することにある。
化する生理活性物質が少量であっても、良好な感度が得
られ、かつ製造が容易な表面プラズモン共鳴バイオセン
サー用の測定チップを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み鋭意研究
の結果、本発明者は、金属膜上に有機ケイ素膜を形成
し、該有機ケイ素膜に生理活性物質を固定化すれば、使
用する生理活性物質が少量であっても良好な感度が得ら
れることを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明
は、透明基板、該透明基板上に配置される金属膜、該金
属膜上に配置される有機ケイ素膜、及び該有機ケイ素膜
上に配置される生理活性物質を備えていることを特徴と
する表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップで
ある。
の結果、本発明者は、金属膜上に有機ケイ素膜を形成
し、該有機ケイ素膜に生理活性物質を固定化すれば、使
用する生理活性物質が少量であっても良好な感度が得ら
れることを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明
は、透明基板、該透明基板上に配置される金属膜、該金
属膜上に配置される有機ケイ素膜、及び該有機ケイ素膜
上に配置される生理活性物質を備えていることを特徴と
する表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップで
ある。
【０００８】また、本発明は、透明基板上に金属膜を配
置した後、該金属膜の上に有機ケイ素膜を配置し、次い
で該有機ケイ素膜上に生理活性物質を配置することを特
徴とする、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チ
ップの製造方法である。
置した後、該金属膜の上に有機ケイ素膜を配置し、次い
で該有機ケイ素膜上に生理活性物質を配置することを特
徴とする、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チ
ップの製造方法である。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明における表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測
定チップ（以下、単に「測定チップ」という）とは、表
面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるチップで
あって、該センサーより照射された光を透過及び反射す
る部分、並びに生理活性物質及びそれを固定化する部分
とを含む部材をいい、該センサーの本体に固着されるも
のであってもよく、また脱着可能なものであってもよ
い。
本発明における表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測
定チップ（以下、単に「測定チップ」という）とは、表
面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるチップで
あって、該センサーより照射された光を透過及び反射す
る部分、並びに生理活性物質及びそれを固定化する部分
とを含む部材をいい、該センサーの本体に固着されるも
のであってもよく、また脱着可能なものであってもよ
い。
【００１０】本発明の測定チップは、透明基板、該透明
基板上に配置される金属膜、該金属膜上に配置される有
機ケイ素膜、及び該有機ケイ素膜上に配置される生理活
性物質を備えている。ここで、「透明基板上に配置され
る金属膜」とは、金属膜が直接接して透明基板上に配置
されている場合のほか、金属膜が透明基板に直接接する
ことなく、他の層を介して配置されている場合をも含む
意である。「金属膜上に配置される有機ケイ素膜」及び
「有機ケイ素膜上に配置される生理活性物質」も上記と
同様の意味である。
基板上に配置される金属膜、該金属膜上に配置される有
機ケイ素膜、及び該有機ケイ素膜上に配置される生理活
性物質を備えている。ここで、「透明基板上に配置され
る金属膜」とは、金属膜が直接接して透明基板上に配置
されている場合のほか、金属膜が透明基板に直接接する
ことなく、他の層を介して配置されている場合をも含む
意である。「金属膜上に配置される有機ケイ素膜」及び
「有機ケイ素膜上に配置される生理活性物質」も上記と
同様の意味である。
【００１１】本発明の一例による測定チップの断面概略
図を図１に示す。本実施例による測定チップは、透明基
板１と、透明基板１上に形成された金属膜２と、金属膜
２の上に形成された有機ケイ素膜３と、有機ケイ素膜３
の表面に固定化された生理活性物質４とを有する。
図を図１に示す。本実施例による測定チップは、透明基
板１と、透明基板１上に形成された金属膜２と、金属膜
２の上に形成された有機ケイ素膜３と、有機ケイ素膜３
の表面に固定化された生理活性物質４とを有する。
【００１２】透明基板１としては、通常表面プラズモン
共鳴バイオセンサー用の測定チップに使用されるもので
あればどのようなものでもよく、一般的にはガラス、ポ
リエチレンテレフタレート、ポリカーボネートなどのレ
ーザー光に対して透明な材料からなるものが使用でき、
偏光に対して異方性を示さず、かつ加工性の優れた材料
が望ましく、その厚さは0.1 〜20mm程度である。
共鳴バイオセンサー用の測定チップに使用されるもので
あればどのようなものでもよく、一般的にはガラス、ポ
リエチレンテレフタレート、ポリカーボネートなどのレ
ーザー光に対して透明な材料からなるものが使用でき、
偏光に対して異方性を示さず、かつ加工性の優れた材料
が望ましく、その厚さは0.1 〜20mm程度である。
【００１３】金属膜２としては、表面プラズモン共鳴が
生じ得るようなものであれば特に限定されない。この金
属膜２に使用することのできる金属の種類としては、
金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、それら
を単独で又は組み合わせて使用することができる。ま
た、上記透明基板１への付着性を考慮して、透明基板１
と金、銀等からなる層との間にクロム等からなる介在層
を設けてもよい。
生じ得るようなものであれば特に限定されない。この金
属膜２に使用することのできる金属の種類としては、
金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、それら
を単独で又は組み合わせて使用することができる。ま
た、上記透明基板１への付着性を考慮して、透明基板１
と金、銀等からなる層との間にクロム等からなる介在層
を設けてもよい。
【００１４】金属膜２の膜厚は、100 〜2000Åであるの
が好ましく、特に200 〜600 Åであるのが好ましい。30
00Åを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出
することができない。また、クロム等からなる介在層を
設ける場合、その介在層の厚さは、５〜50Åであるのが
好ましい。
が好ましく、特に200 〜600 Åであるのが好ましい。30
00Åを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出
することができない。また、クロム等からなる介在層を
設ける場合、その介在層の厚さは、５〜50Åであるのが
好ましい。
【００１５】金属膜２の形成は常法によって行えばよ
く、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティン
グ法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うこ
とができる。これらの方法の中でもスパッタ法を用いる
のが好ましい。
く、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティン
グ法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うこ
とができる。これらの方法の中でもスパッタ法を用いる
のが好ましい。
【００１６】有機ケイ素膜３とは、Ｓｉ−Ｏ及びＳｉ−
Ｃ結合を分子内に含む高分子からなる膜をいう。該有機
ケイ素膜３は、例えば、シランカップリング剤を用いて
形成させることができる。シランカップリング剤とは、
その分子中にビニル基、エポキシ基、アミノ基、メルカ
プト基のような有機材料と親和性のある有機官能基と、
メトキシ基、エトキシ基のような無機材料と親和性のあ
る加水分解基を有する有機ケイ素化合物のことをいう。
シランカップリング剤中の加水分解基は、金属膜２中の
金属原子と結合し、有機官能基は生理活性物質４と結合
