KR20090086235A - 작용기화된 표면 상에서 비­특이적 단백질 결합을 차단하는 방법 - Google Patents

작용기화된 표면 상에서 비­특이적 단백질 결합을 차단하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질-코팅된 바이오센서 표면과 같은 표면 상에서 비-특이적 단백질 결합을 차단하는 방법에 관한 것이다.

Description

작용기화된 표면 상에서 비­특이적 단백질 결합을 차단하는 방법{METHOD FOR BLOCKING NON­SPECIFIC PROTEIN BINDING ON A FUNCTIONALIZED SURFACE}
본 발명은 표면 상에서 비-특이적 단백질 결합을 차단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 비-특이적 단백질 결합을 막기 위해 단당류, 이당류 (예컨대, 트레할로오스), 다당류 (예컨대, 덱스트란), 또는 올리고사카라이드에 의해 차단된 바이오센서 표면에 관한 것이다.
인간 게놈의 서열화를 완성함에 있어서, 분자 생물학의 다음으로 큰 난제 중 하나는 DNA에 의해 엔코딩된 수많은 단백질 표적이 다른 단백질, 소분자 약제학적 후보물질, 및 효소 및 억제제의 큰 숙주와 어떻게 상호작용하는지를 이해하는 것일 것이다 [참조, 예컨대 Pandey & Mann, "Proteomics to study genes and genomes," Nature, 405, p. 837-846, 2000; Leigh Anderson et al., "Proteomics: applications in basic and applied biology," Current Opinion in Biotechnology, 11, p. 408-412, 2000; Patterson, "Proteomics: the industrialization of protein chemistry," Current Opinion in Biotechnology, 11, p. 413-418, 2000; MacBeath & Schreiber, "Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination," Science, 289, p. 1760-1763, 2000; De Wildt et al., "Antibody arrays for high-throughput screening of antibody-antigen interactions," Nature Biotechnology, 18, p. 989-994, 2000]. 이 목적을 위해, 약제학적 발견, 단백질분석(proteomics), 및 진단에 있어서 높은 선택성으로 다수의 상이한 생체분자 상호작용을 동시에 동정하고/거나 정량할 수 있는 도구의 적용이 발견될 것이다. 추가로, 이러한 도구에 대하여 광범한 용도를 찾기 위해서는, 이들의 사용이 간단하고, 소유 및 구동이 저렴하며, 예를 들어 폴리누클레오티드, 펩티드, 소형 단백질, 항체 및 심지어 전체 세포를 포함할 수 있는 광범한 범위의 분석물에 적용될 수 있어야 한다.
표적 분자를 지지 표면상에 고정시키는 것은 생물학적 검정의 개발에 있어서 중요한 측면이 되어 왔다. 일반적으로, 생물학적 검정은 마이크로웰 플레이트, 현미경 슬라이드, 튜브, 실리콘 웨이퍼 또는 막의 표면 상에서 수행된다. 표적 분자는 표면 위에 있는 작용기 및 분자의 작용기 간에 커플링 반응을 이용하여 표면 상에서 공유적으로 고정된다. 유리 표면 상에서의 인기 있는 작용기화 기술 중 하나는 기능성 실란을 이용한 실란화이다 (Silane , Silicones , and Metal - Organics, p. 88, published by Gelest Inc., Tullytown, PA (2000)). 코닝 잉크 (Corning Inc.)에 의해 제조된 GAPS II 코팅된 슬라이드, 텔레켐 인터내셔널, 잉크 (TeleChem International, Inc (Sunnyvale, CA))에 의해 공급되는 아리이트(Arryit™) 슈퍼아민 슬라이드, 시그마 다이아그노틱스 (Sigma Diagnostics (St Louis, MO))에 의해 제공되는 실란-프렙(SILANE-PREP™) 아민-작용기화된 슬라이드 등이 현미경 슬라이드 포맷에서 이용가능한 생물학적 검정 표면들의 예이다. 슈퍼아민 슬라이드는 mm2 당 5 x 1012개 아민기를 제공할 것이 요구된다. 또 다른 예로서, 나일론 지지체 상에서 유도체화된 아미딘이었던 아미드기를 이용하여 하이브리드화 검정에서 DNA 및 RNA 프로브를 고정시켜 특이적 폴리누클레오티드 서열을 검출한다. 미국특허 4,806,546호 참조. 낼지 눙크 인터내셔널 (Nalge Nunc International (Rochester, NY))에 의해 제공되는 누클레오링크 (NucleoLink™) 및 코바링크 (CovaLink™)를 포함하는 마이크로웰 플레이트 및 튜브 포맷에서의 생성물은 고분자 지지체 표면상에서만 이용가능하다. 코바링크™ 생성물은 1 mm2의 표면적에 대하여 약 1012개의 기가 있는 이차 아민 표면을 제공한다. 이차 아민은 다수의 컨주게이션 반응에서 일차 아민 보다 낮은 반응성을 나타낸다. 참조 문헌[Loudon, G. Marc, Organic Chemistry, 3d ed., The Benjamin/Cummings Publishing, Redwood City, CA (1995)].
예를 들어, 실리콘, 유리 또는 금과 같은 재료의 표면을 화학적으로 작용기화하는 수많은 공지된 방법들이 있다. 표면 작용기화는 표면에 대한 확대된 적용을 종종 초래하여, 비-화학적으로 작용기화된 표면과 비교하여 표면에 대한 다양한 분자의 개선된 결합 및 분석이 가능해지므로 매우 흥미롭다. 표면 상에 있는 화학적 작용기화 코팅의 유형, 분량 및 품질은 특정 분석물에 결합되는 표면의 공유 강도 및 용량을 결정한다. 코팅 자체가 쉽게 세척되거나 다회 이용 후 분해되지 않는 것이 매우 바람직하다.
표면에 코팅된 알데히드-작용기 및 아민 작용기는 생체분자를 검출하기 위한 다능의 플랫폼을 제공하는 것으로 나타났다. 이러한 기들은, 예를 들어 정전기적 상호작용 또는 화학적 결합과 같은 물리적 인력을 통해 생체분자를 포획할 수 있다. 이러한 화학적 결합은 직접 또는 간적접으로 (즉, 화학적 링커를 통해) 달성될 수 있다. 수많은 동종이작용성 또는 이종이작용성 링커가 당 분야에 공지되어 있다. 표면을 아민으로 코팅시키는 단순한 방법으로 세정된 표면을 폴리리신에 직접 노출시킨다. 한 예가 마이크로어레이 프린팅에 이용되는 유리 슬라이드 표면이다. 표면을 아민으로 코팅시키는 것의 대안책은 아민-코팅 분자를 표면에 공유적으로 부착시키는 것이고, 예컨대 실란을 유리 위에 또는 티올을 금 위에 부착시키는 것이며, 둘 모두는 널리 공지되어 있다.
다양한 아미노알킬실란 시약을 이용하여 실리콘- 또는 유리-기재 표면을 아민기로 코팅할 수 있었다. 이러한 표면을 코팅하는데 이용되는 방법은 다양한 실란 시약, 용매, 및 상이한 물리적 처리 절차의 이용을 포함한다. 추가로, 표면 상에서 화학기의 존재를 조사하기 위해, 방사성, 비색, 형광성, XPS, FTIR, AFM 및 기타 방법을 포함하는 방법들을 이용하였다. 민감성은 표면 시험에 적합한 방법을 선택할 때 중요한 문제이다. 일반적으로 말해, 바이오센서 센서 표면을 화학적으로 코팅시키는 표준의 산업 공정도, 상기 바이오센서 상에서 특정 화학적 부분의 존재 또는 양을 검출하는 표준화된 시험 방법도 존재하지 않는다.
알데히드 결합 부위를 갖는 표면을 코팅시키는 한 가지 방법은 표면을 아민기로 작용기화하고 시아노보로히드라이드를 포함하는 알데히드 용액을 아민-작용기화된 표면에 첨가하는 것이다. 생성된 바이오센서를 단백질 및 다른 아민-함유 분 자를 결합시키는데 이용할 수 있다. 프린팅 어레이를 위한 일부 알데히드-개질된 슬라이드도 시판된다 (예컨대, CEL Associates 및 NoAb BioDiscoveries).
예를 들어, 올리고누클레오티드, 항체-항원 상호작용, 호르몬-수용체 상호작용, 및 효소-기판 상호작용을 포함하는 다양한 생체분자 복합체를 검출하기 위해 바이오센서가 개발되어 왔다. 일반적으로, 바이오센서는 고도로 특이적인 인식 엘리먼트 및 분자 인식 사건을 정량화가능한 시그널로 전환시키는 트랜스듀서의 두 부품으로 구성된다. 시그널 변환은 형광성, 간섭법(interferometry)(Jenison et al., "Interference-based detection of nucleic acid targets on optically coated silicon," Nature Biotechnology, 19, p. 62-65; Lin et al., "A porous silicon-based optical interferometric biosensor," Science, 278, p. 840-843, (1997)), 및 중량측정(gravimetry)(A. Cunningham, Bioanalytical Sensors, John Wiley & Sons (1998))을 포함하는 다수의 방법에 의해 달성되었다.
광학식-기재 변환 방법에서, 분석물을 형광성 화합물로 표지시킬 것을 요구하지 않는 직접 방법은 상대적인 검정의 단순성 및 소형 분자와 쉽게 표지되지 않는 단백질의 상호작용을 연구할 수 있기 때문에 흥미롭다. 직접 광학 방법은 표면 플라스몬 공명 (SPR)(Jordan & Corn, "Surface Plasmon Resonance Imaging Measurements of Electrostatic Biopolymer Adsorption onto Chemically Modified Gold Surfaces," Anal . Chem., 69:1449-1456 (1997)), 그레이팅 커플러 (grating couplers) (Morhard et al., "Immobilization of antibodies in micropatterns for cell detection by optical diffraction," Sensors and Actuators B, 70, p. 232- 242, (2000)), 타원법 (Jin et al., "A biosensor concept based on imaging ellipsometry for visualization of biomolecular interactions," Analytical Biochemistry, 232, p. 69-72, (1995)), 일시적 웨이브 장치 (Huber et al., "Direct optical immunosensing (sensitivity and selectivity)," Sensors and Actuators B, 6, p. 122-126, (1992)), 및 반사법 (Brecht & Gauglitz, "Optical probes and transducers," Biosensors and Bioelectronics, 10, p. 923-936, (1995))을 포함한다. 이러한 검출 방법들의 이론적으로 예상된 검출 한계를 결정하고 진단상의 관련된 농도 범위로 낮추어질 수 있는지를 실험에 의해 확인하였다.
