JP2603611B2 - 液状分析物中の種のパラメーターを光学的に確認する方法および装置 - Google Patents

液状分析物中の種のパラメーターを光学的に確認する方法および装置

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    • Y10S436/805—Optical property

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は液状分析物（analyte）中のパラメーターを
確認する方法、例えば、その中に溶解した種を決定する
方法に関する。
〔従来の技術と発明が解決しようとする問題点〕
この方法は既知の技術に関し、ここで完全に反射した
光の信号を運ぶ光学的導波路（waveguide）は分析物と
接触し、そして前記信号のエバネッセント波成分は固体
と液体との界面において分析物と、その内部の種に固有
のあるパラメーターに対して応答性であるような方法で
相互作用する。例えば、このようなパラメーターについ
ての情報は、導波路内の入射信号の反射点における入射
信号の視感エネルギーの一部の吸収に関し、あるいはこ
のような種に特徴的な蛍光信号の連続的生成を伴う前記
視感エネルギーによるある蛍光発生体（fluorophore）
の励起に関係づけることができる。一般に、相互作用は
入射光のエバネッセント波成分が分析物中に浸透する深
さに対応する区域に限定され、この深さは導波路の表面
から出発して数十〜数百ナノメートルの範囲である。
前述の相互作用は全体の溶液中のあるパラメーターに
ついて情報を提供することが一般に知られている〔ハー
ディ（Hardy）、米国特許4,050,895号〕が、最近発表さ
れた研究が示すように、エバネッセント波成分と分析物
との相互作用（あるいはむしろ、そのエネルギーの実質
的な部分の分析物中への漏れ）が導波路の表面と結合し
た問題の化合物の単一層（一般に単分子層）を含むよう
に限定されるとき、改良された結果（すなわち、すぐれ
た感度および精度）が得られる。換言すると、非常に有
用な分析技術は、研究すべき分析物との接触前に、導波
路上に前記分析物の種に対して特異性の反応成分を取り
付け、その後、それを前記分析物中に浸漬させることに
基づくことができることが最近発見された。これらの条
件下で、問題の種は前記反応成分と結合し、そして導波
路の表面に複合体（complex）の層を形成し、問題の種
のその層中の濃度（すなわち、相互作用の区域における
前記種の実際の密度）は時間とともに非常に急速に増加
し、そして導波路内を移動する光との相互作用は増加し
かつその出力における応答は強くなるであろう〔クロニ
ック（KRONIK）およびリトル（LITTLE）、米国特許3,93
9,350号〕。
導波路の表面上の問題の生成物の非常に薄い層の形式
を含むこのような型の分析において、光の信号と溶液の
本体との相互作用は妨害（バックグラウンドの雑音）と
考えられており、そしてそれをできるだけ多く最小とす
る試みがなされてきた。例えば、エバネッセント成分と
導波路の表面上に付着した単分子層との最大の相互作用
および全体の溶液との最小の相互作用の間の妥協的条件
は、導波路／分析物の界面における導波路の材料の外側
の前記エバネッセント成分の浸透深さを制御することに
よって達成できる。このような制御は、溶液の屈折率
（n2）に関して適当な屈折率（n1）をもつ導波路を選択
し、そして導波装置内の全体の反射角ならびに入射光の
波長を適切に選ぶことによって実施できる（これを実施
できる理由およびこのような選択を行う方法については
後に詳述する）。例えば、欧州特許出願（EP−Ａ）7535
3号において、この浸透深さは問題の前記層の厚さに合
致するように、あるいはそれを超えるように最適化でき
ることが開示されている。
〔問題点を解決するための手段および作用効果〕
しかしながら、このアプローチは常に最も望ましいと
いうことはないことが予期せぜることには今回発見され
た。事実、問題の層の厚さに相当する距離を明確に越え
るエバネッセント波成分の浸透は、問題の前記層中に特
定的に含まれるもの以外の分析物のパラメーター、例え
ば、分析物中に溶解した種についての分析結果を同時に
得るとき、きわめて有用でありうることが発見された。
その上、この方法は、また、導波路が運ぶ光と分析物と
の有用な相互作用が導波路の１つより多い特定の区域
（すなわち、この区域上の単一層の被膜または全体の溶
液との相互作用、あるいは全体溶液および被膜の両者の
同時の相互作用が起こる区域）を含むことができ、すな
わち、前記導波路の２つまたはいくつかの明確に異なる
区域を含むことができるということを認識した後、それ
以上の面に拡張された。例えば、１つの区域において、
相互作用は全体の溶液と起こり、そして他のあるいはさ
らに多い光学的に分離された区域において、相互作用は
問題の１つまたはいくつかの層と起こるであろう。
すなわち、この発明は、導波路中の励起放射線の多重
内部反射を用いて単一液体試料中の１より多い成分を測
定する方法であって、 液体試料中に含まれる第１成分に特異な反応体で導波
路の表面を被覆すること、 該被覆表面を該試料に暴露して該反応体と該第１成分
の反応で形成された複合体（complex）の層を形成させ
ること、 該導波路の入力端に光励起信号を照射して、該信号の
エバネッセント成分が該試料中に十分な距離浸透し、該
複合体及び該液体試料本体中の第２成分と相互作用する
ようにすること、 該相互作用後の信号を集めること、および その後、該信号を分析し、該信号の初めの急激な減少
または増加の変化から該第２成分の存在または量を検出
し、該信号のその後の漸進的な減少または増加の変化か
ら該第１成分の存在または量を検出すること を含むことを特徴とする液体試料中の１より多い成分を
測定する方法にある。
とりわけ、本発明は、血液試料の総ヘモグロビンと総
ヘモグロビンに対する別のヘモグロビン因子又は誘導体
を実質的に同時に測定する下記の工程を含む方法に向け
られている。
（ａ）血液試料の屈折率より大きい屈折率の光導波路系
の表面の少なくとも一部に、ヘモグロビン因子又は誘導
体に特異的な反応体からなりかつヘモグロビン因子又は
誘導体の層を形成可能な１又は２以上の複合体（comple
x）形成反応体で被覆すること、 （ｂ）導波路の入力端に光ビームを照射して出力端で励
起光を回収し、光ビームは光ビームに伴なうエバネッセ
ント光成分の案内の外側の作用に有効な領域が前記複合
体層のそれを越えるような角度の、多重内部反射機構で
該導波路に沿って伝搬されること、 （ｃ）血液試料と照射された導波路を互いに接触させ
て、一方では、導波路中を伝搬される光の部分を試料本
体のヘモグロビンとのエバネッセント波成分の相互作用
によって最初に吸収させ、出力端から励起光における瞬
時の鋭い低下（Ｉ）を示し、他方では、血液試料中のグ
リコシレート化ヘモグロビン又はその他の因子と複合体
層が連続的に累積している導波路上の対応する反応体の
間に免疫型反応が発生し、累積によってエバネッセント
波成分と形成された複合体層の相互作用にもとづき励起
光の信号の比較的ゆるやかな変化がもたらされること、 （ｄ）出力端から集めた伝搬光に起きる急激な光吸収低
下（Ｉ）を観察、測定及び／又は記録するが、この低下
は試料の総ヘモグロビンの濃度に量的に比例すること、 （ｅ）試料中のグリコシル化ヘモグロビン又はその他の
因子の量に大きさ（Ｍ）と速度（Ｋ）が量的に比例する
前記比較的ゆるやかな変化を観察し、測定し及び／又は
記録すること、 （ｆ）Ｉ及びＭ又はＫの値から得た結果を、総ヘモグロ
ビンの濃度及び／又は試料中のヘモグロビンに対するグ
リシジル化ヘモグロビン又はその他の因子の比として表
現するために必要な計算をすること。
本発明の方法において、導波路内を案内される光と分
析物との任意の型の相互作用を考えることができる。こ
うして、この相互作用は信号の一部の吸収から生ずるこ
とができ、次いで出力は出力エネルギーの減少であり、
導波路の出力に位置する収集および検出手段により集め
られる。あるいは、問題の種（分析物本体中に位置する
かあるいは導波路の表面上の問題の被膜中に位置するか
にかかわらず）が入射信号による励起下に蛍光を発生で
きる場合、相互作用は蛍光を生成することができる。こ
れは例えば蛍光型のアッセイの場合であり、ここで導波
装置の表面上に形成しつつある複合体中の相手の１つ
は、前記複合体の形成下に蛍光を誘発する蛍光体の群か
らなる。他の方法において、有用な応答は照明された導
波路の表面上に構成された大きい分子の凝集体による入
射光の散乱から生ずることもできる。
本発明の方法を実施するために、例えば、光学繊維の
形あるいは分析物中に溶解した１つの第１種に対して特
異性の試薬で被覆されたガラスまたはプラスチックのス
ライドの形の導波路を使用することができ、ここで分析
物は他のあるいはそれ以上の問題の種をさらに含有す
る。
後に詳述する実施例において、この第１種は他のヘモ
グロビンまたは血液の因子をも含有する血液の試料中の
