CN101646943A - 阻断官能化表面上的非特异性蛋白结合的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种阻断表面例如蛋白涂覆的生物传感器表面上的非特异性蛋白结合的方法。

Description

阻断官能化表面上的非特异性蛋白结合的方法
发明领域
本发明涉及阻断(block)表面上的非特异性蛋白结合的方法。本发明还涉及生物传感器表面，该表面已被单糖、二糖(例如海藻糖)、多糖(例如葡聚糖)或寡糖封闭(block)以防止非特异性蛋白结合(non-specific proteinbinding)。
发明背景
随着人类基因组测序的完成，分子生物学的下一个重要的挑战是了解DNA编码的多种蛋白靶如何与其他蛋白、小分子药物候选物以及多种酶和抑制剂相互作用。参见例如，Pandey & Mann，“Proteomics to study genes andgenomes，”Nature，405，p.837-846，2000；Leigh Anderson等，“Proteomics：applications in basic and applied biology，”Current Opinion in Biotechnology，11，p.408-412，2000；Patterson，“Proteomics：the industrialization of proteinchemistry，”Current Opinion in Biotechnology，11，p.413-418，2000；MacBeath& Schreiber，“Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput FunctionDetermination，”Science，289，p.1760-1763，2000；De Wildt等，“Antibodyarrays for high-throughput screening of antibody-antigen interactions，”NatureBiotechnology，18，p.989-994，2000。为此，能够高灵敏度地同时鉴定和/或定量多种不同的生物分子相互作用的工具将用于药物发现、蛋白质组学和诊断学。此外，为使这些工具能够被广泛应用，它们必须易于使用、购买和操作的成本低廉并适用于各种各样的分析物，所述分析物包括例如多核苷酸、肽、小蛋白、抗体、甚至完整细胞。
将靶分子固定在支持物表面上已成为生物学测定的发展过程中一个非常重要的方面。通常，生物学测定在微孔滴定板、显微镜载玻片、试管、有机硅圆片(silicone wafers)或膜的表面上进行。利用表面上的官能团和靶分子官能团之间的偶联反应将靶分子共价固定在表面上。在玻璃表面上进行表面官能化的一种通用技术是用功能性硅烷进行硅烷化。Silane，Silicones，andMetal-Organics，p.88，Gelest Inc.出版，Tullytown，PA(2000)。当前可用的显微镜载玻片形式的生物学测定表面例如Corning Inc.(Corning，NY)生产的涂覆有GAPS II的载玻片，TeleChem International，Inc(Sunnyvale，CA)提供的ArryitTM SuperAmine载玻片，Sigma Diagnostics(St Louis，MO)提供的SILANE-PREPTM胺官能化载玻片，以及其他例子。据称，SuperAmine载玻片每mm2提供5×1012个胺基团。再如，尼龙支持物上已衍生脒的酰胺基用于在检测特异性多核苷酸序列的杂交试验中固定DNA和RNA探针。参见美国专利4,806,546。微孔滴定板和试管形式的产品包括Nalge Nunc International(Rochester，NY)提供的NucleoLinkTM和CovaLinkTM，仅存在于高分子支持物表面。CovaLinkTM产品提供仲胺表面，约1012个基团/mm2表面积。在多种共轭反应中，仲胺显示出比伯胺更低的反应性。参见，Loudon，G.Marc，OrganicChemistry，第3版，The Benjamin/Cummings Publishing，Redwood City，CA(1995)。
有许多已知方法可用于对材料表面进行化学官能化，所述材料例如硅、玻璃或金。表面官能化引起了人们极大的兴趣，因为相对于未进行化学官能化的表面，其往往使表面的用途得到扩展，从而可能使各种分子与表面的结合得到增强并对各种分子进行分析。表面上的化学官能化涂层的类型、数量和质量决定了该表面结合具体分析物的共价强度和能力。非常希望该涂层自身在多次使用后不易降解或不易被冲洗掉。
已证明，涂覆在表面上的醛-官能团和胺-官能团为检测生物分子提供了多种平台。这些基团可通过物理吸引例如静电相互作用或例如化学结合而捕获生物分子。可直接地或间接地(即，通过化学接头(liker))实现这种化学结合。本领域已知多种同基双功能或异基双功能接头。用胺涂覆表面的一种简单方法是将清洁的表面直接暴露于聚赖氨酸。一个例子是用于微阵列印刷的载璃片表面(glass slide surface)。用胺涂覆表面的一种可选方案是将胺-涂覆分子共价附着在表面上，例如将硅烷附着在玻璃上或将硫醇附着在金上，这两种情况均是公知的。
各种氨基烷基硅烷试剂已用于涂覆带有胺基的硅基或玻璃基表面。用于涂覆此类表面的方法包括使用多种硅烷试剂、溶剂和不同的物理处理程序。此外，为检测表面上化学基团的存在，已使用的方法包括放射性方法、比色法、荧光、XPS、FTIR、AFM、及其他方法。灵敏度是选择用于表面试验的合适方法时一个重要的问题。一般而言，既没有用于化学涂敷生物传感器的感受器表面的标准工业程序，也没有用于检测此类生物传感器上的具体化学部分的存在或数量的标准测试方法。
用醛结合位点涂覆表面的一种方法是用胺基官能化该表面并向该胺官能化表面(amine-functionalized surface)添加含有氰基硼氢化物(cyanoborohydride)的醛溶液。得到的生物传感器可用于结合蛋白及其他含有胺的分子。也可通过商业途径(例如CEL Associates和NoAbBioDiscoveries)获得一些醛改性的载玻片用于印刷阵列。
业已开发出了例如用于检测包括寡核苷酸的多种生物分子复合物、抗体抗原相互作用、激素-受体相互作用以及酶-底物相互作用的生物传感器。一般，生物传感器由两个元件组成：高度特异性的识别元件，和能够将分子识别事件转换成可定量信号的转换器。业已通过多种方法实现了信号转导、包括荧光、干涉量度学(Jenison等，“Interference-based detection of nucleicacid targets on optically coated silicon，”Nature Biotechnology，19，p.62-65；Lin等，“A porous silicon-based optical interferometric biosensors，”Science，278，p.840-843，1997)和重量分析法(A.Cunningham，BioanalyticalSensors，John Wiley & Sons(1998))。
在所述基于光学的转导方法中，直接方法不需要用荧光化合物标记分析物，它是有价值的，因为测定相对简单，并且能够研究不容易标记的小分子和蛋白的相互作用。直接光学方法包括表面等离子体共振(SPR)(Jordan &Corn，“Surface Plasmon Resonance Imaging Measurements of ElectrostaticBiopolymer Adsorption onto Chemically Modified Gold Surfaces，”Anal.Chem.，69：1449-1456(1997))，光栅耦合器(Morhard等，“Immobilization of antibodies in micropatterns for cell detection by opticaldiffraction，”Sensors and Actuators B，70，p.232-242，(2000))，椭圆偏光法(Jin等，“A biosensor concept based on imaging ellipsometry forvisualization of biomolecular interactions，”Analytical Biochemistry，232，p.69-72，(1995))，损耗波装置(Huber等，“Direct optical immunosensing(sensitivity and selectivity)，”Sensors and Actuators B，6，p.122-126，1992)，和反射测量术(Brecht & Gauglitz，“Optical probes andtransducers，”Biosensors and Bioelectronics，10，p.923-936，1995)。理论上推测的这些检测方法的检测极限业已确定，并且用实验证实了可用于诊断上相关的浓度范围。