알데히드-작용기화된 표면을 이용하여 마이크로어레이, 마이크로웰 플레이트 및 웰 슬라이드를 포함하는 여러 장치 포맷의 표면에 표적 분자를 고정하거나 포획하였다. 표적 분자는 표면에 고정된 후, 샘플을 분석할 수 있도록 특이적 분자 상호작용에 의해 알려지지 않은 샘플 중 분석물 분자에 결합될 수 있다. 그러나, 미반응된 알데히드기가 표적 분자-분석물 상호작용으로 분석물 분자를 표면에 화학적으로 부착시키는 능력을 지닌 채 여전히 반응성으로 남아 있어서 비-특이적인 결합을 초래한다. 수많은 화학적 및 생물학적 분자 및 세포가 심지어 표면 상에 생물학적 수용체와 같은 임의의 표적 분자 없이도, 소수성 상호작용 및/또는 전하 상호작용을 통해 대부분의 표면에 흡착되는 경향이 있다. 이러한 흡착도 원치 않는 비-특이적 결합을 야기한다. 비-특이적 결합은 특정 생체분자 상호작용에 기초한 생체분자 검출에 있어서 시그날-대-노이즈 비를 감소시킨다. BIND™ 센서를 포함하는 바이오센서의 알데히드 밀도가 급격하게 증가되었다. 알데히드 밀도가 증가함 에 따라, 비-특이적 결합이 현저한 수준에 도달하여, 검출 시그널이 분석물로부터 온 것인지 또는 잘못된 판독으로부터 온 것인지를 결정하는데 어려움을 초래한다. 따라서, 비-특이적 결합의 감소는 매우 흥미로운 것이다. 아민-작용기화된 표면에 대한 비-특이적 결합을 감소시키는 것도 매우 흥미롭다.
예로서, 스트렙타비딘과 같은 표적 분자를 바이오센서 표면에 고정시킬 수 있다. 바이오센서는 결합 사건에 의해 생성된 시그널에서의 변화를 측정함에 의해 리간드로서도 공지된 다른 단백질 또는 소 분자의 표적 분자에 대한 결합을 측정할 수 있다. 이러한 시그널은, 예를 들어 광학적, 전기적 또는 가시적일 수 있다. 그러나, 표적 분자를 함유하는 바이오센서 표면은 표면에 대한 단백질 또는 소형 분자의 비-특이적 결합을 감소시키고 단지 표적 분자와의 특정 상호작용만이 허용되도록 차단될 필요가 있다. 이러한 특정 상호작용의 예로는 스트렙타비딘과 스트렙타비딘에 대한 특정 리간드인 비오틴의 상호작용이 있다. 차단은 통상적으로 슈퍼블록® 차단 완충제, 씨(Sea) 블록 차단 완충제, 브록케리트(Blockerit), 블록커 카신(Blocker Casin), 피쉬 스킨 젤라틴, 및 BSA, 예컨대 1% BSA+트윈®과 같은 시판되는 임의의 차단제를 이용하여 달성되었다. 이러한 차단제는 양극성이며, 다른 하나에 대해 하나의 원치 않는 인력만을 이용할 수 있다. BIND™ 센서 플레이트와 같은 스트렙타비딘-코팅된 바이오센서를 차단하려는 이전의 시도는, 스트렙타비딘에 결합되는 감소된 비오틴과 관련하여 측정된 대로, 이러한 시판되는 차단제에 의한 간섭으로 인해 스트렙타비딘의 활성을 감소시켰다. 이러한 간섭은 부분적으로 시판되는 차단제에 존재하는 단백질 (또는 펩티드)와 같은 생물학적 물질의 존재 때문일 수 있었다. 따라서, 이러한 문제를 해결하고자 하는 요구가 당 분야에 여전히 남아 있다.
발명의 개요
본 발명의 일 구체예는 표면 상에서 비-특이적 결합을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 표면은 알데히드-작용기화되거나, 아민-작용기화되거나 또는 이들의 조합이다. 상기 방법은 표면을 당 분자로 처리하여, 표면 상의 비-특이적 결합을 감소시키는 것을 포함한다. 당 분자는 이당류를 포함할 수 있다. 이당류는 트레할로오스 분자일 수 있거나 트레할로오스 분자를 포함할 수 있다. 당 분자는 덱스트란 설페이트이거나 이를 포함할 수도 있다. 표면은 비색 공명 반사 바이오센서 표면과 같은 바이오센서 표면일 수 있다. 당 분자는 단당류, 이당류, 다당류, 삼당류, 사당류, 오당류 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 표면은 아민-작용기화된 표면일 수 있다. 당 분자는 락토오스, 글리세르알데히드, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 당 분자는 트레할로오스 및 락토오스를 포함한다. 당 분자는 트레할로오스 및 글리세르알데히드를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 표면-부착된 알데히드기에 결합된 다수의 특이적 결합 물질 및 표면-부착된 알데히드기에 결합된 다수의 당 분자를 포함하는 바이오센서를 제공한다. 당 분자는 이당류이거나 이를 포함할 수 있다. 이당류는 트레할로오스 분자일 수 있다. 대안적으로, 당 분자는 덱스트란이거나 이를 포함할 수 있다. 특이적 결합 물질은 단백질일 수 있다. 단백질은 스트렙타비딘을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 또 다른 구체예는 표면-부착된 알데히드기에 결합된 특이적 결합 물질 및 당 분자를 포함하는 저장 용액을 갖는 바이오센서를 함유하는 패키지를 제공한다.
따라서, 본 발명은 양극성 차단제와 같이 원치 않는 인력을 제공하지 않는 높은 친수성, 비-하전된 특성을 갖는 소 분자를 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1A 및 1B는 비색 공명 반사 바이오센서에 이용된 광학 그레이팅 구조의 다양한 구체예의 개략도이다. n기판은 기판 재료를 나타낸다. n1은 커버층의 굴절율을 나타낸다. n2는 1- 또는 2-차원 그레이팅의 굴절율이다. nbio는 하나 이상의 특이적 결합 물질의 굴절율을 나타낸다. t1은 커버층의 두께이다. t2는 그레이팅의 두께이다. tbio는 하나 이상의 특이적 결합 물질의 층의 두께를 나타낸다.
도 2는 스트렙타비딘(SA)-고정된 웰, 또는 5% 트레할로오스 용액만을 함유하는 대조 웰에 첨가된 5% 트레할로오스 용액으로부터 초래된 시프트(shift)를 nm으로 나타낸다. 고정 동안의 SA 농도는 0.05 mg/ml 또는 0.2 mg/ml이었다.
도 3은 스트렙타비딘(SA)-고정된 웰에 이어 10% 또는 100% FBS에 첨가된 5% 트레할로오스 용액으로부터 초래된 시프트를 nm으로 나타낸다. 고정 동안의 SA 농도는 0.05 mg/ml 또는 0.2 mg/ml이었다.
도 4는 5% 트레할로오스로 차단시킨 후 HSA에 대한 와파린 결합으로 초래된 표준화된 피크 파장 값(PWV)을 나타낸다.
도 5는 5% 트레할로오스로 차단시킨 후 카르보닉 탈수효소에 대한 CBS 결합으로부터 초래된 표준화된 피크 파장 값(PWV)을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
바이오센서의 작용기화된-코팅된 표면은 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 누클레오티드, 폴리누클레오티드, 소 분자, 소형 유기 분자, 비오틴, 세포, 분획화된 세포, 세포 추출물, 세포 분획, 세포의 일부, 및 예를 들어 단백질분석, 게놈분석, 제약, 약물 발견 및 진단 연구의 분야에서 관심있는 기타 화학적 또는 생물학적 분자와 같은 화학적 또는 생물학적 분자를 결합시키는데 유용하다. 예를 들어, 바이오센서는 관심있는 화학적 또는 생물학적 분자를 결합시키기 위해 알데히드-코팅되거나 아민-코팅될 수 있다.
본원에서 사용된 "알데히드"는 화학식 -CHO를 갖는 분자를 언급하고 "아민"은 화학식 -NH2를 갖는 일차 아민 및 이차 아민 둘 모두를 언급한다. 알데히드 및 아민은 직접 또는 결합 분자를 통해 표면, 예컨대 바이오센서의 표면에 부착될 수 있다. 아민-코팅된 표면 또는 아민-작용기화된 표면은 직접 또는 간접적으로 화학적 변형, 예컨대 특이적 결합 물질의 부착에 이용될 수 있는 아민기를 제공하는 표면을 언급한다. 알데히드-코팅된 표면 또는 알데히드-작용기화된 표면은 직접 또는 간접적으로 화학적 변형, 예컨대 특이적 결합 물질의 부착에 이용될 수 있는 알데히드기를 제공하는 표면을 언급한다. 간접 부착은 당 분야에 널리 공지된 화학적 링커를 통한 화학적 또는 생물학적 분자의 부착을 언급한다.
본원에서 사용된 "표면"은 특이적 결합 물질을 직접 또는 간접적으로 결합시킬 수 있는 임의의 표면을 언급한다. 예를 들어, 표면은 표면에 직접 부착된 작용성 아민 또는 작용성 알데히드기를 함유하거나, 작용기는 링커 분자에 의해 표면에 부착될 수 있다. 표면은 작용기화되거나 작용기화되지 않을 수 있다. 표면은 이에 제한되는 것은 아니나 플라스틱, 유리 또는 금일 수 있다. 이러한 표면은 이에 제한되는 것은 아니나 센서 표면, 예컨대 바이오센서 표면을 포함한다.
또한, 본원에서 사용된 당 분자는 단당류, 이당류, 다당류 및 올리고사카라이드를 언급한다. 이당류, 다당류 또는 올리고사카라이드는 이에 제한되는 것은 아니나 트레할로오스, 락토오스, 말토오스, 말토트리오스, 팔라티노오스, 락투로오스, 수크로오스, 덱스트란, 라피노오스, 스타키오스, 베르바스코오스이다. 트레할로오스는 α-1,1 결합에 의해 결합된 두 글루코오스 분자로 이루어진 이당류이다. 참조 문헌[Higashiyama, Pure Appl . Chem., 74(7): 1263-1269 (2002)].
바이오센서 그레이팅은 높은 굴절율을 갖는 물질, 예를 들어 산화탄탈 또는 다른 적합한 물질에 이어, 임의로 산화규소의 오버코트에 의해 코팅될 수 있다. 플라스틱의 넓은 표면적 위에 고-민감성 바이오센서를 제공하는 능력은 미세역가 플레이트 및 마이크로어레이 슬라이드와 같은 일회용 검정 포맷의 넓은 범위에 바이오센서가 혼입되는 것을 가능하게 한다. 바람직하게는, 바이오센서가 바닥없는(bottomless) 미세역가 플레이트의 바닥, 마이크로어레이 또는 미세유동 장치로 혼입될 수 있고, 바이오센서 플레이트는 예를 들어 다수의 단백질-단백질 또는 표적 분자-리간드 결합 검정을 동시에 수행하도록 이용될 수 있다. 바닥없는 미세역가 플레이트는 예를 들어 6, 8, 12, 24, 48, 96, 384, 1536, 또는 3456개 웰을 지닐 수 있다. 플라스틱-기판 바이오센서의 검출 민감성은 이전에 보고된 유리-기판 바이오센서 보다 양호하거나 동등한 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 플라스틱-기재 바이오센서는 대량-생산될 수 있다; 바이오센서 어레이, 예컨대 96-웰 또는 384-웰의 규모를 늘려 대량-생산할 수 있다.