特定のヘモグロビン化合物であることができる。こうし
て、この場合において、導波路は第１種に対して特異的
の抗体を取り付けて有し、そして、照明された導波路を
血液試料と接触させ、かつ導波路内の光を、溶液本体お
よび導波路の表面上に形成する複合体の単分子層（抗体
および第１種を含む）と、同時に、効果的にかつ信号発
生的に相互作用させるための測定条件（後に詳述する）
を準備すると、信号が導波路の出口に得られ、この信号
は励起信号と塊状で相互作用した合計のヘモグロビン
（または他の血液因子）と複合体の形成に参加した前記
第１種とを同時に表わす。
この場合において、導波路の出口における信号は２つ
の独立の効果を表わし、そして簡単な手段により解読す
ることができる。なぜなら、全体のヘモグロビンに対す
る応答は導波路の端から集められる信号出力の即時の部
分的励起に相当し（これは実際には前述のバックグラウ
ンドの雑音である）一方薄層に対する応答は抗体および
決定すべき第１の特異的種の前記複合体層の、遅い反応
である、形成による時間依存性の信号であるからであ
る。
そうでなければ、分析物中の２つの特定の因子（例え
ば、存在するなかでも因子１および因子２）を決定しな
くてはならない場合、２つの独立に働く光学的区域をも
つ導波路を選択することが好ましく、各区域は決定すべ
き前記因子の１つに対して特異的な１つの試薬（抗体）
を有する。このような場合において、導波路の出力に集
められた２つの応答信号（これは導波路が別の出力をす
でにもたない場合に当てはまる）は（ａ）相依存性また
は（ｂ）周波数依存性である。
場合（ａ）は２つの独立の光学的素子をもつ導波路に
より例示され、このような素子の例は分析用キュベット
の２つの対向する壁であり、前記壁は全反射信号のため
に光伝導性であり、そして各々は内部が２つの前述の反
応成分の１つで被覆されており、各々は分析物中の決定
すべき２つの因子（因子１および因子２）の１つに対し
て特異性である。この場合において、２つの素子は順番
に照明され（交互に加えられるパルス）、加えるモード
は対応する信号を適切に分離しかつ独立に表示するため
に、検出および処理の末端において、同期化の目的でも
使用される。
場合（ｂ）は、導波路の同一の光路（すなわち、光学
的に分離されていない）上の２つの物理学的に分離され
た区域を含むが、簡単なキュベットにおいて２つの異る
波長であるいは２つの異る波長における吸収で応答する
導波路の構造により例示することができる（これは、例
えば、吸収波長において、吸収に応答する１つの区域お
よび蛍光の応答、すなわち、吸収波長と異る励起波長の
信号、を提供する区域を設けることによって実施でき
る）。この場合において、２つの波長をもつ信号から成
る出力の成分を通常の手段（帯域通過フィルターまたは
二色のビームスプリッター）により個々の信号に分離す
る手段をもつ検出装置を準備する。このような場合は、
例えば、次のようにして生じさせることができる。すな
わち、導波路の第１区域に、分析すべき因子No.1に対し
て特異性の第１試薬を取り付け、この反応生成物の層は
光吸収性であり、そして導波路の第２区域に、因子No.2
に対して特異性の第２試薬を取り付け、前記第２試薬と
因子No.2の反応生成物は入射光による励起下に蛍光性で
ある。
もちろん、場合（ｂ）は場合（ａ）の構造の変形、す
なわち、別々に照明される導波路の一方が吸収に対して
応答性であり、他方が蛍光応答性である変形、により例
示することもできる。
本発明の実際的面を、実際の分析の場合を参照して説
明する。第１の場合は血液の分析に関し、さらに詳しく
は、血液試料中のヘモグロビンおよび他のヘモグロビン
因子、例えば、グリコシル化ヘモグロビン（これは、必
要に応じて、この試料中の合計のヘモグロビンに関係づ
けられる）の直接決定に関する。
グリコシル化ヘモグロビン（HbA1a,A1bおよびA1c）
は、糖尿病患者の診断および監視における重要な因子で
ある。合計のヘモグロビン（すなわち、HbA0、グリコシ
ル化されていないヘモグロビン＋（HbA1））に関するHb
A1cの含量（これは合計のグリコシル化ヘモグロビン（H
bA1）の約80％である）の決定はこの病気に関してとく
に重要である。
ヘモグロビンA1cはHbA0のそれと同一のアミノ酸構造
をもつグリコヘモグロビンである；重要な差はHbA1cの
ベータ鎖中のＮ−末端バリンに対して2,3−ジホスホグ
リセレートポケット（pocket）中に結合された１−アミ
ノ−１−デオキシ−フルクトースの存在である。HbA1c
へのHbA0の修飾は連続の非酵素的後翻訳プロセスであ
り、その速度は血液のグルコース濃度の関数である。グ
リコシル化は２工程プロセスとして起こる。第１に、グ
ルコースの開いたアルデヒドの形態はHbのベーター鎖の
末端アミノ基と反応してシッフ塩基を形成する。第２
に、シッフ塩基は次いでアマドリ（AMADORI）転位を行
ってHbA1cを形成する。中間体のシッフ塩基は不安定で
あり、HbA1cの安定なケトアミンよりも60倍大きい解離
する（遊離の糖およびタンパク質に）傾向をもつ。血液
のグルコースの小部分のみが開いたアルデヒドの形態で
あり（ほぼ0.001％）かつケトアミンの形成速度は遅い
（が効果的に不可逆的である）ので、HbA1cの形成は長
期間の血液グルコースの濃度の指示である。人間の赤血
球の120日の寿命にわたり、グリコシル化Hb分子の数は
平均の血液グルコース濃度に対して比例して増加する。
平均の血漿グルコースとHbA1c濃度との間の関係は独特
であり、単一のHbA1cの測定は先行する６〜８週にわた
り血液グルコースの遡及的評価である。
HbA1cの測定は炭水化物の代謝の病気、ことに真性糖尿
病の監視における非常に有用な道具であることが一般に
認められている。糖尿病は高い長期間の糖レベルを有
し、これはそれらのHbA1cレベルに反映する。正常の大
人はHbA1cとして合計のヘモグロビンの約３〜６％を有
し、これに対し未熟および成熟の初期の糖尿病はHbA1c
として６〜15％である。HbA1c濃度の同様な増加は、遺
伝的におよび化学的に誘導した糖尿病をもつマウスおよ
び膵切除したイヌにおいて認められた。
血液中のグリコシル化Hb,HbA1を決定するために存在
するいくつかの方法のうちで、とくにHbA1cの測定は糖
尿病の処置を監視するために選択される方法と現在なっ
てきた〔L.ジョバノビック（JOVANOVIC）ら、アメリカ
ン・ジャーナル・オブ・メディシン（American J.of Me
dicine）（1981）70,331;D.E.ゴールドステイン（GOLD
STEIN）ら、糖尿病（Diabetes）（1982）31,70;K.H.ガ
ッボイ（GABBOY）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・
エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム（J.of Cli
nical Endocrinology and Metabolism（1977）44,859;
B.ゴーネン（GONEN）ら、ダイアベトロジア（Diabetolo
gia）（1978）15,1;C.M.ペターソン（PETERSON），糖尿
病（Diabetes）（1982）31,1〕。また、次の特許も有用
に述べている：米国特許4,247,553号；英国特許1,580,3
18号；米国特許4,222,836;米国特許4,372,747号；米国
特許4,200,435号；米国特許4,341,635号。これらの方法
はグリコシル化されていないHbからグリコシル化Hbを分
離するために用いられる機構により容易に分類できる。
例えば、イオン交換クロマトグラフィーが初期に用いら
れ、そしてなお最も普通の方法である〔H.G.クンケル
（KUNKEL）ら、サイエンス（Science）（1955）122,28
8〕。このようなイオン交換技術はHbA1cを特定的に測定
する現在唯一の利用可能な方法であるが、ある数の制限
をもち、それらのうちで温度およびpHの感受性は最も重
要である。また、イオン交換は障害にさらされる。なぜ
なら、不安定なグリコシル化Hb（プレーHbA1c）をアッ
セイ前に除去しなくてはならず、そして胎児Hb（HbF）
および鎌状赤血球Hb（HbS）は結果を妨害するからであ
る。
他の技術は寒天ゲル電気泳動〔L.メナード（MENARD）
ら、クリニカル・ケミストリ−（Clinical Chemistry）
（1980）26,1598）、等電収束（isoelectric focusin
g）〔K.M.スパイサ−（SPICER）ら、糖尿病（Diabete
s）（1978）27,384〕、比色法、例えば、チオバルビツ
ル酸を用いる〔R.フルキガ−（FLUKIGER）ら、FEBSレタ
−ズ（Letters）（1976）71,356〕および親和性クロマ
トグラフィ−〔V.ブ−リオチス（BOURIOTIS）ら、ダイ
ベトロジア（Diabetologia）（1981）21,579〕を包含す
る。唯一の型の放射線免疫検定法が報告されており〔J.