醛-官能化表面(aldehyde-functionalized surface)已用于固定或捕获几种装置形式的表面上的靶分子，所述装置形式包括微阵列、微孔板和孔载玻片(well slide)。将靶分子固定在表面上之后，它可通过特异性分子间相互作用而结合未知样品中的分析物分子从而分析样品。然而，未反应的醛基仍然具有反应性，能够通过靶分子-分析物相互作用将分析物分子化学性附着至表面上，从而导致非特异性结合。即使表面上没有任何靶分子(例如生物学受体)，很多化学和生物分子以及细胞仍趋向于通过疏水性相互作用和/或电荷相互作用吸附至绝大多数表面上。这种吸附同样引起不希望的非特异性结合。非特异性结合降低了基于特异性生物分子相互作用的生物分子检测中的信噪比。生物传感器(包括BINDTM传感器)的醛密度已显著提高。由于醛密度增加，非特异性结合达到了显著性水平，造成难以确定检测信号来自于分析物还是来自虚假读数。因此，对减少这种非特异性结合非常感兴趣。对减少胺-官能化表面的非特异性结合同样非常感兴趣。
作为例子，可将靶分子(如链霉抗生物素蛋白)固定在生物传感器表面。生物传感器可通过检测其它蛋白或小分子(又称配体)与靶分子的结合事件产生的信号变化而检测此类结合。所述信号可以是例如光信号、电信号或可视信号。然而，需要封闭含有靶分子的生物传感器表面以减少蛋白或小分子与该表面的非特异性结合，仅允许与靶分子的特异性相互作用。此类特异性相互作用的例子是链霉抗生物素蛋白和生物素(链霉抗生物素蛋白的特异性配体)之间的相互作用。通常利用任何可通过商业途径获得的阻断剂(例如
Figure G2007800487364D00041
阻断缓冲液、Sea Block阻断缓冲液、Blockerit、Blocker Casin、Fish skin gelatin和BSA(利用1％ BSA+))来进行阻断。这些阻断剂是两亲性的，仅可将一种不希望的引力对换成另外一种。先前试图封闭链霉抗生物素蛋白-涂覆的生物传感器(例如BINDTM传感器板)的尝试通过利用此类可通过商业途径获得的阻断剂进行干扰而降低了链霉抗生物素蛋白活性，这种降低通过检测到结合于链霉抗生物素蛋白的生物素减少而测得。这种干扰部分可由商业阻断剂中存在的生物材料例如蛋白(或肽)而引起。因此，本领域仍然需要解决这个问题。
发明概述
本发明一种实施方式提供减少表面上非特异性结合的方法，其中所述表面是醛-官能化的、胺-官能化的或它们的组合。该方法包括用糖分子处理该表面，从而减少表面上的非特异性结合。糖分子可包括二糖。二糖可以是海藻糖分子或包括海藻糖分子。糖分子也可以是硫酸葡聚糖或包括硫酸葡聚糖。表面可以是生物传感器表面，例如比色共振反射生物传感器表面。糖分子可包括单糖、二糖、多糖、三糖、四糖、五糖、或它们的组合。表面可以是胺官能化表面。糖分子可包括乳糖、甘油醛或它们的组合。糖分子包括海藻糖和乳糖。糖分子可包括海藻糖和甘油醛。
本发明另一种实施方式提供一种生物传感器，其包含结合于表面附着的醛基的多种特异性结合物质以及结合于表面附着的醛基的多种糖分子。糖分子可以是二糖或包括二糖。二糖可以是海藻糖分子。或者，糖分子可以是葡聚糖或包括葡聚糖。特异性结合物质可以是蛋白。蛋白可包括链霉抗生物素蛋白。
本发明另一种实施方式提供一种包装，其容纳生物传感器和包含糖分子的存贮溶液(storage solution)，所述生物传感器含有结合于表面附着的醛基的特异性结合物质。
因此，本发明提供具有高亲水性、非电荷特征的小分子，它们不像两亲性阻断剂一样提供不希望的吸引。
附图简述
图1A和1B是用于比色共振反射生物传感器的光栅结构的各种实施方式的示意图。n基片代表基片(substrate)材料。n1代表覆盖层的折射率。n2代表一维或二维光栅的折射率。nbio代表一种或多种特异性结合物质的折射率。t1代表覆盖层的厚度。t2代表光栅的厚度。tbio代表一种或多种特异性结合物质的层厚度。
图2表示加入到固定有链霉抗生物素蛋白(SA)的孔中或加入到仅含有5％海藻糖溶液的对照孔中的5％海藻糖溶液产生的偏移(nm)。固定期间SA的浓度是0.05mg/ml或0.2mg/ml。
图3表示在固定有链霉抗生物素蛋白(SA)的孔中加入5％海藻糖溶液，然后加入10％或100％FBS产生的偏移(nm)。结果与无海藻糖的孔比较。固定期间SA的浓度是0.05mg/ml或0.2mg/ml。
图4表示用5％海藻糖阻断后华法林(warfarin)结合于HSA产生的归一化(normalized)峰值波长(PWV)。
图5表示用5％海藻糖阻断后CBS结合于碳酸酐酶产生的归一化峰值波长(PWV)。
发明详述
官能化的、经涂覆的生物传感器表面用于结合化学或生物分子，例如蛋白、肽、多肽、核苷酸、多核苷酸、小分子、小的有机分子、生物素、细胞、分级的(fractionated)细胞、细胞提取物、细胞级分(fractions)、细胞部分，以及例如在蛋白质组学、基因组学、制药学、药物发现和诊断研究领域中感兴趣的其他化学或生物分子。例如，生物传感器可以涂覆醛或涂覆胺，以结合感兴趣的化学或生物分子。
如本文所用，“醛”指具有式-CHO的分子，“胺”指具有式-NH2的伯胺以及仲胺。醛和胺可直接附着于表面或通过连接分子附着于表面，例如生物传感器表面。涂覆胺的表面或胺-官能化表面指提供可进行化学改性的胺基的表面，所述化学改性例如特异性结合物质(specific binding substances)的直接或间接附着。涂覆醛的表面或醛官能化表面指提供可进行化学改性的醛基的表面，所述化学改性例如特异性结合物质的直接或间接附着。间接附着指如本领域公知的通过化学接头附着化学或生物分子。
如本文所用，“表面”指能够直接或间接结合特异性结合物质的任何表面。例如，表面可含有直接附着于表面的官能胺基或官能醛基，或者这些官能团可通过接头分子附着于表面。表面可以是或不是官能化的。表面可以是但不局限于塑料、玻璃或金。此类表面包括但不局限于传感器表面，例如生物传感器表面。
同样如本文所用，糖分子指单糖、二糖、多糖和寡糖。二糖、多糖或寡糖可以是但不限于海藻糖、乳糖、麦芽糖、麦芽三糖、帕拉金糖(palatinose)、乳果糖、蔗糖、葡聚糖、棉籽糖(raffinose)、水苏糖、毛蕊花糖(verbascose)。海藻糖是由两个葡萄糖分子通过α-1，1键键合而成的二糖。参见Higashiyama，Pure Appl.Chem.，74(7)：1263-1269(2002)。
可用具有高折射率的材料(例如氧化钽或其他合适的材料)涂覆生物传感器光栅(grating)，然后任选再涂覆二氧化硅。在塑料中大表面积产生高灵敏度生物传感器的能力使得能够将生物传感器整合入大面积、一次性使用的试验形式(disposable assay formats)，例如微量滴定板和微阵列载玻片。优选生物传感器可整合入无底微量滴定板、微阵列或微流体装置的底部，生物传感器板可用于进行例如多个并行的蛋白-蛋白或靶分子-配体结合试验。所述无底的微量滴定板可具有例如6、8、12、24、48、96、384、1536或3456个孔。发现塑料基片生物传感器的检测灵敏度优于或等于以前报道的玻璃基片生物传感器。例如，基于塑料的生物传感器可大量生产；生物传感器阵列例如96孔或384孔例如可进行规模放大(up-scaled)和大量生产。
基于塑料的生物传感器或塑料生物传感器指包含塑料光栅或传感器表面、光栅的塑料支持物(也称为基片)和/或其它塑料组分的生物传感器。用于官能化此类生物传感器表面的反应条件导致此类生物传感器可能容易降解。优选具有光学质量的塑料。该塑料可以是清晰透明的，没有任何微粒，能够提供平滑的消光(flat finish)。作为例子，生物传感器可包含支持丙烯酸类聚合物-光栅层的聚酯基片。作为另一例子，生物传感器可包含支持环氧树脂光栅层的聚碳酸酯基片。塑料的其它非限制性例子包括聚酯和聚氨酯。然而，可使用提供可用于生物传感器的光学质量的任何塑料。另一个例子中，光栅表面是塑料的，从而塑料既充当基片又充当光栅。本领域通常用来官能化此类生物传感器表面的反应条件导致此类生物传感器容易降解。然而，有些官能化方法不引起基于塑料的生物传感器的降解。参见，例如2004年11月11日提交的美国专利申请No.10/983,511，其全文通过参考纳入本文。本领域技术人员将认可本发明方法也能够和基于玻璃生物传感器一起使用。
作为例子，生物传感器可以是BINDTM传感器板。BINDTM系统允许无标记检测化学和生物分子的相互作用。BINDTM系统可包括BINDTM读数仪和96-或384-孔微板生物传感器。BINDTM系统使用光学效应，以提供生物传感器表面结合的灵敏度检测。生物传感器可以是非结构性光栅，将其整合入行业标准形式的微孔滴定板中。BINDTM系统允许检测利用蛋白、肽和细胞进行化学和生物分子的相互作用，以及其他相互作用。BINDTM系统可用于抗原亲合性排序(ranking)、细胞功能性筛选、肽表位作图和免疫遗传学筛选。
醛-官能化表面或胺-官能化表面指具有涂层的表面，通过该涂层可附着特异性结合物质。例如，醛-官能化表面可指但不限于具有高折射率材料涂层的生物传感器的光栅表面，通过所述涂层可附着特异性结合物质。此类高折射率材料包体例如氮化硅、硫化锌、二氧化钛或氧化钽。
任选地，在表面官能化之前将氧化硅层涂覆在高折射率材料上。高折射率材料或氧化硅可用醛官能团或胺官能团官能化，用于附着化学和生物分子。用于对涂覆有高折射率材料的光栅表面进行醛官能化或胺官能化的试剂优选与光栅材料和基片材料(不管它们是塑料或环氧树脂的)相容。虽然光栅涂覆有高折射率材料，所述材料为光栅提供一定的不受用来醛官能化或胺官能化该表面的试剂影响的保护，但光栅的反面仍可能在官能化过程中暴露。同样地，当光栅结合于基片时，基片的反面可能暴露于官能化试剂。同时，光栅表面上的高折射率材料涂层的瑕疵(imperfections)可导致光栅表面上部区域暴露。因此，各层的材料以及层间的粘合应在官能化期间和任何后续分析程序中保持完整。
