JPH1090271A

JPH1090271A - 表面プラズモン共鳴現象を利用する免疫測定方法及び装置

Info

Publication number: JPH1090271A
Application number: JP24339496A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Araimoto; 昌宏新井本; Satoshi Sasaki; 聰佐々木; Kazunori Ikebukuro; 一典池袋; Yuzo Masuda; 勇三増田; Masao Karube; 征夫輕部
Original assignee: DKK Corp
Current assignee: DKK Corp
Priority date: 1996-09-13
Filing date: 1996-09-13
Publication date: 1998-04-10

Abstract

(57)【要約】【課題】尿や血液等の体液中の薬物の濃度を短時間で
かつ高精度で検定することのできる表面プラズモン共鳴
現象を利用する免疫測定方法及び装置の提供。【解決手段】薬物に対する抗体を固定化した固定化面
と、薬物に対する抗体を固定化していない未固定化面と
を有する金属薄層と、金属薄層の未固定化面に設けられ
た高屈折率プリズムと、金属薄層の固定化面に設けられ
たセルとを有し、前記セルを構成する一面が、金属薄層
の固定化面である表面プラズモン共鳴現象発生装置の前
記セルに被検液を注入して、固定化面の薬物に対する抗
体と、被検液中に存在する薬物との間で抗原抗体反応を
起こさせる。次いで、被検液を注入する前及び抗原抗体
反応後における表面プラズモン共鳴現象における共鳴角
の変化を検出し、薬物の量を検定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、表面プラズモン共
鳴現象を利用する免疫測定方法及び装置に関し、特に、
尿や血液等の体液中の薬物の濃度を短時間でかつ高精度
で検定することのできる免疫測定方法及び装置に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来より、尿や血液等の体液中の薬物の
測定方法としては、各種の測定方法が採用されている。
例えば、クロマトグラフィーや、呈色反応、質量分析、
沈殿反応、分光分析等の各種の測定方法が挙げられる。
しかしながら、これらの測定方法においては、いずれ
も、測定に使用する被検液の調製には、抽出工程や、精
製工程等の煩雑な工程が必要であり、迅速に被検液を測
定することは困難である。また、これらの測定方法は、
感度が低く、実用に耐えるものではなかった。表面プラ
ズモン共鳴現象は、金属薄層を有するプリズムの金属薄
層に、プリズムを通して光を反射させると、その金属薄
層の表面状態又は屈折率によって、ある角度で入射した
場合には、エバネッセント波の波数と表面プラズモンの
波数とが一致して共鳴し、反射光強度が減衰する現象で
ある。この現象自体は公知であり、各種の文献等に記載
されている。また、この現象を利用する測定方法も提案
されている。この表面プラズモン共鳴現象を利用する測
定方法の利点としては、例えば、光が試料溶液中を通過
しないので、試料の着色や、不透明さによって測定精度
が影響され難いこと、共鳴が目的物の光学特性とは無関
係に起こるので、目的物の吸収スペクトルを考慮する必
要がないこと、屈折率の変化を測定するので、リアルタ
イムで測定が可能であること、試料溶液の量が少なくて
済むこと、バックグラウンドノイズが少ないこと、更
に、金属面上での現象であるため、物質を固定化するこ
とによって、面を利用することができること等が挙げら
れる。