ジャビド（JAVID）ら、ブリティシ・ジャ−ナル・オブ
・ヘマトロジ−（British J.of Haematology）（1978）
38,329〕これは遅く（作業に３日以上を要する）そして
技術的に複雑であり、放射線標識HbA1cの調製を必要と
する。先行技術の方法は価値を要するが、急速な結果
（約15分以内）をもたらし、熟練を必要とせずかつ日常
の基準で実施に経費がかからない方法がなお要求されて
いる。現在の技術の方法は遅く（典型的には結果を得る
ために１時間以上）、技術的に複雑であり（５回以上の
ピペット操作の工程を必要とする）そして実験室の環境
外に実施に適さない。さらに、現在の方法は合計のヘモ
グロビンをグリコシル化因子と別に確認することを必要
とし、そして両方の分析データを実質的に一緒に確認し
かつ遅滞なく相互に関係づけることが可能であることが
望ましいであろう。本発明の方法は、先行技術の方法の
欠点を排除し、そして、必要に応じて、合計のヘモグロ
ビンに対してグリコシル化因子または他のヘモグロビン
因子の百分率を直接関づけるという利点をさらに提供す
る。
本発明の方法によると、(Hb)A1c,A1aまたはA1bのよう
な種のいずれかに対して特異性の抗体が純粋な形態で入
手できるとき、このような種を別々に決定することがで
きる。あるいは、特異性が低い抗体を用いるとき、本発
明の方法は２種以上の血液因子、すなわち、例えば合計
のHbに関してすべてのグリコシル化Hb、を同時に決定す
ることができる。もちろん、この方法は、また、複合体
形成反応における因子に対して特異性の対応する試薬
（例えば、HbF,HbSまたは他のヒトヘモグロビン変異
種）が入手できる場合、上に述べた以外の血液因子の決
定を提供する。
本発明は、先行技術に属するこのような特異的に反応
性の複合体種（モノクローナルまたはポリクローナル抗
体）を得ることあるいは調製することに関しないが、本
発明に従い分析すべき試料と接触させる活性導波路の調
製において、被覆物質としてそれらを使用することに関
する。
本発明の方法において使用する導波路は多くの種類の
ものであることができ、そしていくつかは選択した反応
性抗体で導波路を被覆する方法と一緒に係属中の欧州特
許出願（EP−Ａ）75353号に開示されている。
本発明の場合において、分析用キュベットの構成員と
して含まれた板様または繊維の光導波路を使用すること
が望ましく、導波路の被覆された表面を、血液試料がい
ったんキュベット中に注入されたならば、それと接触さ
せる。
ここで使用する光学技術は、前述のように、主として
光の吸収に関する。すなわち、導波路内を伝送される波
のエバネッセント成分は、第１に周囲の液体中の分子と
相互作用し（エバネッセント成分の浸透深さは抗体被膜
の厚さを多少越え、これは瞬間的応答を提供する）そし
て、第２に、Hb−抗体の複合体と相互作用し、この複合
体は、決定すべき血液因子と導波路の表面上に前もって
被覆された特異的複合体部分との反応のため、導波路上
に追加の層の形態で蓄積し始める。エバネッセント光成
分の相互作用の深さは複合体の層の厚さに実質的に限定
されないが、前記蓄積に対する光学的応答は血液自体の
ため全体の吸収に対して独立であり、そして２つの効果
は一方または他方の効果から生ずる信号を解読するため
に複雑な技術を用いないで容易に区別できることが、驚
くべきことには発見された。
Hb誘導体はその化学的状態に依存して特性吸収スペク
トルを有する。それゆえ、任意の吸収測定技術を本発明
の実施において等しく使用できる〔L.テントリ（TENTOR
I）ら、ヘモグロビン、エンジモロジーにおける方法に
おいて（Hemoglobin,in Methods in Enzymology）（198
1）,vol.76,707−732、アカデミック・ピレス（Academi
c Press）、ニューヨーク〕。シアノメトヘモグロビン
法および、好ましくは400〜600nm、とくに400〜420nmお
よび550〜600nmの範囲における、単一または多波長吸収
測定アッセイが包含される。また、Hb分子による吸収が
酸素の飽和度に対して独立であるアイソベスティック点
法（isobestic point methcd）が包含される。
本発明によれば、上記の如き方法を実施する装置とし
て、 導波路中の励起放射線の多重内部反射を用いて単一液
体試料中の１より多い成分を測定する方法であって、 液体試料中に含まれる第１成分に特異的な反応体で導
波路の第１表面を被覆すること、該導波路は該第１表面
と異なる位置に第２表面を有し、 該導波路の該被覆第１表面及び該第２表面を該試料に
暴露し、該反応体と該第１成分の反応で形成された複合
体（complex）の層を該第１表面上に形成させること、 該導波路の入力端に光励起信号を照射して、該信号の
エバネッセント成分が該第１表面の該複合体及び該第２
表面の該試料の溶液本体と相互作用するようにするこ
と、 該相互作用後の信号を集めること、および その後、該第２表面を介して得られる該信号の初めの
急激な減少または増加の変化から該溶液本体中の成分の
存在または量を検出し、該第１表面を介して得られる該
信号の漸進的な減少または増加の変化から該第１成分の
存在または量を検知すること を含むことを特徴とする液体試料中の１より多い成分を
測定する方法をも提供する。
そして、より特定的には、本発明の装置は、導波路手
段はその一部をヘモグロビン因子に特異的な反応体で被
覆されているので、導波路手段を血液試料に暴露したと
き反応体とヘモグロビン因子による複合体の層を形成
し、導波路手段の第２部分は未処理であるか又はヘモグ
ロビン因子ブロッキング剤で処理であり、よって光信号
が反応体被覆部分と相互作用すると、ヘモグロビン因子
の測定のための情報が集められ、かつ光信号が未被覆又
はブロッキング部分と相互作用するところでは、ヘモグ
ロビンの測定のための情報が集められる、血液試料中の
ヘモグロビンと少なくとも１つのヘモグロビン因子を平
行して測定する装置に向けられている。
〔発明の具体的態様の説明〕
本発明およびその例示的な面を、添付図面を参照しな
がら説明する。
前述のように、光線１が角度θで２つの透明な媒質n1
およびn2の間の界面に衝突するとき（第1a図）（大きい
屈折率をもつ媒質n1（n1＞n2）から衝突）、全内面反射
が起こり〔N.J.ハリック（HARRICK）、インターナル・
リフレキション・スペクトロスコピー（Internal Refle
xion Spectroscopy）、ウィリー・インターサイエンス
（Wiley Interscience）、ニューヨーク（1967）、この
時の反射角θは次の方程式により与えられる臨界角と呼
ばれるある角度θcより大きい： θc＝sin-1（n2／n1） １ 反射光線は数字２で示されている。この場合におい
て、エバネッセント波は反射表面を越えて屈折率n2の希
薄な媒質の中に波長のほぼ一部分の距離（dp）だけ浸透
する。マクスウエルの方程式に従い、反射表面に対して
垂直の定常正弦波が密の媒質中に確立される（第1b
図）。非吸収性の希薄媒質中へのエネルギーの流れは存
在しないが、その媒質中には消散性（エバネッセント）
の非伝搬性場３が存在し、その電場の振幅（Ｅ）は表面
の界面において最大であり（E0）そして次の方程式に従
い表面からの距離（ｚ）で指数関数的に減衰する： Ｅ＝E0・exp（−z/dp） ２ 電場の振幅が表面におけるその値のexp（−１）に低
下するために要する距離として定義された、浸透の深さ
（dp）は、次により与えられる： 90°から出発して、θがθcに近づくにつれて、dpは
無限に大きくなり、そして固定した角度において、屈折
率が合致すると増加する（すなわち、n2／n1→１）。ま
た、dpは波長に比例するので、波長が長くなると大きく
なる。
こうして、透明な導波路の屈折率n1、入射角および波
長を適当に選択することにより、dpを選択して、界面に
近接してあるいはそれから所定の距離において主として
物質４と、前記距離を越えてわずかに物質５と、あるい
は応答比を変化されて、４および５の両者と、の光学的
相互作用を制御することができる。そして、これは本発
明の重要な因子の１つであり、すなわち、前記パラメー
ター（n1、θおよびλ）の適当に選択して、分析物中の
２つの独立のパラメーターを、同時に、測定するために
最適な条件を得ることを確率することである。
本発明の実施態様において、密の媒質を石英の顕微鏡
スライド（n1＝1.54）で構成することができ、そして希
薄な媒質は水性血液試料（n2≒1.34）であり、そしてθ
を制御可能に変更させ、これによりλが選択された可視
波長であるとき、最適な応答が得られるまで、dpを約20
〜300nmの間で変化させることができる。もちろん、導
波路のために他の材料を1.54以外の屈折率で使用でき
る。
単一の反射システムを使用できるが、エバネッセント
波の原理を多重内部反射と組み合わせることにより感度
を増大（検出の限界を減少）することができる。反射の