生物传感器的醛-官能化表面或胺-官能化表面指基于塑料的生物传感器以及非基于塑料的生物传感器。例如，生物传感器包括二氧化钛涂覆的传感器，或具有高折射率、低吸收率(index of absorption)涂层的其他传感器，或在顶层上和基层材料结构上具有覆盖层(covering)的传感器。此外，考虑各种物理形式的二氧化硅或其他具有低吸收率和低折射率的材料。这些生物传感器是示例性的，并不限制具有醛-官能化表面或胺-官能化表面的生物传感器。
亚波长(subwavelength)结构表面(SWS)生物传感器
在本发明的一种实施方式中，亚波长结构表面(SWS)被用于在特定波长产生强烈光学共振反射，可将它用于以高灵敏度跟踪化学或生物学材料的相互作用，如特异性结合物质或结合伴侣(parters)或这两者。比色共振反射生物传感器表面起着特异性结合物质的表面结合平台的作用。
亚波长结构表面是非常规类型的衍射光学元件(optic)，它能模拟薄膜涂层的作用(Peng & Morris，“Resonant scattering from two-dimensionalgratings，”J.Opt.Soc.Am.A，Vol.13，No.5，p.993，1996年5月；Magnusson，& Wang，“New principle for optical filters，”Appl.Phys.Lett.，61，No.9，p.1022，1992年8月；Peng & Morris，“Experimentaldemonstration of resonant anomalies in diffraction from two-dimensionalgratings，”Optics Letters，Vol.21，No.8，p.549，1996年4月)。SWS结构包括表面浮雕的(surface-relief)一维或二维光栅，其中，与入射光的波长相比，光栅周期较小，以便不允许除了反射和透射零级以外的衍射级波长传播。参见美国专利申请号10/059,060和10/058,626，全文通过参考纳入本文。SWS表面窄带滤光片可以包括在基片层和覆盖层之间所夹的一维或二维光栅，所述覆盖层填充光栅刻线槽(grooves)。可任选地不使用覆盖层。当光栅区的有效折射率大于所述基片或覆盖层时，就会产生导模(guidedmode)共振效应。当适当设计滤光片时，一维或二维光栅结构选择性耦合(couple)窄带波长的光。光发生散射并与向前和向后传播的零级光耦合。这种导模共振效应从任何光子进入该结构的位点开始高度局限性地发生在约3微米的区域。由于导模在侧向的传播没有得到支持，因此没有产生波导。
这种结构的反射或透射颜色可以通过将诸如特异性结合物质或结合伴侣或这两者添加在覆盖层的上表面或一维或二维光栅表面上而进行调节。所添加的分子增加了通过该结构的入射辐射的光程长度，并因此改变了发生最大反射或透射的波长。
在一种实施方式中，在用白光照射生物传感器时，将它设计成只能反射单一波长。当特异性结合物质或靶分子(例如化学和生物分子)附着在生物传感器的表面上时，反射波长(颜色)由于耦合入光栅的灯光的光程改变而偏移。通过将特异性结合物质连接在生物传感器表面上，可以在不使用任何类型的荧光探针或颗粒标记的情况下检测互补性结合伴侣分子。所述检测技术能够分辨，例如，大约0.1nm厚的蛋白结合变化，并且能够用浸泡在流体中的或干燥的生物传感器表面来实施。
检测系统由例如光源和分光计组成，所述光源以正入射方式通过例如光纤探头照射生物传感器的小斑点，所述分光计通过，例如，同样是正入射的第二个光纤探头收集反射光。由于在激发/检测系统和生物传感器表面之间没有物理接触，所以不需要特殊的耦合棱镜，并且所述生物传感器可以容易地应用在任何常用测定平台上，包括，例如微量滴定板和微阵列载玻片。可以在几毫秒时间内进行一次分光计读数，因此，有可能快速测量在生物传感器表面上平行发生的大量的分子相互作用，并且实时监控反应动力学。
这种技术可应用于平行测量大量的生物分子的相互作用，特别是当分子标记能改变或抑制研究中的分子的功能时。用蛋白靶高通量筛选药用化合物库，以及用于蛋白质组学的蛋白-蛋白相互作用的微阵列筛选是需要由本发明的组合物和方法提供的灵敏度和通量的应用的例子。
图1是SWS结构的一种例子的示意图。在图1中，n基片表示基片材料。n1表示任选的覆盖层的折射率。n2表示一维或二维光栅的折射率。nbio表示一种或多种特异性结合物质的折射率。t1表示在一维或二维光栅结构上的覆盖层的厚度。t2表示光栅的厚度。tbio表示一种或多种特异性结合物质层的厚度。在一种实施方式中，n2＞n1(参见图1)。对层厚度(即覆盖层，一种或多种特异性结合物质，或光栅)进行选择，以便获得对顶面上的其他分子的共振波长灵敏度。选择光栅周期，以便获得理想波长的共振。所述结构可由玻璃或氮化硅介电材料制成。或者，所述结构可由具有合适的介电覆盖层的压纹塑料(embossed plastic)形成。
本发明一种实施方式提供SWS生物传感器。SWS生物传感器包括一维或二维光栅、支持光栅的基片层、以及固定在基片层反面的光栅表面的一种或多种特异性结合物质。
一维或二维光栅可由例如以下材料组成：硫化锌、二氧化钛、氧化钽和氮化硅。光栅的横截面轮廓可以包括任何周期性的重复功能，例如，“方波”。光栅还可以包括选自以下的重复形式的形状：连续的平行线、正方形、圆形、椭圆形、三角形、梯形、正弦波、卵形、长方形和六边形。正弦形横截面轮廓优选用于需要将光栅形状压纹为软材料例如塑料或将光栅表面复制为例如环氧树脂材料的制造应用。本发明的一种实施方式中，光栅的深度约0.01微米至约1微米，光栅周期约0.01微米至约1微米。
SWS生物传感器还可包括一维线形光栅表面结构，即一系列平行的线或槽。一维线形光栅足够产生导模共振滤光效应。二维光栅在与传感器表面平面交叉的两个侧向均有特征，即两者均为亚波长，而一维光栅的横截面仅在一个侧向是亚波长，长度(long dimension)可大于共振光栅效应的波长。一维光栅生物传感器可包含高折射率材料，将其以薄膜涂覆在具有一维光栅表面结构的低折射率材料层上。或者，一维光栅生物传感器可包含低折射率材料基片，在该基片上将高折射率薄膜材料模制到(patterned into)一维光栅表面结构中。低折射率材料可以是玻璃、塑料、聚合物或固化环氧树脂。高折射率材料的折射率必须大于低折射率材料。高折射率材料可以是例如硫化锌、氮化硅、氧化钽、二氧化钛或氧化铟锡(indium tin oxide)。
可例如通过将光栅表面制造为与标准显微镜载玻片一样大小，然后将高亲和性化学受体试剂微滴置于光栅表面的x-y栅格位点上，从而将SWS结构用作微阵列平台。或者，可将SWS结构制造为和标准微量滴定板一样大小，并整合入整块板的底部表面。当化学官能化表面(例如微阵列/微量滴定板)暴露于分子(例如分析物)时，这些分子将会被优先吸引到具有高亲和性的位置。因此，一些表面位置(locations)聚集另外的材料，而其他表面位置则不聚集。可通过检测各单独的表面位置内(例如各单独的微阵列/微滴定板表面位置内)共振波长的偏移来确定所述吸引另外的材料的表面位置。因此，例如，可通过检测共振波长偏移的程度来确定样品中结合分子(例如分析物)的数量以及受体试剂和这些分子之间的化学亲合性。
本发明的一种实施方式中，可检测第一分子和第二测试分子间的相互作用。使用如上所述的SWS生物传感器。因此，生物传感器包括一维或二维光栅、支持一维或二维光栅的基片层和任选地覆盖层。如上所述，当用光照射生物传感器时，在反射辐射光谱上产生共振光栅效应，光栅的深度和周期小于共振光栅效应的波长。
为检测第一分子和第二测试分子间的相互作用，将第一和第二分子的混合物施加于生物传感器上的不同位点。不同位点可以是生物传感器上的一个斑点或孔或者可以是生物传感器上的大面积。还将第一分子和第三对照分子的混合物施加于生物传感器上的不同位点。生物传感器可以是如上所述同一个生物传感器，或者可以是第二个生物传感器。如果所述生物传感器是同一个生物传感器，则第二个不同位点可用于第一分子和第三对照分子的混合物。或者，可将第一和第二分子从生物传感器洗掉之后利用相同的独特(distinct)生物传感器位置。第三对照分子不与第一分子相互作用，约和第一分子同样大小。检测来自(一个或多个)生物传感器的独特位置(distinct locations)反射光波长的偏移。如果具有第一分子和第二测试分子的独特位置的反射光波长偏移大于具有第一分子和第三对照分子的独特位置的反射光波长偏移，则第一分子和第二测试分子相互作用。相互作用可以是例如核酸分子的杂交、抗体或抗体片段与抗原的特异性结合、以及多肽的结合。第一分子、第二测试分子或第三对照分子可以是例如核酸、多肽、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(scFv)、F(ab)片段、F(ab′)2片段、Fv片段、小的有机分子、细胞、病毒和细菌。
胺官能化的生物传感器