【０００３】しかしながら、表面プラズモン共鳴現象を
利用する測定方法は、数千以上の分子量を有する、分子
量の比較的大きい物質に対して採用されてきたものであ
り、薬物等、例えば、アンフェタミンや、メタンフェタ
ミン等の低分子量の覚醒剤等については、これまで適用
されたことはなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、尿や血液等
の体液中の薬物の濃度を短時間でかつ高精度で検定する
ことのできる免疫測定方法及び装置を提供することを目
的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、表面プラ
ズモン共鳴現象の特徴を利用しながら、更に、検出時間
及び感度を向上させることのできる技術を鋭意検討した
結果、非常に選択的であり、かつ感度の向上に繋がる抗
原抗体反応を組合せることを検討した。本発明者らは、
更に、低分子量である薬物に対して、抗原抗体反応前後
の共鳴角の変化が十分大きくなるように、分子量を増大
させた標準物質を得、この標準物質と被検液中の薬物と
を競合的に抗体に結合させることにより、更に、測定感
度を向上できることを見い出した。本発明は、かかる新
規な知見に基づくものである。即ち、本発明は、以下の
発明に関するものである。１．薬物に対する抗体を固定化した固定化面と、前記薬
物に対する抗体を固定化していない未固定化面とを有す
る金属薄層と、前記金属薄層の未固定化面に設けられた
高屈折率プリズムと、前記金属薄層の固定化面に設けら
れたセルとを有し、前記セルを構成する一面が、前記金
属薄層の固定化面である表面プラズモン共鳴現象発生装
置の前記セルに被検液を注入して、前記固定化面の薬物
に対する抗体と、前記被検液中に存在する薬物との間で
抗原抗体反応を起こさせる工程、前記被検液を注入する
前及び前記抗原抗体反応後における表面プラズモン共鳴
現象に基づく共鳴角を検出する工程、前記共鳴角の変化
から薬物の量を検定する工程、を有することを特徴とす
る免疫測定方法、２．薬物に対する抗体を固定化した固定化面と、前記薬
物に対する抗体を固定化していない未固定化面とを有す
る金属薄層と、前記金属薄層の未固定化面に設けられた
高屈折率プリズムと、前記金属薄層の固定化面に設けら
れたセルとを有し、前記セルを構成する一面が、前記金
属薄層の固定化面からなる表面プラズモン共鳴現象発生
装置、前記高屈折率プリズムを通して前記金属薄層の未
固定化面に入射光を供給する光源、前記高屈折率プリズ
ムを通して、前記金属薄層の未固定化面から生じる共鳴
角を検出する検出装置、を有することを特徴とする薬物
の免疫測定装置、及び３．表面プラズモン共鳴現象発生装置に使用する金属薄
層であって、該金属薄層の一面に、薬物に対する抗体を
結合したことを特徴とする金属薄層。

【０００６】また、本発明において、抗原抗体反応を行
う場合に、競合法を採用することにより、測定感度を更
に向上できることを見出した。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明について、詳細に説
明する。本発明において、測定の対象となる薬物として
は、例えば、メタンフェタミン（分子量：149.24) や、
アンフェタミン（分子量：135.21) 等の覚醒剤や、モル
ヒネ（分子量：285.34) 、ジアセチルモルヒネ（ヘロイ
ン）（分子量：369.42)、コデイン（分子量：299.37)
、コカイン（分子量：303.36) 、メサドン（分子量：3
09.45) 、リセルギン酸ジエチルアミド（ＬＳＤ）（分
子量：323.44) 等の麻薬、フェノバルビタール（分子
量：232.24) 、ジアゼパム（分子量：284.74)、ニトラ
ゼパム（分子量：281.27) 等の向精神薬、大麻としてテ
トラヒドロカンナビノール（分子量：314.47) などを挙
げることができる。これらの薬物の分子量は、１００〜
４００、実際上は、１３０〜３３０の範囲内に入る。こ
のような低分子量の薬物に対しては、これまで、表面プ
ラズモン共鳴現象を利用して測定を行っても、薬物の分
子量が小さいために、金属薄層上の屈折率の変化を有意
に起こさせるものではなく、従って、測定値を再現性よ
く評価することができなかった。

【０００８】薬物（又は薬物のエピトープ）を認識する
抗体は、モノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体
でも特に制限なく使用することができる。モノクローナ
ル抗体は、例えば、ケーラー・ミルシュタイ（Kohler、
Milstein）の方法に従って当業者には容易に製造するこ
とができる。一般に、抗原で免疫したマウス等の哺乳類
の脾臓細胞等に由来する抗体産生細胞と、マウス等の哺
乳類のミエローマ細胞とを融合し、選択培地によって、
抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングするこ
とによって、所望のハイブリドーマを入手し、これを培
養してモノクローナル抗体を産生させるか、又はハイブ
リドーマをマウス等の哺乳類の腹腔内に投与し、腹水か
らモノクローナル抗体を精製することによってモノクロ
ーナル抗体を入手することができる。

【０００９】本発明においては、抗原としての薬物は、
低分子量なので、薬物に、キャリヤーとして、ウシ血清
アルブミン（BSA)や、ヒト血清アルブミン等を結合し、
免疫原性を付与した後、上記のように免疫することによ
って、薬物に対する抗体を産生させることができる。ポ
リクローナル抗体は、例えば、薬物にキャリヤーを付加
した後、マウス等の哺乳類に皮下又は腹腔内投与して、
その哺乳類から血清を入手し、精製することによってポ
リクローナル抗体を取得することができる。ここで使用
されるキャリヤーとしては、従来より使用されているも
のであれば、特に限定されるものではなく、各種のもの
を使用することができる。キャリーとしては、例えば、
上記のＢＳＡや、ヒト血清アルブミン等を挙げることが
できる。