数（Ｎ）は導波路の長さ（Ｌ）および厚さ（Ｔ）および
入射角（θ）の関数である： Ｎ＝L/T・cosθ ４ 実験のいくつかにおいて使用した顕微鏡スライドの導
波路は36mmの活性長さ、1mmの厚さを有し、そして入射
角は約60°〜75°で変化した。こうして、明確な光線の
ための１つの側における反射の数はほぼ６であった。同
様に、繊維の光導波路を用いる他の実施態様において、
この装置は64mmの活性長さ、0.6mmの厚さを有しそし
て、同一の入射角度で、明確な光線の反射の合計の数は
約30〜40の間で変化した。
前述のように、本発明の方法はまた消散（エバネッセ
ント）効果に頼る。導波路と液体との界面において発生
する蛍光の放射を、また、導波路の出力において監視す
ることができる。相互関係の理論により予測されかつ単
分子層〔カルナグリア（CARNAGLIA）およびマンデル（M
ANDEL）、ジャーナル・オブ・オプチカル・ソサイアテ
ィー・オブ・アメリカ（J.Optical Soc.of America）6
3,479（1972）〕および単分散球〔リー（LEE）ら、アプ
ライド・オプチクス（Applied Optics）18,862（197
2）〕の両者において染料分子を用いて立証されたよう
に、導波路／液体の界面における蛍光放射をエバネッセ
ント波として処理できる。事実、エバネッセント波によ
る蛍光の励起は、エバネッセント波の特性をもつ蛍光放
射を生成し、こうして蛍光の内部で反射する光線を発生
する。この形の蛍光放射の方向は、主としてそれぞれの
屈折率の比の関数であり、そして光子の放射が多分臨界
角（θc）に近い「好ましい」角度の分布を有するとい
う主要な特性（上のCARNAGLIAの文献を参照）を有す
る。
実際には、このことは蛍光を励起光と同一の光学的平
面において導波路の出力において監視可能であることを
意味する。理論的には、これは小さい角度の範囲内に蛍
光放射の強さを集中させるという利点を有する；また、
これらの蛍光の光子は溶液の本体を通過せず、こうして
主要な光学的妨害（例えば、吸収、散乱）にさらされな
い。
この技術は欧州特許出願（EP−Ａ）75353中で詳述さ
れている。
本発明を例示する蛍光の測定のため、励起波長を490n
mで選択し、そして光検出素子の前にカット・オフ・フ
ィルターを配置することにより、蛍光放射（510nmより
大きい波長）を導波路の出力において測定した〔kV8.5;
320nmにおいて50％の透過率；ショット・グラス・ワー
クス（SCHTT GLASS WORKS），マインツ，ドイツ〕。
２またはそれより多いパラメーターを同時に決定でき
る蛍光技術、例えば、多分析物導波システムは、臨床的
診断の分野において、例えば、甲状腺ホルモンT4および
T3、ゴナドトロピンLHおよびFSH、腫瘍遺伝標識AFPおよ
びCEAの同時測定、また臨床微生物学において用いられ
る細胞表面の抗原の決定の全範囲において、多くの用途
をもつ。
用いた装置の１つの実施態様は第２図に概略的に表わ
されており、ここにおいてブロック線図として主要な構
成成分が示されている。これらの成分は、モノクロメー
ター９、光源６、導波路８をもつ流れセル７、および光
電子増倍管検出器10、プリアンプ11、マイクロプロセッ
サーの光源制御システム12、マイクロコンピューター1
3、プリンター14およびメモリー（フロッピーディス
ク）15を含むデータ獲得および処理用マイクロコンピュ
ーターを有する電子工学装置からなる。
この場合における光源６はキセノン閃光ランプ（E.G.
＆G.Salem,MA）であり、そしてモノクロメーターは凹形
ポログラム格子（Jobin−Yuon,Paris,France）を備えて
5nmの分解能を可能とした。閃光ランプの作動をマイク
ロコンピューター12により制御した。試料を入口18から
セル７に注入するため、プログラミング可能な自動ピペ
ット〔Microlad−P;ハミルトン・ポナヅズ（Hamilton B
onaduz）AG,ボナヅズ，スイス〕を好適に使用した。光
学的成分は、さらに、２枚の鏡M1およびM2と２つのプリ
ズム16および17を含んだ。検出器10の光電子増倍管（R9
28;東京、浜松）を導波路の出力に配置して、光の強さ
の変化を直接監視した。光電子増倍管からの信号を増幅
し（11）、閃光時間の間積分し（12）そして標準の12−
ビットのアナログ／ディジタル変換器（図示せず）によ
りディジタルのフォーマットに変換した。会社内で開発
したマイクロコンピューター12は急速な信号の平均化を
実施し、そしてすべてのデータをマイクロコンピュータ
ー内に配置された光ダイオード19と参照することにより
閃光ランプの強さの変動について調節した。信号をマイ
クロコンピューター13、好ましくはAPPLE II型に、表示
および記憶のため、伝送した。導波路の２つの異る実施
態様を使用した： １つの実施態様として第２図に示す分析用セルまたは
キュベットを、顕微鏡のスライドの導波システムに基づ
く。図解されたシステムは流れセル７を示し、その底は
実際に顕微鏡のスライド８である。緊密性をガスケット
20により確保する；スライド８を２つの四分円形シリカ
のプリズム16および17、好ましくはヘラエウス（Heraeu
s）製のものを屈折率が合致する油とともに使用して、
直接の光学的接触で配置した。屈折率が合致する油は特
別にみがかれた、光学的に平らな導波路の面の必要性を
排除した。プリズムは入射光の角度θ（第1a図参照）の
調節を容易としかつシール用ガスケット20との光の接触
を回避するように設計した。
流れセルは、アルミニウム合金から機械加工により作
り、光路に沿った急速な泡不含層状流れを可能とする基
準を満足した。その設計は、また、急速かつ精確な分離
および再配置を保証した。アルミニウム合金を選択した
が、他の合金、例えば、真ちゅうも適する。なぜなら、
それは食塩溶液との反応性をもたず、そしてつや消しの
黒色に陽極酸化して迷う光の作用を回避した後、低い光
学的反射性をもつからである。ガスケット20は厚さ0.5m
mの医学的等級のシリコーンゴムであり、そして2kg/cm2
の一定の密封圧力下で水密性である。入口18および出口
21を含めて、合計のセル容量は1.8mlであり、導波路の
真上の容量は0.66ml（53×25×0.5mm）であり、そして
光路より上の容量は0.29ml（36×16×0.5mm）であっ
た。
第２実施態様（第３図参照）は光学繊維のシステムに
基づく。繊維の導波路31は、まず標準の伝送光学繊維を
120mmの片に切り、次いでシリコーンとテトラフルオロ
エチレンとのクラッドを除去して120mm2の光学的に活性
な区域を露出することによって作った。繊維の未満をみ
がき、そして支持および保護のために特別に作られたス
テンレス鋼の末端取付け32および33（７×3mm内径）内
に保持した。繊維の流れセル34は開口端の石英管（内径
4mm、長さ80mm）であり、試料のそう入および取り出し
のための入口35および出口36の管が付加されていた。繊
維をシリコーンゴムの栓37,38をもつ流れセル内の所定
位置に配置した。光源39からの光をレンズ40,41で繊維
の端上に68°の平均口径角で集束しかつ過した（第１
図参照）；繊維の出口において、光はレンズ42により光
電子増倍管43上に再集束した。
必須の光学的構成成分が第4a図に概略的に示されてい
る装置は、二重の導波セル50からなり、その主要な壁51
および52は源53から発生する励起信号を輸送する２つの
独立に付勢される素子を構成し、そして内側の壁は裸で
あるか、遮断されているか、あるいは特異性反応成分で
被覆されており、セル50内に含有されている分析物の溶
液と接触している。キュベットの特別に造形された光伝
導性壁は、通常の手段により、例えば、透明なプラスチ
ック、例えばルーサイトで成形することにより形成する
ことができる。これらの壁は屈折率が同一であるかある
いは異る材料から作ることができる。
源53から発生する光線54は、交互に、回転チョッパー
鏡57a,bにより光線55および56に分割される。第4a図に
おいて、この鏡57は２つの位置で表わされており、１つ
の凍結された位置は数字57aに相当し、そして他の位置
（第１位置に対してほぼ直角である）は数字57bに相当
する。容易に理解されるように、鏡57の位置に依存し
て、光線54は光線55に反射されるか、あるいは光線56に
伝搬される。こうして、源53からの光はそれぞれ鏡58a,
b,cおよび59a,bおよびｃの一系列の１つにより、二重導
波セル50の位置51および52に交互に注入される。次い
で、導波装置の部分からのそれぞれ出力光60および61は
検出器62上に集められる。
この実施態様の残りの構成成分は、技術的に知られて
おりかつ第２図の実施態様に関連して開示した対応する
構成成分と同一であるので、図示されていない。
他の実施態様（第4b図参照）において、この装置は前
の実施態様のセルと同一の二重導波セル70からなり、す
なわち、壁71および72を有し、これらの壁は理解される
