JP2000146976A

JP2000146976A - Ｓｐｒセンサー用金属薄膜、その製法およびそれを用いた測定方法

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Publication number: JP2000146976A
Application number: JP10318087A
Authority: JP
Inventors: Koji Suzuki; 鈴木　　孝治
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1998-11-09
Filing date: 1998-11-09
Publication date: 2000-05-26
Anticipated expiration: 2018-11-09
Also published as: JP3657790B2

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、センサー表面を様々な特性や機能
を有する高分子を用いて化学修飾することで、より多く
の生体成分を検出できるセンサーデバイスを提供する。
より具体的には、金属薄膜をセンサー基盤として用い、
デバイスとして表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon R
esonance :ＳＰＲ）装置を使用して、抗原-抗体反応を
利用した高感度免疫センサーを提供する。【解決手段】本発明は、自由電子金属表面を有する金
属薄膜の表面が、（１）金属表面に固定され得る官能基
及びポリマーと結合し得る官能基を有する有機リンカ
ー、並びに、（２）検出用試薬に直接結合し得る官能基
若しくは検出用試薬にスペーサーを介して結合し得る官
能基及び前記有機リンカーと結合し得る官能基を有する
ポリマー、で処理されてなる金属薄膜に関する。より詳
細には、本発明は、当該ポリマーが、キトサン又はポリ
エチレンイミンなどのアミノ基を有するポリマーである
前記金属薄膜に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ポリマーが結合し
た有機リンカーで表面処理された金属薄膜、それを用い
た表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置、及び、それによ
る試料を検出、同定又は定量する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】今日、感染症の検査や診断の分野におい
て免疫測定法が広く利用されている。一般に、通常の感
染症では体内に多量の抗体が作り出され、この抗体の有
無を見分けることで診断を行っている。また、血清、
尿、唾液など体液中の成分(血糖値、コレステロールな
ど)の値も、患者の病態を把握し治療方針を検討するう
えで大切なパラメータとなっている。診断の際、試料の
採取量には制約があり、頻回の採取は難しいため測定法
には高い精度(再現性)と感度が要求される。しかも目的
成分は、通常生体試料という複雑なマトリックス中に微
量しか含まれていないため、信頼度の高い分析結果を的
確に得ることは極めて重要である。

【０００３】一方、表面プラズモン共鳴(Surface Plasm
on Resonance :ＳＰＲ）センサーは、金や銀などの金属
薄膜表面に発生する表面プラズモン共鳴現象を検出する
デバイスである。表面プラズモンとは、金属−誘電体界
面に生じる電子の疎密波の一種であり、その波数は金属
薄膜表面に接する数１００ｎｍまでの試料の厚さや光学
特性（誘電率、屈折率）によって変化する。この変化を
直接測定することは不可能なため、ＳＰＲセンサーでは
レーザー光を試料の反対面から当てエバネッセント波を
発生させ、これが表面プラズモンと共鳴する時のレーザ
ーの入射角度変化（SPR angle shift)を測定することで
表面の状態の変化を間接的に測定するのが一般的な方法
となっている。

【０００４】このセンサーは、１９７１年にクレチュマ
ン（Kretschmann）により光励起による表面プラズモン
励起法が確立され、それから１１年後になってＳＰＲが
初めてナイランダー（Nylander）らによってセンサーと
してガスセンシングに応用された例が報告された。この
センサーは試料の存在によるバルクの屈折率変化を捕ら
えた単純なものであったが、１９９０年頃までには、試
料液中のアルコール濃度等を対象としたこの種のセンサ
ーの開発がさかんに行われた。

【０００５】１９８０年代後半には、チオール、スルフ
ィド類等の金表面に対する自己吸着の研究が行われ、カ
ルボン酸やアミノ基など様々な官能基をもったアルキル
チオール類で金表面を修飾した自己吸着性単層膜（Self
-Assembled Monolayer）の研究例が報告された。１９９
３年には、金表面の自己吸着性単層膜（Self-Assembled
Monolayer）上に電荷を有するもうひとつの層を形成さ
せた、２層構造の活性部位に抗原-抗体などの特異的な
反応を示すリガンドを固定したバイオセンサーが開発さ
れ、定性、定量分析や反応プロセスの解明などに用いら
れるようになった（Stelzle, M.,et al., J. Phys. Che
m., 97, 2974-2981 (1993)）。

【０００６】また、この頃から小型化を目的とした光フ
ァイバー型SPRセンサーの研究例が報告され始め、従来
の光源の波長を一定にし、試料への共鳴の起こる入射角
を測定する方法から、光の入射角を一定にし波長を変化
させるセンサー装置が開発された。１９９５年以降は、
ＳＰＲセンサーを利用した多くのセンシング例が報告さ
れ、特にバイオセンサーの分野でセンサーの高感度化や
新規リガンド測定を目的とした数多くの研究例が報告さ
れている。

【０００７】ＳＰＲ化学センサーの開発において、セン
シング部の金属薄膜に何らかの修飾を施すことが要求さ
れ、ＳＰＲセンサーをバイオセンサーに応用させるに
は、官能基を有するポリマーの金属薄膜への修飾が考え
られる。金属薄膜に金薄膜を用いる場合、金へのチオー
ル、スルフィド類の自己吸着性（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍ
ｂｌｙ）を利用する修飾法が考えられ、実際にＳＰＲバ
イオセンサーにおけるセンサー表面へのリガンドの固定
化にはＡｕ薄膜上に自己吸着したアルカンチオールをリ
ンカーレイヤーとして、カルボキシメチルデキストラン
（ＣＭＤ）層を導入しそのＣＭＤ層に固定化する方法が
報告されている。ＣＭＤ層の役割は固定するリガンド量
の増加、金薄膜への生体分子の非特異的結合防止などで
ある。チオール、スルフィド類の修飾方法は、Ｃｌａｉ
ｒｅＥ．Ｊｏｒｄａｎらの論文（Jordan,C.E., et al.,
Langmuir, 1994, 10,3642-3648）では１ｍＭのチオー
ルのエタノール溶液に１ｈ、金薄膜を浸すだけで９０％
の吸着率という簡単なもので、吸着の評価はＸＰＳ（Ｘ
線光電子分光法）やＳＰＲ角変化を見ることで可能であ
る。

【０００８】また、特表平４−５０１６０５号には、金
属表面に結合する層の上にヒドロゲルなどの生適合性多
孔質マトリックスの層を設けてなる検出表面についての
発明が記載されており、特表平４−５０１６０６号には
二官能性又は多官能性分子を用いるセンサーユニットに
ついての発明が記載されており、また、特表平４−５０
１６０７号にはセンサー表面にリガンドが結合したセン
サーを用いる巨大分子の特性の決定方法についての発明
が記載されている。特表平７−５０７８６５号には可逆
的結合受容体を含む固定化された結合パートナーを含む
固体支持体を用いて試料中の関心のある分析対象物を検
出する方法及び装置についての発明が記載されている。
また、ＷＯ９６／１０１７８には、自己吸着性単層膜
（Self-Assembled Monolayer）上に膜形成蛋白質又は脂
質を結合させた気質表面の製造方法についての発明が記
載されている。

【０００９】ＳＰＲセンサーは、エバネッセント波を用
いて間接的に試料の状態変化を測定するデバイスである
ので、測定に使われるレーザー光の通る部位と試料の存
在する部位が異なるので、従来の光学センサーと比較し
て次のような利点がある。１．センサー表面で起こる試料の屈折率変化がリアルタ
イムで検出できるので、実験の進行状況および速度論的
な関係を知ることができる。２．測定に使用するレーザー光が試料溶液中を通過しな
いので、試料溶液の着色、濁りや気泡などの影響を受け
にくい。３．センサー基盤表面から１μｍほどの、ごく狭い領域
での光学特性が検出されるので、必要とする試料溶液の
量が極めて少なくてすみ、バックグランドノイズの影響
を受けにくい。しかしながら、従来のセンサー表面の処理ではＳＰＲの
感度が良好ではなく、また、反応性も充分でなくリアル
タイムでの測定には実用的なものではなかった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、センサー表
面を様々な特性や機能を有する高分子を用いて化学修飾
することで、より多くの生体成分を検出できるセンサー
デバイスを提供することを目的としている。具体的に
は、金属薄膜をセンサー基盤として用い、デバイスとし
て表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance :Ｓ
ＰＲ）装置を使用して、抗原-抗体反応を利用した高感
度免疫センサーを提供することを目的としている。さら
に、糖質結合タンパク（Concanavalin A :ConA)を利用
した新規糖質センサーを提供することを目的としてい
る。また、本発明はこれらの新規なセンサー用の金属薄
膜、それを用いたＳＰＲ装置、それを用いた試料の検
出、同定又は定量方法を提供するものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、自由電子金属
表面を有する金属薄膜の表面が、（１）金属表面に固定
され得る官能基及びポリマーと結合し得る官能基を有す
る有機リンカー、並びに、（２）検出用試薬に直接結合
し得る官能基若しくは検出用試薬にスペーサーを介して
結合し得る官能基及び前記有機リンカーと結合し得る官
能基を有するポリマー、で処理されてなる金属薄膜に関
する。より詳細には、本発明は、当該ポリマーが、キト
サン又はポリエチレンイミンなどのアミノ基を有するポ
リマーである前記金属薄膜に関する。

【００１２】また、本発明は、前記ポリマーにさらに、
検出用試薬が直接又は検出用試薬に結合し得る官能基を
有するスペーサーを介して検出用試薬が結合している金
属薄膜に関する。本発明の金属薄膜は、表面プラズモン
共鳴（ＳＰＲ）の測定用の高感度のセンサー薄膜として
有用である。

【００１３】また、本発明は前記金属薄膜の製造方法、
これを用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による測定
方法、そのためのキット、及び、表面プラズモン共鳴
（ＳＰＲ）測定装置に関する。

【００１４】本発明の金属薄膜の表面は、（１）一方が
金属薄膜表面に固定されている有機リンカー層、（２）
有機リンカー層に結合するポリマー層、（３）ポリマー
層に直接又はスペーサーを介して結合する検出用試薬層
からなるものである。

【００１５】本発明の有機リンカー層は、金属表面に固
定され得る官能基とポリマーと結合し得る官能基の間
が、炭素原子、酸素原子、及び、窒素原子からなる群か
ら選ばれる原子からなり、直鎖部分が２〜２０原子、好
ましくは２〜１５原子、より好ましくは２〜１０原子で
ある直鎖状若しくは分枝状又は環状の化学構造を有する
ものであればよく、単一の分子種であってもよいが、２
種以上の分子種を用いて設計されるものであってもよ
い。２種以上の分子種を用いる場合には、比較的反応性
に富む官能基を使用することができ、短時間で且つ安価
に有機リンカー層を形成することがでるので、より好ま
しい本発明の態様となる。

【００１６】本発明の有機リンカー層を形成する金属表
面に固定され得る官能基及びポリマーと結合し得る官能
基を有する有機リンカーの「金属表面に固定され得る官
能基」としては、金属表面と化学結合により固定される
官能基であってもよいが、吸着により固定され得る官能
基であってもよい。このような官能基としてはメルカプ
ト基、スルフィド基又はジスルフィド基のような硫黄原
子を含有するものが好ましい。また、「ポリマーと結合
し得る官能基」としては、使用するポリマーが含有して
いる官能基に応じて種々の官能基を選択することができ
る。例えば、ポリマーがアミノ基を含有している場合に
は、カルボキシル基やカルボニル基などを選択すること
ができるし、ポリマーがカルボキシル基を含有している
場合には、アミノ基や水酸基などを選択することができ
る。本発明におけるカルボニル基は、アルデヒド基やケ
ト基を包含するものであり、好ましくはアルデヒド基で
ある。