【００１０】図１には、表面プラズモン共鳴現象を利用
する本発明で採用する測定装置の原理が示されている。
本発明の装置は、高屈折率プリズム１と、その下方でプ
リズムの一面に設けられた金属薄層２と、その金属薄層
２の下端に設けられたセル３と、プリズム１を通して金
属薄層２に向けて光を照射する光源４と、プリズムを通
して金属薄層２で反射された反射光を受光する受光装置
５とから基本的に構成されている。高屈折率プリズム用
材としては、高屈折率のものであれば、特に限定される
ことなく各種のプリズム用材を使用することができる。
このような高屈折率プリズム用材としては、例えば、Ｂ
Ｋ７（ n_d＝1.5163）、ＳＦＬ６（ n_d＝1.80518）等
が好適に使用されるが、その材質はこれらのガラスに限
定されるものではない。

【００１１】金属薄層としては、薄膜化できるものであ
れば、各種の金属を使用することができる。例えば、白
金や、金、銀、銅、ニッケル、鉄、アルミニウム、ステ
ンレス等が含まれる。特に好ましい金属薄層としては、
金からなる金属薄層が挙げられる。なお、金属薄層２
は、金属を高屈折率プリズムの一辺に蒸着等の手段によ
り、被覆することによって形成することができる。もし
くは同様な手法によって金属を被覆したガラスを、高屈
折率プリズムに接着させることでも形成することができ
る。金属薄層の厚みは、通常、２５〜９０nm、好ましく
は４０〜６０nmである。金属薄層２の一面には、薬物を
認識する抗体が固定されている。金属薄層への抗体の固
定化は、例えば、抗体に対して金属表面に親和性を持た
せた後、抗体を金属表面に固定することが好ましい。例
えば、白金や、銅のような酸化し易い金属の場合には、
空気中に放置するだけで、酸化して、金属表面に水酸基
を生ずるので、この官能基を使用して、抗体を固定化す
る。一方、酸化し難い金属等の場合には、カルボキシル
基等の官能基を有するデキストラン、若しくはそのよう
なカルボキシル基等を有する有機チオール化合物（例え
ば、メルカプトプロピオン酸）等を例えばカップリング
剤として使用して金属表面にカルボキシル基等の官能基
を固定化し、これを利用して、抗体であるタンパク質の
アミノ基又はカルボキシル基と結合させることが通常行
われる。このような酸化し難い金属としては、例えば、
金が挙げられる。金属表面に形成した水酸基を利用し
て、電極表面に抗体を結合するための官能基を付与する
ためには、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン（γ
−APTES)等のシランカップリング剤を使用することがで
きる。この処理によって、金属表面には、水酸基とシリ
ル基との反応によって生じたシロキシ基を介してアミノ
基が付与される。次いで、アミノ基と反応するグルタル
アルデヒドを作用させて、アミド基を介してアルデヒド
基を付与した後、抗体であるタンパク質を反応させる。

【００１２】セル３は、被検液を受け入れる容器であ
り、そのセルを構成する一面は、金属薄層２の抗体を固
定化した固定化面からなっている。図１において、セル
３の左右両端に開口部を設けることによって、セル内の
洗浄や、被検液の注入等を簡易に行うようにすることが
できる。光源としては、各種の光源を使用することがで
きる。例えば、光源としては、波長が２００〜１，３０
０nm、好ましくは４００〜８００nmの光を発光する光源
が好適に使用される。例えば、６５０〜８００nmの光を
発光する発光ダイオードを好適に使用することができ
る。受光装置５としては、例えば、フォトダイオード、
リニアアレイ、ＣＣＤカメラ等を好適に使用することが
できる。