ように同様に導波路の２つの独立の素子として作用しか
つ操作される。
この装置は光源73を含み、その出力はそれぞれ導波素
子71および72の入口側にレンズおよび鏡（鏡は数字74お
よび75で示されている）により各側に集束される。窓の
穴77をもつチョッパーディスク76は、交互に励起光を素
子71および72に分配する作用をする。次いで、導波路か
らの出力信号は鏡79および80により検出器78へ向けられ
る。
第4a図および第4b図に描かれている両者の実施態様に
おいて、導波素子の一方（51,71）は分析物中の測定す
べき１つの成分に対して特異性の抗体で複合化反応（前
述した）により被覆されているが、第２素子（52,72）
は被覆されないままである。ここで、被覆されないは抗
体をもたない表面を意味する。しかしながら、この表面
上のタンパク質吸着部位は通常この表面にタンパク質
（例えば、BSA）を吸着させることにより遮断されてい
る。したがって分析の間、被覆されない区域の出力に集
められる信号は励起光線と分析物の本体との相互作用を
反映する。すなわち、それは試料中の合計のヘモグロビ
ンについての所望の情報を提供する。しかしながら、同
時に、導波路の被覆された側から出る信号は、セルのこ
の側の内表面上に被覆された特異的反応成分により結合
されつつある成分についての要求する情報を提供する。
これはこの出願の実施例４を参照して詳述されている。
ここでは次のように述べることで十分であろう。すなわ
ち、この種類の導波システム（二重型）は、導波路の別
々の区域から２つの型の情報を集め（すなわち、前の実
施態様におけるような重ねられた現象はもはや存在しな
い）これにより決定においていっそうすぐれた精度を得
ることができる。
変形の実施態様は第4c図に表わされている。この変形
において、前述のセル50および70と同一の全体的構成の
二重の導波セル90を使用し、ここで差異は末端91aおよ
び92aが実際に、例えば鏡を用いる金属化（銀）によ
り、反射性とされていることである。したがって、導波
光伝導性素子のそれぞれ他端91bおよび92bは同時に入力
端および出力端として使用する。これは２つの光源93お
よび94により提供される励起光線の通路で例示され、こ
れらはそれぞれ交差ビームスプリッター95および96の後
に端91bおよび92bへ向けられる。こうして、端91bおよ
び92bに入る光は導波素子を通してまず前方に、次いで
端91aおよび92aで反射された後後方に移動する。この構
成により、励起光の分析物との相互作用の能力は前に開
示した実施態様に比較して実際に２倍となる。この変形
は、さらに、検出器97を含む、この検出器97は91bおよ
び92bから出て、そしてビームスプリッター95および96
および三角形の鏡98によりそれらに向けられる後方への
信号を集める。源93および94は交互に同期化されるの
で、導波装置の端91bおよび92bから出る信号パルスは検
出器97に同時に到達しない。
第５図は、前に開示したような二重導波型のセル内の
分析の間に起こる現象を、分子レベルで図解する略図で
ある。第５図において、51および52で示す区域は、例え
ば、第4a図に描かれた導波素子51および52に相当する。
区域51および52の間の中間区域は、分析媒質を概略的に
表わし、種がその中に溶解しており、そして反応成分ま
たは種は素子51および52の内壁上に取り付けられてい
る。素子51は101で示すHbA1c実在物に対して特異性の抗
体100をその上に付着してすることが描かれている。こ
れらのHbA1c分子のあるものは特異的抗体100と複合化し
た後の状態で示されており、他のものはまだ遊離の状態
である。他方の表面（すなわち、素子52の表面）は遮断
剤102（例えば、ウシ血清アルブミン）で被覆されてお
り、この遮断剤は溶液中の他の種、例えば、HbA0103お
よび任意の型の他のタンパク質104に対する裸の壁の存
在しうる親和性を最小とすることを意図している。
こうして、分析の間、表面52に対するHbの特異的結合
は防止され（あるいは少なくとも強く最小とされ）、こ
うして52中を移動する信号のエバネッセント波成分と分
析物との相互作用により、表面上に付着した遮断性被膜
の深さを越えた深さにおいて、全体のヘモグロビンを測
定することが可能となる。
これと対照的に、表面51上でその上に被覆された抗体
分子100と分析物溶液中のHbA1c（AG）との間の複合化反
応が起こる。この反応は急速ではない。したがって、導
波路のその素子中を移動する光成分との連続的な対応す
る相互作用とともに、複合体の層が漸進的に表面51上に
蓄積する。これにより、第６図に描かれたＡまたはＢ型
の応答曲線が得られる（下の実施例を参照）。
試験を実際に実施するために、顕微鏡のスライドを濃
硫酸および蒸留水、エタノールおよびアセトン中に、標
準のスライド着色ガラス器具を用いて、連続的に浸漬す
ることにより清浄にした。繊維をエタノール中で超音波
処理に清浄にし、そしてガラス棒上に支持し、種々の抗
体溶液中に浸漬した。抗体は導波装置の表面に物理的に
吸着されるか、あるいは共有結合した。吸着は清浄され
た導波路を抗体の溶液（5mgのタンパク質/mlの0.05モル
/lのトリス（Tris）Hcc緩衝液、pH7.0）と一緒に１時間
インキュベーションすることによって実施した。吸着し
ないタンパク質を食塩溶液（Saline）で洗浄除去し、そ
して残りのタンパク質結合性部位を抗体被覆した導波路
をウシ血清アルブミン（トリス緩衝液中1.0重量％）と
ともにインキュベーションすることによって遮断した。
この結合法は酸性水性シラン化環境においてアミノプロ
ピルトリエトキシシラAPTS〔固定化生化学物質および親
和性クロマトグラフィー（Immobilized Biochemicals a
nd Affinity Chromatography）,R.B.ダンロップ（Dunlo
p）、プレナム・プレス（Plenum Press），ニューヨー
ク,191−212ページ〕を含むウィートール（Weetall）の
方法と本質的に同一であった。〔固定化酵素、抗原、抗
体およびペプチド：調製およびクロマトグラフィー（Im
mobilized Enzymes,Antigens,Antibody and Peptide:Pr
eparotion and Chromatography），エンジモロジー（En
zymology）,H.A.ウートール（Weetall），マーセル・デ
ッカー・インコーポレーテッド（Marcel Dekker Inc.）
ニューヨーク1975,1−48ページ〕。
一般に、導波路をAPTS（0.4モル/l）と80℃において
３時間反応させた。次いでスライドまたはキュベットの
壁を120℃におよび繊維を100℃に２時間加熱し、次いで
リン酸塩緩衝液（0.1モル/l、pH6.8）中のグルタルアル
デヒド溶液（0.5モル/l）中でそれらを周囲温度におい
て90分間ソーキングした。この「活性化された」導波路
を、次いで抗血清Ab（5mgのタンパク質/mlのリン酸塩緩
衝液）と４℃において24時間反応させた。抗体が結合し
た導波路をリン酸塩緩衝液中で洗浄した後、等張食塩溶
液（0.14モル/l、ナトリウムアジドを含有する、８ミリ
モル/l）中で４℃において保存した。結合の前および後
にタンパク質の測定〔アナリティカル・バイオケミスト
リー（Anal.Biochem.）51,654−655（1973）〕は、タン
パク質の吸収が石英１cm2につきほぼ１μｇであること
を示した。
〔実施例〕
次の実施例により、本発明をさらに詳しく説明する。
実施例１ 次の２つの光学的現象を明らかにするため： ｉ）エバネッセント波成分と全体のヘモグロビンとの相
互作用 ii）エバネッセント波成分と形成しつつあるAg/Ab複合
体との相互作用） 使用した装置は第２図の実施態様のそれであった。
既知のヘモグロビン溶液を用いる標準の調製。
精製されたヘモグロビンＡ（HbA）をセルパ・フェイ
ンバイオケミカ（SERVA FEINBIOCHEMICA,ハイデルベル
グ,FRG）から入手した。ウシ血清アルブミン（BSA）を
シグマ・ケミカル・カンパニー（SIGMA CHEMICAL CO.,S
t.Louis,MO,USA）から入手した。緩衝液および溶媒のす
べての化学物質は、メルク（MERCK,Darmstadt,FRGまた
はBDH,Poole,Dorset,UK）から入手した分析級または試
薬級のものであった。ヒトHbAに対するウサギ抗血清はD
AKO（DAKO,Copenhagen,Denmark）から購入した。
導波路はヘラエウス・クアルズシュメルズ（HERAEUS
QUARZSCHMEIZE GmbH,Hanan,FRG）から入手した溶融シリ
カの顕微鏡スライド（Suprasil 75.0mm×25mm×1mm）で
あった。
スライドを連続的に濃硫酸、蒸留水、エタノールおよ
びアセトン中に浸漬（各10分）することによって清浄し
た。清浄なスライドをリン酸塩緩衝化食塩溶液（PBS;0.