【００１７】本発明の有機リンカーとして単一の分子種
を用いる場合には、例えば、メルカプト基、スルフィド
基又はジスルフィド基のような硫黄原子を含有する官能
基を有する炭素数２〜２０、好ましくは２〜１５、より
好ましくは２〜１２の脂肪酸を使用することができる。
より具体的には、例えば、１１−メルカプト−ウンデカ
ン酸が挙げられる。

【００１８】より好ましい本発明の有機リンカーとして
は、２種以上の分子種を用いて形成されるものが挙げら
れる。金属表面に固定される第一の分子種としては、
「金属表面に固定され得る官能基」としてメルカプト
基、スルフィド基又はジスルフィド基のような硫黄原子
を含有する官能基を有し、かつ、第二の分子種と化学結
合を形成し得る他の反応性の官能基を有する有機化合物
が挙げられる。反応性の官能基としては、第二の分子種
と化学結合を形成し得るものであればよく、例えば、ア
ミノ基、水酸基、カルボキシル基などが挙げられる。反
応性や入手の容易さからメルカプト基、スルフィド基又
はジスルフィド基のような硫黄原子を含有する官能基を
有するアミノ酸又はその誘導体が好ましく、より具体的
にはシステインアルキルエステルが好ましい。アルキル
エステルとしては、炭素数１〜１０、好ましくは１〜５
のアルキルエステルが好ましい。より具体的には、シス
テインメチルエステル、システインエチルエステルなど
が挙げられる。

【００１９】本発明の有機リンカーを形成する第一の分
子種に結合する第二の分子種としては、第一の分子種の
反応性の官能基に化学結合し得る官能基を有し、次のポ
リマー層を形成するポリマーに結合し得る官能基を有す
る有機化合物であり、これらの官能基としては、例え
ば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、カルボニル基
などが挙げられる。好ましい第二の分子種としては、例
えば、反応性に富むカルボニル基を有する化合物が好ま
しく、より具体的にはグルタルアルデヒドなどが挙げら
れる。本発明の有機リンカーを形成する分子種として
は、種々の有機化合物の組み合わせが存在するが、好ま
しい組み合わせとしては、第一の分子種としてシステイ
ンメチルエステルを用い、第二の分子種としてグルタル
アルデヒドを用いたものが挙げられ、このものは官能基
を特別な活性化操作（例えば、カルボキシル基を活性エ
ステルにするなどの。）をすることなく反応が進行する
ので好ましい本発明の態様とすることができる。

【００２０】本発明の有機リンカーを金属表面に固定す
る方法としては、有機リンカーとなる化合物を金属に接
触させることにより行うことができる。接触させる前に
金属表面を水酸化カリウムなどのアルカリで洗浄してお
くことが好ましい。金属表面との接触は、ジメチルホル
ムアミド（ＤＭＦ）などの有機溶媒や水などの存在下に
行うのが好ましい。次いで、必要に応じて第二の分子種
を反応させることにより、有機リンカー層を形成するこ
とができる。この場合に必要に応じて、反応に関与する
官能基を活性化してから行うこともできる。

【００２１】本発明のポリマー層を形成するポリマーと
しては、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、カルボニ
ル基などの有機リンカー中の「ポリマーに結合し得る官
能基」と結合し得る反応性の官能基を有し、かつ、検出
用試薬又は検出用試薬を結合するためのスペーサーを結
合し得る官能基を有するポリマーである。これらのポリ
マー中の「反応性の官能基」と「検出用試薬などに結合
し得る官能基」とは異なる官能基であってもよいが、同
種じ官能基であってもよい。好ましい官能基としては、
アミノ基、カルボキシル基、水酸基、カルボニル基など
が挙げられる。有機リンカー中の「ポリマーに結合し得
る官能基」がアルデヒド基などのカルボニル基の場合に
は、第一級アミノ基を有するポリマーが好ましい。ポリ
マー中の第一級アミノ基は、ポリマーの主鎖に結合する
ものであってもよいが、ポリマーの側鎖に結合するもの
が好ましい。

【００２２】本発明のポリマーを例示すれば、ポリアル
キレンイミンや多糖類、ポリリジンなどが挙げられる
が、ポリ低級アルキレンイミンやアミノ糖を含有する多
糖類が好ましい。ポリアルキレンイミンはアルキレンジ
アミンの重合体が挙げられ、側鎖部分に第一級アミノ基
が存在している重合体が好ましいが、重合後に化学修飾
により側鎖部分に第一級アミノ基を導入したものであっ
てもよい。アルキレンジアミンとしては、炭素数２〜１
０、好ましくは２〜６のアルキレン基を有するジアミン
であり、好ましくはエチレンジアミンが挙げられる。好
ましいアルキレンジアミンの重合体としては、例えば、
次式で示される繰り返し単位を有するポリエチレンイミ
ンが挙げられる。

【００２３】

【化１】

【００２４】多糖類としては、アミノ糖を含有する多糖
類が好ましく、アミノ糖が重合したものでも、アミノ糖
が部分的に導入されているものでもよいが、キトサンの
ようにアミノ糖が重合した多糖類が好ましい。たま、多
糖類にアミノ基などの反応性の官能基を導入したもので
あってもよい。これらのポリマーの分子量は、ポリマー
の種類によっても異なるが、一般的には、１，０００〜
１，０００，０００、好ましくは５，０００〜１，００
０，０００、より好ましくは５，０００〜５００，００
０程度である。

【００２５】有機リンカーとポリマーとを結合させる方
法としては、これらを溶媒の存在下に直接反応させるこ
ともできるが、反応性が充分でない場合にはこれらの官
能基を活性化、例えば、活性エステル化などにより活性
化させて、反応させることもできる。原料物質として、
システインメチルエステル、グルタルアルデヒド及びポ
リエチレンイミンを用いた場合の本発明の金属薄膜の処
理法を、図１に示す。金属薄膜を温めた水酸化カリウム
水溶液に数回つけることで洗浄した後、Ｌ−システイン
メチルエステルのＤＭＦ溶液に浸すことにより図１の
（１）の状態とし、これを、グルタルアルデヒド水溶液
で処理して図１の（２）の状態にし、これにポリエチレ
ンイミン水溶液を浸して図１の（３）のポリエチレンイ
ミン膜を有するセンサープローブとすることができた。

【００２６】また、原料として、システインメチルエス
テル、グルタルアルデヒド及びキトサンを用いた場合の
本発明の金属薄膜の処理法を、図２に示す。図２では、
さらに、スペーサーとしてα−ブロム酢酸が使用されて
いる。図１に示した方法と同様な方法により、金属薄膜
を洗浄した後、Ｌ−システインメチルエステルＤＭＦ溶
液及びグルタルアルデヒド水溶液で処理して有機リンカ
ー部分を調製し、これに１％キトサン水溶液を接触させ
ることによりキトサンを固定化してセンサープローブを
調製した。次いで、キトサンをα−ブロム酢酸の水酸化
ナトリウム溶液でカルボキシル化して、カルボキシメチ
ル（スペーサー部分）化されたＣＭ−キトサンセンサー
プローブを調製した。

【００２７】本発明の検出用試薬としては、試料中の特
定の物質を検出、同定又は定量することができる試薬で
あって、前記ポリマーに吸着又は結合などにより固定で
きるものでれば特に制限はないが、カルボキシル基やア
ミノ基などの官能基を有するものが好ましい。好ましい
検出用試薬として、蛋白質が挙げられる。より詳細に
は、抗原又は抗体が挙げられる。本発明の検出用試薬を
直接前記したポリマー層に固定することもできるが、固
定するに当たって必要に応じてスペーサーとなる物質を
用いて両者を固定することもできる。スペーサーとして
は、多官能性の種々の物質を使用することができる。比
較的長鎖の物質を使用することもできるが、炭素数が２
〜１５、好ましくは２〜１０程度の短いものが好まし
い。スペーサーとして使用される化合物としては、例え
ば、α−ブロム酢酸、α−クロル酢酸などのハロカルボ
ン酸、グルタル酸、アジピン酸、スベリン酸などのジカ
ルボン酸などが挙げられる。

【００２８】図３に、図１に示したポリエチレンイミン
膜を有する金属薄膜にスペーサーとしてスベリン酸を用
い、活性エステル化法により検出用試薬（図３中ではリ
ガンドとして示されている。）を固定する方法を示す。
図４に、図２に示したＣＭ−キトサンセンサープローブ
に検出用試薬（図４中ではリガンドとして示されてい
る。）を固定する方法を示す。図４中のＥＤＣは１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミドを示し、ＮＨＳはＮ−ヒドロキシサクシンイミドを
示す。

【００２９】本発明の金属薄膜に使用される金属として
は、自由電子を有する金属であればよく、例えば、金、
銀、銅、アルミニウム、クロムなどが挙げられる。好ま
しい金属は、金であるが、銀、銅、アルミニウなども好
ましい金属である。金属薄膜は金属を延ばして製造され
るものであってもよく、また、基板に蒸着などの方法で
形成されるものであってもよい。金属薄膜の厚さは、測
定可能な厚さであれば特に制限はないが、５０〜１，０
００ｎｍ、好ましくは５０〜５００ｎｍ、より好ましく
は１００〜５００ｎｍ程度である。

【００３０】表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Res
onance :ＳＰＲ）装置に本発明の金属薄膜を使用する場
合には、プリズムなどの基板に本発明の金属薄膜が密着
されて使用される。図５に本発明の金属薄膜の調製法
と、表面プラズモン共鳴装置の概要を示す。図５に示さ
れるように本発明の金属薄膜を調製法としては、バッチ
法とオールフローインジェクト法（ＡＦＩ法）がある。
バッチ法は、有機リンカー層、ポリマー層、検出用試薬
などを形成させるための必要な物質（図５中ではＡ液、
Ｂ液、Ｃ液として示されている。）で金属薄膜を処理し
て、処理された金属薄膜（センサープローブ）を調製し
た後、これをＳＰＲ装置にセットして試料を添加して測
定する方法である。

【００３１】また、ＡＦＩ法は、ＳＰＲ装置にセットさ
れた金属薄膜に順次、処理溶液を金属薄膜に流すことに
より、セットされた金属薄膜を所望の状態に処理するも
のである。より詳細には、図５に示されるように、ＨＰ
ＬＣ用のポンプなどのポンプにより常時緩衝液など（例
えば、ランニングバァファー（ｐＨ７．４１０ｍＭＨ
ＢＳ（ＨＥＰＥＳＢｕｆｆｅｒＳａｌｉｎｅ）／Ｔ
ｕｅｅｎ））を、流速が０．１〜１．０、好ましくは
０．２〜０．４ｍｌ／ｍｉｎで流しておき、必要な時に
各反応試薬を含有する溶液をインジェクターから注入す
ることで、金属薄膜（センサープローブ）に供給させる
ことにより必要な処理を行うことができる。そして、こ
の間測定を継続することも可能であり、金属薄膜の測定
面の反対側で生起している反応を、反応系に直接光やマ
イクロ波などの測定線を照射することなく反応系を測定
することができる。