【００１３】本発明においては、まず、セル２に、キャ
リヤー緩衝液（例えば、ＨＢＳ）を通し、光源４から入
射光をプリズムを通して抗体を固定していない金属表面
に当て、その反射光における反射光強度が最小となる光
の入射角を共鳴角（１）として測定する。ここで、簡単
に、表面プラズモン共鳴現象について説明すると、光が
高屈折率プリズムと金属薄膜との界面で全反射すると
き、エバネッセント波と表面プラズモンの波数が一致す
ると共鳴が起こる。このとき光のエネルギーの一部が表
面プラズモンを励起するために使われ、反射光強度が減
少する（図１、右上の図を参照）。この現象を、表面プ
ラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance、SPR)とい
う。ここで、エバネッセント波は、高屈折率プリズムに
光を全反射角で入射したときに、プリズムの外側にしみ
出してプリズム表面上を伝播する表面波である。金属が
十分に薄い場合（例えば、２５〜９０nm）、エバネッセ
ント波は金属を通過する。また、表面プラズモンは、表
面に局在したプラズマ振動の量子、つまりエネルギーが
量子化されることに対応する表面プラズマ振動の素励起
である。金属は自由電子が固定した陽イオンの背景の中
を動き回っていて、固体プラズマとみなすことができ、
その表面では表面プラズモンが生じる。表面プラズモン
の波数は金属薄膜に接する物質の屈折率に依存する。金
属薄膜に接する物質の状態変化により屈折率が変化する
と、表面プラズモンの波数が変化し、表面プラズモン共
鳴の起こるエバネッセント波の波数が変化する。つま
り、反射光強度の減少するエバネッセント波の波数が変
化する。エバネッセント波の波数は光の入射角に依存す
るため、反射光強度を減少させる光の入射角が変化す
る。従って、反射光強度が極小となる入射角、すなわ
ち、共鳴角を読みとることにより金属薄膜に接する物質
の状態（具体的には、屈折率）を知ることができる。ま
た、屈折率が大きくなるほど、共鳴角が大きくなる。

【００１４】上記キャリヤー緩衝液について共鳴角
（１）を測定した後、被検液をセル２に注入する。抗原
抗体反応が完了したと考えられる時間が経過した後、例
えば、５〜６０分、好ましい１０〜３０分後に、被検液
を排出し、次いでキャリヤー緩衝液を流してセルを洗浄
する。この時、被検液注入前に比べて、抗原抗体反応に
より、金属表面に固定された抗体の分子量が、結合した
薬剤の分子量分大きくなるため、屈折率が大きくなり、
共鳴角（２）も、被検液注入前にキャリヤー緩衝液を流
した後に比べて、大きくなっている。このように測定す
ることにより、試料自体の屈折率の違いに影響されるこ
となく、抗原の結合分による共鳴角の変化を測定するこ
とができる。従って、予め、既知濃度の薬物について、
検量線を作成しておけば、測定された共鳴角の変化に基
づいて、薬物の濃度を測定することができる。なお、共
鳴角の差として、他の時点の共鳴角の差を取ってもよ
い。例えば、キャリヤー緩衝液注入後と、被検液注入後
（キャリヤー緩衝液注入前）との間での共鳴角の差を取
ってもよい。但し、後者の方法では、被検液注入直後の
共鳴角の値を読み取る際に、反応開始点を読み取りにく
い場合があり、誤差の原因となりやすい。

【００１５】抗原抗体反応は、通常、５〜４５℃、好ま
しくは２０〜３５℃で行うことが適当である。本発明に
おいては、更に、検出感度を向上させるために、競合法
を採用することが好ましい。即ち、被検液に、高分子量
化した薬物を併用することが好ましい。高分子量化する
ことによって、大きな共鳴角を得ることができ、感度、
精度が向上する。高分子量化に使用する物質としては、
抗体を産生させるために、薬物に結合させるのに使用し
たキャリヤーと同じ物質を挙げることができる。このよ
うな物質としては、例えば、タンパク質を挙げることが
でき、具体的には、アルカリフォスファターゼ（分子
量：約８万）、ペルオキシダーゼ（分子量：約１０
万）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（分子量：約１1.６
万）等の酵素や、ＢＳＡ等のアルブミン（分子量：約6.
９万）、ＩｇＧ（分子量：約１５万）、糖タンパク質、
リポタンパク質等のグロブリン、ヘモグロビン（分子
量：約6.４万）等のヘムタンパク質、甲状腺刺激ホルモ
ン（分子量：約2.８万）、インスリン等のタンパク質性
ホルモン等が挙げられる。共鳴角の変化量を大きくする
に充分な分子量を有しかつ抗原である薬物とは反応しな
いものであれば、上記以外の物質、例えば、澱粉等も使
用することができる。更に、ゲスト分子を取り込んで、
大きな共鳴角を生じる物質、例えば、クラウンエーテル
や、シクロデキストリン、カリックスアレーン等も使用
することができる。