플라스틱-기재 바이오센서 또는 플라스틱 바이오센서는 플라스틱 그레이팅 또는 센서 표면, 기판으로서도 언급되는 그레이팅용 플라스틱 지지체, 및/또는 기타 플라스틱 부품을 함유하는 바이오센서를 언급한다. 이러한 바이오센서는 바이오센서의 표면을 작용기화하는데 이용되는 반응 조건의 결과로서 분해되기 쉬울 수 있다. 광학 특성을 지니는 플라스틱이 바람직하다. 플라스틱은 임의의 미립자 없이 맑고 투명할 수 있으며 매끄럽고 평평한 마감을 제공할 수 있다. 예로서, 바이오센서는 아크릴 중합체-그레이팅 층을 지지하는 폴리에스테르 기판을 포함할 수 있다. 추가의 예로서, 바이오센서는 에폭시 그레이팅 층을 지지하는 폴리카르보네이트 기판을 포함할 수 있다. 플라스틱의 다른 비제한적인 예로는 폴리에스테르 및 폴리우레탄이 있다. 그러나, 바이오센서에 이용되는 광학 품질을 제공하는 임의의 플라스틱을 이용할 수 있다. 또 다른 예에서, 그레이팅 표면은 플라스틱이어서, 플라스틱이 기판 및 그레이팅 둘 모두로서 기능한다. 상기 바이오센서는 바이오센서의 표면을 작용기화하는데 당 분야에서 통상적으로 이용되는 반응 조건의 결과로서 분해되기 쉬워진다. 그러나, 플라스틱-기재 바이오센서의 분해를 야기하지 않는 작용기화 방법이 있다. 참조, 예컨대 2004년 11월 11일 출원된 미국특허출원 10/983,511호, 이의 전체가 참조로서 포함된다. 당업자는 본 발명의 방법이 유리-기재 바이오센서에도 이용될 수 있음을 이해할 것이다.
예로서, 바이오센서는 BIND™ 센서 플레이트일 수 있다. BIND™ 시스템은 화학적 및 생물학적 분자 상호작용의 비-표지 검출이 가능하다. BIND™ 시스템은BIND™ 리더 및 96- 또는 384-웰 마이크로플레이트 바이오센서를 포함할 수 있다. BIND™ 시스템은 바이오센서 표면 상에서 결합의 민감한 측정을 제공하는 광학 효과를 이용한다. 바이오센서는 비구조화된 광학 그레이팅일 수 있고, 이것은 산업 표준 포맷에서 마이크로웰 플레이트에 혼입된다. BIND™ 시스템은 다른 것들 중에서도 단백질, 펩티드 및 세포를 이용한 화학적 및 생물학적 분자 상호작용의 측정을 가능하게 한다. BIND™ 시스템은 항원과의 친화력 랭킹 및 세포를 이용한 기능적 스크리닝, 펩티드 에피토프 맵핑 및 면역원성 스크리닝에 이용될 수 있다.
알데히드-작용기화된 표면 또는 아민-작용기화된 표면은 특이적 결합 물질이 부착될 수 있는 코팅을 지니는 표면을 언급한다. 예를 들어, 알데히드-작용기화된 표면은 특이적 결합 물질이 부착될 수 있는 높은 굴절율 물질의 코팅을 지니는 바이오센서의 그레이팅 표면을 언급할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 높은 굴절율 물질에는, 예를 들어 질화규소, 황화아연, 이산화티탄 또는 산화탄탈이 있다.
임의로, 산화규소층은 표면 작용기화 이전에 높은 굴절율 물질 위에 코팅될 수 있다. 높은 굴절율 물질 또는 산화규소가 화학적 및 생물학적 분자의 부착을 위해 알데히드-작용기 또는 아민-작용기로 작용기화될 수 있다. 높은 굴절율 물질로 코팅된 그레이팅 표면을 알데히드 작용기화 또는 아민 작용기화하는데 이용된 시약은 그레이팅 물질 또는 기판 물질이 플라스틱이든 또는 에폭시든 간에 이들과 양립할 수 있는 것이 바람직하다. 그레이팅을 높은 굴절율 물질로 코팅하여 표면을 알데히드 작용기화 또는 아민 작용기화하는데 이용된 시약으로부터 그레이팅 물질의 일부 보호를 제공하는 한편, 그레이팅의 반대면은 작용기화 공정 동안 여전히 노출되어 있을 수 있다. 마찬가지로, 그레이팅이 기판에 결합되면, 기판의 반대면이 작용기화 시약에 노출될 수 있다. 또한, 그레이팅 표면 상에서 높은 굴절율 물질의 코팅에서의 결함이 노출된 그레이팅 표면의 상부측 영역에 초래될 수 있다. 따라서, 다양한 층들의 물질 및 층들 간 부착이 작용기화 및 임의의 후속 검정 공정 동안 불완전한 채로 남아 있어야 한다.
바이오센서의 알데히드-작용기화된 표면 또는 아민-작용기화된 표면은 플라스틱-기재 바이오센서 뿐만 아니라 플라스틱 기재가 아닌 바이오센서도 언급한다. 예를 들어, 바이오센서는 산화티탄-코팅된 센서 또는 높은 굴절율을 지니는 추가 센서, 낮은 흡수율의 코팅 또는 윗층과 기판 물질 구성에 대한 커버링을 포함한다. 추가로, 모든 다양한 물리적 형태의 이산화규소 또는 낮은 흡수율 및 낮은 굴절율을 지니는 기타 물질이 고려된다. 이러한 바이오센서는 예시적인 것이며 알데히드-작용기화된 표면 또는 아민-작용기화된 표면을 지니는 바이오센서를 제한하려는 것이 아니다.
서브파장 구조화된 표면( SWS ) 바이오센서
본 발명의 일 구체예에서, 서브파장 구조화된 표면(SWS)을 이용하여 특이적 결합 물질 또는 결합 파트너 또는 둘 모두와 같은 화학적 또는 생물학적 물질의 상호작용을 높은 민감성으로 탐지하는데 이용될 수 있는 특정 파장에서 날카로운 광학적 공명 반사를 생성한다. 비색 공명 반사 바이오센서 표면이 특이적 결합 물질에 대한 표면-결합 플랫폼으로서 기능한다.
서브파장 구조화된 표면은 박막 코팅의 영향을 모방할 수 있는 회절 옵틱의 비통상적인 유형이다. (Peng & Morris, "Resonant scattering from two-dimensional gratings," J. Opt . Soc . Am . A, Vol. 13, No. 5, p. 993, May; Magnusson, & Wang, "New principle for optical filters," Appl . Phys . Lett., 61, No. 9, p. 1022, August, 1992; Peng & Morris, "Experimental demonstration of resonant anomalies in diffraction from two-dimensional gratings," Optics Letters, Vol. 21, No. 8, p. 549, April, 1996). SWS 구조는 그레이팅 기간이 입사광의 파장 보다 작아서 반사되고 전달된 영차(zeroth order) 이외에 어떠한 회절 차수도 전파되는 것을 허용하지 않는 표면-부조(relief), 1-차원 또는 2-차원 그레이팅을 함유한다. 전체가 참조로서 포함된 미국특허출원 10/059,060 및 10/058,626 참조. SWS 표면 좁은밴드(narrowband) 필터는 그레이팅 그루브를 메우는 커버층과 기판층 사이에 샌드위치된 1-차원 또는 2-차원 그레이팅을 포함할 수 있다. 임의로, 커버층을 이용하지 않는다. 그레이팅 영역의 효과적인 굴절율이 기판 또는 커버층 보다 클 때, 도파 방식 공명 효과가 발생한다. 필터가 적합하게 고안되는 경우, 1-차원 또는 2-차원 그레이팅 구조가 좁은 밴드의 파장에서 선택적으로 빛에 연결된다. 빛은 산란되고, 전방- 및 후방-전파 영차 빛에 연결된다. 도파 방식 공명 효과는 임의의 광양자가 구조체로 들어가는 지점으로부터 약 3 미크론의 매우 국한된 영역 상에서 일어난다. 측 방향에서 도파 방식의 전파가 지지되지 않기 때문에, 도파관이 생성되지 않는다.
이 구조체의 반사되거나 전달된 컬러는 특이적 결합 물질 또는 결합 파트너 또는 둘 모두와 같은 분자를 커버층의 상부면 또는 1-차원 또는 2-차원 그레이팅 표면에 첨가함에 의해 개질될 수 있다. 첨가된 분자는 구조체를 통한 입사 복사선의 광학로 길이를 증가시키므로 최대 반사율 또는 전달율이 발생하는 파장을 변경시킨다.
일 구체예에서, 바이오센서는 백색광으로 조명될 때 단일 파장만을 반사하도록 고안된다. 특이적 결합 물질 또는 표적 분자, 예컨대 화학적 및 생물학적 분가가 바이오센서의 표면에 부착될 때, 반사된 파장(컬러)은 그레이팅에 연결되는 빛의 광학로의 변경으로 인해 전위된다. 특이적 결합 물질을 바이오센서 표면에 연결시킴에 의해, 상보적인 결합 파트너 분자가 여하한 종류의 형광성 프로브 또는 입자 표지 없이 검출될 수 있다. 검출 기술은 예를 들어 ~0.1 nm 두께의 단백질 결합의 변화를 해소할 수 있어서, 유체에 침지되거나 건조된 바이오센서 표면으로 수행될 수 있다.
검출 시스템은, 예를 들어 보통의 입사각에서 바이오센서의 작은 지점을 조명하는 광원, 예를 들어 섬유 옵틱 프로브, 및 또한 보통의 입사각에서 예를 들어 두 번째 섬유 옵틱 프로브를 통해 반사광을 수집하는 분광계로 구성된다. 여기/검출 시스템 및 바이오센서 표면간에 어떠한 물리적 접촉도 일어나지 않으므로, 어떠한 특수한 커플링 프리즘이 요구되지 않으며 바이오센서는 예를 들어 미세역가 플레이트 및 마이크로어레이 슬라이드를 포함하는 보통 이용되는 임의의 검정 플랫폼에 용이하게 적용될 수 있다. 단일 분광계 판독을 수 밀리초가 지나 수행할 수 있으므로, 바이오센서 표면 상에서 동시에 발생하는 다수의 분자 상호작용을 신속하게 측정하고 실시간으로 반응 동력학을 모니터링할 수 있다.
이러한 기술은 다수의 생체분자 상호작용을 동시에 측정할 때, 특히 분자 표지가 연구 중 분자의 작용성을 변경시키거나 억제할 때, 적용에 있어서 유용하다. 단백질 표적을 지니는 약제학적 화합물 라이브러리의 고-처리량 스크리닝, 및 단백질분석을 위한 단백질-단백질 상호작용의 마이크로어레이 스크리닝은 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 제공되는 민감성 및 처리량을 요구하는 적용들의 예이다.