【００３２】ＡＦＩ法は、測定を継続しつつ金属薄膜の
表面を処理することができるので、表面の状態をリアル
タイムで把握することができる。また、金属薄膜の表面
に固定された検出用試薬と試料中の物質との相互の動向
（化学反応などの）を逐次測定し観察することができ
る。本発明はバッチ法及びＡＦＩ法のいずれの方法をも
包含するものである。

【００３３】材料に目的とする性能、機能を付与するた
めには材料表面を分子レベルで設計し機能特性をもたせ
ることが重要となってくる。そのため、今日の臨床化学
分野における抗原-抗体反応や、セルレセプター認識を
用いた生体物質のセンシングにおいてそのセンサー材料
表面及び、生体物質間の相互作用を含めた反応プロセス
の理解は大切な課題となっている。

【００３４】本発明では、様々な官能基を有する高分子
を用いてセンサー表面を構築することで、幅広い物質の
固定化、検出に利用できるセンサープローブを構築する
ことを目的とした。具体的には、金薄膜をセンサー基盤
として用い、デバイスとして表面プラズモン共鳴(Surfa
ce Plasmon Resonance :ＳＰＲ)装置を使用して、セン
サー表面の設計を行った。

【００３５】より具体的には、抗原-抗体反応を利用し
た高感度免疫センサーを開発するために、タンパク質を
固定化するに当たって、金表面を修飾する膜として、異
なる官能基を有する高分子であるポリエチレンイミン
（polyethyleneimine(PEI)）、及びキトサン（chitosa
n）に着目した。ＰＥＩ膜は膜中に存在する一級アミン
を、キトサン膜はカルボキシル基を活性化させて、タン
パク質中のアミノ基とバインディングサイトを持たせ、
そこに抗原を化学結合させてセンサ−膜を作製した。
本発明では、この作製方法として、従来から行われてい
るバッチ法の他に、すべての試薬をフロ−系に導入して
固定化するオ−ルフロ−型固定化法も開発した。作製し
たセンサ−膜に、抗体が特異的に結合した際のＳＰＲア
ングルシフトによりその定量を行った。

【００３６】また、糖質結合タンパク（Concanavalin A
:ConA)を利用した新規糖質センサーの開発において
は、まず、糖質としてグルコースを測定対象とした。Ｃ
ｏｎＡの特性として、ｐＨ７付近でグルコースとの４つ
のバインディングサイトを持っているためグルコースに
対する吸着性は高い。しかし、あらかじめＣｏｎＡとグ
ルコースを混合し、バインディングサイトがいくつかグ
ルコースと結合したものを作用させると、その選択的吸
着性は低下し、この変化は、ＣｏｎＡの濃度を一定とす
れば、混合するグルコース濃度に対応してくると考え
た。この特性を利用し、Ａｕ表面をグルコースユニット
で修飾してやることで、そこに吸着するＣｏｎＡの濃度
から逆にグルコース濃度の測定を行った。

【００３７】本発明の方法は、特にポリマー層に直接又
はスペーサーを介して固定された抗原又は抗体と、試料
中の抗体又は抗原との反応を測定するのに有利な方法で
である。例えば、抗体タンパク質を多量に固定化し、高
感度に検出するため、金属表面を修飾する膜材として
は、異なる官能基を有する高分子であるポリエチレンイ
ミン（ＰＥＩ）、及びカルボキシメチル化キトサン（Ｃ
Ｍ−ｃｈｉｔｏｓａｎ）が特に好ましい。ＰＥＩは膜中
に存在する一級アミンを、ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎはカ
ルボキシル基を活性化し、抗体と特異的に反応するリガ
ンドを化学結合させてセンサ−プローブ表面を構築し
た。

【００３８】本発明ではこれらの表面を作製する際、従
来から行われているバッチ法に加え、すべての試薬をフ
ロ−系に導入して固定化するオ−ルフロ−インジェクト
（ＡＦＩ）法も検討した。作製したセンサ−プローブを
利用して、具体的には、プロテインＡ−ヒト免疫グロブ
リンＧ（ｈＩｇＧ）、抗ヒト免疫グロブリンＧ（ａｎｔ
ｉ−ｈＩｇＧ）−ヒト免疫グロブリンＧ（ｈＩｇＧ）系
におけるＳＰＲ応答を検討した。

【００３９】今回の実験に使用したＳＰＲセンサー（Ｄ
ＫＫ製）は、図５に示すフロースルーのシステムが実行
できるものである。ＡＦＩ法により実験を行う場合に
は、ＨＰＬＣ用のポンプによって常時ランニングバァフ
ァー（ｐＨ７．４１０ｍＭＨＢＳ（ＨＥＰＥＳＢｕ
ｆｆｅｒＳａｌｉｎｅ）／Ｔｕｅｅｎ）を流速０．２
〜０．４ｍｌ／ｍｉｎで流しておき、各試料溶液をイン
ジェクターから注入することで、ＳＰＲ装置中のセンサ
ープローブと接触させ、そのデータをコンピューターに
よって出力している。

【００４０】次に本発明をより具体的に説明するが、本
発明はこれらの具体例に限定されるものではない。本発
明のより具体的な説明において使用する略号を、以下に
まとめて示しておく。

【００４１】化合物ＢＳＡ；ウシ血清アルブミン（Bovine serum albumi
n）。ＢＳ３；スベリン酸ビス（スルホサクシンイミドイル）
（Bis(sulfosuccinimidyl) suberate。ＣＡＰ；セルロースアセテートフタレート（Cellulose
acetate phtalate）。ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ；カルボキシメチルキトサン
（Carboxymeyhylatedchitosan）。ＥＤＣ；１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド（1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopro
pyl) carbodiimide）。ＨＢＳ；ＨＥＰＥＳ緩衝液（HEPES Buffer Saline）。ｈＩｇＧ；ヒト免疫グロブリンＧ（human immunoglobul
in G）。ＮＨＳ；Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（N-Hydroxysuc
cinimide）。ＰＥＩ；ポリエチレンイミン（Polyethylene imine）。

【００４２】溶媒ＡｃＯＨ；酢酸（Acetic Acid ）。ＤＭＦ；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（N,N-Dimethyl
formamide）。ＥｔＯＨ；エタノール（Ethanol）。ｉ−ＰｒＯＨ；イソプロパノール（Isopropanol）。

【００４３】まず、金薄膜を７０℃ほどに温めた１ＭＫ
ＯＨ水溶液に数回つけることで洗浄した後、５ｍＭＬ
−システインメチルエステルのＤＭＦ溶液に、２４時間
浸すことにより、図１の（１）の状態とした。これを、
５％グルタルアルデヒド水溶液で２時間処理して図１の
（２）の状態とし、次いで２％ＰＥＩ水溶液に２時間浸
し図１の（３）で示されるのＰＥＩ膜センサープローブ
を得た。

【００４４】このようにして調製されたセンサープロー
ブの有機リンカー部分の表面構造は、一部のグタルアル
デヒドが２分子のシステインのアミノ基と結合して２個
のアルデヒド基を消費した状態のものなどがあり、分子
が金属表面に規則正しく整列している自己吸着性単層膜
（Self-Assembled Monolayer）の状態とは異なる状態を
形成しているものと考えられる。詳細な金属表面の状態
はＸＰＳなどの表面分析を利用しその厚さを測定するこ
とにより把握することができるであろう。

【００４５】次に、作製したプローブをＳＰＲ装置にセ
ットし、ｐＨ７．４ＨＢＳＴ／バッファーによるベ
ースラインが安定した後、膜中に存在する未反応のグル
タルアルデヒドを０．１Ｍグリシン溶液をインジェク
トすることでブロックした。この後、ＰＥＩ膜中の一級
アミンをスペーサーであるＢＳ３で活性化させ、０．５
ｍｇ／ｍｌＢＳＡを固定化した時の結果を図６に示
し、次いで、０．１ｍｇ／ｍｌｈＩｇＧを添加した時
の結果を図７に示す。

【００４６】図６及び図７は、ＳＰＲの測定結果であ
り、横軸に時間（分）、縦軸にレスポンス（アーク秒
（１度は３６００アーク秒））を示す。図６中の、
（１）はｐＨ７．４ＨＢＳＴ／バッファーを添加し
た時点を、（２）はＢＳ３を添加した時点を、（３）は
０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した時点を、（４）は
グリシンｐＨ３を添加した時点をそれぞれ示している。
ＢＳＡを添加した時点でのレスポンスΔθは６０４アー
ク秒であった。図７中の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳ
Ｔ／バッファーを添加した時点を、（２）はＢＳ３を
添加した時点を、（３）は０．１ｍｇ／ｍｌのｈＩｇＧ
を添加した時点を、（４）はグリシンｐＨ３を添加した
時点をそれぞれ示している。ｈＩｇＧを添加した時点で
のレスポンスΔθは１５０アーク秒であった。

【００４７】次に、オールフロ−インジェクト法（ＡＦ
Ｉ法）による金属薄膜の処理を検討した。金薄膜を洗浄
した後、直接ＳＰＲ装置にセットし、そこからすべての
試薬をフロ−系に導入して固定化した。即ち、１０ｍＭ
Ｌ−システインの水：エタノール１：４溶液、１０％グ
ルタルアルデヒド水溶液、１％ＰＥＩ水溶液を順にイン
ジェクトしてＰＥＩ膜プローブを作製し、ＢＳＡを固定
化した。結果を図８及び図９に示す。図８中の、（１）
はｐＨ７．４ＨＢＳＴ／バッファーを添加した時点
を、（２）は１０ｍＭＬ−システインを添加した時点
を、（３）は１０％グルタルアルデヒドを添加した時点
を、（４）は１％ＰＥＩを添加した時点をそれぞれ示し
ている。

【００４８】図９中の、（ａ）はｐＨ７．４ＨＢＳ
Ｔ／バッファーを添加した時点を、（ｂ）は１ｍＭのＢ
Ｓ３を添加した時点を、（ｃ）は５００μｇ／ｍｌのＢ
ＳＡを添加した時点を、（ｄ）はグリシンｐＨ３を添加
した時点を、（ｅ）はｐＨ８．５で０．１Ｍのエタノー
ルアミンを添加した時点をそれぞれ示している。（ｄ）
のグリシンを添加した時点でのレスポンスΔθは静電的
相互作用に起因するもので３３４アーク秒であり、共有
結合による相互作用に起因するものが１１３０アーク秒
であった。

【００４９】次に、ＰＥＩ膜センサープローブ表面への
非特異的吸着の抑制について検討した。センサーを作製
する際、体液中に存在する多種のタンパク質のセンサー
膜表面への非特異的吸着は、検出感度やその選択性を低
下させる主な原因として指摘されている。前記した実験
においても、ＰＥＩ膜表面にＢＳＡを接触させた時、全
吸着量の内の１／４から１／３程度の非特異的吸着（グ
リシン／塩酸ｐＨ３．０を接触させた時に脱離した分）
が見られた。これは、膜中に多数残存するアミンがプロ
トン化することで持つプラスチャージによるＢＳＡとの
静電的相互作用が主な原因であると考えられる。

【００５０】そこで、タンパク質をＰＥＩ膜プローブに
固定化する際、ｐＨ７．４ＨＢＳＴ／バッファーの代
わりにｐＨ５．３酢酸バッファーを使用し反応時のｐＨ
を変化させた時の結果を図１０に示す。図１０中の、
（１）はｐＨ５．３酢酸バッファーを添加した時点を、
（２）はスペーサーのＢＳ３を１ｍＭ添加した時点を、
（３）は０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液を添加した時点
を、（４）は０．１Ｍのグリシン（ｐＨ３．０）を添加
した時点をそれぞれ示している。グリシンを添加した時
点でのレスポンスΔθはそれぞれ８６０及び６２０アー
ク秒であった。