する。これにより金属膜２、有機ケイ素膜３及び生理活
性物質４の三者は強固に固定化される。本発明に使用で
きるシランカップリング剤は、上記定義に該当するもの
であればいかなるものでもよく、３−アミノプロピルト
リエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシ
ラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３
−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシ
ラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）ジメト
キシメチルシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキ
シシラン、ジメトキシ−３−メルカプトプロピルメチル
シランなどを単独又は組み合わせて使用することができ
る。
Ｃ結合を分子内に含む高分子からなる膜をいう。該有機
ケイ素膜３は、例えば、シランカップリング剤を用いて
形成させることができる。シランカップリング剤とは、
その分子中にビニル基、エポキシ基、アミノ基、メルカ
プト基のような有機材料と親和性のある有機官能基と、
メトキシ基、エトキシ基のような無機材料と親和性のあ
る加水分解基を有する有機ケイ素化合物のことをいう。
シランカップリング剤中の加水分解基は、金属膜２中の
金属原子と結合し、有機官能基は生理活性物質４と結合
する。これにより金属膜２、有機ケイ素膜３及び生理活
性物質４の三者は強固に固定化される。本発明に使用で
きるシランカップリング剤は、上記定義に該当するもの
であればいかなるものでもよく、３−アミノプロピルト
リエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシ
ラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３
−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシ
ラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）ジメト
キシメチルシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキ
シシラン、ジメトキシ−３−メルカプトプロピルメチル
シランなどを単独又は組み合わせて使用することができ
る。
【００１７】有機ケイ素膜３は、ケイ素原子が上下方向
に重ならない単分子層膜であることが好ましい。単分子
層膜にすることにより、生理活性物質と相互作用する測
定対象物と、入射した光が反射する面との距離を短くす
ることができ、良好な感度が得られるとともに、使用す
るシランカップリング剤の量を必要最小限に抑え、コス
トの低減化を図ることができる。
に重ならない単分子層膜であることが好ましい。単分子
層膜にすることにより、生理活性物質と相互作用する測
定対象物と、入射した光が反射する面との距離を短くす
ることができ、良好な感度が得られるとともに、使用す
るシランカップリング剤の量を必要最小限に抑え、コス
トの低減化を図ることができる。
【００１８】また、有機ケイ素膜３は、細密充填構造を
とるのが好ましい。細密充填構造とは、有機ケイ素膜３
を構成するＳｉ及びＯの網目構造中に他の分子が貫入す
る余地のないほど、網目構造が緻密であることをいう。
細密充填構造をとることにより、生理活性物質を高い密
度で均等に固定することができ、測定感度を向上させる
ことができる。有機ケイ素膜３が細密充填構造をとるか
どうかは、以下の方法により確認することができる。
とるのが好ましい。細密充填構造とは、有機ケイ素膜３
を構成するＳｉ及びＯの網目構造中に他の分子が貫入す
る余地のないほど、網目構造が緻密であることをいう。
細密充填構造をとることにより、生理活性物質を高い密
度で均等に固定することができ、測定感度を向上させる
ことができる。有機ケイ素膜３が細密充填構造をとるか
どうかは、以下の方法により確認することができる。
【００１９】プロピルエトキシシラン（シランカップリ
ング剤である３−アミノプロピルトリエトキシシランの
アミノ基を水素原子で置換した化合物）を用いて金属膜
２上に有機ケイ素膜３を形成させる。プロピルエトキシ
シランは、強い疎水性を有する化合物なので、有機ケイ
素膜２の表面の濡れ程度により、プロピルエトキシシラ
ンの密度（即ち、有機ケイ素膜３の細密充填の程度）を
知ることができる。即ち、シリンジにより蒸留水を滴下
した際に表面が一様に水滴を弾くのであれば有機ケイ素
膜３は細密充填構造をとっており、表面が部分的にしか
水を弾かないのであれば、細密充填構造をとっておら
ず、Ｓｉ及びＯの網目構造に空隙が存在することが推測
される。
ング剤である３−アミノプロピルトリエトキシシランの
アミノ基を水素原子で置換した化合物）を用いて金属膜
２上に有機ケイ素膜３を形成させる。プロピルエトキシ
シランは、強い疎水性を有する化合物なので、有機ケイ
素膜２の表面の濡れ程度により、プロピルエトキシシラ
ンの密度（即ち、有機ケイ素膜３の細密充填の程度）を
知ることができる。即ち、シリンジにより蒸留水を滴下
した際に表面が一様に水滴を弾くのであれば有機ケイ素
膜３は細密充填構造をとっており、表面が部分的にしか
水を弾かないのであれば、細密充填構造をとっておら
ず、Ｓｉ及びＯの網目構造に空隙が存在することが推測
される。
【００２０】有機ケイ素膜３は、例えば、シランカップ
リング剤を用いることにより形成させることができる。
具体的には、シランカップリング剤の飽和蒸気中に金属
膜２を一定時間暴露する方法（飽和蒸気法）、シランカ
ップリング剤を含む溶液中に金属膜２を一定時間浸漬す
る方法（浸漬法）、スピンコータを用いる方法（スピン
コーティング法）、グラビア印刷機を用いる方法（グラ
ビア法）などにより成膜することができる。本発明にお
いては、これらのいずれの方法を用いてもよいが、細密
充填構造をとる単分子層膜を形成させるためには、飽和
蒸気法を用いるのが好ましい。
リング剤を用いることにより形成させることができる。
具体的には、シランカップリング剤の飽和蒸気中に金属
膜２を一定時間暴露する方法（飽和蒸気法）、シランカ
ップリング剤を含む溶液中に金属膜２を一定時間浸漬す
る方法（浸漬法）、スピンコータを用いる方法（スピン
コーティング法）、グラビア印刷機を用いる方法（グラ
ビア法）などにより成膜することができる。本発明にお
いては、これらのいずれの方法を用いてもよいが、細密
充填構造をとる単分子層膜を形成させるためには、飽和
蒸気法を用いるのが好ましい。
【００２１】飽和蒸気法においては、暴露時の温度、湿
度なども単分子層構造及び細密充填構造の形成に影響を
与えるが、暴露時間が最も重要な要素である。暴露時間
が長すぎると単分子層構造が得られず、また、暴露時間
が短すぎると細密充填構造が得られない。暴露時間は、
通常、１〜600 分とするのが好ましく、15〜90分とする
のが更に好ましい。
度なども単分子層構造及び細密充填構造の形成に影響を
与えるが、暴露時間が最も重要な要素である。暴露時間
が長すぎると単分子層構造が得られず、また、暴露時間
が短すぎると細密充填構造が得られない。暴露時間は、
通常、１〜600 分とするのが好ましく、15〜90分とする
のが更に好ましい。
【００２２】本発明における有機ケイ素膜３は、以下の
ような利点を有する。 生理活性物質４を金属膜２に極めて近い位置に固定
化することができるので、従来の測定チップを使用する
場合よりも大幅に測定感度を向上させることができる。 成膜が容易であり、また、一度に大量の成膜処理が
できる。 シランカップリング剤の種類を変えることにより、
膜厚だけでなく、表面改質、官能基導入などの化学修飾
が可能となる。
ような利点を有する。 生理活性物質４を金属膜２に極めて近い位置に固定
化することができるので、従来の測定チップを使用する
場合よりも大幅に測定感度を向上させることができる。 成膜が容易であり、また、一度に大量の成膜処理が
できる。 シランカップリング剤の種類を変えることにより、
膜厚だけでなく、表面改質、官能基導入などの化学修飾
が可能となる。
【００２３】生理活性物質４としては、測定対象物と相
互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋
白質、酵素、微生物、核酸等が挙げられる。免疫蛋白質
としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなど
を例示することができる。抗体としては、種々の免疫グ
ロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、Ｉｇ
Ｄを使用することができる。具体的には、測定対象物が
ヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清ア
ルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺
虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻
薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合
には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、
抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中で
Ｏ抗原26、55、86、111 、157 などに対する抗体等を使
用することができる。
互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋
白質、酵素、微生物、核酸等が挙げられる。免疫蛋白質
としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなど
を例示することができる。抗体としては、種々の免疫グ
ロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、Ｉｇ
Ｄを使用することができる。具体的には、測定対象物が
ヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清ア
ルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺
虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻
薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合
には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、
抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中で
Ｏ抗原26、55、86、111 、157 などに対する抗体等を使
用することができる。
【００２４】酵素としては、測定対象物又は測定対象物
から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、
特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元
酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素
等を使用することができる。具体的には、測定対象物が
グルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定
対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキ
シダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫
剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、
コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場
合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示
す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールア
ミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ド
ーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができ
る。
から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、
特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元
酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素
等を使用することができる。具体的には、測定対象物が
グルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定
対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキ
シダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫
剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、
コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場
合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示
す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールア
ミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ド
ーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができ
る。
【００２５】微生物としては、特に限定されることな
く、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用すること
ができる。核酸としては、測定の対象とする核酸と相補
的にハイブリダイズするものを使用することができる。
核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれも使用できる。
く、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用すること
ができる。核酸としては、測定の対象とする核酸と相補
的にハイブリダイズするものを使用することができる。
核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれも使用できる。
【００２６】生理活性物質として抗体を用いた場合、通
常は図１に示されるように抗体のＦｃフラグメントが有
機ケイ素膜３の表面のみに固定化され、抗体は単分子層
状態に形成される。但し、抗体のＦａｂフラグメントが
有機ケイ素膜３から離れる程、感度や反応速度が低下す
るため、図３に示すようにＦａｂフラグメント（図３
(a) ）又はＦ(ａｂ')2 フラグメント（図３(b) ）を直
接有機ケイ素膜３に固定化して、感度や反応速度を向上
させてもよい。
常は図１に示されるように抗体のＦｃフラグメントが有
機ケイ素膜３の表面のみに固定化され、抗体は単分子層
状態に形成される。但し、抗体のＦａｂフラグメントが
有機ケイ素膜３から離れる程、感度や反応速度が低下す
るため、図３に示すようにＦａｂフラグメント（図３
(a) ）又はＦ(ａｂ')2 フラグメント（図３(b) ）を直
接有機ケイ素膜３に固定化して、感度や反応速度を向上
させてもよい。
【００２７】生理活性物質４の厚さは、使用する生理活
性物質自体の大きさにもよるが、100 〜3000Åであるの
が好ましく、特に100 〜1000Åであるのが好ましい。生
理活性物質の固定化方法は常法によって行えばよく、例
えば、所定量の生理活性物質４を有機ケイ素膜３に所定
時間接触させることにより固定化することができる。ま
た、フローセル型の表面プラズモン共鳴バイオセンサー
に有機ケイ素膜３を形成させた透明基板１を設置して一
定流量の生理活性物質４を所定時間（所定量）流すこと
によっても固定化できる。
性物質自体の大きさにもよるが、100 〜3000Åであるの
が好ましく、特に100 〜1000Åであるのが好ましい。生
理活性物質の固定化方法は常法によって行えばよく、例
えば、所定量の生理活性物質４を有機ケイ素膜３に所定
時間接触させることにより固定化することができる。ま
た、フローセル型の表面プラズモン共鳴バイオセンサー
に有機ケイ素膜３を形成させた透明基板１を設置して一
定流量の生理活性物質４を所定時間（所定量）流すこと
によっても固定化できる。
【００２８】生理活性物質として抗体を用いた場合であ
って、抗体のＦａｂフラグメントを直接有機ケイ素膜３
に固定化する場合には、パパインを用いて抗体を部分分