1モル/lリン酸塩、pH7.4、09％（w/v）NaCl）中の５倍
希釈の抗HbAの溶液中で１時間インキュベーションする
ことによって、抗体を表面に被覆した。蒸留水中ですす
いだ後、残りのタンパク質結合成部位をPBS中の１％（w
/v）のBSAとともに１時間インキュベーションすること
によって遮断した。次いで、スライドを蒸留水中ですす
ぎ、使用するまで、４℃において等張食塩溶液中で保存
した。
スライドを第２図に示す、第１実施態様に、光がスラ
イド中に異る角度θで結合するような方法で、しっかり
固定した。流れセル７を表面に0.5mmのシラスティック
ガスケット20を介して固定し、そしてセルを通してアッ
セイ緩衝液（PBS＋5.0％（w/v）のBSA）を送入すること
によって気泡を系からパージした。標準のHb溶液（1.0,
0.5,0.1,0.05mg/ml）をアッセイ緩衝液中で構成して、5
mgの合計タンパク質/mlの最終タンパク質濃度にした。
アッセイ手順は3.5mlの標準Hb溶液をセルの中に、基
線信号の確立後、注入することによって開始した。入力
光線の波長は410nmにおいてモノクロメーターを調節す
ることによって選択し、そして反応を410nmにおける強
度の減少により監視した。角度θをまず66°（臨界角）
より上でランダムに選択した。約67°の値を下に報告す
る試験において使用した。
連続的に抗体被覆したスライドを使用し、1.0（曲線
Ａ）および0.1mg/m（曲線Ｂ）のHb標準を用いて得られ
た抗体結合曲線を第６図に示す。基線の確立後、標準を
t0において注入し、そして伝送の直ちに低下（IA,IB）
（任意の単位）をゆっくりであるが、なお速い結合事象
により追跡し、この事象は次の10分にわたって続いた。
初期の低下はエバネッセント波のDP範囲内で光学的に吸
収性の遊離ヘモグロビンのためであった（第１図参
照）。この早い段階において、複合体は形成し始ること
に注意されたい；したがって、エバネッセント波成分は
初期のAb被膜をきわめて有意に越えて延長し、そして本
体の溶液と自由に相互作用する。時間t1における速度Ｋ
および大きさ、それぞれ、MAおよびMBの信号の引き続く
遅い変化は、表面におけるHbの抗体結合のためであっ
た。これはAb被膜を用いない図示しない対照実験におい
て示された。
次いで、セルをアッセイ緩衝液で洗浄し（t1）、これ
により結合しない物質を除去した。信号の残りの絶対的
変化（WA,WB）を、下表に示すように投与量に関係づけ
る。
標準曲線ＡおよびＢは、血液の未知の試料中のヘモグ
ロビンの決定（determination）のための型（templat
e）として有用であった。同様に再現可能な情報を、未
知の試料が一定時間t1後に測定されるかぎり、測定値MA
およびMBから収集することができた。
実施例２ 抗体被覆スライドを所定位置にし、Hb標準溶液を流れ
セル中に注入した。10分間反応させた後、結合しない物
質をアッセイ緩衝液で洗浄除去した。結合した物質を41
0nmにおける透過の減少により監視した。光の入射角の
効果を角度（θ）を64°から78°の間で変化させて研究
した。臨界角（θc）は66°である。結果を入射角に対
して透過の減少％（＝感度）としてプロットした（第７
図）。これから理解できるように、Hbの抗体結合のこの
系の測定は66°〜70°の間の角度で可能であり、68°付
近において最適である。角度が大きくなるほどこの場合
浸透深さは小さくなり過ぎるが、このような角度は異る
種類の分析系に適合することがあるであろう；角度が小
さくなると、反射が起こらなくなる。66°〜68°の角度
は適切さに劣る。なぜなら、光線がある角度で広がり、
光が部分的に反射しかつ部分的に屈折し、後者の部分は
系から失われるからである。
実施例３ より繊細な標準曲線の作成Hb標準溶液を別の抗体被覆
したスライドとともにインキュベーションし、そして最
適角度としてθ＝約68°を用いて反応を監視した。透過
率％として表わした結果は、抗与量−応答の関係を示
す： 標準 透過率％ （mg/ml） 1.0 87.2 0.5 94.0 0.1 94.4 0.05 95.3 0 100 この系の最小検出は約0.1mg/mlすなわち0.1g/lであ
る。正常の大人のHbA値は135〜175g/lであり、正常のHb
A1cレベルは４〜9g/lであり、こうしてこの方法は適切
な感度で×10〜×100の希釈で用いることができる。
実施例４ 異質ヘモグロビンの存在下のヘモグロビンの測定 溶液の試料を、鳥類のヘモグロビン（ハト）に基づき
かつ測定すべきヒトヘモグロビンを変化する比率で含有
するようにして調製した。両者のヘモグロビンの合計は
通に5mg/mlであり、そしてヒトヘモグロビンの比率を下
表に記載する。第4a図および第4b図に示す型の二重導波
路を使用し、表面の一方（例えば、51）をヒトHbに対す
る抗体で被覆した。他方の表面（52）をウシ血清アルブ
ミンで通常のように遮断した。
測定を実施するとき、75.3％の透過率に相当する鋭い
低下（Ｉ）すべての場合に測定された；次いで透過率の
それ以上の低下（Ｍ）（実施例１および第６図を参照）
が10分の間隔後に記録された。鳥類のヘモグロビンのみ
を含有する試料の場合において、10分の間隔の間それ以
上の変化は観測されなかった。結果を下に要約する。
こうして、最初の初期の低下Ｉについて記録された値
は存在する合計のヘモグロビンに関係づけることがで
き、一方10分の反応期間後に観測されかつヒトヘモグロ
ビン因子の表面51上に被覆された抗体への結合に相当す
る値（Ｍ）は試料のヒトヘモグロビン含量および合計の
ヘモグロビンに対するその比に関係づけることができ
る。この実施例において使用した装置に結合した自動記
録装置に上のデータを記録することにより、標準曲線を
つくった。その後、このような曲線は鳥類ヘモグロビン
中のヒトヘモグロビンの未知の混合物の決定のための比
較データとして使用した。
実施例５ ヘモグロビンの存在下のグリコシル化ヘモグロビン
（HbA1c）の測定 プールしヘパリン化した全血から、Bio−REX70樹脂
〔バイオ−ラド（BIO−RAD），リッチモンド，カルフォ
ルニア洲米国〕を使用するカチオン交換クロマトグラフ
ィー〔L.A.トライベリ（TRIVELLI）ら、ニュー・イング
ランド・ジャーナル・オブ・メディシン（New England
J.of Medicine）284（1971）,353〕により、標準のグリ
コシル化Hb（HbA1c）を調製した。次いで、精製したHbA
1cを使用して、それを変化する既知量でグリコシル化ヘ
モグロビン不含血液と再び組み合わせることによって、
標準試料を調製した。試料中の合計のヘモグロビンに関
するHbA1cの濃度は１〜20重量％の間で変化させ、そし
て合計のHb濃度は150g/l程度であった。
第4b図に図解するような二重導波路を含むキュベット
を有する分析装置を決定に使用した；キュベットの一方
の側の内表面をHbA1cに対して特異性の抗体で被覆し、
一方反対側の表面はそのままにしておいた。各セルの含
量（各標準の連続的試験に新しいものを使用した）は約
1mlであり、そして約0.9mlのPBSと一緒に0.1mlの測定す
べき標準をピペットで入れた。第８図は15分のインキュ
ベーション時間（20％のHbA1c試料を用いる）後に得ら
れた滴点曲線の１つを示し、上の曲線（ほとんど平坦）
は導波路の被覆されない部分で記録されたものであり、
そして下の曲線は導波路の抗体で被覆された部分の応答
を示す。
種々の標準の分析結果を下表にまた記載する。
ゼロのHbA1cの試料についての0.3％の差は、グリコシ
ル化血液媒質に対するHbA1c特異性の抗体のある程度の
親和性を示しうる。しかしながら、この因子は実際の分
析条件下で無視することができる。
導波路の被覆しない部分における透過率％は１つのセ
ルから他のセルにおいて一定ではなく、これはこの方法
が合計のHbの精確な決定のために適当ではないと思われ
ることに、また、注意すべきである。しかしながら、こ
の場合において合計のHbを測定することは不必要であ
り、かつまた被覆されない側および被覆された側からの
信号を関係づけることは不必要である。第２に、一連の
キュベットの各々がこの装置の初期の目盛定めを行なわ
ないで絶対的測定値を完全に再現できるように、このよ