将高折射率材料层(例如氮化硅层)涂覆到表面(例如塑料表面)后，将胺官能团附着在高折射率材料表面上从而准备将该装置用作传感器。基于塑料的生物传感器可在向其表面提供胺官能团的化学改性期间发生降解(即，传感器上的结构或组成改变)。为了避免此类降解，生物传感器胺表面官能化的方法中可使用与生物传感器的塑料相容的试剂。已将高折射率材料沉积在塑料生物传感器的光栅表面上之后，可存储传感器或将其直接用于官能化。在胺官能化程序之前可使用湿法(例如用液体(如溶剂)清洁)或干法(例如紫外线、臭氧或等离子)使传感器经历清洁步骤。一种实施方式中，胺官能化程序包括(a)将塑料比色共振生物传感器暴露于硅烷醇溶液(alcoholic silanesolution)，然后(b)用醇清洗暴露的塑料比色共振生物传感器。当生物传感器干燥后，光栅表面含有胺官能团，即-NH2基团。
一种实施方式中，硅烷溶液含有3-氨丙基三乙氧基硅烷和醇(例如乙醇)或其他合适的低分子量醇。同样地，任何合适的低分子量醇可用于清洗生物传感器。用胺涂覆塑料生物传感器的一个例子是：首先将传感器暴露于含有3-氨丙基三乙氧基硅烷和乙醇的溶液，然后在乙醇中短暂地(briefly)清洗传感器，最后干燥传感器。可调节3-氨丙基硅烷在乙醇中的浓度，以使3-氨丙基硅烷在乙醇中的浓度为约1％-约15％。此外，乙醇可以是约90％-100％(体积/体积，用水调节)。例如，可在烘箱中于约70℃进行干燥步骤10分钟。干燥可在较高的温度下进行，条件是选择温度，以使传感器不发生降解。
可使用很多合适的溶剂、浓度、反应时间和固化/保温时间。变化包括表面类型、硅烷试剂(其他硅烷，例如3-氨丙基三甲氧基硅烷等)、硅烷浓度、涂覆溶剂或溶剂组合(例如乙醇和水)、涂覆反应时间、清洗溶剂或溶剂组合(例如乙醇和水)、固化时间和固化温度。
表面处理
本发明的一种实施方式中，可用化学处理来改性传感器表面。例如，可通过将表面浸在溶液中来用溶液处理表面。或者，也可用气相处理(包括化学蒸汽或雾化(atomization)沉积)来涂覆表面。气相处理可用于确保几何学上非平坦表面的保形涂覆(conformal coating)。这种涂覆可用于表面硅烷化步骤中，或用于向表面上加入其他有机材料。本领域技术人员知晓可用于处理表面的其他方法。
在气相涂覆处理之前，通常可使用等离子处理。等离子处理可除去表面上的大多数污染并活化一些表面以改善后续气相涂敷处理中的粘合。
气相涂覆处理可用于在高分子膜表面上添加化学官能性(chemicalfunctionality)并使吸附的水分、有机污染物和低分子量材料最小化。气相涂覆的优点包括但不限于：对表面的处理均匀，处理高分子膜时无背面(backside)处理，处理多孔材料时无针孔。用于本发明的此类涂敷服务包括但不限于由以下厂商提供的服务：Sigma Technologies(Tucson，AZ)、4th State(Belmont，CA)、Yield Engineering(San Jose，CA)、Erie Scientific(Portsmouth，NH)以及AST Products(高级表面技术(advanced surface technologies))(Billerica，MA)。
声学(acoustic)生物传感器
本发明的另一种实施方式中，使用声学生物传感器。声学生物传感器通过检测由分子和/或分析物的结合引起的沉积质量变化导致的生物传感器表面上共振振荡频率的变化，来检测分子(例如分析物)与共价附着于表面的化学或生物分子或靶分子的结合。例如可利用压阻装置、机械振动器(例如微机械悬臂(micromachined cantilevers)、膜或音叉)或声表面波振荡器来检测共振振荡频率。
电子生物传感器
本发明的另一种实施方式中，使用电子生物传感器。电子生物传感器通过检测由分子和/或分析物的结合所引起的沉积质量变化导致的生物传感器表面上的电阻(例如直流电(DC)或交流电(AC)、低频或高频、电容或电感)的变化来检测分子(例如分析物)与共价附着于表面的化学或生物分子或靶分子的结合。
特异性结合物质和结合伴侣
可通过例如物理吸附或化学结合将一种或多种特异性结合物质或靶分子固定在表面(例如传感器表面)上。特异性结合物质能够例如特异性地结合于添加在传感器表面上的结合伴侣。特异性结合物质特异性地结合于它的结合伴侣，但基本上不结合添加在生物传感器表面上的其他结合伴侣。例如，当所述特异性结合物质是抗体，并且它的结合伴侣是特殊抗原时，所述抗体能特异性地结合所述特殊抗原，但基本上不结合其他抗原。特异性结合物质可以是例如核酸、肽、多肽、蛋白、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(scFv)、F(ab)片段、F(ab′)2片段、Fv片段、小分子、小的有机分子、生物素、细胞、细胞提取物、细胞部分、病毒、细菌、聚合物、肽溶液、单链或双链DNA溶液、RNA溶液、含有来自组合化学库的化合物的溶液、或生物样品。生物样品可以是例如血液、血浆、血清、胃肠分泌物、组织或肿瘤的匀浆物、滑液、粪便、唾液、痰、囊液、羊水、脑脊液、腹腔液、肺灌洗液、精液、淋巴液、眼泪和前列腺液。
优选一种或多种特异性结合物质排列在生物传感器上独特位置的微阵列中。特异性结合物质的微阵列包含位于本发明生物传感器表面上的一种或多种特异性结合物质，从而表面含有多个独特位置，每一个位点具有不同的特异性结合物质或具有不同数量的特异性结合物质。例如，阵列可包含1、10、100、1,000、10,000或100,000个独特位置。由于一种或多种特异性结合物质通常以x-y坐标中规则的栅格模式排列，这种生物传感器表面称为微阵列。然而，本发明的微阵列可包括以任何类型的规则或不规则模式排列的一种或多种特异性结合物质。例如，独特位置可限定一种或多种特异性结合物质的斑点微阵列(microarray of spots)。微阵列斑点的直径可以是约50-约500微米。微阵列斑点的直径还可以是约150-约200微米。一种或多种特异性结合物质可结合于它们的特异性结合伴侣。
可通过将一种或多种特异性结合物质的微滴置于例如一维或二维光栅或覆盖层表面的x-y栅格位点上来制造本发明生物传感器上的微阵列。当生物传感器暴露于含有一种或多种结合伴侣的测试样品时，结合伴侣将优先被吸引到含有对该结合伴侣有高亲和性的特异性结合物质的微阵列上的独特位置。一些独特位置在其表面上聚集结合伴侣，而其它位置不聚集。
本发明的微阵列的一种例子是核酸阵列，其中，所述阵列中的每一个独特位置包含不同的核酸分子。在本实施方式中，在所述核酸微阵列中的斑点检测与测试样品中核酸的相反链的互补性化学结合。
尽管微量滴定板是用于生物化学测定的最常见的形式，但微阵列越来越被认为是使可以同时测量的生物化学相互作用的数目最大化，同时使珍贵试剂的体积最小化的方法。通过用微阵列点样器(spotter)将特异性结合物质施加在本发明的生物传感器上，可以获得的特异性结合物质的密度为10,000特异性结合物质/英寸2。通过聚焦照射光束来检查单个微阵列位置，可以将生物传感器用作无标记微阵列读出系统。
固定一种或多种特异性结合物质
将一种或多种结合物质固定在生物传感器上，以便特异性结合物质不会被清洗程序洗掉，并且它与测试样品中结合伴侣的结合不受生物传感器表面的妨碍。业已实施了若干种不同类型的表面化学策略，以便将特异性结合物质共价附着在例如，玻璃上，以便用于各种类型的微阵列和生物传感器。这些相同的方法可容易地适用于本发明的生物传感器。对生物传感器进行表面制备以使表面含有用于结合一种或多种特异性结合物质的正确官能团，这是生物传感器生产工艺的必需部分。
如本文所用，术语“靶分子”或“化学或生物分子”或“特异性结合物质”指可附着于官能化表面的任何特异性结合物质。化学或生物分子可选自例如蛋白、肽、多肽、核苷酸、多核苷酸、小分子、生物素、细胞、分级细胞、细胞提取物、细胞级分和细胞部分。
如本文所用，术语蛋白、肽和多肽指氨基酸残基聚合物。这些术语同样适用于如下氨基酸聚合物，即其中一种或多种氨基酸是相应的天然存在氨基酸的化学类似物，包括经翻译后程序(例如，糖基化作用和磷酸化作用)修饰的氨基酸。如本文所用，术语“蛋白”指任何蛋白，包括但不限于肽、酶、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、生长因子等等。
术语“多肽”指氨基酸聚合物，不考虑聚合物长度；因此，肽、寡肽和蛋白均包括在多肽定义中。该术语既指天然存在的多肽也指合成多肽。该术语可包括多肽的化学或表达后修饰。因此，术语″多肽″明确地涵盖例如，对多肽的修饰，包括共价附着糖基、乙酰基、磷酸基、脂质基团等。化学修饰的多肽包括掺入了鉴定或捕获标记的多肽。天然的或其它化学修饰(例如上文列举的那些)可发生在多肽中的任何位置，包括肽主链、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。可理解，同样类型的修饰可以相同或不同程度存在于给定多肽的几个位点。另外，给定多肽可含有多种类型的修饰。多肽可以是分支的，例如由泛素化(ubiquitination)引起的分支；它们也可以是有或者没有分支的环状。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价附着黄素、共价附着血红素部分、共价附着核苷酸或核苷酸衍生物、共价附着脂质或脂质衍生物、共价附着磷脂酰肌醇、交联、环化、形成二硫键、脱甲基作用、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸酯(pyroglutamate)、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、形成GPI锚、羟基化、氢化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊二烯化(prenylation)、外消旋化、硒化、硫酸化、转运RNA介导的向蛋白中加入氨基酸(例如精氨酰化和泛素化)。(参见，例如，Proteins-Structure and Molecular Properties，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；PosttranslationalCovalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，NewYork，第1-12页(1983)；Seifter等，Meth Enzymol 182：626-646(1990)；Rattan等，Ann NY Acad Sci 663：48-62(1992))。还包括在“多肽”定义中的是含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然存在的氨基酸、天然情况下仅存在于不相关生物系统中的氨基酸、哺乳动物系统的修饰氨基酸等)的多肽，具有天然存在和非天然存在的替代的键(substituted linkages)以及本领域已知的其它修饰的多肽。这些多肽可以是天然存在或合成的。