【００１６】

【実施例】以下、本発明について、実施例により、更に
詳細に説明するが、本発明の範囲は実施例によって限定
されるものではない。実施例１使用した試薬抗メタンフェタミン抗体は、イーストエイカーバイオロ
ジカル（EAST ACRES BIOLOGICAL)社製の抗体を使用し
た。その他の試薬としては、1-エチル-3-(3-ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド・HCl (EDC) は、ピアー
ス(PIERCE)社製、N-ヒドロキシサルフォスクシンイミド
(Sulfo-NHS)はピアース社製、エタノールアミンはシグ
マ（SIGMA)社製、塩酸は和光純薬工業社製、塩酸メタン
フェタミンは大日本製薬社製、ペルオキシダーゼ標識メ
タンフェタミンはシバヤギ社製、N-ヒドロキシエチルピ
ペリジン-N′-2−エタンスルホン酸(HEPES) は同仁化学
研究所社製、塩化ナトリウムは和光純薬工業社製、EDTA
は和光純薬工業社製、Tween 20 (ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノラウレート) は和光純薬工業社製、リン酸
水素二ナトリウムは和光純薬工業社製、リン酸二水素ナ
トリウムは和光純薬工業社製、アジ化ナトリウムは和光
純薬工業社製、ウシ血清アルブミン（BSA)は和光純薬工
業社製を用いた。測定装置の説明実施例１では、表面プラズモン共鳴現象を応用した測定
装置(Pharmacia Biotech社製 BIAcore2000）を使用し
た。この装置はフロー型でありキャリヤー緩衝液は、 p
H 7.4 のHBS(10 mM HEPES 、150mM NaCl、3.4 mM EDTA
、0.005% v/v Tween 20)を用い、流速を５μl/min と
した。この装置は、試料を添加する際に流路が切り替わ
り、キャリー緩衝液中に試料が拡散することはない。ま
た、光源は、発光ダイオードであり、その光の波長は76
0nm である。

【００１７】抗体固定化用金薄膜としてはカルボキシル
メチルデキストランが被覆されている Pharmacia Biote
ch社製 CM5を用いた。この装置を使用した実験は25℃で
行った。以下、特に断らない限り、同一の温度条件で行
った。抗メタンフェタミン抗体の活性の確認固定化した抗メタンフェタミン抗体と、ペルオキシダー
ゼ標識メタンフェタミンを免疫反応させ、未反応のペル
オキシダーゼ標識メタンフェタミンを除去した後、ペル
オキシダーゼの酵素活性から抗体と抗原の結合を確認し
た。コントロールとしてはBSA を固定化したものを用い
た。具体的に述べれば、抗メタンフェタミン抗体を pH
7.4 PBS(16.2 mM リン酸水素二ナトリウム、3.8mM リン
酸二水素ナトリウム、100mM 塩化ナトリウム、0.1%アジ
化ナトリウム）に溶解し、100 μg/ml抗メタンフェタミ
ン抗体溶液を調製した。同様に pH 7.4 PBS を用いて10
0 μg/ml BSA溶液を調製した。

【００１８】96穴マイクロタイタープレートに100 μg/
ml抗メタンフェタミン抗体溶液100μl と、100 μg/ml
BSA溶液100 μl とを分注し、これを４℃で一晩インキ
ュベーションし、それぞれを固定化した。固定化後、抗
体溶液及びBSA 溶液を捨て、 PBS 320μl を分注した。
３分間インキュベーションし、PBS を捨てた。この操作
を３回繰り返し、洗浄を行った。次に、BSA を純水に溶
解し、３％ BSA溶液を調製した。抗体及びBSA を固定化
した場所に、それぞれ３％ BSA溶液 320μl を分注し
た。これを室温で２時間インキュベーションし、ブロッ
キングした。ブロッキング後、３％ BSA溶液を捨て、 P
BS 320μl を分注した後、３分間インキュベーション
し、PBS を捨てた。この操作を３回繰り返し、洗浄を行
った。