SWS 구조체 예의 개략도를 도 1에 도시한다. 도 1에서, n기판은 기판 물질을 나타낸다. n1은 임의의 커버층의 굴절율이다. n2는 1- 또는 2-차원 그레이팅의 굴절율이다. Nbio는 하나 이상의 특이적 결합 물질의 굴절율이다. t1은 1- 또는 2-차원 그레이팅 구조 위의 커버층의 두께를 나타낸다. t2는 그레이팅의 두께이다. tbio는 하나 이상의 특이적 결합 물질 층의 두께를 나타낸다. 일 구체예에서, n2>n1이다 (도 1 참조). 층 두께 (즉, 커버층, 하나 이상의 특이적 결합 물질 또는 그레이팅)는 상부면 상에서 추가의 분자에 대한 공명 파장 민감성을 달성하도록 선택된다. 그레이팅 기간은 요망되는 파장에서 공명을 달성하도록 선택된다. 구조체는 유리 및 질화규소 유전체 물질로 제조될 수 있다. 대안적으로, 구조체는 적합한 유전체 커버층을 갖는 엠보싱 플라스틱으로 형성될 수 있다.
본 발명의 일 구체예는 SWS 바이오센서를 제공한다. SWS 바이오센서는 1-차원 또는 2-차원 그레이팅, 그레이팅을 지지하는 기판층 및 기판층과 마주보고 있는 그레이팅의 표면 상에 고정된 하나 이상의 특이적 결합 물질을 포함한다.
1-차원 또는 2-차원 그레이팅은 예를 들어 황화아연, 이산화티탄, 산화탄탈 및 질화규소를 포함하는 물질로 이루어질 수 있다. 그레이팅의 단면 프로필은 임의의 주기적으로 반복되는 기능, 예를 들어 "방형파(square-wave)"를 포함할 수 있다. 그레이팅은 연속적인 평행선 정사각형, 원, 타원, 삼각형, 사다리꼴, 사인 곡선, 타원체, 직사각형 및 육변형으로 구성된 군으로부터 선택된 반복적인 패턴의 형상으로 이루어질 수 있다. 사인 단면 프로필이 플라스틱과 같은 연질 물질로의 그레이팅 형상의 엠보싱을 요구하는 응용물을 제조하거나, 에폭시와 같은 물질로 그레이팅 표면을 모사(replicating)하는데 바람직하다. 본 발명의 일 구체예에서, 그레이팅의 깊이는 약 0.01 미크론 내지 약 1 미크론이고 그레이팅의 주기는 약 0.01 미크론 내지 약 1 미크론이다.
SWS 바이오센서는 1-차원 선형 그레이팅 표면 구조, 즉 일련의 평행선 또는 그루브도 포함할 수 있다. 1-차원 선형 그레이팅은 도파 방식 공명 필터 효과를 제공하기에 충분하다. 2-차원 그레이팅이 센서 표면의 평면을 가로질러 둘 모두가 서브파장인 두 측면 방향의 특징을 지니는 한편, 1-차원 그레이팅의 단면은 한 측면 방향으로만 서브파장이며, 긴 치수가 공명 그레이팅 효과의 파장 보다 클 수 있다. 1-차원 그레이팅 바이오센서는 1-차원 그레이팅의 표면 구조를 갖는 보다 낮은 굴절율 물질 층 위에 박막으로서 코팅된 높은 굴절율 물질을 포함할 수 있다. 대안적으로, 1-차원 그레이팅 바이오센서는 낮은 굴절율 물질 기판을 포함할 수 있고, 그 위에 높은 굴절율 박막 물질이 1-차원 그레이팅의 표면 구조로 패턴화되어 있다. 낮은 굴절율 물질은 유리, 플라스틱, 중합체 또는 경화된 에폭시일 수 있다. 높은 굴절율 물질은 낮은 굴절율 물질 보다 큰 굴절율을 지녀야 한다. 높은 굴절율 물질은, 예를 들어 황화아연, 질화규소, 산화탄탈, 이산화티탄 또는 산화주석인듐일 수 있다.
SWS 구조체는, 예를 들어 표준 현미경 슬라이드와 동일한 크기의 그레이팅 표면을 쌓고 고 친화력 화학적 수용체 시약의 미세점적을 그레이팅 표면상의 x-y 격자 위치로 정위시킴에 의해 마이크로어레이 플랫폼으로서 이용될 수 있다. 대안적으로, SWS 구조체는 표준 미세역가 플레이트와 동일한 크기로 구축되고 전체 플레이트의 바닥면으로 혼입될 수 있다. 화학적으로 작용기화된 표면, 예를 들어 마이크로어레이/미세역가 플레이트를 분석물과 같은 분자에 노출시킬 때, 분자는 높은 친화력을 갖는 부위에 우선적으로 끌어 당겨질 것이다. 결과적으로, 일부 표면 부위가 추가의 분자를 수집하고, 다른 표면 부위는 그렇지 않다. 추가의 물질을 끌어 당기는 표면 부위는 개별적인 각 마이크로어레이/미세역가 표면 부위와 같은 개별적인 각 표면 부위내에서 공명 파장의 시프트를 측정함에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 예를 들어 샘플 중 분석물과 같은 결합된 분자의 양 및 수용체 시약 및 분자간 화학적 친화력은 공명 파장의 시프트 정도를 측정함에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 제1 분자와 제2 시험 분자의 상호작용을 검출할 수 있다. 상기 개시된 SWS 바이오센서를 이용한다. 따라서, 바이오센서는 1- 또는 2-차원 그레이팅, 1- 또는 2-차원 그레이팅을 지지하는 기판층 및 임의로 커버층을 포함한다. 상기 개시된 대로, 바이오센서가 조명될 때 공명 그레이팅 효과가 반사된 복사선 스펙트럼상에 생성되며, 그레이팅의 깊이 및 주기는 공명 그레이팅 효과의 파장 보다 작다.
제1 분자와 제2 시험 분자의 상호작용을 검출하기 위해, 제1 및 제2 분자의 혼합물을 바이오센서 상의 별개의 위치에 적용시킨다. 별개의 부위는 바이오센서 상의 한 스폿(spot) 또는 웰일 수 있거나 바이오센서 상의 넓은 영역일 수 있다. 제1 분자와 제3 대조 분자의 혼합물도 바이오센서 상의 별개의 위치에 적용시킨다. 바이오센서는 상기 개시된 동일한 바이오센서일 수 있거나, 제2의 바이오센서일 수 있다. 바이오센서가 동일한 바이오센서인 경우, 제2의 별개의 위치를 제1 분자 및 제3 대조 분자의 혼합물 용으로 이용할 수 있다. 대안적으로, 동일한 별개의 바이오센서 위치를 제1 및 제2 분자를 바이오센서로부터 세척한 후에 이용할 수 있다. 제3 대조 분자는 제1 분자와 상호작용하지 않고 제1 분자와 대략 동일한 크기이다. 바이오센서 또는 바이오센서들의 별개의 위치로부터의 빛의 반사된 파장의 시프트를 측정한다. 제1 분자 및 제2 시험 분자를 갖는 별개의 위치로부터의 빛의 반사된 파장의 시프트가 제1 분자 및 제3 대조 분자를 갖는 별개의 위치로부터의 반사된 파장의 시프트 보다 클 경우, 제1 분자 및 제2 시험 분자는 상호작용한다. 상호작용은, 예를 들어 핵산 분자의 하이브리드화, 항체 또는 항체 단편의 항원으로의 특이적 결합, 및 폴리펩티드의 결합일 수 있다. 제1 분자, 제2 시험 분자 또는 제3 대조 분자는, 예를 들어 핵산, 폴리펩티드, 항원, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 단쇄 항체 (scFv), F(ab) 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 소형 유기 분자, 세포, 바이러스 및 세균일 수 있다.
아민- 작용기화된 바이오센서
높은 굴절율 물질, 예컨대 질화규소 층을 플라스틱 표면과 같은 표면 상에 코팅시킨 후, 높은 굴절율 물질의 표면에 아민-작용기를 부착시킴에 의해 센서로서 이용되는 장치를 제조한다. 플라스틱-기재 바이오센서는 그 표면에 아민 작용기를 제공하는 화학적 변형 동안에 분해될 수 있다 (즉, 센서의 구조 또는 조성 변화). 이러한 분해를 피하기 위해, 바이오센서의 아민 표면 작용기화 공정은 바이오센서의 플라스틱과 양립할 수 있는 시약을 이용할 수 있다. 높은 굴절율 물질을 플라스틱 바이오센서의 그레이팅 표면에 침착시킨 후, 센서를 저장하거나 작용기화에 직접 이용할 수 있다. 센서를 아민 작용기화 절차 이전에 습윤 (예컨대, 용매와 같은 액체를 이용한 세정) 또는 건식 (예컨대, UV 오존 또는 플라즈마) 방법을 이용한 세정 단계로 처리할 수 있다. 일 구체예에서, 아민 작용기화 절차는 (a) 플라스틱 비색 공명 바이오센서를 알코올 실란액에 노출시킨 다음, (b) 노출된 플라스틱 비색 공명 바이오센서를 알코올로 세정하는 것을 포함한다. 바이오센서를 건조시킬 때, 그레이팅 표면은 아민 작용기, 즉 -NH2 기를 함유한다.
일 구체예에서, 실란액은 3-아미노프로필트리에톡시실란 및 알코올, 예컨대 에탄올 또는 다른 적합한 저분자량 알코올을 포함한다. 유사하게 임의의 적합한 저분자량 알코올을 바이오센서를 세정하는데 이용할 수 있다. 플라스틱 바이오센서를 아민으로 코팅시키는 예는, 먼저 센서를 3-아미노프로필트리에톡시실란 및 에탄올을 함유하는 용액에 노출시킨 다음, 센서를 에탄올에서 잠시 세정하고, 마지막으로 센서를 건조시키는 것이다. 에탄올에서 3-아미노프로필실란의 농도는, 3-아미노프로필실란의 농도가 에탄올 중 약 1% 내지 약 15%가 되도록 조정될 수 있다.
추가로, 에탄올은 약 90% - 100%일 수 있다 (부피/부피, 물로 조정됨). 건조 단계는, 예를 들어 약 70℃의 오븐에서 10분 동안 수행될 수 있다. 건조는, 온도가 센서 분해가 일어나지 않도록 선택되는 한, 보다 높은 온도에서 수행될 수 있다.
수많은 적합한 용매, 농도, 반응 시간 및 경화/인큐베이션 시간이 이용될 수 있다. 변형은 표면 유형, 실란 시약 (기타 실란, 예컨대 3-아미노프로필트리메톡시실란 등), 실란 농도, 코팅 용매 또는 용매의 조합물 (예컨대, 에탄올 및 물), 코팅 반응 시간, 세정 용매 또는 용매의 조합물 (에컨대, 에탄올 및 물), 경화 시간 및 경화 온도를 포함한다.