【００５１】また、ｐＨ７．４バッファーで、ＢＳ３を
スペーサーとして用いずに、膜中のアミノ基を１００ｍ
Ｍグリオキル酸（ＧｌｙｏｘｙｌｉｃＡｃｉｄ）と反
応させカルボキシル化し、膜全体のチャージバランスを
とり、これを０．４ＭＥＤＣ／０．１ＭＮＨＳ
１：１混合溶液で活性化した後、ＢＳＡを固定化した際
の結果を図１１に示す。図１１中の、（１）はｐＨ７．
４ＨＢＳバッファーを添加した時点を、（２）は０．４
ＭＥＤＣ／０．１ＭＮＨＳを添加した時点を、（３）は
０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液を添加した時点を、
（４）は０．１Ｍのグリシン（ｐＨ３．０）を添加した
時点をそれぞれ示している。ＢＳＡを添加した時点のレ
スポンスΔθは１２１１アーク秒であり、グリシンを添
加した時点のレスポンスΔθは６７３アーク秒であっ
た。

【００５２】この結果、反応時のｐＨやセンサープロー
ブ表面のチャージバランスを変えることにより、ＢＳＡ
の非特異的吸着を減少させることはできなかった。ＢＳ
Ａなどのタンパク質は、全体としてプラスかマイナスの
どちらかの電荷をもっていることが多いが、各分子内に
はプラスチャージとマイナスチャージの両方の部位をも
っているため、ｐＨの変化や全体としてプローブ表面の
チャージのバランスをとってみても、タンパク質分子中
の各部位すべてを膜表面に吸着しにくい状態にするのは
困難である。タンパク質の種類により、非特異的な吸着
を防ぐ最適なｐＨ、及びチャージ状態は決まってくるの
であろうが、血清中など多種のタンパク質が存在する中
でＰＥＩ膜免疫センサープローブとして測定する際、ｐ
Ｈやチャージバランスを変えての測定は全く意味を持た
ない。

【００５３】そこで、チャージを持つ膜中の未反応のア
ミノ基どうしを、グルタルアルデヒドで架橋することで
不活性にしてチャージを抑制すると共に、残ったアルデ
ヒド基による活性部位の増加を考えた。このプローブの
活性化部位に検出する抗体と特異的に反応するリガンド
を固定化し、これをＰＥＩ膜センサープローブとした。
この反応を模式化して図１２に示す。

【００５４】以上の実験から、ＰＥＩ膜センサープロー
ブの基礎特性として次のように考えられる。アミノ基を
持つリガンドの固定化が行えたことから、ＰＥＩ膜セン
サ−プローブの作製が従来から行われているバッチ法に
加えて、すべての試薬をフロ−系に導入して作製するオ
−ルフロ−インジェクト（ＡＦＩ）法でも行えることが
確認できた。フロー系による試料と表面との接触時間は
１０分程度であるので、図１に示す反応はすべてがこの
時間内で進行することがわかった。ＡＦＩ法は、これま
でに確立されている作製に数十時間かかる他のセンサー
プローブと比較し、簡便、迅速なプローブの作製方法と
して有用な方法と考えられる。バッチにより作製したＰ
ＥＩ膜プローブとフローによるプローブのＢＳＡの固定
化量を比較すると(図６及び図８、図９）、フロー系の
方が２．８倍大きなレスポンスとして検出されている。
しかし、ＢＳＡ固定化のための活性剤であるＢＳ３の応
答は、フロー系の方が小さくなっており、ＢＳＡの固定
化量と逆になっている。作成した２つのプローブの表面
構造に何らかの違いがあることに起因していると考えら
れる。

【００５５】また、問題となるＰＥＩ膜表面へのタンパ
ク質の非特異的吸着量を小さくするため、可能なかぎり
高い濃度のＢＳ３およびＥＤＣ／ＮＨＳを接触させて、
膜中の官能基を活性化させることや、余ったアミノ基を
十分にブロックしていく必要がある。タンパク質の吸着
の少ない物質として知られている、エーテル結合を多く
含んだエチレングリコールユニットを持つ試薬を膜表面
の設計の際に導入することも１つの方法として考えられ
る。

【００５６】次に、センサープローブのアプリケーショ
ンとして、ＰＥＩ膜中のバインディングサイトに抗ｈＩ
ｇＧおよびｐｒｏｔｅｉｎＡを結合させ、これらに高い
特異性と強い結合力をもつ人間の免疫グロブリン抗体、
ｈＩｇＧを濃度を変化させて接触させたときのレスポン
スをそれぞれ測定し、ｈＩｇＧの定量を行った。また、
ｐｒｏｔｅｉｎＡとの弱い結合性をもつマウス−Ｉｇ
Ｇ、全く結合性を示さないチキンＩｇＧ（ｃｈｉｃｋｅ
ｎ−ＩｇＧ）を接触させることでプローブ表面へのタン
パク質の非特異吸着量について検討した。測定に用いた
８種類のプローブを図１３にまとめる。

【００５７】まず図１３のＮｏ．８のプローブを用いて
測定を行った時のｈＩｇＧ検出のリアルタイムプロット
を図１４に示した。図１４中の、（１）はＨＢＳ／ＮＨ
Ｓバッファーを添加した時点を、（２）はＥＤＣ／ＮＨ
Ｓを添加した時点を、（３）は２００μｇ／ｍｌの抗ｈ
ＩｇＧを添加した時点を、（４）はエタノールアミンを
添加した時点を、（５）はグリシンを添加した時点を、
（６）は０．１ｕｇ／ｍｌのｈＩｇＧを添加した時点
を、（７）は１．０ｕｇ／ｍｌのｈＩｇＧを添加した時
点をそれぞれ示している。

【００５８】バッファーが定流している状態でＥＤＣ／
ＮＨＳをインジェクトして（図１４の（２）の時点）、
膜中のカルボキシル基を活性化し、抗ｈＩｇＧを接触さ
せたところ、ＳＰＲアングルシフトで、２１００ａｒｃ
ｓｅｃｏｎｄほどの固定化量がみられた。図１４の
（４）、（５）の時点で、ｐＨ８．５エタノールアミ
ン、ｐＨ３．０グリシン溶液により、チャージで吸着し
ている抗ｈＩｇＧを脱離させると共に、残った膜中の活
性化部位をブロックした。ここまでで、ｈＩｇＧ測定の
ためのセンサープローブの作製が完了し、ｈＩｇＧを濃
度を変化させて膜に接触させ、得られるレスポンスを検
出した。まず、０．１μｇ／ｍｌｈＩｇＧをインジェ
クトした結果、ほとんど検出されなかったので、塩酸を
流して膜の状態を戻し、１０倍の濃度の１μｇ／ｍｌを
接触させたところ、２８８ａｒｃｓｅｃｏｎｄのレス
ポンスが検出された。その後、６０、１６０、再び６０
μｇ／ｍｌｈＩｇＧを順にインジェクトした結果、そ
れぞれの濃度に対応したレスポンスを得ることができた
（図１５参照）。

【００５９】それぞれのプローブごとに得られたデータ
に基づき検量線を作成し、活性化方法による違い（図１
３のＮｏ．２−Ｎｏ．６、Ｎｏ．４−Ｎｏ．８）、およ
び作製方法による違い（図１３のＮｏ．５−Ｎｏ．６、
Ｎｏ．７−Ｎｏ．８）について検討を行った（図１６及
び図１７参照）。図１６中の左側はＢＳ３で活性化した
バッチ法によるものであり、右側はＥＤＣ／ＮＨＳで活
性化したバッチ法によるものであり、黒三角印及び白四
角印はプロテインＡ−ｈＩｇＧ系を示し、黒丸印及びバ
ツ印は抗ｈＩｇＧ−ｈＩｇＧ系を示す。図１７中の左側
はＥＤＣ／ＮＨＳで活性化したバッチ法によるものであ
り、右側はＥＤＣ／ＮＨＳで活性化したＡＦＩ法のよる
ものであり、白四角印及び白丸印はプロテインＡ−ｈＩ
ｇＧ系を示し、バツ印及び白菱形印は抗ｈＩｇＧ−ｈＩ
ｇＧ系を示す。また、非特異抗体の吸着量についてもＮ
ｏ．１、５、６チップを比較することで検討した（図１
８参照）。図１８中のグレーの棒はｈＩｇＧを示し、斜
線の棒はマウスＩｇＧを示し、横線の棒はチキンＩｇＧ
を示す。いずれの濃度も９０μｇ／ｍｌである。ＰＥＩ
膜中のアミノ基をＢＳ３を用いて活性化した結果と、グ
リオキシル酸でカルボキシル基にし、膜表面全体のチャ
−ジバランスをとり、これをＥＤＣ／ＮＨＳで活性化し
た場合について図１６で比較検討した。

【００６０】その結果、プロテインＡ−ｈＩｇＧ系にお
いて、カルボキシル基を導入した表面の方が得られる検
量線の直線性が高いうえに、検出感度も増加することが
わかった。これは、図１８の非特異抗体の吸着量をみて
も、プロ−ブＮｏ．５のＥＤＣ／ＮＨＳ活性の方が、Ｎ
ｏ．１のＢＳ３活性と比較してマウス（Ｍｏｕｓｅ）、
チキン（Ｃｈｉｃｋｅｎ）−ＩｇＧともに、ｈＩｇＧの
量と相対的にみて吸着量がおさえられ、検出精度が高く
なった結果とも一致している。前記したＢＳＡの固定化
の実験においては、ＰＥＩにカルボン酸を導入すること
でＢＳＡの非特異的吸着量は増加したが、今回の抗原−
抗体反応においては、等電点などタンパク質の複雑な構
造の違いにより、マウス（Ｍｏｕｓｅ）、チキン（Ｃｈ
ｉｃｋｅｎ）−ＩｇＧの膜への非特異吸着は膜にマイナ
スのチャージを導入することで防げることがわかった。

【００６１】図１７で、このカルボン酸を導入した系に
ついてＡＦＩ法、バッチ法と分けて検量線を作製した。
その結果、フロー系で作製したプローブについても、バ
ッチ法と同等の検出感度、直線性を得られた。また、図
１８に示す様に、ＡＦＩ法で作製したＰＥＩ膜はバッチ
法と比較して非特異的吸着が減少した。これはチップ表
面の膜構造（アミノ基の配向性など）に何らかの違いが
あるためだとおもわれる（図１９参照）。例えば、１９
図に示されるように吸着ホモポリマー型や、投錨型ポリ
マー（cerminally-anchored）型などが考えられる。Ａ
ＦＩ法による金属、特に金基盤表面へのタンパク質の固
定化はこれまでに報告例がなく、簡便、迅速かつ再現性
のよいセンサープローブの作製法として有用な方法であ
ると考えられる。これらの結果より、タンパク質の非特
異的吸着の少ない膜表面の設計には膜表面の電荷の制御
が1つの重要なファクターであることがわかり、膜材や
作製方法をさらに検討することで、検出特性や検出能は
さらに改善される。

【００６２】また、タンパク質は一般に高分子表面に接
触すると徐々に接点を増やし、そのコンフォメーション
を変化させることが有り、自然な状態の性質が損なわれ
る。さらに、その活性サイトが表面との接点になってい
たり、立体的に障害されるように配置されても活性を落
としてしまう。リガンド固定化の際にその配向性を制御
していくことも、検出精度の増加につながる。