【００１９】次に、PBS を用いて100 μg/mlペルオキシ
ダーゼ標識メタンフェタミン溶液を調製し、それぞれに
分注した。これを室温で１時間インキュベーションし、
免疫反応を起こさせた。反応後、ペルオキシダーゼ標識
メタンフェタミン溶液を捨て、 PBS 320μl を分注した
後、３分間インキュベーションし、PBS を捨てた。この
操作を４回繰り返し、洗浄を行った。次に、基質溶液
（1.25g Na₂HPO₄ 、18.2g NaH₂PO₄ 、0.282g Urea hydr
ogen peroxide をメスフラスコを用いて純水に溶かし、
1000 mlにしたもの）と、色素溶液（288 mg/ml テトラ
メチルベンジジンを 100 ml のジメチルスルホキシドに
溶解後12mgペニシリンＧと、500 μl Phosphor-Acid を
加え、メスフラスコを用いて純水で1000 ml にした）と
を調製し、基質１に対して色素２の割合で混合した。こ
の混合液200 μl をそれぞれに分注した。これを室温で
５分間インキュベーションし、酵素反応を起こさせた。

【００２０】５分後、２Ｎ硫酸50μl をそれぞれに分注
し、酵素反応を停止させた。この溶液の 450 nm(参照62
0 nm) の吸収を測定した。金属薄層への抗体の固定化使用した測定装置の検知部（金属薄層）としては、金薄
膜にカルボキシメチルデキストランが被覆されているも
のを用い、この金薄膜に抗メタンフェタミン抗体を固定
化した。まず、カルボキシメチルデキストランのカルボ
キシル基を活性化するために、400 mM EDC溶液と100 mM
Sulfo-NHS溶液を容量比1:1 で混合し、この混合液150
μl を測定装置に注入した。流速が５μl/min であるか
ら、反応時間は30分であった。このときEDC が触媒とな
り、カルボキシメチルデキストランのカルボキシル基が
NHS エステルとなる。

【００２１】次に、pH5.0 酢酸緩衝液（2.96mM酢酸、7.
04mM酢酸ナトリウム）で調製した100 μg/ml抗メタンフ
ェタミン抗体 150μl を測定装置に注入した（反応時間
30分）。このとき、抗体のアミノ基と活性化したカルボ
キシル基がペプチド結合した。EDC とNHS とでカルボキ
シル基を活性化させる際、カルボキシル基のすべてがNH
S エステルにはならず、陰イオンが残っている。金薄膜
近傍に抗体を凝集させ反応を促進するために、等電点よ
り低いpHの緩衝液であるpH5.0 酢酸緩衝液を用いて抗体
溶液の調製を行った。次に、残存活性基を不活性化する
ためにエタノールアミン 35 μl を測定装置に注入した
（反応時間７分）。

【００２２】最後に、検知部表面を洗浄するために0.1N
塩酸５μl を測定装置に注入した（洗浄時間１分）。メタンフェタミンの検出検知部に抗メタンフェタミン抗体を固定化した測定装置
にメタンフェタミンを注入し、メタンフェタミン注入前
の共鳴角とメタンフェタミン注入終了後キャリシ緩衝液
に切り替わったときの共鳴角の差を、免疫反応により、
メタンフェタミンが抗メタンフェタミン抗体に結合した
ことによる共鳴角変化量として測定を行った。まず、塩
酸メタンフェタミンをpH 7.4 PBSに溶解して、０ppb 、
0.1 ppb、1ppb 、10 ppb、100 ppb 、 1 ppm、10 pp
m、100 ppm 、 1000 ppm のメタンフェタミン溶液を調
製した。

【００２３】次に、各濃度のメタンフェタミン溶液50μ
ｌをフローセルに注入し、上記と同様にして共鳴角変化
量を測定した（反応時間10分）。ひとつの試料を測定し
た後、次の試料を注入する前に抗体と結合している抗原
を解離し、同じ系で実験を繰り返した。0.１N 塩酸をフ
ローセルに注入して抗原を解離した。長時間低いpHにし
たままだと抗体が失活するおそれがあるので１回の注入
量は５μｌとした（１分）。この操作を４回繰り返すと
抗原が完全に解離することが確かめられたので、以下、
各試料測定間に0.１N HCl ５μｌを注入する操作を４回
繰り返した。競合法におけるペルオキシダーゼ標識メタンフェタミン
濃度の最適化 0.01 mg/ml、0.02 mg/ml、0.05 mg/ml、0.1 mg/ml 、
0.2 mg/ml、0.5 mg/ml、1 mg/ml のペルオキシダーゼ標
識メタンフェタミンをpH 7.4 PBSを用いて調製し、標準
物質とした。