표면 처리
본 발명의 일 구체예에서, 센서 표면은 화학 처리에 의해 개질될 수 있다. 예를 들어, 표면을 용액에 침지시킴에 의해 표면을 용액으로 처리할 수 있다. 대안적으로, 화학적 증기 또는 분무 침착을 포함하는 기체상 처리도 표면을 코팅하는데 이용될 수 있다. 기체상 처리를 이용하여 기하하적으로 평면이 아닌 표면의 공형 코팅을 확보할 수 있다. 이러한 코팅을 표면을 실란화하는 단계에 이용하거나 기타 유기 물질을 표면에 첨가하기 위해 이용할 수 있다. 표면을 처리할 수 있는 다른 방법이 당업자에 의해 이해될 것이다.
플라스마에 의한 처리는 일반적으로 기체상 코팅 공정 이전에 이용될 수 있다. 플라스마 처리는 표면 위의 대부분의 오염물질을 제거하고 표면 일부를 활성화시켜 후속하는 기체상 코팅 공정의 부착을 개선시킬 수 있다.
기체상 코팅 공정을 이용하여 화학적 기능을 부여하고 중합체 필름의 표면에 흡착되는 수분, 유기 오염물질. 및 저분자량 물질을 최소화할 수 있다. 기체상 코팅은 표면의 균일한 처리, 중합체 필름을 처리할 때 후부(backside) 처리 없음, 다공성 물질을 처리할 경우 작은-구멍 부재를 포함하나 이로 제한되지 않는 이점을 지닌다. 본 발명에서 유용한 이러한 코팅 서비스에는 시그마 테크놀로지스 (Tucson, AZ), 4th 스테이트 (Belmont, CA), 일드 엔지니어링(Yield Engineering) (San Jose, CA), 에이레 사이언티픽(Erie Scientific) (Portsmouth, NH), 및 AST 프로덕츠 (advanced surface technologies) (Billerica, MA)에 의해 제공되는 서비스가 있으나 이로 제한되지 않는다.
음향 바이오센서
본 발명의 또 다른 구체예에서, 음향 바이오센서를 이용한다. 음향 바이오센서는 분자 및/또는 분석물의 결합의 결과로서 침착된 질량에 있어서의 변화에 의해 야기된 바이오센서 표면 상에서의 공명 진동 빈도의 변화를 검출함에 의해 표면에 공유적으로 부착되는 화학적 또는 생물학적 분자 또는 표적 분자에 대한 분자, 예컨대 분석물의 결합을 측정한다. 공명 진동 빈도는, 예를 들어 압전저항 장치, 기계적 진동기, 예컨대 마이크로머신 캔틸레버, 막 또는 튜닝 포크, 또는 표면 음향파 진동기를 이용하여 측정될 수 있다.
전자 바이오센서
본 발명의 또 다른 구체예에서, 전자 바이오센서를 이용한다. 전자 바이오센서는 분자 및/또는 분석물의 결합의 결과로서 침착된 질량에 있어서의 변화에 의해 야기된 바이오센서 표면 상에서의 저항성의 변화, 예를 들어 DC 또는 AC, 저 또는 고 주파수, 전기용량, 또는 인덕턴스를 검출함에 의해 표면에 공유적으로 부착되는 화학적 또는 생물학적 분자 또는 표적 분자에 대한 분자, 예컨대 분석물의 결합을 측정한다.
특이적 결합 물질 및 결합 파트너
하나 이상의 특이적 결합 물질 또는 표적 분자를, 예를 들어 물리적 흡착 또는 화학적 결합에 의해 센서 표면과 같은 표면에 고정시킬 수 있다. 특이적 결합 물질은, 예컨대 센서의 표면에 첨가되는 결합 파트너에 특이적으로 결합될 수 있다. 특이적 결합 물질은 이의 결합 파트너에 특이적으로 결합되나, 바이오센서의 표면에 첨가된 다른 결합 파트너에 실질적으로 결합되지 않는다. 예를 들어, 특이적 결합 물질이 항체이고 이의 결합 파트너가 특정 항원일 때, 항체는 특정 항원에 특이적으로 결합되나 다른 항원에는 실제로 결합되지 않는다. 특이적 결합 물질은, 예를 들어 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항원, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 단쇄 항체 (scFv), F(ab) 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 소분자, 소형 유기 분자, 비오틴, 세포, 세포 추출물, 세포의 일부, 바이러스, 세균, 중합체, 펩티드 용액, 단일- 또는 이중-가닥 DNA 용액, RNA 용액, 조합된 화학 라이브러리로부터의 화합물을 함유하는 용액, 또는 생물학적 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은, 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 위장 분비물, 조직 또는 종양의 균질화액, 윤활액, 대변, 타액, 가래, 낭액, 양막액, 뇌척수액, 복강액, 폐 세척액, 정액, 림프액, 눈물 또는 전립선액일 수 있다.
바람직하게는, 하나 이상의 특이적 결합 물질을 바이오센서 위에서 별개 부위의 마이크로어레이로 정렬한다. 특이적 결합 물질의 마이크로어레이는 본 발명의 바이오센서 표면 위에 하나 이상의 특이적 결합 물질을 포함하여, 표면이 각각 상이한 특이적 결합 물질 또는 다른 양의 특이적 결합 물질을 지니는 다수의 별개 부위를 함유하도록 한다. 예를 들어, 어레이는 1, 10, 100, 1,000, 10,000 또는 100,000개의 별개의 부위를 포함할 수 있다. 하나 이상의 특이적 결합 물질이 통상적으로 x-y 좌표의 규칙적인 격자 패턴에 배치되기 때문에 이러한 바이오센서 표면을 마이크로어레이라 부른다. 그러나, 본 발명의 마이크로어레이는 임의의 유형의 규칙적이거나 불규칙적인 패턴으로 배치된 하나 이상의 특이적 결합 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 별개의 부위가 하나 이상의 특이적 결합 물질의 마이크로어레이 스폿을 규정할 수 있다. 마이크로어레이 스폿은 직경이 약 50 내지 약 500 미크론일 수 있다. 마이크로어레이 스폿은 직경이 약 150 내지 약 200 미크론일 수도 있다. 하나 이상의 특이적 결합 물질은 이들의 특정 결합 파트너에 결합될 수 있다.
본 발명의 바이오센서 상의 마이크로어레이는, 하나 이상의 특이적 결합 물질의 미세점적을, 예를 들어 1- 또는 2-차원 그레이팅 또는 커버층 표면에 있는 부위의 x-y 격자에 정위시킴에 의해 생성될 수 있다. 바이오센서를 하나 이상의 결합 파트너를 포함하는 시험 샘플에 노출시킬 때, 결합 파트너는 결합 파트너에 대해 높은 친화력을 갖는 특이적 결합 물질을 포함하는 마이크로어레이 상의 별개의 부위에 우선적으로 끌어 당겨질 것이다. 별개 부위 중 일부는 이들의 표면으로 결합 파트너를 수집하는 한편, 다른 부위들은 그렇지 않을 것이다.
본 발명의 마이크로어레이의 일례는 핵산 마이크로어레이이며, 여기서 어레이 내에 있는 각 개별적인 부위는 상이한 핵산 분자를 함유한다. 이 구체예에서, 핵산 마이크로어레이 내에 있는 스폿들이 시험 샘플 중 핵산의 반대되는 가닥과 결합하는 상보적인 화학물질을 검출한다.
미세역가 플레이트가 생화학적 검정에 이용되는 가장 일반적인 포맷인 한편, 마이크로어레이는 비싼 시약의 양을 최소화하면서 한번에 측정될 수 있는 생화학적 상호작용의 수를 최대화하기 위한 수단으로서 증가하는 것으로 보인다. 마이크로어레이 스폿터를 이용하여 특이적 결합 물질을 본 발명의 바이오센서에 적용시킴에 의해, 특이적 결합 물질의 밀도가 10,000 특이적 결합 물질/in2으로 수득될 수 있다. 단일 마이크로어레이 부위를 조사하기 위해 조명 빔을 집중시킴에 의해, 바이오센서를 비-표시 마이크로어레이 판독 시스템으로서 이용할 수 있다.
하나 이상의 특이적 결합 물질의 고정
하나 이상의 결합 물질을 바이오센서 상에 고정시켜 특이적 결합 물질이 세정 절차에 의해 씻겨 나가지 않도록 하고, 시험 샘플 중의 결합 파트너에 대한 이의 결합이 바이오센서 표면에 의해 방해되지 않도록 한다. 여러 상이한 유형의 표면 화학 전략이 다양한 유형의 마이크로어레이 및 바이오센서에 사용되는, 예를 들어 유리에 대한 특이적 결합 물질의 공유 부착을 위해 고려되어 왔다. 이러한 동일한 방법이 본 발명의 바이오센서에 용이하게 적용될 수 있다. 하나 이상의 특이적 결합 물질을 결합시키기 위한 정확한 작용기를 함유하도록 하는 바이오센서의 표면 제조는 바이오센서 제조 공정의 필수 부분이다.
본원에서 사용된 "표적 분자" 또는 "화학적 또는 생물학적 분자" 또는 "특이적 결합 물질"이라는 용어는 작용기화된 표면에 부착될 수 있는 임의의 특이적 결합 물질을 언급한다. 화학적 또는 생물학적 분자는, 예컨대 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 누클레오티드, 폴리누클레오티드, 소분자, 비오틴, 세포, 분획화된 세포, 세포 추출물, 세포 분획, 및 세포의 일부로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에서 사용된 단백질, 펩티드 및 폴리펩티드라는 용어는 아미노산 잔기의 중합체를 언급한다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산이 상응하는 천연 발생 아미노산의 화학적 유사체인 아미노산 중합체에도 적용되며, 번역후 공정 (예컨대, 글리코실화 및 포스포릴화)에 의해 개질된 아미노산을 포함한다. 본원에서 사용된 "단백질"은 임의의 단백질을 의미하고, 이에 제한되는 것은 아니나 펩티드, 효소, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 성자 인자 등을 제한 없이 포함한다.