【００６３】次に、アミノ糖を含有するポリマーを膜に
使用することについて検討した。キチン（chitin）はポ
リアミノ糖であり、キトサン（chitosan）はキチンのア
セチル基が部分的に加水分解されたもので、Ｄ−グルコ
ースアミンのβ−（１，４）−重合体である。chitin、
chitosanは甲殻類、昆虫類の組織支持体であるため、生
体との親和性がよく、酵素によって生体内で分解され
る。このことを利用して、医療材料として吸収性縫合糸
や人工皮膚などに用いられている。また、免疫活性を有
すること、タンパク質などの体液中成分の吸着が少ない
ことからドラッグデリバリーシステムの担体としても利
用されている。さらにchitosanの誘導体は、アシル基の
長さにより光学異性体の選択的吸着性があるので、ＨＰ
ＬＣでラセミ混合物の分離に用いられている。

【００６４】本発明では、キトサンの高い生体適合性
と、ＰＥＩ膜センサープローブで問題となったタンパク
質の非特異的吸着のない性質を利用して、キトサン膜免
疫センサープローブの作製を試みた。まず、ＰＥＩの時
と同様に、金薄膜を７０℃ほどに温めた１Ｍ、ＫＯＨ水
溶液に数回つけることで洗浄した後、５ｍＭＬ−シス
テインメチルエステルのＤＭＦ溶液に２４時間浸した
後、これを５％グルタルアルデヒド水溶液に２時間浸け
た。これに１％キトサン水溶液を２４時間接触させるこ
とでキトサンを固定化した。次に、キトサン中のＯＨ基
を２ＭのＢｒＣＨ_２ＣＯＯＨ／１ＭＮａＯＨ溶液に１
２時間浸すことでカルボキシル化し、カルボキシメチル
化キトサン（ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ）センサープロー
ブを作製した（図２参照）。

【００６５】ＰＥＩ膜プローブによる測定と同様に、作
製したプローブをＳＰＲ装置にセットし、ｐＨ７．４
ＨＢＳＴ／バッファーによるベースラインが安定した
後、膜中の−ＣＯＯＨ基を、０．４ＭＥＤＣ／０．１
ＭＮＨＳ１：１混合溶液をインジェクトして活性化
した後、０．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡを固定化した時の結
果を図２０に示す。図２０中の、（１）はｐＨ７．４Ｈ
ＢＳ／Ｔバッファーを添加した時点を、（２）は０．４
ＭＥＤＣ／０．１ＭＮＨＳを添加した時点を、（３）は
０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液を添加した時点を、
（４）はエタノールアミンを添加した時点をそれぞれ示
している。ＢＳＡを添加した時点のレスポンスΔθは１
５０アーク秒であった。

【００６６】キトサン膜にＢｒＣＨ_２ＣＯＯＨを浸すこ
とで膜中の−ＯＨ基を−ＣＯＯＨ基にし、これを活性化
した後、ＢＳＡを固定化したところ、図２０に示すよう
に１５０アーク秒のレスポンスが得られた。その際、Ｂ
ＳＡの固定化量はＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ膜プローブ中
に存在するＣＯＯＨ基の量に依存すると考えられる。そ
こで、キトサンをカルボキシル化する際に、バッチ法に
よりプローブ表面で行うものから、あらかじめカルボキ
シル化率の高いＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎを合成し、これ
を表面に固定化することでリガンドの固定化量増加を試
みた。

【００６７】キトサン１．０ｇ、ラウリルスルホン酸ナ
トリウム０．１ｇを４５％ＮａＯＨ水溶液７０ｍｌ中に
ゆっくり加え、４℃に保ちながら溶解するまで１時間ほ
ど攪拌した。これを−２０℃で、１２時間ほど放冷した
後、ｉ−ＰｒＯＨ１２５ｍｌ、ＣｌＣＨ_２ＣＯＯＨ２
８．４ｇを加えて７２時間反応させた。続いて、２ＭＨ
Ｃｌを加えていき、白色の結晶を９．８７２７ｇ得た。
次に、この結晶０．５ｇを１０％ＮａＯＨ水溶液２０ｍ
ｌに溶解させた後、４ＭＨＣｌをｐＨ１になるまで加え
た。これに、大量のアセトンを加えることで結晶を析出
させ、吸引ろ過により０．７ｇのＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａ
ｎを得た。

【００６８】前記の方法で合成したＣＭ−ｃｈｉｔｏｓ
ａｎを前と前記したスキームと同様な方法でセンサープ
ローブに固定化しカルボキシル基を活性化したが、この
系ではＢＳＡを固定化することはできなかった。スキー
ム中に反応のいかないステップがあると考えられる。グ
ルタルアルデヒドの固定化までは反応が進むことがわか
っているので、ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎをモノレイヤ−
に固定化する反応がネックになっていると予想された。
ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎを合成する際、糖のアミノ基も
カルボキシル化されるため、ポリマー中の−ＮＨ_２基の
量が少なくなっていること、−ＮＨ_２基がポリマーの主
鎖に直接ついているため自由度がなく、反応性が低いこ
とが原因になっていると思われる。そこで、別の反応径
路に変えてキトサン膜センサ−プローブの作製を行っ
た。

【００６９】金薄膜を洗浄した後、１０^−３ＭのＨＳ−
Ｃ_１０Ｈ_２０ＣＯＯＨ／ＥｔＯＨ溶液に２時間、０．４
ＭＥＤＣ／０．１ＭＮＨＳの１：１混合溶液に４０
分浸した後、先程の２％ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ水溶液
に２時間つけることで、ｃｈｉｔｏｓａｎ膜センサープ
ローブＩＩの作製を行った。このプローブを用いて、膜
中の−ＣＯＯＨ基を、０．４ＭＥＤＣ／０．１ＭＮ
ＨＳ１：１混合溶液で活性化し、２００μｇ／ｍｌ
ｈＩｇＧを固定化した後、５００μｇ／ｍｌのＢＳＡの
膜への吸着を測定した結果を図２１に示す。図２１中
の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳ／Ｔバッファーを添加し
た時点を、（２）はＥＤＣ／ＮＨＳを添加した時点を、
（３）は０．２ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ溶液を添加した時点
を、（４）はエタノールアミンを添加した時点を、
（５）は５００μｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した時点をそ
れぞれ示している。ＢＳＡを添加した時点のレスポンス
Δθは７２０アーク秒であった。

【００７０】反応系を変えることで、ＣＭ−ｃｈｉｔｏ
ｓａｎを基盤に固定化することができた。キトサンの性
質から、ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ膜プローブではＰＥＩ
膜にみられたタンパク質（ＢＳＡ）の膜への非特異的吸
着は、ほとんどみられなかった。それを確かめるため、
プローブにキトサンおよびＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎを固
定化し、それらを活性化しないでＢＳＡを接触させた時
の様子を図２２及び図２３に示す。図２２中の、（１）
はｐＨ７．４ＨＢＳ／Ｔバッファーを添加した時点を、
（２）はグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ３）を添加した時点
を、（３）は５００μｇ／ｍｌのＢＳＡを添加下時点を
それぞれ示している。ＢＳＡを添加した時点のレスポン
スΔθは５０アーク秒であった。図２３中の、（１）は
ｐＨ７．４ＨＢＳ／Ｔバッファーを添加した時点を、
（２）は５００μｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した時点をそ
れぞれ示している。ＢＳＡを添加した時点のレスポンス
Δθは１００アーク秒であった。

【００７１】キトサンはその性質のとおり非特異吸着は
ほとんどみられなかったが、その誘導体であるＣＭ−ｃ
ｈｉｔｏｓａｎも、膜中に多量のカルボキシル基が存在
しているにも関わらず、５００ｕｇ／ｍｌというかなり
高濃度のＢＳＡを接触させた時のレスポンスは１００ア
ーク秒と非常に小さな値となった。これによりＰＥＩ膜
プローブ作製課程で行ったプローブ表面の電荷のブッロ
クはＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ膜では必要ないことが確認
できた。

【００７２】次に、ＰＥＩと同様にＡＦＩ法によるキト
サン膜センサープローブの調製を行った。ＰＥＩ膜セン
サープローブの時と同様に金薄膜をＳＰＲ装置にセット
し、そこからすべての試薬をフロ−系に導入して固定化
するオ−ルフロ−系固定化法を試みた。結果を図２４に
示す。図２４中の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳ／Ｔバッ
ファーを添加した時点を、（２）はモノレイヤーのエタ
ノール溶液を添加した時点を、（３）はＥＤＣ／ＮＨＳ
の０．２Ｍ／０．０５Ｍを添加した時点を、（４）は１
％ＣＭ−キトサンを添加した時点を、（５）は０．５ｍ
ｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した時点をそれぞれ示してい
る。ＢＳＡを添加した時点のレスポンスΔθが観測され
た。

【００７３】ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ膜センサ−プロー
ブの作製をフロ−系で試みた結果、フローで行った系で
もＢＳＡを固定化することができたが、そのレスポンス
わ僅かであった。これは、フロ−系での各試薬と膜表面
との接触時間が約１０分であることから、時間的に反応
が充分ではないステップがあると考えられる。フロ−で
のＰＥＩ膜の作製が行えることから、ＣＭ−ｃｈｉｔｏ
ｓａｎをモノレイヤ−に固定化する反応がネックになっ
ていると予想され、これはおそらく問題となった固定化
部位であるＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ中の−ＮＨ_２基がポ
リマーの主鎖に直接ついているため自由度がなく、反応
性が低いことが原因になっていると考えられる。ポリマ
ーの主鎖ではなく、側鎖に自由度の大きなアミノ基など
の官能基を有するようにポリマーを修飾することによ
り、より反応性のあるポリマーとすることができると考
えられる。

【００７４】これまでの実験結果より、合成したCM-chi
tosanを基盤に固定化したセンサープローブの作製がバ
ッチ法で行え、アミノ基を持つリガンドの検出がＳＰＲ
シグナルとして確認できた。その際、ＰＥＩ膜プローブ
にみられたタンパク質（ＢＳＡ）の膜への非特異的吸着
は、ほとんどみられなかった。このプローブのＡＦＩ法
へ適用することもできるが、−ＮＨ_２基がポリマーの主
鎖に直接ついているため自由度がなく、反応性が低いこ
とが原因となって、バッチほうに比べて充分な反応性が
みられないことがある。ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ合成に
もう１ステップ加えて、アミノ基に親水性の高いスぺー
サーを導入し、モノレイヤーとの結合部位の自由度を高
めることによっても、この問題は解決できると考えられ
る。

【００７５】また、CM-chitosanの水溶性が低いこと
も、プローブを作製するうえで問題点のひとつになって
いる。一般にキトサンは数十万の分子量をもっており、
これが小さくなるにつれて水溶性が増していくことがわ
かっている。分子量の小さいキトサンを使用して、CM-c
hitosanを合成することで、基盤に固定化されやすくな
ると予想される。その時の反応条件として酸性度が高す
ぎると、アミノ基の求核性がプロトン化することで失わ
れ反応が進まなくなるので、中性よりやや塩基性側で反
応を行うのが適当だと考えられる。