【００２４】ここで使用したペルオキシダーゼ標識メタ
ンフェタミンは、メタンフェタミン５０mg及びモノクロ
ロ酢酸３１７mgをリン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳ（ｐＨ７
〜８）に溶解し、一晩攪拌し、ここで得た化合物と、ペ
ルオキシダーゼ４0.２ｇ及び１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノブロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤ
Ｃ）６3.９mgをＰＢＳ（ｐＨ６〜6.５）に溶解し、一晩
攪拌することにより得たものである。各濃度のペルオキ
シダーゼ標識メタンフェタミン溶液50μｌをセルに注入
し、共鳴角変化量を測定した（反応時間10分）。競合法を採用したメタンフェタミンの測定塩酸メタンフェタミンをpH 7.4 PBSに溶解して０ppb 、
0.1 ppb、1ppb、2ppb、5ppb、10 ppb、20 ppb、50 pp
b、100 ppb のメタンフェタミン溶液を調製した。

【００２５】メタンフェタミン溶液と、0.5 mg/ml ペル
オキシダーゼ標識メタンフェタミン溶液を容量比1:1 で
混合した。その混合液50μｌをセルに注入し、共鳴角変
化量を測定した（反応時間10分）。結果及び考察抗体活性の確認抗メタンフェタミン抗体を固定化した場合、溶液の吸収
は0.687 であり、コントロールとしてBSA を固定化した
場合、溶液の吸収は0.286 であった。抗メタンフェタミ
ン抗体を固定化して実験を行った溶液の吸収の方が大き
かった。これは免疫反応により抗メタンフェタミン抗体
と結合したペルオキシダーゼ標識メタンフェタミンによ
るものと考えられる。従って、抗メタンフェタミン抗体
の活性が確認された。抗体の固定化の確認抗体固定化の際のセンサーグラムを図２に示す。

【００２６】まず、EDC 溶液とSulfo-NHS 溶液の混合液
が注入され、HBS より屈折率が大きいためセンサーグラ
ムが上にシフトしている(1) 。Sulfo-NHS は低分子であ
り（217.14）結合量は小さいため、注入終了後キャリア
緩衝液に切り替わったあとの共鳴角はもとの共鳴角と比
較して大きな変化はなかった(2) 。抗体溶液を注入した
際のセンサーグラムは時間とともに上昇し、抗体が結合
していく様子を観測することができた(3) 。注入終了後
キャリア緩衝液に切り替わった後の共鳴角はもとの共鳴
角と比較して大きく増加した(4) 。以下エタノールアミ
ン(5) 、塩酸(6) を注入した様子を観測できた。抗体固
定化後の共鳴角変化量は約15800 ×10^-4度であった。共
鳴角１×10^-4度の増加は検知部表面約１pg/mm²の結合量
に相当する。また検知部面積は0.2 mm²である。従っ
て、抗体固定化量は約3.2 ngであると考えられる。メタンフェタミンの検出抗メタンフェタミン抗体を固定化した測定装置にメタン
フェタミン溶液を注入したときの、共鳴角変化量と、メ
タンフェタミン濃度との関係を図３に示す。この図３か
ら、メタンフェタミンの測定では、0.1 ppm 以上のメタ
ンフェタミンの有無が検知できた。メタンフェタミンを
用いる免疫測定法としては従来法に比べ高感度であっ
た。競合法におけるペルオキシダーゼ標識メタンフェタミン
濃度の最適化抗メタンフェタミン抗体を固定化した測定装置に、ペル
オキシダーゼ標識メタンフェタミン溶液を注入したとき
の、共鳴角変化量と、ペルオキシダーゼ標識メタンフェ
タミン濃度との関係を図４に示す。競合法に用いるペル
オキシダーゼ標識メタンフェタミン濃度としては、メタ
ンフェタミンと競争反応を起こすとその平衡状態が変わ
るような濃度でなければならない。また、応答値も高い
方が好ましい。図４より、0.5mg/ml付近では応答値が十
分あり、0.5mg/ml付近では比較的平衡状態が変化しやす
いと考えられる。従って、実施例における競合法に用い
るペルオキシダーゼ標識メタンフェタミン濃度として、
0.5mg/mlを採用した。競合法を採用したメタンフェタミンの測定抗メタンフェタミン抗体を固定化した測定装置にメタン
フェタミン溶液とペルオキシダーゼ標識メタンフェタミ
ン溶液の混合液を注入し競合法を採用したときの、共鳴
角変化量と、メタンフェタミン濃度との関係を図５に示
す。メタンフェタミン濃度が０ppb 、つまりメタンフェ
タミンが存在しないときの共鳴角変化量は159.0 ×10^-4
度であった。競合法を採用した場合、ppb オーダーのメ
タンフェタミンの定量が可能であった。また、メタンフ
ェタミンのみを用いた測定と比較し、応答値が１０倍程
度大きくなり、ばらつきが小さくなったのでより高感度
な測定が可能であった。結言競合法を採用した免疫測定法を、表面プラズモン現象を
用いる測定法により評価し、メタンフェタミンの測定を
行った。その結果、従来法と比較して高感度に測定でき
ることが分かった。更に、この測定法では、操作が試料
と、ペルオキシダーゼ標識メタンフェタミン溶液とを混
合して、測定装置に注入するだけであるので非常に簡単
である。