うなキュベットの手による製作を一定に維持することは
困難である。凝いなく、キュベットが大規模に工業的に
成形により製作されるとき、この欠点は克服される。
実施例６ 蛍光型アッセイによるヒトIgGおよびヒト血清アルブ
ミン（HSA）の同時定量 前の実施例におけるような二重導波路を使用し、490n
mの入射輻射を遮断しそして520nmの蛍光信号を通過させ
るカットオフフィルターを検出器78の前に光路中にそう
入した。
第２図に関連して開示した型のモノクロメーター
（９）により励起光を発生させた。
二重導波路としてはたらくキュベットの１つの表面
（Ａ）を、IgGに対してヒツジでレイズ（raise）した抗
血清で被覆した。これは抗血清の希釈溶液を用いる通常
の手段に従って、吸着により実施した（α−鎖特異性;S
APU,Carluke,Scotland;容量1/400の希釈）。キュベット
の対向する壁（Ｂ）を同じ技術に従いHSAに対するヒツ
ジ抗血清（1/100容量の最終希釈、同一の入手源）で被
覆した。
次いで、混合した組み合わせ標準溶液をヒトIgG（SER
VA BIOCHEMICALS）およびHSA（UCB−BIOPRODUCTS,Bruss
els,Begium）を一緒に溶解することによって調整した。
標準媒質として使用した緩衝溶液は、リン酸塩緩衝剤で
あった:0.05モル/l（pH7.4）;0.9％のNaCl（w/v）;0.05
％のNaN3（w/v）；ツイーン20（SIGMA）0.1％（v/v）お
よび２％（v/v）の正常ヒツジ血清（SAPV）。
この実験において開示する試験は、「サンドイッチ」
型のアセツを行うことに基づく。すなわち、キュベット
を標準と接触させ、そしてインキュベーションを一定期
間実施して、表面（Ａ）および（Ｂ）に取り付けられた
それぞれの特異的抗体へ抗原を十分に結合させた。この
インキュベーション時間は精確に測定した10分の期間で
あり、その期間に全体の結合した抗原の量は標準中のそ
の濃度に比例した。ブランク（０％の抗原試薬）に対す
る試験を同じように実施した。
その後、セルを空にし、結合しない物質のすべてを洗
浄除去し、そして導波装置の表面に取り付けられた抗原
に対する第２抗体の組み合わせた溶液を加えた。この組
み合わせた溶液は、フルオレセインで標識付けした1/40
（v/v）緩衝液希釈のウサギ抗HSAおよびウサギ抗IgG（D
AKOIMMUNOGLOBULINSから入手した）を含有した（フルオ
レセインイソシアネート、FITCを通常の手段に従い実際
のマーカーとして使用した）。
蛍光標識付けした混合抗体溶液を加えると、瞬間的な
蛍光の上昇が導波装置の出力において観測され、次いで
遅い速度依存性信号が観測され（第９図参照）、所定期
間後のその高さは独立に取ったIgGおよびHSAの標準濃度
に比例した。解読後、表面（Ａ）および（Ｂ）から生ず
る信号の成分を別々に表示し、そして結果を下表に記載
する。
第９図は、成分ＡおよびＢについて、１μg/l（破
線）および10μg/l（混合線）の標準の場合における０
〜15分の状態をグラムで示す。実線はブランクを表わ
す。
上の実施例におけるように、未知の濃度でIgGおよびH
SAを含む試料を同じように試験しかつ標準と比較するこ
とにより確認した。
【図面の簡単な説明】
第1a図は、屈折率n1の媒質（導波路）内の完全に反射し
た光の伝搬を説明する線図であり、n1は導波装置が接触
している他の媒質（分析物）の屈折率n2より大きい。 第1b図は、第1a図に付随し、そして希薄な媒質（分析
物）中のエバネッセント波成分の浸透を概略的に表わ
す。 第２図は、本発明の方法を実施するための単一の導波路
の概略的配置図である。 第３図は、本発明の方法を実施するための装置の他の実
施態様の略配置図である。 第4a図は、二重導波セルを含む分析装置の他の実施態様
の細部の略上面図である。 第4b図は、第4a図の実施態様の変形の略図である。 第4c図は、なお他の実施態様の略図である。 第５図は、本発明の方法に従う分析の間に生ずる現象の
略表示である。 第６図は、本発明の１つの実施態様に従う分析を実施す
るときの応答曲線を示す線図である。 第７図は、導波装置を通して移動する多重反射光線の入
射角θの関数として、応答曲線の１つのパラメーターの
変動を示す線図である。 第８図は、ヘモグロビンの存在下のHbA1cの分析におけ
る典型的な応答曲線の線図である。 第９図は、蛍光を含む他の型の分析を示す。 １…光線、２…反射光線、4,5…物質、６…光源、７…
流れセル、８…導波路、９…モノクロメータ、10…光電
子増倍管、11…プリアンプ、12…制御システム、13…マ
イクロコンピューター、14…プリンタ、15…メモリー
（フロッピーディスク）、16,17…プリズム、18…入
口、20…シール用ガスケット、31…導波路、34…流れセ
ル、35…入口、36…出口、37,38…栓、39…光源、40,4
1,42…レンズ、43…光電子増倍管、50…導波セル、51,5
2…壁（素子）、53…源、54,55,56…光線、57,58,59…
鏡、60,61…出力光、70…二重導波セル、71,72…導波素
子、73…光源、74,75…鏡、76…チョッパーディスク、7
7…窓、78…検出器、79,80…鏡、90…二重導波セル、9
3,94…光源、95,96…交差ビームスプリッター、97…検
出器、98…プリズム、100…抗体、101…HbA1c、102…遮
断剤、103…HbA0、104…タンパク質。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジヨルジエ ルビレ スイス国，ジユネーブ，1213 オネ，ツ エーハー．フランソワーズ シヤバ，20 (56)参考文献 特開 昭52−102094（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−81560（ＪＰ，Ａ) 米国特許3939350（ＵＳ，Ａ)

Claims (22)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】導波路中の励起放射線の多重内部反射を用
    いて単一液体試料中の１より多い成分を測定する方法で
    あって、 液体試料中に含まれる第１成分に特異な反応体で導波路
    の表面を被覆すること、 該被覆表面を該試料に暴露して該反応体と該第１成分の
    反応で形成された複合体の層を形成させること、 該導波路の入力端に光励起信号を照射して、該信号のエ
    バネッセント成分が該試料中に十分な距離浸透し、該複
    合体及び該液体試料本体中の第２成分と相互作用するよ
    うにすること、 該相互作用後の信号を集めること、および その後、該信号を分析し、該信号の初めの急激な減少ま
    たは増加の変化から該第２成分の存在または量を検出
    し、該信号のその後の漸進的な減少または増加の変化か
    ら該第１成分の存在または量を検出すること を含むことを特徴とする液体試料中の１より多い成分を
    測定する方法。
  2. 【請求項２】前記信号の相互作用が蛍光の吸収、散乱又
    は発生による特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】励起信号が前記複合体の生成中に該複合体
    と相互作用して、前記第１成分の時間依存性応答と前記
    第２成分の瞬時応答を提供する特許請求の範囲第２項記
    載の方法。
  4. 【請求項４】前記導波路が光スライド又は光ファイバで
    ある特許請求の範囲第２項記載の方法。
  5. 【請求項５】血液試料の総ヘモグロビンと該総ヘモグロ
    ビンに対する別のヘモグロビン因子又は誘導体を実質的
    に同時に測定するために下記（ａ）〜（ｆ）を含む特許
    請求の範囲第１項記載の方法であって、 （ａ）血液試料の屈折率より大きい屈折率の光導波路系
    の表面の少なくとも一部に、前記ヘモグロビン因子又は
    誘導体に特異的な反応体からなりかつ該ヘモグロビン因
    子又は誘導体の層を形成可能な１又は２以上の複合体形
    成反応体で被覆すること、 （ｂ）該導波路の入力端に光ビームを照射して出力端で
    励起光を回収し、該光ビームは該光ビームに伴なうエバ
    ネッセント光成分の案内の外側の作用に有効な領域が前