【００７６】さらに、本発明は抗原-抗体反応を利用し
た高感度免疫センサーを提供する。ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓ
ａｎセンサープローブのアプリケーションとして、ＰＥ
Ｉ膜と比較するためバインディングサイトにプロテイン
Ａを結合させ、これらに高い特異性と強い結合力をもつ
人間の免疫グロブリン抗体、ｈＩｇＧを濃度を変化させ
て接触させたときのレスポンスをそれぞれ測定し、ｈＩ
ｇＧの定量を行った。Ｎｏ．５、６のＰＥＩ膜プローブ
の結果と合わせた検量線を図２５に示す。図２５中の丸
印はＰＥＩ膜プローブを用いたＡＦＩ法によるものであ
り、四角印はＰＥＩ膜プローブを用いたバッチ法による
ものであり、三角印はＣＭ−キトサン膜プローブを用い
たバッチ法によるものである。

【００７７】また同様に、プロテインＡとの弱い結合性
をもつマウス−ＩｇＧ、全く結合性を示さないチキン
（ｃｈｉｃｋｅｎ）−ＩｇＧを接触させることでプロー
ブ表面へのタンパク質の非特異吸着量について検討し、
ＰＥＩ及び市販品であるＣＭＤ膜プローブと比較したデ
ータを図２６に示す。図２６中のグレーの棒はｈＩｇＧ
を示し、斜線の棒はマウスＩｇＧを示し、横線の棒はチ
キンＩｇＧを示す。いずれの濃度も９０μｇ／ｍｌであ
る。

【００７８】ＰＥＩ膜と比較し応答感度は１／４程度に
低下したが、この膜は以前に考察したように非特異的抗
体の吸着が全くみられず、市販品であるＣＭＤ膜プロー
ブと比較しても、高い検出精度を得ることができた。こ
れまでに、オリゴエチレンモノレイヤーで表面を被服さ
れたプローブは、タンパク質の非特異的な吸着を抑制す
ることが報告されており、同様な傾向がＣＭ−ｃｈｉｔ
ｏｓａｎ、ＣＭＤ膜プローブでもみられた。

【００７９】これまでは、タンパク質の吸着性を電荷と
親疎水性の点から論じてきたが、この特異的性質を表面
付近の水と膜の相互作用という観点から考えてみたい。
水は生命に不可欠な溶媒としての重要性から、また４℃
付近で最も密度が高くなり、他の液体に比べて著しく大
きな比熱を持つといった特異的性質のため、古くから非
常によく研究されてきた。この水の性質は、分子同士が
互いに水素結合することにより形づくられる「構造」に
由来するが、その構造に関しては未解決の問題が多く残
されている。また、タンパク質や高分子をはじめとする
水溶性高分子が、水との相互作用によってその構造や性
質、機能に大きく影響を受けることや、逆に高分子の水
和水や高分子ゲル中の水が、運動性、凍結−融解挙動等
の性質においてバルク水と異なることが知られている。
一般に、高分子表面の水は、自由水とポリマーに束縛さ
れた水に分類することができ、束縛の強さによって、ポ
リマー表面に形成される水和層の状態が異なってくる。
この表面水和層の状態が、タンパク質の表面への吸着性
を決定する要因の１つであるといわれている。

【００８０】ポリエチレングリコール、ＣＭ−ｃｈｉｔ
ｏｓａｎ、ＣＭＤの化学構造に共通する点として、いず
れもエーテル結合を分子内部に持っており、この部位に
より膜表面に形成される水和層が、タンパク質の非特異
的な吸着を抑制するのではないかと予想される。

【００８１】本発明は、ＰＥＩ膜センサープローブの作
製法として従来のバッチ法に加え、オールフローインジ
ェクト（ＡＦＩ）法を提供したものであり、ＡＦＩ法で
作製したＰＥＩ膜は、バッチ法と同等の高い応答感度が
得られ、非特異抗体の吸着量も小さかった。また、タン
パク質の非特異的吸着の少ない膜表面の設計には膜表面
の電荷の制御が１つの重要なファクターであることがわ
かり、膜材や作製方法をさらに検討することで、検出特
性や検出能はさらに改善されると考えられる。さらに、
ＡＦＩ法で作製したＰＥＩ膜は、バッチ法と比較して非
特異的吸着が少ないうえ、検出精度も高くなることがわ
かった。これはプローブ表面の膜構造（アミノ基の配向
性など）に何らかの違いがあるためだとおもわれる。Ａ
ＦＩ法による、金属表面へのタンパク質の固定化はこれ
までに報告例がなく、簡便、迅速かつ再現性のよいセン
サープローブの作製法として有用な方法と考えられる。

【００８２】本発明のＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ膜に基づ
くセンサープローブの検討では、ＡＦＩ法及びバッチ法
による作製を行い、プロテインＡを固定化してｈＩｇＧ
を検出した。その結果、ＰＥＩ膜の場合と比較して応答
感度は１／４程度に低下したが、ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａ
ｎ膜は非特異的吸着が全くみられなかった。これらの結
果より、タンパク質の非特異的吸着の少ない膜表面の設
計には膜表面の電荷の制御が１つの重要なファクターで
あることがわかり、膜材や作製方法をさらに検討するこ
とで、検出特性や検出能はさらに改善されると考えられ
る。

【００８３】本発明のセンサープローブの効果をより明
確にするために、公知のデキストラン膜センサーチップ
との比較試験を行った。デキストラン膜は既にカルボキ
シメチル化されているので、本発明のＰＥＩ膜と同様に
０．４ＭＥＤＣ／０．１ＭＮＨＳの１：１混合液で活性
化して両者にプロテインＡを固定した。これに、濃度
０．１、１．０、１０、４５、９０、２００μｇ／ｍｌ
のｈＩｇＧをそれぞれのセンサーに流した。本発明のＰ
ＥＩ膜の経時変化を図２７に示す。また、これらの実験
で得られた両者の検量線を図２８に示す。図２８の左側
が本発明のＰＥＩ膜のものであり、右側はデキストラン
膜のものである。

【００８４】この結果、図２８からもわかるように、本
発明のＰＥＩ膜ではｈＩｇＧ濃度が０．１〜９０μｇ／
ｍｌ、デキストラン膜では１０〜２００μｇ／ｍｌの範
囲でほぼ直線性を示すことがわかり、本発明のＰＥＩ膜
のほうがその応答感度において約２０倍も大きく、その
ために検出限界も低くなっている。このように、本発明
のポリマー膜、特にＰＥＩ膜は、比較的簡単な化学構造
を有するポリマーを使用することにより、簡便で、安価
な、しかも高感度のセンサープローブであることがわか
る。

【実施例】次に実施例により本発明をさらに具体的に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。

【００８５】実施例１金薄膜を７０℃ほどに温めた１ＭＫＯＨ水溶液に数回つ
けることで洗浄した後、５ｍＭＬ−システインメチル
エステルのＤＭＦ溶液に、２４時間浸すことにより、図
１の（１）の状態とした。これを、５％グルタルアルデ
ヒド水溶液で２時間処理して図１の（２）の状態とし、
次いで２％ＰＥＩ水溶液に２時間浸し図１の（３）で示
されるのＰＥＩ膜センサープローブを得た。

【００８６】実施例２実施例１で作製したプローブをＳＰＲ装置にセットし、
ｐＨ７．４ＨＢＳＴ／バッファーによるベースライン
が安定した後、膜中に存在する未反応のグルタルアルデ
ヒドを０．１Ｍグリシン溶液をインジェクトすること
でブロックした。この後、ＰＥＩ膜中の一級アミンをス
ペーサーであるＢＳ３で活性化させ、０．５ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡを固定化した時の結果を図６に示し、次いで、
０．１ｍｇ／ｍｌｈＩｇＧを添加した時の結果を図７
に示す。

【００８７】実施例３実施例２において、タンパク質をＰＥＩ膜プローブに固
定化する際、ｐＨ７．４ＨＢＳＴ／バッファーの代
わりにｐＨ５．３酢酸バッファーを使用し反応時のｐＨ
を変えて実施例２と同様に行った。結果を図１０に示し
た。

【００８８】実施例４また、実施例２においてｐＨ７．４ｂｕｆｆｅｒで、
スペーサーとしてＢＳ３の代わりに１００ｍＭグリオ
キシ酸ル（ＯＨＣ−ＣＯＯＨ）と反応させカルボキシル
基を導入し、膜全体のチャージバランスをとり、これを
０．４ＭＥＤＣ／０．１ＭＮＨＳ１：１混合溶液
で活性化した後、ＢＳＡを固定化した。この結果を図１
１に示した。

【００８９】実施例５スペーサーによりカルボキシル基を導入したセンサープ
ローブに緩衝液を流し、バッファーが定流している状態
でＥＤＣ／ＮＨＳをインジェクトして、膜中のカルボキ
シル基を活性化し、抗ｈＩｇＧを接触させたところ、Ｓ
ＰＲアングルシフトで、２１００ａｒｃｓｅｃｏｎｄほ
どの固定化量がみられた。次いで、ｐＨ８．５エタノー
ルアミン、ｐＨ３．０グリシン溶液により、チャージで
吸着している抗ｈＩｇＧを脱離させると共に、残った膜
中の活性化部位をブロックした。ここまでで、ｈＩｇＧ
測定のためのセンサープローブの作製が完了した。ｈＩ
ｇＧを濃度を変化させて膜に接触させ、得られるレスポ
ンスを検出した。１μｇ／ｍｌを接触させたところ、２
８８ａｒｃｓｅｃｏｎｄのレスポンスが検出された。
その後、６０、１６０、再び６０μｇ／ｍｌｈＩｇＧ
を順にインジェクトした結果、それぞれの濃度に対応し
たレスポンスを得ることができた。結果を図１４及び図
１５に示した。

【００９０】実施例６それぞれのプローブごとに実施例５と同様にして得られ
たデータに基づき検量線を作成し、活性化方法による違
い（図１３のＮｏ．２−Ｎｏ．６、Ｎｏ．４−Ｎｏ．
８）、および作製方法による違い（図１３のＮｏ．５−
Ｎｏ．６、Ｎｏ．７−Ｎｏ．８）について同様にして行
った。結果を図１６及び図１７に検量線として示した。
また、非特異抗体の吸着量についても図１３のＮｏ．
１、５、６チップを比較することで検討した。結果を図
１８に示した。

【００９１】実施例７実施例１のＰＥＩの時と同様に、金薄膜を７０℃ほどに
温めた１Ｍ、ＫＯＨ水溶液に数回つけることで洗浄した
後、５ｍＭＬ−システインメチルエステルのＤＭＦ溶
液に２４時間浸した後、これを５％グルタルアルデヒド
水溶液に２時間浸けた。これに１％キトサン水溶液を２
４時間接触させることでキトサンを固定化した。次に、
キトサン中のＯＨ基を２ＭのＢｒＣＨ_２ＣＯＯＨ／１Ｍ
ＮａＯＨ溶液に１２時間浸すことでカルボキシル化
し、カルボキシメチル化キトサン（ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓ
ａｎ）センサープローブを作製した（図２参照）。

【００９２】実施例８ＰＥＩ膜プローブによる測定と同様に、作製したプロー
ブをＳＰＲ装置にセットし、ｐＨ７．４ＨＢＳＴ／
バッファーによるベースラインが安定した後、膜中の−
ＣＯＯＨ基を、０．４ＭＥＤＣ／０．１ＭＮＨＳ
１：１混合溶液をインジェクトして活性化した後、０．
５ｍｇ／ｍｌＢＳＡを固定化した時の結果を図２０に
示す。