如本文所用，“小分子”指小于约2,500道尔顿的分子。这些分子包括例如小的有机分子，如生物素；还包括小肽，例如肽模拟物(peptidomimetics)以及核苷酸，如通常在抗病毒筛选库中发现的那些核苷酸。小分子既可指合成分子，也可指趋向于具有较大分子量的天然化合物，所述合成分子可以是多种取向的(diversity oriented)并且分子较小。小分子还包括口服起效药物，其上限分子量范围为约500道尔顿。参见Lipinski，C.A.“Drug-like Properties andthe Causes of Poor Solubility and Poor Permeability，”J.Pharm.And Tox.Methods.44：235(2000)，236(“Lipinski”)。
可以通过物理吸附(即，不使用化学接头)或通过化学结合(即，使用化学接头)将一种或多种特异性结合物质附着在生物传感器表面上。化学结合能在生物传感器表面上产生较强的特异性结合物质的附着，并且提供表面结合分子的规定的取向和构象。
化学结合类型的例子包括例如胺官能化、醛官能化、羧基官能化；以及生物素、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和镍活化。这些表面可用于将特异性结合物质直接附着于生物传感器表面，或通过利用如表1所示的几种不同类型的化学接头将特异性结合物质附着于生物传感器表面。还参见，Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，NY，1996。
表1
可以用胺官能化表面附着几种类型的接头分子，而醛表面可用于直接结合蛋白，而不需要额外的接头。例如，表面上的醛官能化涂层厚度小于约50埃。此外，表面可以是平坦的或不平坦的。“不平坦的”表面可以是例如包含如本文所述的光栅的表面。“平坦的”表面可以是例如包含具覆盖层的光栅的表面，所述覆盖层例如为氧化硅或旋涂玻璃(spin-on-glass)(SOG)，如2001年8月15日提交的美国专利申请09/930,352和2002年1月29日提交的美国专利申请10/059,060(通过参考纳入本文)。镍表面可用于结合具有掺入的组氨酸(“his”)标记的分子。利用镍-活化的表面进行的“组氨酸标记的”分子的检测为本领域所熟知(Whitesides，Anal.Chem.68，490，(1996))。
例如可基本按照针对固定至玻璃所述，将特异性结合物质固定于塑料传感器的表面(可以是氧化物)。但是，应消除会损害固定特异性结合物质的材料的洗涤和涂覆处理步骤。
为了检测浓度低于大约0.1ng/ml的结合伴侣，优选扩增结合在生物传感器上的结合伴侣并将其转换成生物传感器表面上的额外的层。由于光程长度增加，可以容易地检测沉积在生物传感器上的增加了的质量。通过将更大的质量整合到生物传感器表面上，也增加了所述表面上结合伴侣的光密度，因此能够比未添加质量时产生更大的共振波长偏移。添加质量可以通过例如，酶促方法，通过“夹心”测定，或者通过将物质以具有各种大小和组成的适当偶合的珠或聚合物形式直接应用在生物传感器表面上而实现。这种原则业已应用在其他类型的光学生物传感器上，以用于证实灵敏度相对于没有质量放大的灵敏度极限而言提高了超过1500x。参见，例如，Jenison等，“Interference-based detection of nucleic acid targets on optically coatedsilicon”，Nature Biotechnology，19：62-65，2001。
作为例子，胺官能化生物传感器表面可能具有特异性结合物质，包括固定在该表面上的单链DNA捕获探针。所述捕获探针选择性地与它的互补性结合伴侣相互作用。反过来，可以将所述结合伴侣设计成包括能够结合“检测(detector)”分子的序列或标记。检测分子可以包括，例如，连接在辣根过氧化物酶(HRP)上的接头，当所述接头暴露于正确的酶时，会选择性地将额外的材料仅沉积在生物传感器上存在检测分子的部位。所述方法能够在几分钟内将，例如，300
Figure G2007800487364D00181
的可检测生物材料添加在生物传感器上。
还可用“夹心”方法增强检测灵敏度。在该方法中，可以用大分子量分子放大低分子量分子的存在。例如，分子量为，例如，大约0.1kDa-大约20kDa的结合伴侣可以进行标记，例如，用琥珀酰亚胺基-6-[a-甲基-a-(2-吡啶基-二硫代)甲苯甲酰胺]已酸酯(SMPT)或庚二亚胺酸二甲酯(dimethylpimelimidate)(DMP)、组氨酸或生物素分子进行标记。当所述标记是生物素时，生物素分子能强有力地与链霉抗生物素蛋白结合，它的分子量为60kDa。由于生物素/链霉抗生物素蛋白相互作用是高度特异性的，所以所述链霉抗生物素蛋白能够将只能由小的结合伴侣产生的信号放大60倍。
通过使用化学衍生化的小颗粒能够将检测灵敏度进一步提高。用胶态金、各种塑料，或直径大约为3-300nm的玻璃制备的“纳米颗粒(nanoparticle)”可以用能够使它们选择性地与结合伴侣共价结合的分子种类涂覆。例如，可用链霉抗生物素蛋白共价涂覆的纳米颗粒来增强生物素-标记的结合伴侣在生物传感器表面上的可见度。尽管链霉抗生物素蛋白分子本身的分子量为60kDa，但衍生化的珠的分子量可以为任何大小，包括，例如，60KDa。大型珠的结合，会导致生物传感器表面上光密度的大的改变，并且产生容易检测到的信号。该方法可使灵敏度分辨率增加大约1000x。
使用传感器的方法
本发明的传感器可用于平行研究一种或多种特异性结合物质/结合伴侣相互作用。通过将一种或多种结合伴侣施加于表面上固有一种或多种特异性结合物质的生物传感器上，无需使用标记，即可检测一种或多种特异性结合物质与它们各自的结合伴侣的结合。例如，用光照射SWS生物传感器，检测来自生物传感器的最大反射光波长或最小透射光波长。如果一种或多种特异性结合物质已结合于它们各自的结合伴侣，那么相比于一种或多种特异性结合物质未结合于它们各自的结合伴侣的情况，反射光波长发生了偏移。当用一系列含有一种或多种特异性结合物质的独特位置涂敷SWS生物传感器时，检测来自生物传感器的各独特位置的最大反射光波长或最小透射光波长。
可将多种特异性结合物质(例如抗体)以阵列形式固定在生物传感器上。然后，使生物传感器与含有结合伴侣(例如蛋白)的感兴趣测试样品接触。只有与固定在生物传感器上的抗体特异性结合的蛋白才能保持结合于生物传感器上。该方法基本上是酶联免疫吸附测定的大规模形式；然而，不需要使用酶或荧光标记。
可通过将一种或多种酶施加于已固定了一种或多种特异性结合物质的生物传感器上来检测酶的活性。例如，洗涤生物传感器并用光照射。来自检测生物传感器反射光波长。当一种或多种酶通过酶促活性改变了生物传感器上的一种或多种特异性结合物质时，反射光波长发生偏移。
另外，可将测试样品(例如含有结合伴侣的细胞裂解物)施加于生物传感器，然后洗涤以除去未结合的材料。可从生物传感器上洗脱结合于生物传感器的结合伴侣，用例如质谱法鉴定。任选地，可将噬菌体DNA展示库施加于本发明的生物传感器，然后洗涤以除去未结合的材料。可分离结合于生物传感器的单独的噬菌体颗粒，并对这些噬菌体颗粒中的插入物测序以确定结合伴侣的身份(identity)。
对上述应用而言，尤其是对于蛋白质组学应用而言，将诸如来自测试样品的结合伴侣等材料选择性地结合到本发明生物传感器的能力，和其后从生物传感器的独特位置选择性地除去结合材料以用于进一步分析的能力是非常有利的。本发明生物传感器还能够通过测定光的反射波长的偏移来检测并定量样品中结合到生物传感器阵列独特位置的结合伴侣的数量。例如，可将一个特定生物传感器位点的波长偏移与其他特定生物传感器位点的阳性和阴性对照进行比较，以确定结合于生物传感器阵列独特位置的结合伴侣的数量。
阻断生物传感器表面上的非特异性结合