解した後、同様の処理を行えばよい。一方、抗体のＦ
(ａｂ')2 フラグメントを直接有機ケイ素膜３に固定化
する場合には、ペプシンを用いて抗体を部分分解した
後、同様の処理を行えばよい。
って、抗体のＦａｂフラグメントを直接有機ケイ素膜３
に固定化する場合には、パパインを用いて抗体を部分分
解した後、同様の処理を行えばよい。一方、抗体のＦ
(ａｂ')2 フラグメントを直接有機ケイ素膜３に固定化
する場合には、ペプシンを用いて抗体を部分分解した
後、同様の処理を行えばよい。
【００２９】本発明の他の一例による測定チップの概略
断面図を図４に示す。本実施例による測定チップは、上
記測定チップとほぼ同様の構成を有するが、有機ケイ素
膜３の上にさらに水溶性二価性試薬により形成した膜
（これを「共有結合膜」という。）６が設けられてお
り、生理活性物質４がこの共有結合膜６を介して有機ケ
イ素膜３に固定されている。
断面図を図４に示す。本実施例による測定チップは、上
記測定チップとほぼ同様の構成を有するが、有機ケイ素
膜３の上にさらに水溶性二価性試薬により形成した膜
（これを「共有結合膜」という。）６が設けられてお
り、生理活性物質４がこの共有結合膜６を介して有機ケ
イ素膜３に固定されている。
【００３０】共有結合膜６を形成する水溶性二価性試薬
は、生理活性物質４を共有結合的に強固に固定化できる
ものであれば、特に限定されない。そのような水溶性二
価性試薬としては、例えばグルタルアルデヒド、過ヨウ
素酸、Ｎ，Ｎ'−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−ス
クシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘ
キサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシニミジルマ
レイミド酢酸、Ｎ−スクシニミジル−４−マレイミド酪
酸、Ｎ−スクシニミジル−６−マレイミドヘキサン酸、
Ｎ−スルホスクシニミジル−４−マレイミドメチルシク
ロヘキサン−１−カルボン酸、Ｎ−スルホスクシニミジ
ル−３−マレイミド安息香酸、Ｎ−（４−マレイミドブ
チリロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ
−（６−マレイミドカプロイロキシ）スルホスクシンイ
ミド・ナトリウム塩、Ｎ−（８−マレイミドカプリロキ
シ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（11−
マレイミドウンデカノイロキシ）スルホスクシンイミド
・ナトリウム塩、Ｎ［２−（１−ピペラジニル）エチ
ル］マレイミド・二塩酸等が挙げられ、それぞれ単独で
又は組み合わせて使用することができる。これらの中で
も、汎用性が高く、取扱いの容易なグルタルアルデヒド
が好ましい。
は、生理活性物質４を共有結合的に強固に固定化できる
ものであれば、特に限定されない。そのような水溶性二
価性試薬としては、例えばグルタルアルデヒド、過ヨウ
素酸、Ｎ，Ｎ'−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−ス
クシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘ
キサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシニミジルマ
レイミド酢酸、Ｎ−スクシニミジル−４−マレイミド酪
酸、Ｎ−スクシニミジル−６−マレイミドヘキサン酸、
Ｎ−スルホスクシニミジル−４−マレイミドメチルシク
ロヘキサン−１−カルボン酸、Ｎ−スルホスクシニミジ
ル−３−マレイミド安息香酸、Ｎ−（４−マレイミドブ
チリロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ
−（６−マレイミドカプロイロキシ）スルホスクシンイ
ミド・ナトリウム塩、Ｎ−（８−マレイミドカプリロキ
シ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（11−
マレイミドウンデカノイロキシ）スルホスクシンイミド
・ナトリウム塩、Ｎ［２−（１−ピペラジニル）エチ
ル］マレイミド・二塩酸等が挙げられ、それぞれ単独で
又は組み合わせて使用することができる。これらの中で
も、汎用性が高く、取扱いの容易なグルタルアルデヒド
が好ましい。
【００３１】このような共有結合膜６を設け、生理活性
物質４を共有結合で強固に固定化することにより、当該
測定チップを洗浄しても生理活性物質４の固定化を維持
できるため、繰り返し測定に使用することができるとい
う利点が得られる。共有結合膜６の厚さは、10〜100 Å
であるのが好ましく、特に10〜20Åであるのが好まし
い。
物質４を共有結合で強固に固定化することにより、当該
測定チップを洗浄しても生理活性物質４の固定化を維持
できるため、繰り返し測定に使用することができるとい
う利点が得られる。共有結合膜６の厚さは、10〜100 Å
であるのが好ましく、特に10〜20Åであるのが好まし
い。
【００３２】共有結合膜６は、水溶性二価性試薬を有機
ケイ素膜３に接触させることにより形成することができ
る。共有結合膜６に生理活性物質４を固定化する方法
は、生理活性物質４を有機ケイ素膜３に固定化する場合
と同様にして行うことができる。
ケイ素膜３に接触させることにより形成することができ
る。共有結合膜６に生理活性物質４を固定化する方法
は、生理活性物質４を有機ケイ素膜３に固定化する場合
と同様にして行うことができる。
【００３３】本発明の測定チップは、例えば、図５に示
されるような表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用
することができる。この表面プラズモン共鳴バイオセン
サーは、カートリッジブロック７と、光源８と、検出器
９とを有し、カートリッジブロック７の上に本発明の測
定チップ10を設置して使用する。測定チップ10は、透明
基板が上になるように設置する。カートリッジブロック
７の上面には凹部が設けられており、この凹部と上記測
定チップ10とで測定セル71が構成される。測定セル71
は、流路72、73によりカートリッジブロック７の外部に
連通しており、試料は流路72を通じて測定セル71中に流
れ込み、測定に供された後流路73を通じて外部に排出さ
れる。
されるような表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用
することができる。この表面プラズモン共鳴バイオセン
サーは、カートリッジブロック７と、光源８と、検出器
９とを有し、カートリッジブロック７の上に本発明の測
定チップ10を設置して使用する。測定チップ10は、透明
基板が上になるように設置する。カートリッジブロック
７の上面には凹部が設けられており、この凹部と上記測
定チップ10とで測定セル71が構成される。測定セル71
は、流路72、73によりカートリッジブロック７の外部に
連通しており、試料は流路72を通じて測定セル71中に流
れ込み、測定に供された後流路73を通じて外部に排出さ
れる。
【００３４】光源８からは、測定チップ10の透明基板に
向かって単色光が照射され（入射光80）、測定チップ10
の裏面に設けられた金属膜で反射したその反射光90が、
検出器９に入光する。検出器９では、反射光90の強度を
検出することができる。
向かって単色光が照射され（入射光80）、測定チップ10
の裏面に設けられた金属膜で反射したその反射光90が、
検出器９に入光する。検出器９では、反射光90の強度を
検出することができる。
【００３５】上記のような構造によって、ある入射角θ
に対して谷を形成する反射光強度曲線が得られる（図１
０参照）。反射光強度曲線における谷は、表面プラズモ
ン共鳴によるものである。即ち、光が測定チップ10の透
明基板と外との界面で全反射するときに、その界面にエ
バネッセント波といわれる表面波が生じ、一方、金属膜
にも表面プラズモンといわれる表面波が生じる。この２
つの表面波の波数が一致すると共鳴が起こり、光のエネ
ルギーの一部が表面プラズモンを励起するために使用さ
れ、反射光の強度が低下する。ここで、表面プラズモン
の波数は、金属膜表面のごく近くにある媒質の屈折率の
影響を受けるため、測定対象物質と生理活性物質との相
互作用により媒質の屈折率が変化すると、表面プラズモ
ン共鳴が生じる入射角θが変化する。従って、反射光強
度曲線の谷のずれによって、測定対象物質の濃度の変化
を検知することができる。入射角θの変化量は共鳴シグ
ナルといわれ、10-4°の変化を１RUとして表す。
に対して谷を形成する反射光強度曲線が得られる（図１
０参照）。反射光強度曲線における谷は、表面プラズモ