【００９３】実施例９キトサン１．０ｇ、ラウリルスルホン酸ナトリウム０．
１ｇを４５％ＮａＯＨ水溶液７０ｍｌ中にゆっくり加
え、４℃に保ちながら溶解するまで１時間ほど攪拌し
た。これを−２０℃で、１２時間ほど放冷した後、ｉ−
ＰｒＯＨ１２５ｍｌ、ＣｌＣＨ_２ＣＯＯＨ２８．４ｇを
加えて７２時間反応させた。続いて、２ＭＨＣｌを加え
ていき、白色の結晶を９．８７２７ｇ得た。次に、この
結晶０．５ｇを１０％ＮａＯＨ水溶液２０ｍｌに溶解さ
せた後、４ＭＨＣｌをｐＨ１になるまで加えた。これ
に、大量のアセトンを加えることで結晶を析出させ、吸
引ろ過により０．７ｇのＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎを得
た。

【００９４】実施例１０金薄膜を洗浄した後、１０^−３ＭのＨＳ−Ｃ_１０Ｈ_２０
ＣＯＯＨ／ＥｔＯＨ溶液に２時間、０．４ＭＥＤＣ／
０．１ＭＮＨＳの１：１混合溶液に４０分浸した後、
実施例９で製造した２％ＣＭ−ｃｈｉｔｏｓａｎ水溶液
に２時間つけることで、キトサン膜センサープローブＩ
Ｉを製造した。このプローブを用いて、膜中の−ＣＯＯ
Ｈ基を、０．４ＭＥＤＣ／０．１ＭＮＨＳ１：１
混合溶液で活性化し、２００μｇ／ｍｌｈＩｇＧを固
定化した後、５００μｇ／ｍｌのＢＳＡの膜への吸着を
測定した結果を図２１に示す。

【００９５】実施例１１実施例２と同様にして、ＡＦＩ法によりキトサン膜セン
サープローブの調製を行った。ＰＥＩ膜センサープロー
ブの時と同様に金薄膜をＳＰＲ装置にセットし、そこか
らすべての試薬をフロ−系に導入して固定化するオ−ル
フロ−系で固定化法を行った。結果を図２４に示す。図
２４中の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳ／Ｔバッファーを
添加した時点を、（２）はモノレイヤーのエタノール溶
液を添加した時点を、（３）はＥＤＣ／ＮＨＳの０．２
Ｍ／０．０５Ｍを添加した時点を、（４）は１％ＣＭ−
キトサンを添加した時点を、（５）は０．５ｍｇ／ｍｌ
のＢＳＡを添加した時点をそれぞれ示している。ＢＳＡ
を添加した時点のレスポンスΔθが観測された。

【００９６】実施例１２ＰＥＩ膜を０．４ＭＥＤＣ／０．１ＭＮＨＳの１：１混
合液で活性化して、これにプロテインＡを固定した。こ
れに、濃度０．１、１．０、１０、４５、９０、２００
μｇ／ｍｌのｈＩｇＧをそれぞれのセンサーに流した。
ＡＦＩ法によるＰＥＩ膜の経時変化の結果を図２７に示
す。図２７中の１，０００Ｒ．Ｕは１ｎｇ／ｍｍ^２であ
る。また、この実験で得られた検量線を図２８の左側に
示す。

【００９７】比較例１デキストラン膜を用いて実施例１２と同様に行った。そ
の結果得られた検量線を、図２８の右側に示す。

【００９８】

【発明の効果】本発明は、簡便、迅速かつ再現性のよい
ＳＰＲ測定用のセンサープローブとして有用な金属薄膜
を提供するものであり、本発明のセンサープローブは高
感度で、高精度のものであり、かつ、簡便で安価に製造
することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、原料物質として、システインメチルエ
ステル、グルタルアルデヒド及びポリエチレンイミンを
用いた場合の本発明の金属薄膜の処理法を示す。

【図２】図２は、原料として、システインメチルエステ
ル、グルタルアルデヒド及びキトサンを用いた場合の本
発明の金属薄膜の処理法を示す。

【図３】図３は、本発明のポリエチレンイミン膜を有す
る金属薄膜にスペーサーとしてスベリン酸を用い、活性
エステル化法により検出用試薬（図３中ではリガンドと
して示されている。）を固定する方法を示す。

【図４】図４は、図２に示したＣＭ−キトサンセンサー
プローブに検出用試薬（図４中ではリガンドとして示さ
れている。）を固定する方法を示す。

【図５】図５は、本発明の金属薄膜の調製法と、表面プ
ラズモン共鳴装置の概要と、本発明の金属薄膜のバッチ
法とオールフローインジェクト法（ＡＦＩ法）の概要を
示す。

【図６】図６は、本発明のＰＥＩ膜を用いたＳＰＲの測
定結果であり、横軸に時間（分）、縦軸にレスポンス
（アーク秒（１度は３６００アーク秒））を示す。図６
中の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳＴ／バッファーを
添加した時点を、（２）はＢＳ３を添加した時点を、
（３）は０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した時点を、
（４）はグリシンｐＨ３を添加した時点をそれぞれ示し
ている。ＢＳＡを添加した時点でのレスポンスΔθは６
０４アーク秒であった。

【図７】図７は、本発明のＰＥＩ膜を用いたＳＰＲの測
定結果であり、横軸に時間（分）、縦軸にレスポンス
（アーク秒（１度は３６００アーク秒））を示す。図７
中の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳＴ／バッファーを
添加した時点を、（２）はＢＳ３を添加した時点を、
（３）は０．１ｍｇ／ｍｌのｈＩｇＧを添加した時点
を、（４）はグリシンｐＨ３を添加した時点をそれぞれ
示している。ｈＩｇＧを添加した時点でのレスポンスΔ
θは１５０アーク秒であった。

【図８】図８は、本発明のＰＥＩ膜を用いたＡＦＩ法に
よるＳＰＲの測定結果である。図８中の、（１）はｐＨ
７．４ＨＢＳＴ／バッファーを添加した時点を、
（２）は１０ｍＭＬ−システインを添加した時点を、
（３）は１０％グルタルアルデヒドを添加した時点を、
（４）は１％ＰＥＩを添加した時点をそれぞれ示してい
る。

【図９】図９は、本発明のＰＥＩ膜を用いたＡＦＩ法に
よるＳＰＲの測定結果である。図９中の、（ａ）はｐＨ
７．４ＨＢＳＴ／バッファーを添加した時点を、
（ｂ）は１ｍＭのＢＳ３を添加した時点を、（ｃ）は５
００μｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した時点を、（ｄ）はグ
リシンｐＨ３を添加した時点を、（ｅ）はｐＨ８．５で
０．１Ｍのエタノールアミンを添加した時点をそれぞれ
示している。

【図１０】図１０は、本発明のＰＥＩ膜を用い、緩衝液
としてｐＨ５．３酢酸バッファーを用いたときのＳＰＲ
の測定結果である。図１０中の、（１）はｐＨ５．３酢
酸バッファーを添加した時点を、（２）はスペーサーの
ＢＳ３を１ｍＭ添加した時点を、（３）は０．５ｍｇ／
ｍｌのＢＳＡ溶液を添加した時点を、（４）は０．１Ｍ
のグリシン（ｐＨ３．０）を添加した時点をそれぞれ示
している。

【図１１】図１１は、本発明のＰＥＩ膜を用い、膜中の
アミノ基を１００ｍＭグリオキル酸と反応させカルボキ
シル化したときのＳＰＲの測定結果である。図１１中
の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳバッファーを添加した時
点を、（２）は０．４ＭＥＤＣ／０．１ＭＮＨＳを添加
した時点を、（３）は０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液を
添加した時点を、（４）は０．１Ｍのグリシン（ｐＨ
３．０）を添加した時点をそれぞれ示している。

【図１２】図１２は、本発明のＰＥＩ膜の未反応のアミ
ノ基どうしを、グルタルアルデヒドで架橋することで不
活性化するようすを模式的に示したものである。

【図１３】図１３は、本発明の測定に用いた８種類のプ
ローブをまとめて示したものである。

【図１４】図１４は、本発明の図１３に記載のＮｏ．８
のプローブを用いて測定を行った時のｈＩｇＧ検出のリ
アルタイムプロットを示したものである。図１４中の、
（１）はＨＢＳ／ＮＨＳバッファーを添加した時点を、
（２）はＥＤＣ／ＮＨＳを添加した時点を、（３）は２
００μｇ／ｍｌの抗ｈＩｇＧを添加した時点を、（４）
はエタノールアミンを添加した時点を、（５）はグリシ
ンを添加した時点を、（６）は０．１ｕｇ／ｍｌのｈＩ
ｇＧを添加した時点を、（７）は１．０ｕｇ／ｍｌのｈ
ＩｇＧを添加した時点をそれぞれ示している。

【図１５】図１５は、ｈＩｇＧを濃度を６０、１６０、
再び６０μｇ／ｍｌｈＩｇＧに変化させて膜に接触さ
せ、得られるレスポンスを示したものである。

【図１６】図１６は、本発明のセンサープローブを用い
た検量線を示す。図１６中の左側はＢＳ３で活性化した
バッチ法によるものであり、右側はＥＤＣ／ＮＨＳで活
性化したバッチ法によるものであり、黒三角印及び白四
角印はプロテインＡ−ｈＩｇＧ系を示し、黒丸印及びバ
ツ印は抗ｈＩｇＧ−ｈＩｇＧ系を示す。

【図１７】図１７は、本発明のセンサープローブを用い
た検量線を示す。図１７中の左側はＥＤＣ／ＮＨＳで活
性化したバッチ法によるものであり、右側はＥＤＣ／Ｎ
ＨＳで活性化したＡＦＩ法のよるものであり、白四角印
及び白丸印はプロテインＡ−ｈＩｇＧ系を示し、バツ印
及び白菱形印は抗ｈＩｇＧ−ｈＩｇＧ系を示す。

【図１８】図１８は、本発明のセンサープローブを用い
たときの非特異抗体の吸着量を示す。図１８中のグレー
の棒はｈＩｇＧを示し、斜線の棒はマウスＩｇＧを示
し、横線の棒はチキンＩｇＧを示す。いずれの濃度も９
０μｇ／ｍｌである。

【図１９】図１９は、センサープローブの表面の膜構造
をもし九滴に示したものである。

【図２０】図２０は、本発明のＣＭ−キトサン膜を用い
たＳＰＲ測定の結果を示す。図２０中の、（１）はｐＨ
７．４ＨＢＳ／Ｔバッファーを添加した時点を、（２）
は０．４ＭＥＤＣ／０．１ＭＮＨＳを添加した時点を、
（３）は０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液を添加した時点
を、（４）はエタノールアミンを添加した時点をそれぞ
れ示している。

【図２１】図２１は、本発明のＣＭ−キトサン膜を用い
たＳＰＲ測定の結果を示す。図２１中の、（１）はｐＨ
７．４ＨＢＳ／Ｔバッファーを添加した時点を、（２）
はＥＤＣ／ＮＨＳを添加した時点を、（３）は０．２ｍ
ｇ／ｍｌのＩｇＧ溶液を添加した時点を、（４）はエタ
ノールアミンを添加した時点を、（５）は５００μｇ／
ｍｌのＢＳＡを添加した時点をそれぞれ示している。

【図２２】図２２は、活性化をせずに本発明のＣＭ−キ
トサン膜を用いたＳＰＲ測定の結果を示す。図２２中
の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳ／Ｔバッファーを添加し
た時点を、（２）はグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ３）を添加
した時点を、（３）は５００μｇ／ｍｌのＢＳＡを添加
下時点をそれぞれ示している。