"폴리펩티드"라는 용어는 중합체의 길이와 상관없이 아미노산의 중합체를 언급하므로, 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질이 폴리펩티드의 정의 내에 포함된다. 이 용어는 천연 발생 폴리펩티드 및 합성 폴리펩티드 둘 모두를 의미한다. 이 용어는 폴리펩티드의 화학적 또는 발현후 개질을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 글리코실기, 아세틸기, 포스페이트기, 지질기 등의 공유 부착을 포함하는 폴리펩티드에 대한 개질이 폴리펩티드라는 용어에 명백히 포함된다. 화학적으로 개질된 폴리펩티드는 동정 또는 포획 태그(tag)가 폴리펩티드에 혼입되어 있는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 예에 나열된 것들과 같은 천연 또는 다른 화학적 개질이 폴리펩티드 백본, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함하는 폴리펩티드의 어디에서든 일어날 수 있다. 동일한 유형의 개질이 주어진 폴리펩티드의 여러 부위에서 동일하거나 다양한 정도로 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 제공된 폴리펩티드는 수많은 유형의 개질을 함유할 수 있다. 폴리펩티드는, 예를 들어 편재(ubiquitination)의 결과로서 분지될 수 있고, 분지되거나 분지되지 않은 고리형일 수 있다. 개질은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴(heme) 부분의 공유 부착, 누클레오티드 또는 누클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유 부착, 가교, 고리화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 수소화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 단백질분해 공정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레닐화, 황화, 운반-RNA 매개된 아미노산의 단백질로의 첨가, 예컨대 아르기닐화 및 편재를 포함한다 (참조, 예컨대 Proteins - Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al, Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al, Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)). 아미노산 (예를 들어, 비-천연 발생 아미노산, 비관련 생물학적 시스템에서만 천연 발생하는 아미노산, 포유동물 시스템으로부터 개질된 아미노산 등)의 하나 이상의 유사체를 함유하는 폴리펩티드, 치환된 결합을 지니는 폴리펩티드 및 당 분야에 공지된 기타 변형물 (둘 모두는 천연 발생이고 비-천연 발생이다)도 정의 내에 있다. 폴리펩티드는 천연 발생이거나 합성일 수 있다.
본원에서 사용된 "소 분자"는 약 2,500 돌턴 미만의 분자를 언급한다. 이러한 분자에는, 예를 들어 소형 유기 분자, 예컨대 비오틴이 있으나, 펩티도미메틱과 같은 소형 펩티드 및 항바이러스 스크리닝 라이브러리에서 일반적으로 발견되는 것들과 같은 누클레오티드도 포함한다. 소 분자는 다양하게 배향되고 크기가 더 작을 수 있는 합성 분자 및 더 큰 분자량을 갖는 경향이 있는 천연 화합물 둘 모두를 언급할 수 있다. 소 분자는 약 500 돌턴의 더 상위의 크기 범위를 갖는 경구 작용 약물도 포함한다. 참조 문헌[Lipinski, CA. "Drug-like Properties and the Causes of Poor Solubility and Poor Permeability," J. Pharm. And Tox. Methods. 44:235 (2000) at 236 ("Lipinski")].
하나 이상의 특이적 결합 물질이 물리적 흡착 (즉, 화학적 링커를 이용하지 않음) 또는 화학적 결합 (즉, 화학적 링커를 이용함)에 의해 바이오센서 표면에 부착될 수 있다. 화학적 결합은 바이오센서 표면 상에 특이적 결합 물질의 강력한 부착을 생성하고 표면-결합된 분자의 규정된 배향 및 형태를 제공한다.
화학적 결합 유형의 예로는, 예를 들어 아민 작용기화, 알데히드 작용기화, 카르복실 작용기화, 및 비오틴, 글루타치온-S-트랜스퍼라아제(GST) 및 니켈 활성화가 있다. 이러한 표면은 특이적 결합 물질을 바이오센서 표면에 직접 부착시키거나 표 1에 도시된 여러 상이한 유형의 화학적 링커를 이용하여 부착시키는데 이용될 수 있다. 참조 문헌[Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, NY, 1996].
표 1
센서 표면기 화학적 링커 특이적 결합 물질 상의 표적기
아민 설포숙신이미딜-6-(비오틴아미도)헥사노에이트 (설포-NHS-LC-비오틴) 스트렙타비딘 또는 아비딘
N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트 (DSC, 절단불가능한 링커) 아민
디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트 (DTBP, 절단가능한 링커) 아민
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)/N-히드록시설포숙신이미드(NHS) 카르복실
설포-숙신이미딜 6-[a-메틸-a-(2-피리딜-디티오)톨루아미도]헥사노에이트 (설포-LC-SMPT, 절단가능한 링커) 설프히드릴
설포-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (설포-SMCC, 절단불가능한 링커) 설프히드릴
알데히드 아민
카르복실 아민
니켈(II) His-태깅된 생체분자
비오틴 스트렙타비딘 또는 아비딘
글루타치온 GST-태깅된 생체분자
아민 작용기화된 표면을 여러 유형의 링커 분자를 부착시키는데 이용할 수 있으나, 알데히드 작용기화된 표면은 추가의 링커 없이 직접 단백질을 결합시키는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 표면 상의 알데히드 작용성 코팅은 약 50 옹스트롬 미만의 두께이다. 또한, 표면은 평평하거나 평평하지 않을 수 있다. "평평하지 않은" 표면은, 예를 들어 본원에 기술된 대로 그레이팅을 포함하는 표면일 수 있다. "평평한" 표면은, 예를 들어 2001년 8월 15일 출원된 미국특허출원 09/930,352 및 2002년 1월 29일 출원된 미국특허출원 10/059,060 (참조로서 포함됨)에 기술된, 산화규소 또는 스핀-온-글라스(SOG)와 같은 오버코트를 지닌 그레이팅을 포함하는 표면일 수 있다. 니켈 표면은 혼입된 히스티딘 ("his") 태그를 갖는 분자를 결합시키는데 이용될 수 있다. 니켈-활성화된 표면을 갖는 "his-태깅된" 분자의 검출은 당 분야에 널리 공지되어 있다 (Whitesides, Anal . Chem, 68, 490, (1996)).
예를 들어, 옥사이드일 수 있는 플라스틱 센서의 표면에 대한 특이적 결합 물질의 고정은 유리에 대한 고정을 위해 기술된 바에 따라 본질적으로 수행될 수 있다. 그러나, 특이적 결합 물질이 고정되어 있는 재료를 손상시킬 세척 및 코팅 처리 단계는 제거되어야 한다.
농도가 약 ~0.1 ng/ml 미만인 결합 파트너를 검출하기 위해, 바이오센서에 결합된 결합 파트너를 바이오센서 표면 상의 추가 층으로 증폭시키고 변환시키는 것이 바람직하다. 바이오센서에 침착된 증가된 질량이 증가된 광학로 길이의 결과로서 용이하게 검출될 수 있다. 더 많은 질량을 바이오센서 표면으로 혼입시킴에 의해, 표면 상의 결합 파트너의 광학 밀도도 증가되므로, 첨가되는 질량 없이 발생하는 것에 비해 더 큰 공명 파장 시프트를 제공한다. 질량의 첨가는, 예를 들어 효소적으로, "샌드위치" 검정을 통해서나 적합하게 컨주게이션된 비즈 또는 다양한 크기 및 조성의 중합체 형태의 바이오센서 표면에 대한 질량의 직접 적용에 의해 달성될 수 있다. 이러한 원리는 질량 증폭 없이 달성되는 민감성 한계를 넘어서 1500x를 초과하는 민감성 증가를 입증하기 위해 다른 유형의 광학 바이오센서에 대해 활용되어 왔다. 참조, 예컨대 문헌[Jenison et al,, "Interference-based detection of nucleic acid targets on optically coated silicon," Nature Biotechnology, 19: 62-65, 2001].
예로서, 아민 작용기화된 센서 표면은 표면 상에 고정된 단일-가닥 DNA 포획된 프로브를 포함하는 특이적 결합 물질을 지닐 수 있다. 포획 프로브는 이의 상보적인 결합 파트너와 선택적으로 상호작용한다. 결합 파트너는, 차례로, "검출기" 분자에 결합될 서열 또는 태그를 포함하도록 고안될 수 있다. 검출기 분자는, 예를 들어 올바른 효소에 노출시, 검출기 분자가 존재하는 경우에만 바이오센서 상의 추가의 물질을 선택적으로 침착시킬 호스래디쉬 과산화효소(HRP)에 대한 링커를 함유할 수 있다. 이러한 절차는, 예를 들어 수 초 내에 300 옹스트롬의 검출가능한 생체분자를 바이오센서에 첨가시킬 수 있다.
"샌드위치" 접근법이 검출 민감성을 개선시키기 위해 이용될 수 있다. 이러한 접근법에서, 큰 분자량 분자를 이용하여 저 분자량 분자의 존재를 증폭시킬 수 있다. 예를 들어, 분자량이, 예를 들어 약 0.1 kDa 내지 약 20 kDa인 결합 파트너를, 예를 들어 숙신이미딜-6-[a-메틸-a-(2-피리딜-디티오)톨루아미도]헥사노에이트(SMPT), 또는 디메틸피멜이미데이트(DMP), 히스티틴 또는 비오틴 분자로 태깅할 수 있다. 태그가 비오틴인 경우, 비오틴 분자는 스트렙타비딘에 강력하게 결합될 것이며, 이의 분자량은 60 kDa이다. 비오틴/스트렙타비딘 상호작용이 고도로 특이적이기 때문에, 스트렙타비딘은 작은 결합 파트너에 의해서만 생성된 시그널을 60배 만큼 증폭시킨다.
검출 민감성은 화학적으로 유도체화된 소 입자의 이용을 통해서 추가로 개선될 수 있다. 콜로이드 금, 다양한 플라스틱 또는 직경이 약 3-300 nm인 유리로 제조된 "나노입자"를, 이들이 선택적으로 결합 파트너에 공유적으로 결합하게 할 수 있는 분자 종으로 코팅시킬 수 있다. 예를 들어, 스트렙타비딘으로 공유적으로 코팅된 나노입자를 이용하여 바이오센서 표면 상에서 비오틴-태깅된 결합 파트너의 가시성을 개선시킬 수 있다. 스트렙타비딘 분자 자체가 60 kDa의 분자량을 지니는 한편, 유도체화된 비드는 예를 들어 60 kDa를 포함하는 임의의 크기의 분자량을 지닐 수 있다. 거대 비드의 결합은 바이오센서 표면 상에서 광학 밀도의 큰 변화, 및 용이하게 측정할 수 있는 시그널을 초래할 것이다. 이 방법은 민감성 해상력에 있어서 대략 1000x 개선을 초래할 수 있다.
센서를 이용하는 방법
본 발명의 센서를 하나 또는 다수의 특이적 결합 물질/결합 파트너 상호작용을 동시에 연구하는데 이용할 수 있다. 하나 이상의 특이적 결합 물질의 이들의 개개 결합 파트너에 대한 결합을 표지를 이용하지 않고, 하나 이상의 결합 파트너를 표면에 하나 이상의 특이적 결합 물질을 지니는 바이오센서에 적용시킴에 의해 검출할 수 있다. 예를 들어, SWS 바이오센서를 빛으로 조명하여 반사되는 파장의 최대값 또는 빛의 전송된 파장의 최소값을 바이오센서로부터 검출한다. 하나 이상의 특이적 결합 물질이 이들의 개개 결합 파트너에 결합되는 경우, 반사된 빛의 파장이 하나 이상의 특이적 결합 물질이 이들의 개개 결합 파트너에 결합되지 않은 경우에 비해 변화된다. SWS 바이오센서를 하나 이상의 특이적 결합 물질을 함유하는 별개 부위의 어레이로 코팅하는 경우, 반사된 파장의 최대값 또는 빛의 전송된 파장의 최소값이 바이오센서의 각 별개 부위로부터 검출된다.