ン共鳴によるものである。即ち、光が測定チップ10の透
明基板と外との界面で全反射するときに、その界面にエ
バネッセント波といわれる表面波が生じ、一方、金属膜
にも表面プラズモンといわれる表面波が生じる。この２
つの表面波の波数が一致すると共鳴が起こり、光のエネ
ルギーの一部が表面プラズモンを励起するために使用さ
れ、反射光の強度が低下する。ここで、表面プラズモン
の波数は、金属膜表面のごく近くにある媒質の屈折率の
影響を受けるため、測定対象物質と生理活性物質との相
互作用により媒質の屈折率が変化すると、表面プラズモ
ン共鳴が生じる入射角θが変化する。従って、反射光強
度曲線の谷のずれによって、測定対象物質の濃度の変化
を検知することができる。入射角θの変化量は共鳴シグ
ナルといわれ、10-4°の変化を１RUとして表す。
【００３６】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。 〔実施例１〕本実施例では、図１に示されるような構成
を有する測定チップを作製した。透明基板としては、18
mm×18mm、厚さ0.17mmのカバーグラス（松浪硝子工業社
製）を使用した。この透明基板上に、スパッタリングに
よりクロムからなる層、次いで金からなる層を形成し
た。スパッタリングは、クロムについては100 Ｗ，30秒
間、金については100 Ｗ，150 秒間で行った。得られた
クロム層の厚さは32.2Åであり、金層の厚さは474 Åで
あった。
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。 〔実施例１〕本実施例では、図１に示されるような構成
を有する測定チップを作製した。透明基板としては、18
mm×18mm、厚さ0.17mmのカバーグラス（松浪硝子工業社
製）を使用した。この透明基板上に、スパッタリングに
よりクロムからなる層、次いで金からなる層を形成し
た。スパッタリングは、クロムについては100 Ｗ，30秒
間、金については100 Ｗ，150 秒間で行った。得られた
クロム層の厚さは32.2Åであり、金層の厚さは474 Åで
あった。
【００３７】上記の金属膜を有する透明基板を、シラン
カップリング剤の飽和蒸気中に暴露し、金属膜上に有機
ケイ素膜を形成させた。まず、10mlサンプルびんに原液
のままのγ−アミノプロピルエトキシシラン（H2N-(C
H2)3Si(OEt)3、東芝シリコーン（株）TSL 8331 ）を50
0 μl 入れ、室温で24時間放置し、びん内部をγ−アミ
ノプロピルエトキシシランの飽和蒸気で満たした。次
に、上記で作成した透明基板を、金属膜部分が露出する
ようにＰＥＴ製のマスク（支持具）の中央部に固定し、
このマスクをサンプルびんの開口部に載せ、15分又は90
分間放置し、カバーグラスの金属膜上に有機ケイ素膜を
形成させた。
カップリング剤の飽和蒸気中に暴露し、金属膜上に有機
ケイ素膜を形成させた。まず、10mlサンプルびんに原液
のままのγ−アミノプロピルエトキシシラン（H2N-(C
H2)3Si(OEt)3、東芝シリコーン（株）TSL 8331 ）を50
0 μl 入れ、室温で24時間放置し、びん内部をγ−アミ
ノプロピルエトキシシランの飽和蒸気で満たした。次
に、上記で作成した透明基板を、金属膜部分が露出する
ようにＰＥＴ製のマスク（支持具）の中央部に固定し、
このマスクをサンプルびんの開口部に載せ、15分又は90
分間放置し、カバーグラスの金属膜上に有機ケイ素膜を
形成させた。
【００３８】上記の金属膜及び有機ケイ素膜を有する透
明基板を、市販の表面プラズモン共鳴バイオセンサー
（ファルマシアバイオセンサー社製、BIAcore2000 ）の
カートリッジブロック上に設置した。このセンサーは図
５に示すような構造を有する。このセンサーの測定セル
に５％グルタルアルデヒドを流速１μl/分で20分間流し
込み、次いで、１mg/ml の抗ヒト血清アルブミン抗体を
流速１μl/分で10時間流し込み、有機ケイ素膜の表面に
抗ヒト血清アルブミン抗体を固定化し、測定チップを作
製した。ここで、固定されていない余分な抗体を洗い流
すために、0.1 Ｎの塩酸５μl を流速５μl/min で測定
セルに流し込んだ。
明基板を、市販の表面プラズモン共鳴バイオセンサー
（ファルマシアバイオセンサー社製、BIAcore2000 ）の
カートリッジブロック上に設置した。このセンサーは図
５に示すような構造を有する。このセンサーの測定セル
に５％グルタルアルデヒドを流速１μl/分で20分間流し
込み、次いで、１mg/ml の抗ヒト血清アルブミン抗体を
流速１μl/分で10時間流し込み、有機ケイ素膜の表面に
抗ヒト血清アルブミン抗体を固定化し、測定チップを作
製した。ここで、固定されていない余分な抗体を洗い流
すために、0.1 Ｎの塩酸５μl を流速５μl/min で測定
セルに流し込んだ。
【００３９】上記測定チップを設置した測定セルに、0.
01、10、又は100 μg/mlに希釈したヒト血清アルブミン
（ＨＳＡ）を流速５μl/分で10分間流しながら光強度を
測定し、共鳴シグナル（RU）を求めた。また、対照とし
てウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を流した場合の共鳴シ
グナルも求めた。この結果を図６に示す。図中、●はシ
ランカップリング剤に90分暴露して作製したチップでＨ
ＳＡを測定した場合であり、○はシランカップリング剤
に15分暴露して作製したチップでＨＳＡを測定した場合
であり、■はシランカップリング剤に90分暴露して作製
したチップでＢＳＡを測定した場合であり、□はシラン
カップリング剤に15分暴露して作製したチップでＢＳＡ
を測定した場合である。
01、10、又は100 μg/mlに希釈したヒト血清アルブミン
（ＨＳＡ）を流速５μl/分で10分間流しながら光強度を
測定し、共鳴シグナル（RU）を求めた。また、対照とし
てウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を流した場合の共鳴シ
グナルも求めた。この結果を図６に示す。図中、●はシ
ランカップリング剤に90分暴露して作製したチップでＨ
ＳＡを測定した場合であり、○はシランカップリング剤
に15分暴露して作製したチップでＨＳＡを測定した場合
であり、■はシランカップリング剤に90分暴露して作製
したチップでＢＳＡを測定した場合であり、□はシラン
カップリング剤に15分暴露して作製したチップでＢＳＡ
を測定した場合である。
【００４０】図６に示すように、ＢＳＡを流した場合に
は、共鳴シグナルに変化はみられなかったが、ＨＳＡを
流した場合には、試料濃度と共鳴シグナルに正比例に類
似した関係がみられた。これは、抗体の特異的反応に起
因するものであるものと推測される。これより、本実施
例による測定チップを用いれば、共鳴シグナルの値を測
定することにより抗原を定量することができる。
は、共鳴シグナルに変化はみられなかったが、ＨＳＡを
流した場合には、試料濃度と共鳴シグナルに正比例に類
似した関係がみられた。これは、抗体の特異的反応に起
因するものであるものと推測される。これより、本実施
例による測定チップを用いれば、共鳴シグナルの値を測
定することにより抗原を定量することができる。
【００４１】また、シランカップリング剤に長時間暴露
して作製したチップを使用した場合の方が共鳴シグナル
が高かった。これは、長時間暴露することにより、それ
だけ多くのアミノ基が金属膜上に導入され、その結果固
定化される抗体の数も増加したためと推測される。
して作製したチップを使用した場合の方が共鳴シグナル
が高かった。これは、長時間暴露することにより、それ
だけ多くのアミノ基が金属膜上に導入され、その結果固
定化される抗体の数も増加したためと推測される。
【００４２】（実施例２）実施例１と同様にして作成し
た金属膜及び有機ケイ素膜を有する透明基板を、実施例
１で使用したバイオセンサーのカートリッジブロック上
に設置し、測定セルに５％グルタルアルデヒドを流速１
μl/分で20分間流し込み、次いで、0.5 mg/ml の抗アト
ラジン抗体を流速600 μl/分で５分間流し込み、有機ケ
イ素膜に抗アトラジン抗体を固定化し、測定チップを作
製した。固定化されていない余分な抗体は、実施例１と
同様にして除去した。
た金属膜及び有機ケイ素膜を有する透明基板を、実施例
１で使用したバイオセンサーのカートリッジブロック上
に設置し、測定セルに５％グルタルアルデヒドを流速１
μl/分で20分間流し込み、次いで、0.5 mg/ml の抗アト
ラジン抗体を流速600 μl/分で５分間流し込み、有機ケ
イ素膜に抗アトラジン抗体を固定化し、測定チップを作
製した。固定化されていない余分な抗体は、実施例１と
同様にして除去した。
【００４３】上記測定チップを設置した測定セルに、0.