【００２７】ペルオキシダーゼ標識メタンフェタミンに
使用したペルオキシダーゼは、エンザイムイムノアッセ
イで用いる場合とは異なり、酵素反応を利用する指標と
して用いたのではなく、標識抗原の分子量を増加し、屈
折率の変化量を増加させ、共鳴角の変化量を大きくする
ために用いたものである。従って、屈折率を大きく変化
させる物質を探索し、標識物質を変えると、更に、高感
度化できる可能性がある。また、検知部の金属薄層に近
い変化ほど応答が大きくなるため、架橋部分の短い固定
化法を用いて F_c部分を切断して、 F_ab部分のみにした
抗体を固定化することによっても高感度化できる可能性
がある。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の免疫測定装置の原理図。

【図２】抗体固定化の際のセンサーグラムを示す図。

【図３】共鳴角変化量と、メタンフェタミン濃度との関
係を示す図。

【図４】共鳴角変化量と、ペルオキシダーゼ標識メタン
フェタミン濃度との関係を示す図。

【図５】競合法における共鳴角変化量とメタンフェタミ
ン濃度との関係を示す図。

【符号の説明】

１プリズム２金属薄層３セル４光源５受光装置

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者池袋一典東京都渋谷区笹塚３−25−８Ｍａｎｓｉｏｎトミー５ 502号 (72)発明者増田勇三東京都中央区東日本橋２−17−22 (72)発明者輕部征夫神奈川県川崎市宮前区東有馬１−３−16

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】薬物に対する抗体を固定化した固定化面
と、前記薬物に対する抗体を固定化していない未固定化
面とを有する金属薄層と、前記金属薄層の未固定化面に
設けられた高屈折率プリズムと、前記金属薄層の固定化
面に設けられたセルとを有し、前記セルを構成する一面
が、前記金属薄層の固定化面である表面プラズモン共鳴
現象発生装置の前記セルに被検液を注入して、前記固定
化面の薬物に対する抗体と、前記被検液中に存在する薬
物との間で抗原抗体反応を起こさせる工程、前記被検液を注入する前及び前記抗原抗体反応後におけ
る表面プラズモン共鳴現象に基づく共鳴角を検出する工
程、前記共鳴角の変化から薬物の量を検定する工程、を有す
ることを特徴とする免疫測定方法。
【請求項２】薬物に対する抗体を固定化した固定化面
と、前記薬物に対する抗体を固定化していない未固定化
面とを有する金属薄層と、前記金属薄層の未固定化面に
設けられた高屈折率プリズムと、前記金属薄層の固定化
面に設けられたセルとを有し、前記セルを構成する一面
が、前記金属薄層の固定化面からなる表面プラズモン共
鳴現象発生装置、前記高屈折率プリズムを通して前記金属薄層の未固定化
面に入射光を供給する光源、前記高屈折率プリズムを通して、前記金属薄層の未固定
化面から生じる共鳴角を検出する検出装置、を有するこ
とを特徴とする薬物の免疫測定装置。
【請求項３】表面プラズモン共鳴現象発生装置に使用
する金属薄層であって、該金属薄層の一面に、薬物に対
する抗体を結合したことを特徴とする金属薄層。