    記複合体層のそれを越えるような角度の、多重内部反射
    機構で該導波路に沿って伝搬されること、 （ｃ）前記血液試料の前記照射された導波路を互いに接
    触させて、一方では、導波路中を伝搬される光の部分を
    試料本体のヘモグロビンとのエバネッセント波成分の相
    互作用によって最初に吸収させ、前記出力端から励起光
    における瞬時の鋭い低下（Ｉ）を示し、他方では、該血
    液試料中の前記グリコシレート化ヘモグロビン又はその
    他の因子と前記複合体層が連続的に累積している前記導
    波路上の対応する反応体の間に免疫型反応が発生し、該
    累積によって前記エバネッセント波成分と形成された前
    記複合体層の相互作用にもとづき前記励起光の信号の比
    較的ゆるやかな変化がもたらされること、 （ｄ）前記出力端から集めた伝搬光に起きる前記急激な
    光吸収低下（Ｉ）を観察、測定及び／又は記録するが、
    この低下は試料の総ヘモグロビンの濃度に量的に比例す
    ること、 （ｅ）試料中のグリコシル化ヘモグロビン又はその他の
    因子の量に大きさ（Ｍ）と速度（Ｋ）が量的に比例する
    前記比較的ゆるやかな変化を観察し、測定し及び／又は
    記録すること、 （ｆ）Ｉ及びＭ又はＫの値から得た結果を、総ヘモグロ
    ビンの濃度及び／又は試料中のヘモグロビンに対するグ
    ルシジル化ヘモグロビン又はその他の因子の比として表
    現するために必要な計算をすることを含む方法。
  6. 【請求項６】前記（ｄ）および（ｅ）を、両方とも、被
    覆した反応体を有する導波路の領域における入射光と試
    料との相互作用から得られる信号について行なう特許請
    求の範囲第５項記載の方法。
  7. 【請求項７】測定する血液因子がグリコシル化ヘモグロ
    ビンである特許請求の範囲第５項記載の方法。
  8. 【請求項８】前記（ｄ）を、反応体で被覆されていない
    導波路の一部分上の前記相互作用から得られる出力信号
    の成分について行なう特許請求の範囲第５項記載の方
    法。
  9. 【請求項９】一部を反応体で被覆し、他の一部を被覆し
    ない二元型導波路を用いる特許請求の範囲第８項記載の
    方法。
  10. 【請求項１０】前記他の一部を、導波路の未被覆表面領
    域へのヘモグロビンの析出可能性を最小限にするブロッ
    キング用タンパク質で被覆する特許請求の範囲第９項記
    載の方法。
  11. 【請求項１１】二元型導波路として分析用キュベットを
    使用し、その対向する主たる壁面は光伝導性でありかつ
    血液試料より大きい適当な屈折率を持つ透明材料からな
    り、且つこの材料が導波路として機能する特許請求の範
    囲第９項記載の方法。
  12. 【請求項１２】導波路中の励起放射線の多重内部反射を
    用いて単一液体試料中の１より多い成分を測定する方法
    であって、 液体試料中に含まれる第１成分に特異的な反応体で導波
    路の第１表面を被覆すること、該導波路は該第１表面と
    異なる位置に第２表面を有し、 該導波路の該被覆第１表面及び該第２表面を該試料に暴
    露し、該反応体と該第１成分の反応で形成された複合体
    の層を該第１表面上に形成させること、 該導波路の入力端に光励起信号を照射して、該信号のエ
    バネッセント成分が該第１表面の該複合体及び該第２表
    面の該試料の溶液本体と相互作用するようにすること、 該相互作用後の信号を集めること、および その後、該第２表面を介して得られる該信号の初めの急
    激な減少または増加の変化から該溶液本体中の成分の存
    在または量を検知し、該第１表面を介して得られる該信
    号の漸進的な減少または増加の変化から該第１成分の存
    在または量を検知すること を含むことを特徴とする液体試料中の１より多い成分を
    測定する方法。
  13. 【請求項１３】前記第１及び第２表面が導波路の異なる
    表面部分である特許請求の範囲第12項記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記光集収工程が、前記信号を波長に関
    して分離して各相互作用からの作用を分離することをさ
    らに含む特許請求の範囲第12項記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記第１及び第２表面を励起光に交互に
    暴露する特許請求の範囲第12項記載の方法。
  16. 【請求項１６】光信号を伝搬する導波路手段と、 前記導波路手段の入力端に前記光信号を提供する光源手
    段と、 導波路手段を伝搬する光信号が液体試料と相互作用可能
    に液体試料を保持する液体試料保持手段と、 前記導波路手段の出力端から光信号を集めかつ該光信号
    に応答する電気信号を発生する光検出手段と、 前記電気信号を処理しかつそれに応答する出力信号を提
    供する計算手段を有し、 前記導波路手段はその一部を液体試料中の第１成分に特
    異的な反応体で被覆されているので、該導波路手段を該
    試料に暴露したとき該反応体と該第１成分による複合体
    の層を形成し、 前記光源手段と前記導波路手段は、該光源からの光信号
    が該導波路手段中で該導波路手段と前記液体試料との界
    面に衝突しながら伝搬する間に、前記光のエバネッセン
    ト成分が前記反応体／第１成分複合体及び前記試料の本
    体の両方と相互作用して、該反応体／第１成分複合体及
    び該液体試料本体の両方のそれぞれから実質的に同時に
    情報を得るように配列され、 前記電気信号計算手段は、前記出力信号の初めの急激な
    減少または増加の変化により前記第１成分の存在または
    量を検出し、前記出力信号の漸進的な減少または増加の
    変化により前記液体試料本体中の成分の存在または量を
    検出することを特徴とする、液体試料中１より多い成分
    を実質的に同時に測定する装置。
  17. 【請求項１７】前記導波路手段はその一部をヘモグロビ
    ン因子に特異的な反応体で被覆されているので、該導波
    路手段を血液試料に暴露したとき該反応体と該ヘモグロ
    ビン因子による複合体の層を形成し、 前記導波路手段の第２部分は未処理であるか又はヘモグ
    ロビン因子ブロッキング剤で処理されており、 よって光信号が前記反応体被覆部分を相互作用すると、
    ヘモグロビン因子の測定のための情報が集められ、かつ
    光信号が前記未被覆又はブロッキング部分と相互作用す
    るところでは、ヘモグロビンの測定のための情報が集め
    られる、血液試料中のヘモグロビンと少なくとも１つの
    ヘモグロビン因子を平行して測定する特許請求の範囲第
    16項記載の装置。
  18. 【請求項１８】前記導波路手段が二元型構造を有し、前
    記光信号を同時に又は交互に伝搬する２つの独立した光
    学要素を含み、該要素の一方は反応体被覆され、他方は
    裸であるか又はブロッキングされている特許請求の範囲
    第17項記載の装置。
  19. 【請求項１９】前記光源手段が２個の独立した交互に発
    光する光源を含み、それらの出力をそれぞれビーム分割
    手段により前記光学要素の一方の光学的端部に集光し、
    該光学要素の他方の光学的端部は全反射するようにされ
    ているので該光学的要素によって伝搬される光信号がそ
    の内部を前後に進む特許請求の範囲第18項記載の装置。
  20. 【請求項２０】前記導波路手段として、２個の対面する
    壁面が前記導波要素として働く光学セル又はキュベット
    を用いる特許請求の範囲第18項記載の装置。
  21. 【請求項２１】前記光源手段が前記光信号を前記二元導
    波路の２個の光学要素に交互に注入するチョッパー手段
    を含む特許請求の範囲第20項記載の装置。
  22. 【請求項２２】前記チョッパー手段が回転ミラー又はチ
    ョッパーディスクである特許請求の範囲第21項記載の装
    置。
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