糖(例如海藻糖和葡聚糖)可用于减少固定在生物传感器表面上的特异性结合物质与溶液中其他小分子和蛋白之间的非特异性相互作用。可用于本发明的糖包括例如单糖、二糖、三糖、四糖、五糖及其他多糖和寡糖例如葡聚糖。糖是非蛋白性物质，可用于阻断或减少分子与蛋白涂覆的生物传感器表面(例如传感器板)等物质的非特异性结合。糖不干涉特异性蛋白-配体相互作用(例如链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用)。如本文所用，“寡糖”指具有约3-10个单糖单元的糖，“多糖”指具有多于约10个单糖单元但可具有多于3000个单糖单元的糖。葡聚糖是复杂的、分支多糖的例子，其由多个葡萄糖分子结合成不同长度的链而构成。糖可用于封闭例如胺-官能化表面、醛-官能化表面和羧基官能化表面。可通过例如实施例3和实施例4描述的方法检测非特异性结合的减少。
这些糖阻断剂(例如二糖阻断剂)还可用作运输蛋白涂覆板时的存储溶液。例如，将所需蛋白固定在醛官能化生物传感器表面上后，例如将链霉抗生物素蛋白固定在传感器板上之后，在包装前将海藻糖溶液加到板上。海藻糖结合于醛表面并阻断任何剩余的醛基。当接收者接收生物传感器时，预先用二糖分子阻断表面。糖提供了一种惰性方式，保持板湿润或稳定而不允许发生可能会损坏板的功能的化学反应。这种实施方式中，糖作为暂时的保护基。认为糖与醛形成了半缩醛，产生短暂的“共价”键，这种键可通过简单的氧化还原化学而容易地除去/逆转。如果在加糖之前将蛋白加到表面上，则糖通过在非常邻近固定化蛋白质处保持重要的、维持水分子的结构层而起到稳定蛋白的作用。由于它们的分子大小和均一的高度疏水性，糖不干涉特异性蛋白-配体相互作用(例如链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用)。糖还具有维持蛋白不变性的作用。添加糖使固定有蛋白的表面能够以更稳定的状态运输并可能以半干状态运输。
用于本发明的糖包括还原糖和非还原糖。还原糖含有醛基，其成员包括例如果糖、葡萄糖、甘油醛、乳糖和麦芽糖。由于还原糖可与胺反应，可用还原糖(例如甘油醛)封闭胺官能化表面。单糖也可附着于胺-官能化表面。可用含有醛基还含有羟基的糖封闭醛官能化表面。还原糖和非还原糖均含有羟基，可与传感器的醛官能化表面上的醛基反应，从而封闭表面。海藻糖和蔗糖属于非还原糖类，因为它们不含有醛基。
醛官能化表面可用于附着蛋白。糖可与醛反应并阻断它们，从而防止蛋白与表面上的未结合于特异性结合物质的醛基反应。本发明的表面也可含有一些胺基。例如，高密度胺表面(其转化为含有醛的表面)上可能不是所有胺基均转变，因此表面上仍保留了一些胺基。因此，还原糖和非还原糖均可用于阻断表面上的胺和醛基，从而在检测期间作为分析物加入的蛋白仅结合于固定的蛋白，而不结合于表面上含有胺和醛基的其他部分。
据信，海藻糖及其他二糖分子可能是经由半缩醛附着于将靶蛋白固定在表面上之后仍未反应的醛官能团。这种键可通过简单的氧化还原化学逆转，并可使其在通常试验的仅约几小时的时间范围中保持稳定。因此，海藻糖似乎以稳定的方式结合于醛表面。
本发明的一种实施方式提供一种生物传感器，其包含结合于表面附着的醛基的多种特异性结合物质和结合于表面附着的醛基的多种糖分子。也就是说，生物传感器被醛-官能化，将糖和特异性结合物质加到生物传感器上，从而特异性结合物质和糖结合于生物传感器表面附着的醛基。
本发明另一种实施方式提供一种包装，其容纳生物传感器和含有糖分子的存贮溶液，所述生物传感器具有结合于表面附着的醛基的特异性结合物质。表面附着的醛基是加到表面上使其成为醛官能化表面的胺基。
本文说明性地描述的本发明可合适地在缺乏本文未明确公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下付诸实施。因此，例如，在本文每种情况下，任一术语“包括”、“基本由......组成”和“由......组成”可由另两个术语中的任一个替换而保留了其普通含义。已采用的术语和表达方式是用作描述性术语，而非限制性的，并且没有任何意图在使用这些术语和表达方式时排除任何已显示的和已描述的等同特征或者其一部分，但应当意识到在所宣称的本发明的范围内可作出各种修改。因此，应当理解虽然已经通过实施方式和可选的特征详细公开了本发明，但本文所公开的概念的修改和变化也应被视为在说明书和所附权利要求界定的本发明范围内。
此外，当本发明的特征和方面以可选方案的马库什组或其他可选择要素组进行描述时，本领域技术人员将认识到本发明也因此根据所述马库什组或其他组的任何独立成员或成员亚组(subgroup)进行了描述。
提供以下实施例只是用于说明目的，而不希望限定上面以广义形式描述的本发明的范围。在本公开内容中引用的所有参考文献都通过参考纳入本文。
实施例1
SWS生物传感器的制造
SWS 生物传感器的详细制造工艺以前已有描述。参见例如，Cunningham等，Sensor and Actuators B 6779，1-6(2002)，通过参考纳入本文。具体而言，使用光学级聚合物薄膜作为SWS传感器的支持物。将可用紫外线固化的丙烯酸基聚合物涂层涂覆在薄膜上，用具有96个圈(circle)(与96孔微滴定板的标准格式对应，所述圈形成SWS结构)的硅掩膜(silicon mask)复制。复制(replication)后，用Xenon Corporation(Woburn，MA)提供的紫外灯RC600固化涂层。然后，将二氧化钛层和二氧化硅(silicone dioxide)层沉积在表面顶端。
固定一种或多种特异性结合物质
对比色共振反射生物传感器使用下述规程，以便用胺官能团使所述表面官能化。胺基可用作用于后续几种类型的接头分子的共价结合的通用表面。
通过将玻璃基片生物传感器浸在Piranha蚀刻剂(etch)(浓硫酸/过氧化氢)中12小时来使其清洁。用水彻底地洗涤该生物传感器。将生物传感器浸在溶于无水丙酮的3％3-氨丙基-三乙氧基硅烷溶液中1分钟，然后用无水丙酮漂洗并风干。然后用水洗涤生物传感器。
用半定量法验证生物传感器表面上氨基的存在。用5mL的50mM碳酸氢钠(pH 8.5)短暂洗涤来自每一批氨基官能化生物传感器的一个生物传感器。然后将生物传感器浸在含有0.1mM硫代-琥珀酰亚胺基的5mL 50mM碳酸氢钠(pH 8.5)中，剧烈振荡30分钟。将3.0mg的s-SDTB溶解在1mL DMF中，并用50mM碳酸氢钠(pH 8.5)稀释至50mL来制备s-SDTB溶液。30分钟温育后，用20mL ddH2O洗涤生物传感器三次，然后用5mL 30％高氯酸处理。出现橙色溶液，表明生物传感器已成功地被胺官能化；未经处理的玻璃生物传感器未观察到颜色变化。
在上述程序之后，通过高氯酸处理后的该溶液在495nm的吸光度可用作表面上胺基的数量的指示。一套试验中，Sigma载玻片、Cel-Associate载玻片和内部(in-house)生物传感器载玻片的吸光度分别是0.627、0.647和0.728。这表明生物传感器表面的NH2官能化水平与通过商业途径获得的官能化微阵列玻璃载片相当。
遵循上述用胺使生物传感器官能化的规程之后，可将接头分子附着于生物传感器。选择交联剂时，应考虑例如活性基团的选择性、间隔臂长度、溶解度、可裂解性(cleavability)等问题。反过来，接头分子结合用于特异性识别结合伴侣的特异性结合物质。作为例子，用下文所述规程将生物素接头分子结合至胺官能化生物传感器。
用生物素使胺涂覆的生物传感器官能化的规程
用PBS(pH8.0)洗涤胺涂覆的生物传感器三次。在PBS缓冲液(pH8)中制备浓度为0.5mg/ml的硫代琥珀酰亚胺基-6-(生物素酰氨基)己酸酯(硫代-NHS-LC-生物素，Pierce，Rockford，Illinois)溶液。向各胺涂覆的生物传感器上添加2ml硫代-NHS-LC生物素溶液，室温下温育30分钟。用PBS(pH8.0)洗涤生物传感器三次。所述硫代-NHS-LC生物素接头的分子量为556.58，长度为22.4。得到的生物传感器可用于捕获抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白分子。
用醛胺使涂覆的生物传感器官能化的规程
在0.1M磷酸钠和0.1％氰基硼氢化钠(pH 7.0)中制备2.5％的戊二醛溶液。向各胺涂覆的生物传感器添加2ml戊二醛溶液，室温下温育30分钟。用PBS(pH7.0)洗涤生物传感器三次。戊二醛接头的分子量为100.11。得到的生物传感器可用于结合蛋白及其他含有胺的分子。该反应通过形成希夫碱来进行，随后的还原性胺化产生稳定的仲胺键。一个实验中，将涂覆醛的载玻片与可通过商业途径获得的醛载玻片(Cel-Associate)比较，观察到用上述方法制备的载玻片上链霉抗生物素蛋白和抗-兔IgG的结合高出10倍。
用NHS使胺涂覆的生物传感器官能化的规程
在碳酸钠缓冲液(pH8.5)中制备25mM的二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC，Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri)溶液。向各胺涂覆的生物传感器上添加2ml DSC溶液，室温下温育2小时。用PBS(pH8.5)洗涤生物传感器三次。DSC接头的分子量为256.17。得到的生物传感器用于结合含有羟基或胺的分子。该接头是可获得的最小的同基双功能NHS酯交联剂之一。