01、0.1 、１、10、又は100 ppm に希釈したアトラジン
を流速５μl/分で10分間流しながら光強度を測定し、共
鳴シグナル（RU）を求めた。アトラジンは分子量が小さ
いため（MW:215.5）、単独で流すと共鳴シグナルが通常
の抗原を用いた場合の１／５程度しか観測できない。そ
こで、アトラジンを西洋わさび由来ペルオキシダーゼで
標識して流した。また、対照としてＢＳＡを流した場合
の共鳴シグナルも求めた。この結果を図７に示す。図
中、▲はシランカップリング剤に90分暴露して作製した
チップでアトラジンを測定した場合であり、△はシラン
カップリング剤に15分暴露して作製したチップでアトラ
ジンを測定した場合であり、■はシランカップリング剤
に90分暴露して作製したチップでＢＳＡを測定した場合
であり、□はシランカップリング剤に15分暴露して作製
したチップでＢＳＡを測定した場合である。
01、0.1 、１、10、又は100 ppm に希釈したアトラジン
を流速５μl/分で10分間流しながら光強度を測定し、共
鳴シグナル（RU）を求めた。アトラジンは分子量が小さ
いため（MW:215.5）、単独で流すと共鳴シグナルが通常
の抗原を用いた場合の１／５程度しか観測できない。そ
こで、アトラジンを西洋わさび由来ペルオキシダーゼで
標識して流した。また、対照としてＢＳＡを流した場合
の共鳴シグナルも求めた。この結果を図７に示す。図
中、▲はシランカップリング剤に90分暴露して作製した
チップでアトラジンを測定した場合であり、△はシラン
カップリング剤に15分暴露して作製したチップでアトラ
ジンを測定した場合であり、■はシランカップリング剤
に90分暴露して作製したチップでＢＳＡを測定した場合
であり、□はシランカップリング剤に15分暴露して作製
したチップでＢＳＡを測定した場合である。
【００４４】図７に示すように、ＢＳＡを流した場合に
は、共鳴シグナルに変化はみられなかったが、アトラジ
ンを流した場合（90分暴露チップ）には、試料濃度と共
鳴シグナルの間にほぼ正比例の関係がみられた。これ
は、抗体の特異的反応に起因するものであるものと推測
される。これより、本実施例による測定チップを用いれ
ば、共鳴シグナルの値を測定することにより抗原を定量
することができる。なお、15分暴露チップでは、試料濃
度と共鳴シグナルの間に正比例関係がみられなかった
が、これは試料濃度１ppm 程度で抗アトラジンが飽和し
てしまったためと推測される。
は、共鳴シグナルに変化はみられなかったが、アトラジ
ンを流した場合（90分暴露チップ）には、試料濃度と共
鳴シグナルの間にほぼ正比例の関係がみられた。これ
は、抗体の特異的反応に起因するものであるものと推測
される。これより、本実施例による測定チップを用いれ
ば、共鳴シグナルの値を測定することにより抗原を定量
することができる。なお、15分暴露チップでは、試料濃
度と共鳴シグナルの間に正比例関係がみられなかった
が、これは試料濃度１ppm 程度で抗アトラジンが飽和し
てしまったためと推測される。
【００４５】（比較例１）実施例１で使用したバイオセ
ンサーに、該センサー用の市販の測定チップ（抗体未固
定）をカートリッジブロックに設置した。この測定チッ
プは、図８に示されるような構造を有する。
ンサーに、該センサー用の市販の測定チップ（抗体未固
定）をカートリッジブロックに設置した。この測定チッ
プは、図８に示されるような構造を有する。
【００４６】この測定チップが有する多孔性材料（カル
ボキシメチルデキストラン）を活性化するために、１−
エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミ
ド（400 mM／H2O ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド
（100 mM／H2O ）との混合物35μl を流速５μl/min で
測定セルに流し込んだ。次いで、50μg/mlの抗ヒト血清
アルブミン抗体35μl を流速５μl/min で測定セルに流
し込み、カルボキシメチルデキストランに抗ヒト血清ア
ルブミン抗体を固定化した。その後、固定化した抗体を
ブロッキングするためにエタノールアミン35μl を流速
５μl/min で測定セルに流し込み、次いで固定化されて
いない余分な抗体を洗い流すために、0.1Ｎの塩酸５μl
を流速５μl/min で測定セルに流し込んだ。
ボキシメチルデキストラン）を活性化するために、１−
エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミ
ド（400 mM／H2O ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド
（100 mM／H2O ）との混合物35μl を流速５μl/min で
測定セルに流し込んだ。次いで、50μg/mlの抗ヒト血清
アルブミン抗体35μl を流速５μl/min で測定セルに流
し込み、カルボキシメチルデキストランに抗ヒト血清ア
ルブミン抗体を固定化した。その後、固定化した抗体を
ブロッキングするためにエタノールアミン35μl を流速
５μl/min で測定セルに流し込み、次いで固定化されて
いない余分な抗体を洗い流すために、0.1Ｎの塩酸５μl
を流速５μl/min で測定セルに流し込んだ。
【００４７】上記の測定チップを設置した測定セルに、
実施例１と同様にしてＨＳＡを流しながら光強度を測定
し、共鳴シグナル（RU）を求めた。また、対照としてＢ
ＳＡを流した場合の共鳴シグナルも求めた。この結果を
図９に示す。図中、×がＨＳＡを流した場合であり、＋
がＢＳＡを流した場合である。
実施例１と同様にしてＨＳＡを流しながら光強度を測定
し、共鳴シグナル（RU）を求めた。また、対照としてＢ
ＳＡを流した場合の共鳴シグナルも求めた。この結果を
図９に示す。図中、×がＨＳＡを流した場合であり、＋
がＢＳＡを流した場合である。
【００４８】図９に示すように、ＢＳＡを流した場合に
は、共鳴シグナルに変化はみられなかったが、ＨＳＡを
流した場合には、試料濃度と共鳴シグナルの間にほぼ正
比例の関係がみられた。これは、抗体の特異的反応に起
因するものであるものと推測される。
は、共鳴シグナルに変化はみられなかったが、ＨＳＡを
流した場合には、試料濃度と共鳴シグナルの間にほぼ正
比例の関係がみられた。これは、抗体の特異的反応に起
因するものであるものと推測される。
【００４９】〔実施例３〕実施例１と同様にして抗ヒト
血清アルブミン抗体を固定化した測定チップを作製し、
1 、10、又は100 μg/mlに希釈したＨＳＡを流速５μl/
分で10分間流しながら光強度を測定し、共鳴シグナル
（RU）を求めた。また、対照としてＢＳＡを流した場合
の共鳴シグナルも求めた。この結果を図９に示す。図
中、●はシランカップリング剤に90分暴露して作製した
チップでＨＳＡを測定した場合であり、○はシランカッ
プリング剤に15分暴露して作製したチップでＨＳＡを測
定した場合であり、■はシランカップリング剤に90分暴
露して作製したチップでＢＳＡを測定した場合であり、
□はシランカップリング剤に15分暴露して作製したチッ
プでＢＳＡを測定した場合である。
血清アルブミン抗体を固定化した測定チップを作製し、
1 、10、又は100 μg/mlに希釈したＨＳＡを流速５μl/
分で10分間流しながら光強度を測定し、共鳴シグナル
（RU）を求めた。また、対照としてＢＳＡを流した場合
の共鳴シグナルも求めた。この結果を図９に示す。図
中、●はシランカップリング剤に90分暴露して作製した