【図２３】図２３は、活性化をせずに本発明のＣＭ−キ
トサン膜を用いたＳＰＲ測定の結果を示す。図２３中
の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳ／Ｔバッファーを添加し
た時点を、（２）は５００μｇ／ｍｌのＢＳＡを添加し
た時点をそれぞれ示している。

【図２４】図２４は、本発明のＣＭ−キトサン膜を用い
たＡＦＩ法によるＳＰＲ測定の結果を示す。図２４中
の、（１）はｐＨ７．４ＨＢＳ／Ｔバッファーを添加し
た時点を、（２）はモノレイヤーのエタノール溶液を添
加した時点を、（３）はＥＤＣ／ＮＨＳの０．２Ｍ／
０．０５Ｍを添加した時点を、（４）は１％ＣＭ−キト
サンを添加した時点を、（５）は０．５ｍｇ／ｍｌのＢ
ＳＡを添加した時点をそれぞれ示している。

【図２５】図２５は、本発明のプローブを用いたときの
検量線を示す。図２５中の丸印はＰＥＩ膜プローブを用
いたＡＦＩ法によるものであり、四角印はＰＥＩ膜プロ
ーブを用いたバッチ法によるものであり、三角印はＣＭ
−キトサン膜プローブを用いたバッチ法によるものであ
る。

【図２６】図２６は、本発明のセンサープローブを用い
たときの非特異抗体の吸着量を示す。図２６中のグレー
の棒はｈＩｇＧを示し、斜線の棒はマウスＩｇＧを示
し、横線の棒はチキンＩｇＧを示す。いずれの濃度も９
０μｇ／ｍｌである。

【図２７】図２７は、本発明のＰＥＩ膜にプロテインＡ
を固定したセンサーを用いた、各種濃度のｈＩｇＧにお
ける経時変化を示したものである。図２７中の１，００
０Ｒ．Ｕは１ｎｇ／ｍｍ^２である。

【図２８】図２８は、実施例１２及び比較例１で得られ
た検量線を示したものである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】自由電子金属表面を有する金属薄膜の表
面が、（１）金属表面に固定され得る官能基及びポリマ
ーと結合し得る官能基を有する有機リンカー、並びに、
（２）検出用試薬に直接結合し得る官能基若しくは検出
用試薬にスペーサーを介して結合し得る官能基及び前記
有機リンカーと結合し得る官能基を有するポリマー、で
処理されてなる金属薄膜。
【請求項２】有機リンカーの、金属表面に固定され得
る官能基とポリマーと結合し得る官能基の間が、炭素原
子、酸素原子、及び、窒素原子からなる群から選ばれる
原子からなり、直鎖部分が２〜２０原子である直鎖状若
しくは分枝状又は環状の化学構造である請求項１に記載
の金属薄膜。
【請求項３】有機リンカーが、２種以上の有機化合物
が結合したものである請求項１又は２に記載の金属薄
膜。
【請求項４】有機リンカーの金属表面に固定され得る
官能基が、硫黄原子を含有する官能基である請求項１〜
３のいずれかに記載の金属薄膜。
【請求項５】有機リンカーの金属表面に固定され得る
官能基が、メルカプト基、スルフィド基又はジスルフィ
ド基である請求項４に記載の金属薄膜。
【請求項６】有機リンカーを形成し、金属表面に固定
され得る官能基を有する有機化合物が、硫黄原子を含有
する官能基を含有するアミノ酸又はその誘導体である請
求項１〜５のいずれかに記載の金属薄膜。
【請求項７】有機リンカーを形成し、金属表面に固定
され得る官能基を有する有機化合物がシステイン又はそ
のエステル誘導体である請求項６に記載の金属薄膜。
【請求項８】有機リンカーのポリマーと結合し得る官
能基が、カルボニル基、アミノ基若しくはカルボキシル
基又はこれらの誘導体である請求項１〜７のいずれかに
記載の金属薄膜。
【請求項９】有機リンカーが、システイン又はそのエ
ステル誘導体、及び、グルタルアルデヒドから誘導され
るものである請求項１〜８のいずれかに記載の金属薄
膜。
【請求項１０】有機リンカーが、メルカプト基、スル
フィド基又はジスルフィド基を有する炭素数２〜２０の
脂肪酸である請求項１〜９のいずれかに記載の金属薄
膜。
【請求項１１】ポリマーの検出用試薬に直接結合し得
る官能基若しくは検出用試薬にスペーサーを介して結合
し得る官能基が、アミノ基、カルボキシル基若しくは水
酸基又はこれらの誘導体である請求項１〜１０のいずれ
かに記載の金属薄膜。
【請求項１２】ポリマーが、ポリマーの主鎖又は側鎖
にアミノ基を有するポリマーである請求項１１に記載の
金属薄膜。
【請求項１３】ポリマーが、アミノ糖を含有する多糖
類である請求項１２に記載の金属薄膜。
【請求項１４】ポリマーが、キトサンである請求項１
３に記載の金属薄膜。
【請求項１５】ポリマーが、ポリ低級アルキレンイミ
ンである請求項１２に記載の金属薄膜。
【請求項１６】金属薄膜の片面のみが処理されている
請求項１〜１５のいずれかに記載の金属薄膜。
【請求項１７】金属薄膜の薄膜の厚さが５０〜１００
０ｎｍである請求項１〜１６のいずれかに記載の金属薄
膜。
【請求項１８】金属薄膜の金属が、金、銀、銅、アル
ミニウム又はクロムのいずれか１種である請求項１〜１
７に記載の金属薄膜。
【請求項１９】金属薄膜の金属が、金である請求項１
８に記載の金属薄膜。
【請求項２０】ポリマーにさらに、検出用試薬が直接
又は検出用試薬に結合し得る官能基を有するスペーサー
を介して検出用試薬が結合している請求項１〜１９のい
ずれかに記載の金属薄膜。
【請求項２１】スペーサーが、ポリマーに結合し得る
官能基及び検出用試薬に結合し得る官能基を有する有機
化合物である請求項２０に記載の金属薄膜。
【請求項２２】検出用試薬に結合し得る官能基が、カ
ルボキシル基又はその反応性誘導体である請求項２１に
記載の金属薄膜。
【請求項２３】検出用試薬が、蛋白質である請求項２
０〜２２のいずれかに記載の金属薄膜。
【請求項２４】蛋白質が抗原又は抗体である請求項２
３に記載の金属薄膜。
【請求項２５】金属薄膜が、基板に密着している請求
項１〜２４のいずれかに記載の金属薄膜。
【請求項２６】基板がプリズムである請求項２５に記
載の金属薄膜。
【請求項２７】金属薄膜が表面プラズモン共鳴（ＳＰ
Ｒ）用の金属薄膜である請求項１〜２６に記載の金属薄
膜。
【請求項２８】自由電子金属表面を有する金属薄膜の
表面を、金属表面に固定され得る官能基及び他の官能基
を有する第一の有機化合物で処理して、当該第一の有機
化合物を金属表面に固定し、次いで当該第一の有機化合
物の金属表面に固定されていない他の官能基と化学反応
をし得る第二の有機化合物を反応させて、前記第一の有
機化合物と当該第二の有機化合物とを結合させることか
らなる有機リンカーが導入された金属薄膜を製造する方
法。
【請求項２９】第一の有機化合物が、硫黄原子を含有
する官能基を含有するアミノ酸又はその誘導体である請
求項２８に記載の方法。
【請求項３０】第一の有機化合物が、システイン又は
そのエステルである請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】第二の有機化合物が、グルタルアルデ
ヒドである請求項２８〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】自由電子金属表面を有する金属薄膜の
表面に、（１）金属表面に固定され得る官能基及びポリ
マーと結合し得る官能基を有する有機リンカーを導入
し、次いで、（２）検出用試薬に直接結合し得る官能基
若しくは検出用試薬にスペーサーを介して結合し得る官
能基及び前記有機リンカーと結合し得る官能基を有する
ポリマーを前記有機リンカーと反応させてこれを結合さ
せることからなる、表面が処理された金属薄膜を製造す
る方法。
【請求項３３】ポリマーが、ポリマーの主鎖又は側鎖
にアミノ基を有するポリマーである請求項３２に記載の
方法。
【請求項３４】ポリマーが、アミノ糖を含有する多糖
類又はポリ低級アルキレンイミンである請求項３３に記
載の方法。
【請求項３５】ポリマーが、キトサン又はポリエチレ
ンイミンである請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】自由電子金属表面を有する金属薄膜の
表面に、（１）金属表面に固定され得る官能基及びポリ
マーと結合し得る官能基を有する有機リンカーを導入
し、次いでこれに、（２）検出用試薬に直接結合し得る
官能基若しくは検出用試薬にスペーサーを介して結合し
得る官能基及び前記有機リンカーと結合し得る官能基を
有するポリマーを前記有機リンカーと反応させてこれを
結合させ、さらに、当該ポリマーに直接又は検出用試薬
に結合し得る官能基を有するスペーサーを介して検出用
試薬を結合又は吸着させてなる、表面が処理された金属
薄膜を製造する方法。
【請求項３７】スペーサーが、ポリマーに結合し得る
官能基及び検出用試薬に結合し得る官能基を有する有機
化合物である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】検出用試薬に結合し得る官能基が、カ
ルボキシル基又はその反応性誘導体である請求項３６又
は３７に記載の方法。
【請求項３９】検出用試薬が、蛋白質である請求項３
６〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】蛋白質が抗原又は抗体である請求項３
９に記載の方法。
【請求項４１】金属薄膜が、金、銀、銅、アルミニウ
ム又はクロムである請求項２８〜４０のいずれかに記載
の方法。
【請求項４２】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により
試料を検出、同定又は定量する際に、表面プラズモン共
鳴（ＳＰＲ）測定用の金属薄膜が請求項２８〜４１のい
ずれかに記載の方法で予め処理されている金属薄膜を使
用することを特徴とする表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
により試料を検出、同定又は定量する方法。
【請求項４３】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により
試料を検出、同定又は定量する際に、表面プラズモン共
鳴（ＳＰＲ）測定用の金属薄膜を請求項２８〜４１のい
ずれかに記載の方法で測定中に処理し、次いで試料を添
加して測定を行うことを特徴とする表面プラズモン共鳴
（ＳＰＲ）により試料を検出、同定又は定量する方法。
【請求項４４】請求項１〜２７のいずれかに記載の金
属薄膜を使用することを特徴とする表面プラズモン共鳴
（ＳＰＲ）により試料を検出、同定又は定量する方法。
【請求項４５】請求項１〜１９に記載の金属薄膜又は
そのポリマー部分に検出用試薬を結合し得る官能基を有
するスペーサーを結合させた金属薄膜に、順次又は同時
に検出用試薬及び試料を添加して、検出用試薬と試料中
の物質との動向を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により
検出、同定又は定量する方法。
【請求項４６】検出用試薬と試料中の物質との動向
が、抗原−抗体反応である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】（１）金属表面に固定され得る官能基
及びポリマーと結合し得る官能基を有する有機リンカ
ー、（２）検出用試薬に直接結合し得る官能基若しくは
検出用試薬にスペーサーを介して結合し得る官能基及び
前記有機リンカーと結合し得る官能基を有するポリマ
ー、及び、（３）金属薄膜からなる表面プラズモン共鳴
（ＳＰＲ）により試料を検出、同定又は定量するための
キット。
【請求項４８】さらに、（４）検出用試薬及び必要の
よりこれをポリマーに結合させるためのスペーサーを包
含してなる請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】請求項１〜２７のいずれかに記載の金
属薄膜を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置。