除上述规程之外，已报道了很多另外的表面官能化和分子接头技术，这些技术针对不同类型的生物分子优化了检测性能。这些技术中最常见的是胺表面、醛表面和镍表面。然后，如表2所示，这些官能化表面可用于将几种不同类型的化学接头附着于生物传感器表面。胺表面用来附着几种类型的接头分子，但醛表面用来直接结合蛋白而无需另外的接头。镍表面专门用于结合具有掺入的组氨酸(“his”)标记的分子。用镍活化的表面检测“组氨酸标记的”分子是本领域公知的(Sigal等(1996)Anal.Chem.，vol.68，p.490)。
表1说明了用于制造和使用生物传感器的步骤的顺序以及可用于表面官能化化学、化学接头分子、特异性结合物质和结合伴侣分子的各种选择的实例。还存在通过用较大的分子(例如HRP或链霉抗生物素蛋白)来进行放大，和使用聚合物材料(例如葡聚糖或TSPS)来增加可用于分子结合的表面积，从而增强所检测到的信号的可能性。
表1
Figure G2007800487364D00241
实施例2
醛表面官能化和测试
以下实施例在比色共振生物传感器表面上提供化学官能团以结合蛋白、肽、核酸、细胞、小分子、小的有机分子、其它化学和/或生物分子等等。蛋白质组学、基因组学、医药、药物发现、诊断学、环境、化学和类似的研究领域和/或工业界对这些化学官能团非常感兴趣。该实施例致力于开发一种涂覆方法，该方法利用不改变或降解生物传感器结构的化学试剂提供了高密度官能性醛结合位点。该实施例解决的另一个问题是开展一种测试方法来验证比色共振生物传感器的官能化表面上的醛结合位点的存在。
传感器表面已预先涂覆有表面胺基。用胺涂覆传感器表面的一种简单方法是将清洁的表面直接暴露于聚赖氨酸。一个例子是用于微阵列印刷的玻璃载玻片表面。用胺涂覆表面的一种可选方案是将胺-涂覆分子共价附着在表面上，例如将硅烷附着在玻璃上或将硫醇附着在金上，这两种情况均是公知的。也可通过商业途径(例如CEL Associates和NoAb BioDiscoveries，见下文)获得一些醛改性的载玻片用于印刷阵列。
该实施例描述了一种方法，该方法在比色共振生物传感器表面上提供了高密度官能性醛结合位点，而没有改变或降解生物传感器的结构。
为了验证醛基的存在，当前的比色和荧光方法通常使用溶液中的样品，这种样品的检测可比干燥表面上的检测更灵敏。已证明，在干燥和不平的(即不是完全平坦的)表面上进行厚度小于约50埃的化学基团的表面鉴定非常困难。
比色共振生物传感器表面可用胺基官能化，其中该表面可以是如本文所述包含塑料、玻璃、环氧树脂、或聚合物基片的生物传感器。可用偶合缓冲液清洗胺-官能化表面。可在pH约7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中配制偶合缓冲液。可将含有氰基硼氢化盐的醛溶液添加到生物传感器表面。醛溶液可包含含有约100mM氰基硼氢化盐的约10％的戊二醛。可允许表面在约室温下静置例如约4小时。可用例如偶合缓冲液洗涤生物传感器表面。
为了测试生物传感器表面上醛基的存在，可使用多种方法，包括但不限于放射性方法、比色、荧光、X射线光电子光谱(XPS)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、原子力显微术(AFM)，等等。
用于醛表面官能化的荧光测试可包括例如，将经醛处理的和未经处理的生物传感器切割成2×2cm2的片。可将醛涂覆的表面暴露于荧光染料，该荧光染料能够被可见光激发。例如，使用配制在PBS(pH7.4)溶液中的荧光肼衍生物如ALEXA 647-肼(Molecular Probes，Portland，OR)，该染料的终浓度可以为约100μg/mL。可将约100μL染料溶液分配在一片盖玻片上，将生物传感器片面朝下(face down)置于染料溶液上。可于室温温育染料和生物传感器约1小时。可丢弃盖玻片和染料溶液，可清洗生物传感器表面，例如在去离子蒸馏水中清洗3次。可将生物传感器片置于培养皿(含例如约20mL去离子蒸馏水)中，在摇动平台上洗涤约1小时。用N2干燥生物传感器片。可用水滴将生物传感器片压在玻璃载玻片上，用例如
Figure G2007800487364D00261
428TM扫描仪扫描。读取各生物传感器片的荧光从而确定醛结合位点的数量。
比色共振生物传感器包含例如如本文所述的沉积在含有低折射率材料的光栅上的高折射率材料。高折射率材料可以是例如硫化锌、二氧化钛、氧化铟锡、氧化钽或氮化硅，而低折射率材料可以是例如玻璃、塑料、聚合物或环氧树脂。一种实施方式中，任选用SiO2涂覆生物传感器的高折射率材料。所用的比色生物传感器表面上的醛涂层可以是任何厚度。包括小于约50埃。另外，生物传感器表面可以是不平的(即，不平坦)。在检测醛表面活化之前，生物传感器表面可以是干燥的。
使用上述醛官能化规程和荧光测试方法，相对于未用醛表面官能化的生物传感器，醛涂覆的带染料的生物传感器通常显示至少10倍的荧光过量。表2表示对未进行醛官能化(空白)的塑料生物传感器和醛-官能化生物传感器的比较，所述所有生物传感器均处于荧光测试程序中。该规程和方法显示，涂覆的醛的表面密度高于商业供应商(例如CEL Associates，TX和NoAbBioDiscoveries，(Mississauga，ON，加拿大))所使用的方法获得的密度。表3显示了没有醛官能化的玻璃载片(空白，所示为4个样品的平均值)和醛-官能化载玻片的比较，这些玻璃载片或载玻片由商业供应商(Cel-Associate和NoAb)的方法或本发明方法获得，均进行了荧光测试程序。
表2
  塑料生物传感器样品   荧光强度(计数)
  空白1-无醛   785
  空白2-无醛   746
  样品1-通过NoAb的方法的醛涂覆的   6431
  样品2-通过NoAb的方法的醛涂覆的   5070
  样品3-通过本发明方法的醛涂覆的   17280
  样品4-使用本发明方法的醛涂覆的   14109
表3
  玻璃载片样品   荧光强度(计数)
  空白1-无醛   825±85
  样品组1-通过Cel-Assoc的方法的醛涂覆的   7684±796
  样品组2-通过NoAb的方法的醛涂覆的   15847±2020
  样品组3-使用本发明方法的醛涂覆的   35486±7664
也可用蛋白结合试验测试醛表面官能化。例如，可在PBS中制备A蛋白的约100μg/mL溶液，pH约7.4，将其添加到醛涂覆的和未经处理的生物传感器片上，于约室温温育约1小时。可用含1％(w/v)BSA的PBS溶液洗涤生物传感器约3次。可在约室温将生物传感器片置于洗涤溶液中洗涤约15分钟。可在约室温下，用约pH7.4的PBS缓冲液洗涤生物传感器片。将合适抗体的标记溶液添加到生物传感器表面并温育。例如，可使用20μg/mL的兔抗-羊IgG-ALEXA 647(Molecular Probes)溶液，黑暗中温育生物传感器大约30分钟。可用含约0.05％TweenTM 20的PBS缓冲液(约pH7.4)(PBST溶液)洗涤生物传感器约3次。可用去离子水洗涤生物传感器并用N2干燥。检测可包括例如用
Figure G2007800487364D00271
428TM扫描仪扫描生物传感器以获得荧光读数。
使用醛涂覆工艺和蛋白结合试验方法，已证明醛涂覆的生物传感器对A蛋白/IgG的结合比未涂敷、并经过同样的A蛋白/IgG处理的生物传感器高约5倍(参见表4)。
表4
  塑料生物传感器样品   荧光强度(计数)
  空白1-无醛   4249
  空白2-无醛   3525
  空白3-无醛   4572
  空白4-无醛   3976
  样品1-醛涂覆的   18759
  样品2-醛涂覆的   22212
  样品3-醛涂覆的   15170
  样品4-醛涂覆的   19525
表5显示当醛官能化的基于塑料的比色共振生物传感器阵列顺序地暴露于PBS、BSA和抗-BSA时如何反应。同时监测六个生物传感器。步骤1中，将所有的生物传感器暴露于PBS(pH7.4)溶液以获得关于生物传感器的基线。然后，步骤2中，将传感器3-6暴露于0.5mg/mL的BSA(在PBS中配制)，而生物传感器1和2(用作参比)仅暴露于PBS。在BSA结合的生物传感器上观察到约0.38nm的平均信号，而参比生物传感器保持在基线水平。最后，步骤3中，传感器3和4暴露于0.5mg/mL的抗-BSA，而生物传感器1和2再次仅暴露于PBS。发现抗-BSA对BSA的结合(生物传感器3和4)产生高于基线的另外约1.4nm的信号。作为对照，该步骤中，生物传感器5和6分别暴露于PBS和0.5mg/mL的BSA，此时它们的反应仍保持步骤2的水平。
表5
  暴露于溶液  步骤1信号波长偏移(nm)  步骤2信号波长偏移(nm)  步骤3信号波长偏移(nm)
 传感器1-参比   步骤1PBS+步骤2PBS+步骤3PBS 0.000 -0.009 -0.020
 传感器2-参比   步骤1PBS+步骤2PBS+步骤3PBS 0.000 0.009 0.020
 传感器3-样品   步骤1PBS+步骤2BSA+步骤3抗BSA -0.002 0.384 1.473
 传感器4-样品   步骤1PBS+步骤2BSA+步骤3抗BSA -0.002 0.350 1.425
 传感器5-对照   步骤1PBS+步骤2BSA+步骤3PBS 0.000 0.389 0.398
 传感器6-对照   步骤1PBS+步骤2BSA+步骤3BSA -0.002 0.380 0.390
由于可使用醛涂覆的表面进行宽范围的检测应用，本文所述的程序、方法和结果可得到广泛应用，包括但不限于蛋白、肽、核酸、细胞、小分子、小的有机分子、其他的化学和/或生物分子等的结合。包括蛋白质组学、基因组学、医药、药物发现、诊断学、环境、化学等很多领域对此类应用非常感兴趣。