다양한 특이적 결합 물질, 예를 들어 항체를 어레이 포맷으로 바이오센서 상에 고정시킬 수 있다. 이후 바이오센서를 단백질과 같은 결합 파트너를 포함하는 관심있는 시험 샘플과 접촉시킨다. 바이오센서 상에 고정된 항체와 특이적으로 결합하는 단백질만이 바이오센서에 결합된 채로 남아 있다. 이러한 접근법은 본질적으로 효소-결합된 면역흡수 검정의 대규모 버젼이다; 그러나, 효소 또는 형광성 표지의 이용은 요구되지 않는다.
효소의 활성은 하나 이상의 특이적 결합 물질이 고정되어 있는 바이오센서에 하나 이상의 효소를 적용시킴에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 바이오센서를 세척하고 빛으로 조명한다. 빛의 반사된 파장을 바이오센서로부터 검출한다. 하나 이상의 효소가 효소 활성에 의해 바이오센서의 하나 이상의 특이적 결합 물질을 변경시키는 경우, 빛의 반사된 파장이 변화된다.
추가로, 시험 샘플, 예를 들어 결합 파트너를 함유하는 세포 용해물을 바이오센서에 적용시킨 후, 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거할 수 있다. 바이오센서에 결합되는 결합 파트너는 바이오센서로부터 용리되고, 예를 들어 질량 분광계에 의해 동정될 수 있다. 임의로, 파지 DNA 디스플레이 라이브러리를 본 발명의 바이오센서에 적용시킨 후 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거할 수 있다. 바이오센서에 결합된 개개 파지 입자를 분리시킨 다음 이들 파지 입자의 삽입물을 서열화하여 결합 파트너의 실체를 결정할 수 있다.
상기 적용들의 경우 및 특정 단백질분석 적용에 있어서, 본 발명의 바이오센서 상에서 시험 샘플로부터의 결합 파트너와 같은, 물질에 선택적으로 결합되는 능력, 이어서 추가의 분석을 위해 바이오센서의 별개의 부위로부터 결합된 물질을 선택적으로 제거하는 능력이 바람직하다. 본 발명의 바이오센서는 빛의 반사된 파장에서의 시프트를 측정함에 의해 바이오센서 어레이의 별개의 부위에 결합된 샘플로부터의 결합 파트너의 양도 검출하고 정량할 수 있다. 예를 들어, 한 별개의 바이오센서 부위에서의 파장 시프트를 다른 별개의 바이오센서 부위에서의 포지티브 및 네거티브 대조군과 비교하여 바이오센서 어레이의 별개의 부위에 결합된 결합 파트너의 양을 결정할 수 있다.
바이오센서 표면 상에서 비-특이적 결합의 차단
트레할로오스 및 덱스트란과 같은 당(sugar)을 이용하여 바이오센서 표면 상에 고정된 특이적 결합 물질과 용액 중의 다른 소분자 및 단백질간의 비-특이적 상호작용을 감소시킬 수 있다. 본 발명에서 유용한 당류에는, 예컨대 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 오당류, 및 기타 다당류 및 올리고사카라이드, 예컨대 덱스트란이 있다. 비-단백질성 물질인 당류는 다른 것들 중에서도 BIND™ 센서 플레이트와 같은 단백질-코팅된 바이오센서 표면에 대한 분자의 비-특이적 결합을 차단하거나 감소시키는데 이용될 수 있다. 당류는 특정 단백질-리간드 상호작용 (예컨대 스트렙타비딘-비오틴 상호작용)을 방해하지 않는다. 본원에서 사용된 "올리고사카라이드"는 약 3개 내지 10개의 단당류 유닛을 갖는 당류를 언급하고, "다당류"는 약 10개를 초과하는 단당류 유닛을 갖는 당류를 언급하나, 3000개를 초과하는 단당류 유닛도 지닐 수 있다. 덱스트란은 다양한 길이의 사슬로 결합된 다수의 글루코오스 분자로 이루어진 복잡한 분지된 다당류의 예이다. 당류는, 예를 들어 아민-작용기화된 표면, 알데히드-작용기화된 표면, 및 카르복실-작용기화된 표면을 차단하는데 이용될 수 있다. 비-특이적 결합의 감소는, 예를 들어 실시예 3 및 4에 개시된 방법에 의해 측정될 수 있다.
이당류 차단제와 같은 이러한 당 차단제는 단백질-코팅된 플레이트를 수용하는 저장 용액으로서 이용될 수도 있다. 예를 들어, 센서 플레이트 상의 스트렙타비딘과 같은 요망되는 단백질을 알데히드-작용기화된 바이오센서 표면에 고정시킨 후, 트레할로오스의 용액을 패키징 전에 플레이트에 첨가한다. 트레할로오스는 알데히드 표면에 결합하여 임의의 남아 있는 알데히드기를 차단한다. 수용체가 바이오센서를 수용했을 때, 표면은 이당류 분자로 미리-차단된다. 당류는 플레이트를 달리 소용없게 만드는 화학적 반응을 허용하지 않으며, 플레이트를 습윤되거나 안정한 채로 유지하는 비활성 수단을 제공한다. 상기 구체예에서, 당류는 일시적인 보호기로서 기능한다. 당류는 알데히드와 반-아세탈을 형성하여 단순한 산화환원 화학을 통해 용이하게 제거/전환될 수 있는 일시적인 "공유" 결합을 초래하는 것으로 여겨진다. 당류가 첨가되기 전에 단백질을 표면에 첨가하는 경우, 당류는 고정된 단백질에 근접하게 물 분자를 유지시키는 중요한 구조체의 층을 유지시킴에 의해 단백질을 안정화시키도록 작용한다. 당류는 이들의 분자 크기 및 균일하게 높은 소수성으로 인해 특정 단백질-리간드 상호작용 (예컨대 스트렙타비딘-비오틴 상호작용)을 방해하지 않는다. 당류는 단백질이 변성되는 것을 막는 기능도 한다. 당류의 첨가는 고정된 단백질을 지니는 표면이 보다 안정하고 아마도 반-건조 상태로 적재되도록 한다.
본 발명에서 유용한 당류는 환원 및 비-환원 당류를 포함한다. 환원 당류는 알데히드기를 함유하고, 프럭토오스, 글루코오스, 글리세르알데히드, 락토오스 및 말토오스와 같은 멤버들이 있다. 환원 당류는 아민과 반응할 수 있으므로, 아민 작용기화된 표면은 환원 당류, 예를 들어 글리세르알데히드로 차단될 수 있다. 단당류도 아민-작용기화된 표면에 부착될 수 있다. 알데히드 작용기화된 표면은 히드록시기도 함유하는 알데히드기를 함유하는 당류로 차단될 수 있다. 환원 및 비-환원 당류 둘 모두는 센서의 알데히드 작용기화된 표면 상에서 알데히드기와 반응하는 히드록실기를 함유함으로써 표면을 차단한다. 트레할로오스 및 수크로오스는 알데히드기를 함유하지 않으므로 이들은 비-환원 당류의 범주에 해당된다.
알데히드 작용기화된 표면을 단백질 부착에 이용할 수 있다. 당류는 알데히드와 반응하여 이들을 차단함으로써 단백질이 특이적 결합 물질에 결합되지 않은 표면상의 알데히드기와 반응하는 것을 막는다. 본 발명의 표면은 일부 아민기도 함유할 수 있다. 예를 들어, 알데히드-함유 표면으로 전환된 고 밀도 아민 표면이 전환된 이의 아민기 모두를 지닐 수 있는 것은 아니므로 표면 상에 남게 된다. 따라서, 환원 및 비-환원 당류 둘 모두를 이용하여 표면 상의 아민 및 알데히드기를 차단할 수 있어서, 검정 동안에 분석물로서 첨가된 단백질이 고정된 단백질에만 결합될 것이며, 아민 및 알데히드기를 함유하는 표면의 다른 부분에는 결합되지 않을 것이다.
트레할로오스 및 기타 이당류 분자는 표적 단백질이 표면에 고정된 후 미반응인 채로 남아있는 알데히드 작용기에 아마도 반-아세탈을 통해 부착되는 것으로 여겨진다. 결합은 단순한 산화환원 화학으로 가역적일 수 있고 단지 약 수 시간의 통상적인 검정의 시간 규모 동안 안정할 수 있다. 따라서, 트레할로오스는 알데히드 표면에 안정한 양상으로 결합되는 것으로 보인다.
본 발명의 일 구체예는 표면-부착된 알데히드기에 결합된 다수의 특이적 결합 물질 및 표면-부착된 알데히드기에 결합된 다수의 당 분자를 포함하는 바이오센서를 제공한다. 즉, 바이오센서는 알데히드-작용기화되고 당 및 특이적 결합 물질이 바이오센서에 첨가되어 특이적 결합 물질 및 당이 바이오센서 표면-부착된 알데히드기에 결합되도록 한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 표면-부착된 알데히드기에 결합된 특이적 결합 물질 및 당 분자를 포함하는 저장 용액을 지니는 바이오센서를 함유하는 패키지를 제공한다. 표면-부착된 알데히드기는 아민기이며, 이것을 표면에 첨가하여 알데히드 작용기화된 표면이 되게 한다.
본원에 예시적으로 개시된 본 발명은 적합하게는 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 엘리먼트(들), 제한(들)의 부재하에 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원의 각 예에서 임의의 "포함하는", "필수적으로 포함하는" 및 "구성된"의 표현은 이들 본래의 의미를 변경하지 않으며, 다른 두 용어로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현들은 서술 용어로서 제한없이 사용되며, 이러한 용어 및 표현의 사용에 있어서 제시되고 기술된 특징들의 임의의 등가물 또는 그 일부를 배제시키려는 의도는 아니나, 다양한 변형이 청구된 본 발명의 범위 내에서 가능한 것으로 이해된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 구체예에 의해 구체적으로 기술되었으나, 본원에 개시된 사상의 임의의 특징, 변형 및 변경이 당업자에 의해 재분류될 수 있고, 그러한 변형 및 변경은 상세한 설명 및 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 범위내에 있는 것으로 고려된다.
또한, 본 발명의 특징 또는 양태가 마쿠쉬 그룹 또는 대안적인 다른 그룹의 용어로 기술되는 경우, 당업자는 본 발명이 이에 의해 마쿠쉬 그룹 또는 다른 그룹의 임의의 개개 멤버 또는 멤버의 서브그룹과 관련해서도 기술됨을 이해할 것이다.
하기는 단지 예시를 목적으로 제공된 것이며 상기 광범한 용어로 기술된 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 본 설명에 인용된 모든 참조문헌은 본원에 참조로서 포함된다.