チップでＨＳＡを測定した場合であり、○はシランカッ
プリング剤に15分暴露して作製したチップでＨＳＡを測
定した場合であり、■はシランカップリング剤に90分暴
露して作製したチップでＢＳＡを測定した場合であり、
□はシランカップリング剤に15分暴露して作製したチッ
プでＢＳＡを測定した場合である。
【００５０】図９において、比較例１の測定チップを使
用した場合と実施例３の測定チップを使用した場合の共
鳴シグナルを比較すると、実施例３の測定チップを使用
した場合には、比較例１の測定チップを使用した場合の
ほぼ２倍の共鳴シグナル（RU）が計測された。従って、
実施例３の測定チップを使用することにより、約２倍の
感度で抗原等の定量が可能である。
用した場合と実施例３の測定チップを使用した場合の共
鳴シグナルを比較すると、実施例３の測定チップを使用
した場合には、比較例１の測定チップを使用した場合の
ほぼ２倍の共鳴シグナル（RU）が計測された。従って、
実施例３の測定チップを使用することにより、約２倍の
感度で抗原等の定量が可能である。
【００５１】〔試験例１〕実施例１で作成した金属膜を
有する透明基板を、実施例１で使用したバイオセンサー
のカートリッジ上に設置し、入射角θに対応する反射光
の強度を測定した。この結果を図10に示す。また、対照
として、金層のみを有し、クロム層を有しない基板につ
いても反射光強度を測定した。図中の−□−が金層及び
クロム層を有する透明基板の反射光強度曲線であり、─
── が金層のみを有する透明基板の反射光強度曲線で
ある。図１０に示すように、金層とクロム層を設けた場
合でも、金層のみを設けた場合でも、表面プラズモン共
鳴が生じることがわかる。
有する透明基板を、実施例１で使用したバイオセンサー
のカートリッジ上に設置し、入射角θに対応する反射光
の強度を測定した。この結果を図10に示す。また、対照
として、金層のみを有し、クロム層を有しない基板につ
いても反射光強度を測定した。図中の−□−が金層及び
クロム層を有する透明基板の反射光強度曲線であり、─
── が金層のみを有する透明基板の反射光強度曲線で
ある。図１０に示すように、金層とクロム層を設けた場
合でも、金層のみを設けた場合でも、表面プラズモン共
鳴が生じることがわかる。
【００５２】
【発明の効果】本発明の測定チップは、製造が容易であ
り、また、固定化する生理活性物質が少量であっても、
良好な感度で測定対象物質を測定することができる。
り、また、固定化する生理活性物質が少量であっても、
良好な感度で測定対象物質を測定することができる。
【図１】本発明の一例による測定チップの概略断面図で
ある。
ある。
【図２】従来の測定チップの概略断面図である。
【図３】本発明の他の例による測定チップの概略断面図
である。(a) は抗体のＦａｂフラグメントを固定化した
例、(b) は抗体のＦ(ａｂ')2 フラグメントを固定化し
た例を示す図である。
である。(a) は抗体のＦａｂフラグメントを固定化した
例、(b) は抗体のＦ(ａｂ')2 フラグメントを固定化し
た例を示す図である。
【図４】本発明の別の例による測定チップの概略断面図
である。
である。
【図５】本発明の測定チップに使用する表面プラズモン
共鳴バイオセンサーの概念図である。
共鳴バイオセンサーの概念図である。
【図６】実施例１で得られた、ＨＳＡ濃度と共鳴シグナ
ルとの関係を示すグラフである。
ルとの関係を示すグラフである。
【図７】実施例２で得られた、アトラジン濃度と共鳴シ
グナルとの関係を示すグラフである。
グナルとの関係を示すグラフである。
【図８】比較例１で使用した測定チップの概略断面図で
ある。
ある。
【図９】実施例３及び比較例１で得られた、ＨＳＡ濃度
と共鳴シグナルとの関係を示すグラフである。
と共鳴シグナルとの関係を示すグラフである。
【図１０】金属膜を形成した基板の反射光強度曲線を示
すグラフである。
すグラフである。
１，１'…透明基板 ２…金属膜 ２'…金属膜 ３…有機ケイ素膜 ４，４'…生理活性物質（抗体） ５…多孔性材料 ６…共有結合膜 ７…カートリッジブロック 71…測定セル 72，73…流路 ８…光源 80…入射光 ９…検出器 90…反射光 10…測定チップ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 永田 良平 東京都新宿区市谷加賀町一丁目１番１号 大日本印刷株式会社内 (72)発明者 中村 洋之 東京都新宿区市谷加賀町一丁目１番１号 大日本印刷株式会社内
Claims (14)
- 【請求項１】 透明基板、該透明基板上に配置される金
属膜、該金属膜上に配置される有機ケイ素膜、及び該有
機ケイ素膜上に配置される生理活性物質を備えているこ
とを特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測
定チップ。 - 【請求項２】 前記生理活性物質が、免疫蛋白質又は酵
素であることを特徴とする、請求項１記載の表面プラズ
モン共鳴バイオセンサー用測定チップ。 - 【請求項３】 前記免疫蛋白質が抗体であることを特徴
とする、請求項２記載の表面プラズモン共鳴バイオセン
サー用測定チップ。 - 【請求項４】 前記抗体が抗ヒト血清アルブミン抗体、
抗アトラジン抗体又は抗メタンフェタミン抗体であるこ
とを特徴とする、請求項３記載の表面プラズモン共鳴バ
イオセンサー用測定チップ。 - 【請求項５】 前記酵素がコレステロールオキシダーゼ
又はアセチルコリンエステラーゼであることを特徴とす
る、請求項２記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー
用測定チップ。 - 【請求項６】 前記抗体のＦａｂフラグメントが有機ケ
イ素膜の表面に固定されていることを特徴とする、請求
項３記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チ
ップ。 - 【請求項７】 前記抗体のＦ(ａｂ')2 フラグメントが
有機ケイ素膜の表面に固定されていることを特徴とす
る、請求項３記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー
用測定チップ。 - 【請求項８】 前記有機ケイ素膜がシランカップリング
剤により形成された膜であることを特徴とする、請求項
１記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チッ
プ。 - 【請求項９】 前記シランカップリング剤が３−アミノ
プロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリ
メトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチル
シラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリ
メトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピ
ル）ジメトキシメチルシラン、３−メルカプトプロピル
トリメトキシシラン及びジメトキシ−３−メルカプトプ
ロピルメチルシランからなる群から選ばれた少なくとも
１種であることを特徴とする、請求項８記載の表面プラ
ズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。 - 【請求項１０】 前記有機ケイ素膜と前記生理活性物質
との間に、さらに水溶性二価性試薬により形成した層が
設けられていることを特徴とする、請求項１記載の表面
プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。 - 【請求項１１】 前記水溶性二価性試薬が、グルタルア
ルデヒド、過ヨウ素酸、Ｎ，Ｎ'−ｏ−フェニレンジマ
レイミド、Ｎ−スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミド
メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−
スクシニミジルマレイミド酢酸、Ｎ−スクシニミジル−
４−マレイミド酪酸、Ｎ−スクシニミジル−６−マレイ
ミドヘキサン酸、Ｎ−スルホスクシニミジル−４−マレ
イミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、Ｎ−ス
ルホスクシニミジル−３−マレイミド安息香酸、Ｎ−
（４−マレイミドブチリロキシ）スルホスクシンイミド
・ナトリウム塩、Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキ
シ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（８−
マレイミドカプリロキシ）スルホスクシンイミド・ナト
リウム塩、Ｎ−（11−マレイミドウンデカノイロキシ）
スルホスクシンイミド・ナトリウム塩及びＮ［２−（１
−ピペラジニル）エチル］マレイミド・二塩酸からなる
群から選ばれた少なくとも１種であることを特徴とす
る、請求項１０記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサ
ー用測定チップ。 - 【請求項１２】 透明基板上に金属膜を配置した後、該
金属膜の上に有機ケイ素膜を配置し、次いで該有機ケイ
素膜上に生理活性物質を配置することを特徴とする、表
面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製造方
法。 - 【請求項１３】 前記有機ケイ素膜をシランカップリン
グ剤を用いて形成させることを特徴とする、請求項１２
記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ
の製造方法。 - 【請求項１４】 シランカップリング剤が、３−アミノ
プロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリ
メトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチル
シラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリ
メトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピ
ル）ジメトキシメチルシラン、３−メルカプトプロピル
トリメトキシシラン及びジメトキシ−３−メルカプトプ
ロピルメチルシランからなる群から選ばれた少なくとも
１種であることを特徴とする、請求項１３記載の表面プ
ラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9073646A JPH10267930A (ja) | 1997-03-26 | 1997-03-26 | 表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9073646A JPH10267930A (ja) | 1997-03-26 | 1997-03-26 | 表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10267930A true JPH10267930A (ja) | 1998-10-09 |
Family
ID=13524273
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9073646A Pending JPH10267930A (ja) | 1997-03-26 | 1997-03-26 | 表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10267930A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000146976A (ja) * | 1998-11-09 | 2000-05-26 | Japan Science & Technology Corp | Ｓｐｒセンサー用金属薄膜、その製法およびそれを用いた測定方法 |
| US6726881B2 (en) * | 2001-09-03 | 2004-04-27 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Measurement chip for surface plasmon resonance biosensor |
| WO2004079367A1 (ja) * | 2003-01-15 | 2004-09-16 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | バイオアレイ |
| WO2008053016A1 (fr) * | 2006-11-03 | 2008-05-08 | Commissariat A L'energie Atomique | Structure amelioree de detection optique pour capteur par resonance plasmon. |
| JP2009515138A (ja) * | 2005-07-07 | 2009-04-09 | ザ ユニヴァーシティー オブ ニューカッスル | 生物学的分子の固定化 |
| KR20190135869A (ko) * | 2018-05-29 | 2019-12-09 | 주식회사 큐에스택 | 수직 채널을 포함하는 바이오 센서 |
| WO2022131857A1 (ko) * | 2020-12-18 | 2022-06-23 | (주)프로테옴텍 | Pet 기판을 이용한 바이오 센서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 미생물의 항생제 감수성 검사방법 |
-
1997
- 1997-03-26 JP JP9073646A patent/JPH10267930A/ja active Pending
Cited By (11)
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| US8031341B2 (en) | 2006-11-03 | 2011-10-04 | Commissariat A L'energie Atomique | Optical detection structure for a plasmon resonance sensor |
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| KR20220088083A (ko) * | 2020-12-18 | 2022-06-27 | (주)프로테옴텍 | Pet 기판을 이용한 바이오 센서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 미생물의 항생제 감수성 검사방법 |
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