实施例3
用5％海藻糖封闭链霉抗生物素蛋白(SA)表面
将40μl5％的海藻糖溶液加到固定有SA的孔(0.05mg/ml SA和0.2mg/mlSA)和对照孔(仅有海藻糖)中，使其结合2小时。洗涤板，测定峰值波长(PWV)偏移(见表6和图2)。SA偏移是SA结合到醛表面的PWV，而阻断剂偏移是允许阻断剂结合到固定有SA的醛表面上的未反应醛官能团后获得的PWV偏移。小阻断剂比较大的SA分子更容易接近未反应的醛。较高的SA浓度使阻断剂的偏移较低，可能是由于这些孔中可结合阻断剂的醛较少。
表6
  固定期间的SA浓度   SA偏移   阻断剂偏移
  Nm   5％海藻糖
  0.05mg/mL SA   2.00   2.96
  0.2mg/mL SA   5.81   2.19
  醛表面(没有链霉抗生物素蛋白)   -   2.91
实施例4
海藻糖减少非特异性结合的效力
为了测试海藻糖减少非特异性结合的效力，测定海藻糖减少胎牛血清(FBS)结合SA表面的能力。使市售10％和100％FBS与SA表面反应，所述SA表面的PWV偏移为2nm或5.8nm，测定产生的偏移(参见表7和图3)。通过将表面被封闭之后产生的信号认为是0或基线将偏移归一化为海藻糖偏移。然后检测由于FBS中存在的蛋白而造成的结合变化并报告为非特异性结合。
表7
Figure G2007800487364D00291
这些结果表明，FBS结合于表面上未反应的醛。另外，这些结果证明，即使在SA低固定密度下(表面上仍有较多可用的未反应醛基)，用海藻糖封闭仍减少了非特异性结合。
海藻糖减少了来自FBS的蛋白与SA表面的非特异性结合。5.8nm SA表面观察到最高的偏移减少，表明阻断剂的最优选择依赖于固定的靶蛋白的表面密度。换句话说，对于低表面密度而言(表面覆盖稀疏)，可使用小分子阻断剂或大分子阻断剂(例如惰性蛋白)。然而，对于高表面密度而言(表面的蛋白覆盖率高)，阻断剂应小到足够穿透蛋白层并结合于未反应的醛。
选择阻断剂的另一个考虑是表面的预期用途。用于例如蛋白-蛋白相互作用(如抗体筛选)应用的表面一般具有低密度靶蛋白，而高固定密度表面用于例如小分子结合的检测，例如药物筛选。
实施例5
海藻糖对特异性蛋白-蛋白相互作用的影响
为了测试海藻糖对特异性蛋白-蛋白相互作用的影响，测定海藻糖干涉生物素与SA表面结合的能力。使10％或100％FBS中的生物素与SA表面反应，所述SA表面的PWV偏移为5.8nm，检测产生的偏移(参见表8)。生物素结合产生的理论偏移(显示在括号中)由以下公式计算：(生物素分子量/SA分子量)x SA上生物素结合位点数目x SA偏移，或(244/55000)x 4(结合位点)x5.8nm(SA偏移)。所有情况下均观察到清晰的生物素结合信号。因此，海藻糖似乎不像其它阻断剂一样影响生物素结合。
表8
Figure G2007800487364D00301
实施例6
海藻糖对HSA-华法林蛋白-小分子系统的影响
海藻糖可用于减少其它蛋白-小分子系统的非特异性结合。例如，海藻糖可阻断与人血清白蛋白(HSA)和华法林的相互作用相关的非特异性结合。试验在1％DMSO中进行。用5％海藻糖阻断HSA。结果示于表8和图4。海藻糖对华法林与表面的非特异性相互作用的阻断使得能够检测小于1μM的与HSA的特异性结合。如果不添加海藻糖，难以检测到如此低浓度的结合。
表9
 华法林浓度μM  华法林结合HAS产生的PWV偏移，nm   标准偏差
 0.00  0.000   0.001
 0.10  0.001   0.002
 0.20  0.008   0.005
 0.39  0.009   0.003
 0.78  0.011   0.002
 1.56  0.015   0.002
 3.13  0.026   0.002
 6.25  0.030   0.003
 12.50  0.047   0.002
 25.00  0.059   0.000
 50.00  0.067   0.001
 100.00  0.085   0.002
实施例7
海藻糖对碳酸酐酶(CA)-羧基磺酰胺(Carboxysulfonamide)(CBS)蛋白-小分子系统的影响
海藻糖可用于减少其它蛋白-小分子系统的非特异性结合。例如，海藻糖可阻断与CBS和碳酸酐酶的相互作用相关的非特异性结合。用5％海藻糖封闭CA表面。结果示于表9和图5。海藻糖对CBS与表面的非特异性相互作用的阻断使得能够检测小于1μM的与CA的特异性结合。如果不添加海藻糖，难以检测到如此低浓度的结合。
表9
  CBS浓度，μM   CBS结合于CA产生的PWV偏移，nm   标准偏差
  0.00   0.000   0.001
  0.05   0.000   0.002
  0.10   0.001   0.000
  0.20   0.003   0.001
  0.39   0.005   0.001
  0.78   0.010   0.002
  1.56   0.020   0.002
  3.13   0.037   0.001
  6.25   0.045   0.002
  12.50   0.054   0.006
  25.00   0.054   0.001
  50.00   0.062   0.001
实施例8
阻断生物传感器表面上的非特异性蛋白结合
二糖分子(例如海藻糖)可用于阻断蛋白或其他分子与例如蛋白涂覆的生物传感器表面(例如BINDTM传感器板)的非特异性结合。
二糖分子还可用作运输蛋白涂敷的板时的存储溶液。所需的蛋白固定在生物传感器表面上，例如链霉抗生物素蛋白固定在BINDTM传感器板上。将二糖分子(例如海藻糖)的溶液添加到板上的孔中并包装。因此，当使用者收到生物传感器时，表面是用二糖分子预封闭的。
实施例9
糖结合于胺表面
分别将5％和2.5％的乳糖和甘油醛水溶液添加到用胺官能团官能化2小时的传感器板上。然后传感器板用水彻底洗涤，水中存储过夜。然后再用水洗涤传感器板，检测糖的结合。下表显示了过夜温育后和温育前的偏移差别。注意，过夜后偏移没有显著差别，表明在糖阻断剂和表面上的胺官能团之间形成了稳定的键。
  结合于胺表面的糖溶液  2小时温育并洗涤后的PWV变化，nm   过夜温育并洗涤后的PWV变化，nm
  5％乳糖溶液  4.86   4.82
  2.5％甘油醛溶液  1.75   1.72

Claims (25)

1.减少表面上的非特异性结合的方法，其中，所述表面是醛官能化的、胺官能化的或它们的组合，所述方法包括：
用糖分子处理表面，从而减少该表面上的非特异性结合。
2.如权利要求1所述的方法，其中，糖分子包括二糖。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述二糖是海藻糖分子或包含海藻糖分子。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述糖分子是硫酸葡聚糖或包含硫酸葡聚糖。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述表面是生物传感器表面。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述生物传感器是比色共振反射生物传感器。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述糖分子包括单糖、二糖、多糖、三糖、四糖、五糖、或它们的组合。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述表面是胺官能化表面。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述糖分子包括乳糖、甘油醛或它们的组合。
10.如权利要求1所述的方法，其中，所述糖分子包括海藻糖和乳糖。
11.如权利要求1所述的方法，其中，所述糖分子包括海藻糖和甘油醛。
12.生物传感器，其包含结合于表面附着的醛基的多种特异性结合物质以及结合于表面附着的醛基的多种糖分子。
13.如权利要求12所述的生物传感器，其中，所述糖分子包括二糖。
14.如权利要求13所述的生物传感器，其中，所述二糖是海藻糖分子。
15.如权利要求15所述的生物传感器，其中，所述糖分子是二糖。
16.如权利要求13所述的生物传感器，其中，所述二糖是海藻糖分子。
17.如权利要求12所述的生物传感器，其中，所述糖分子包括葡聚糖。
18.如权利要求12所述的生物传感器，其中，所述糖分子是葡聚糖。
19.如权利要求12所述的生物传感器，其中，所述特异性结合物质是蛋白。
20.如权利要求19所述的生物传感器，其中，所述蛋白包括链霉抗生物素蛋白。
21.包装，其含有生物传感器和包含糖分子的存贮溶液，所述生物传感器含有结合于表面附着的醛基的特异性结合物质。
22.如权利要求21所述的包装，其中，所述糖分子包括二糖。
23.如权利要求22所述的包装，其中，所述二糖包括海藻糖。
24.如权利要求21所述的包装，其中，所述糖分子包括葡聚糖。
25.如权利要求21所述的包装，其中，所述糖分子是葡聚糖。
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