실시예 1
SWS 바이오센서의 제조
SWS 바이오센서의 상세한 제조 공정을 상기에서 설명하였다. 참조, 예컨대 문헌[Cunningham et al., Sensor and Actuators B 6779, 1-6 (2002), 본원에 참조로서 포함됨]. 구체적으로, 광학-등급 중합체 필름을 SWS 센서의 지지체로서 사용하였다. UV-경화가능한 아크릴-기재 중합체 코팅을 필름 위에 코팅시키고 96-웰 미세역가 플레이트의 표준 포맷에 상응하는 96 써클을 지니는 실리콘 마스크를 이용하여 반복하였으며(replicated) 이 써클이 SWS 구조체를 형성한다. 크세논 코퍼레이션 (Xenon Corporation, Woburn, MA)에서 제공한 UV 램프 RC600을 이용하여 반복 후 코팅을 경화시켰다. 후속하여, 이산화티탄 층 및 이산화규소 층을 표면의 상부로 침착시켰다.
하나 이상의 특이적 결합 물질의 고정
하기 프로토콜을 비색 공명 반사 바이오센서 상에서 이용하여 표면이 아민 작용기를 지니도록 작용기화하였다. 아민기를 여러 유형의 링커 분자의 후속적인 공유 결합을 위한 범-용도 표면으로서 이용할 수 있다.
유리 버젼의 바이오센서를 피라니아 에치 (70/30% (v/v) 농축된 황산/30% 과산화수소)로 12시간 동안 침지시킴에 의해 세정하였다. 바이오센서를 물로 철저히 세척하였다. 바이오센서를 건조 아세톤 중 3% 3-아미노프로필-트리에톡시실란액에 1분 동안 담근 다음 건조 아세톤으로 세정하고 공기-건조시켰다. 바이오센서를 이후 물로 세척하였다.
반-정량법을 이용하여 바이오센서 표면 상에 아미노기의 존재를 확인하였다. 아미노-작용기화된 바이오센서의 각 배치로부터의 하나의 바이오센서를 5 mL의 50 mM 중탄산나트륨 (pH 8.5)으로 간단히 세척하였다. 바이오센서를 0.1 mM의 설포-숙신이미딜-4-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-부티레이트 (s-SDTB, Pierce, Rockford, IL)을 함유하는 5 mL의 50 mM 중탄산나트륨 (pH 8.5)에 담그고 30분 동안 강하게 진탕시켰다. s-SDTB 용액은 3.0 mg의 s-SDTB를 1 mL의 DMF에 용해시키고 50 mM의 중탄산나트륨 (pH 8.5)으로 50 mL로 희석시킴에 의해 제조되었다. 30분 인큐베이션 후, 바이오센서를 20 mL의 ddH2O로 3회 세척하고 이어서 5 mL의 30% 과염소산으로 처리하였다. 오렌지색 용액의 발생은 바이오센서가 아민으로 성공적으로 작용기화되었음을 나타내며; 처리되지 않은 유리 바이오센서에 대하여 색 변화는 관찰되지 않았다.
상기 절차에 따른 과염소산 처리 후 용액의 495 nm에서의 흡광도를 표면 상에 있는 아민기 양의 지시자로서 이용할 수 있다. 일 세트의 실험에서, 흡광도는 시그마 슬라이드, 셀-어쏘시에이트(Cel-Associate) 슬라이드, 및 인-하우스(in-house) 바이오센서 슬라이드에 대하여 각각 0.627, 0.647 및 0.728이었다. 이것은 바이오센서 표면의 NH2 작용기화 수준이 시판되는 작용기화된 마이크로어레이 유리 슬라이드와 필적함을 나타낸다.
바이오센서를 아민으로 작용기화하는 상기 프로토콜에 따른 후, 링커 분자를 바이오센서에 부착시킬 수 있다. 가교제를 선택할 때, 반응기의 선택성, 스페이서 아암 길이, 용해성 및 벽개성(cleavability)과 같은 문제가 고려되어야 한다. 링커 분자는, 차례로 결합 파트너의 특정 인식을 위해 이용된 특정 결합 분자에 결합된다. 예로서, 하기 프로토콜을 이용하여 비오틴 링커 분자를 아민-작용기화된 바이오센서에 결합시켰다.
아민-코팅된 바이오센서를 비오틴으로 작용기화하기 위한 프로토콜
아민-코팅된 바이오센서를 PBS (pH 8.0)로 3회 세척하였다. PBS 완충액 (pH 8)에서 설포-숙신이미딜-6-(비오틴아미도)헥사노에이트 (설포-NHS-LC-비오틴, Pierce, Rockford, Illinois) 용액을 0.5 mg/ml의 농도로 제조하였다. 2 ml의 설포-NHS-LC-비오틴 용액을 각 아민-코팅된 바이오센서에 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 바이오센서를 PBS (pH 8.0)으로 3회 세척하였다. 설포-NHS-LC-비오틴 링커의 분자량은 556.58이었고 길이는 22.4Å이었다. 생성된 바이 오센서를 아비딘 또는 스트렙타비딘 분자를 포획하는데 이용할 수 있다.
아민-코팅된 바이오센서를 알데히드로 작용기화하기 위한 프로토콜
2.5%의 글루타르알데히드 용액을 0.1 M 인산나트륨, 0.1% 나트륨 시아노보로히드라이드에서 제조하였다 (pH 7.0). 2 ml의 글루타르알데히드 용액을 각 아민-코팅된 바이오센서에 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 바이오센서를 PBS (pH 7.0)로 3회 세척하였다. 글루타르알데히드 링커의 분자량은 100.11이었다. 생성된 바이오센서를 단백질 및 기타 아민-함유 분자를 결합시키는데 이용할 수 있다. 반응은 시프(Schiff) 염기의 형성을 통해 진행되고, 후속하는 환원 아미노화가 안정한 이차 아민 결합을 생성한다. 한 실험에서, 코팅된 알데히드 슬라이드를 시판되는 알데히드 슬라이드 (셀-어쏘시에이트)와 비교해볼 때, 상기 방법으로 제조된 슬라이드 상에서 스트렙타비딘과 항-토끼 IgG의 10배 더 높은 결합이 관찰되었다.
아민-코팅된 바이오센서를 NHS 로 작용기화하기 위한 프로토콜
탄산나트륨 완충액 (pH 8.5)에서 25 mM의 N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트 (DSC, Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri)를 제조하였다. 2 ml의 DSC 용액을 각 아민-코팅된 바이오센서에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 바이오센서를 PBS (pH 8.5)로 3회 세척하였다. DSC 링커의 분자량은 256.17이다. 생성된 바이오센서를 히드록실- 또는 아민-함유 분자에 대한 결합을 위해 이용하였다. 이 링커는 이용할 수 있는 가장 작은 동종이작용성 NHS 에스테르 가교제 중 하나이다.
상기 정의된 프로토콜에 추가하여, 다수의 추가 표면 작용기화 및 분자 링커 기술이 상이한 유형의 생체분자에 대해 검정 성능을 최적화하는 것으로 보고되었다. 이들 중 가장 일반적인 것이 아민 표면, 알데히드 표면 및 니켈 표면이다. 작용기화된 표면은, 차례로 여러 상이한 유형의 화학 링커를 바이오센서 표면에 부착시키는데 이용될 수 있다 (표 2에 제시됨). 아민 표면을 여러 유형의 링커 분자를 부착시키는데 이용하는 한편, 알데히드 표면은 추가의 링커 없이 단백질을 직접 결합시키는데 이용된다. 니켈 표면은 혼입된 히스티딘 ("his") 태그를 갖는 분자를 결합시키기 위해 배타적으로 이용된다. "his-태깅된" 분자를 니켈 활성화된 표면으로 검출하는 것은 널리 공지되어 있다 (Sigal et al . (1996) Anal . Chem., vol. 68, p. 490).
표 1은 바이오센서를 제조하고 이용하는 단계들의 순서의 예, 및 표면 작용기화 화학, 화학적 링커 분자, 특이적 결합 물질 및 결합 파트너 분자에 이용될 수 있는 다양한 옵션을 나타낸다. 검출된 시그널을 증폭을 통해 HRP 또는 스트렙타비딘과 같은 더 큰 분자로 늘리고 분자 결합에 이용할 수 있는 표면적을 증가시키기 위해 덱스트란 또는 TSPS와 같은 중합체 물질을 이용할 기회도 존재한다.
표 1
맨 센서 표면 활성화 링커 분자 수용체 분자 검출된 물질 표지 분자 (임의)
유리 임의로 민감성을 2-5x 개선시키는 중합체 덱스트란 TSPS 아미노 알데히드 Ni SMPT NHS-비오틴 DMP NNDC His-태그 기타 Sm m'cules 펩티드 Med 단백질 Lrg 단백질 * IgG cDNA 펩티드 Med 단백질 Lrg 단백질 * IgG 파지 세포 cDNA 민감성 1000x 개선 HRP 스트렙타비딘
실시예 2
알데히드 표면 작용기화 및 시험
하기 실시예는 단백질, 펩티드, 핵산, 세포, 소분자, 소형 유기 분자, 기타 화학적 및/또는 생물학적 분자 등을 결합시키기 위해 비색 공명 바이오센서의 표면 상에 화학적 작용기를 제공한다. 이러한 화학적 작용기는 단백질분석, 게놈분석, 약제학, 약물 발견, 진단, 환경, 화학 및 유사한 연구 영역 및/또는 산업에 있어서 흥미롭다. 이 실시예는 바이오센서 구조를 변경시키거나 분해시키지 않는 화학적 시약을 이용하여 고밀도의 작용성 알데히드 결합 부위를 제공하는 코팅 공정의 개발에 역점을 두고 있다. 본 실시예가 다루고 있는 또 다른 문제는 비색 공명 바이오센서의 작용기화된 표면 상에서 알데하이드 결합 부위의 존재를 입증하는 시험 방법을 개발하는 것이다.
이전의 센서 표면은 표면 아민기로 코팅되었다. 센서 표면을 아민으로 코팅시키는 간단한 방법은 세정된 표면을 폴리리신에 직접 노출시키는 것이다. 예로는 마이크로어레이 프린팅에 사용되는 유리 슬라이드 표면이 있다. 표면을 아민으로 코팅시키는 대안적인 방법은 아민-코팅 분자를 표면에 공유적으로 부착시키는 것이고, 예컨대 실란을 유리 위에 또는 티올을 금 위에 부착시키는 것이며, 둘 모두는 널리 공지되어 있다. 일부 알데히드 개질된 슬라이드도 프린팅 어레이용으로 시판된다 (예컨대, CEL Associates 및 NoAb BioDiscoveries, 아래).
본 실시예는 바이오센서 구조를 변경시키거나 분해시키지 않으며 비색 공명 바이오센서의 표면 상에 고밀도의 작용성 알데히드 결합 부위를 제공하는 공정을 기술한다.
알데히드기의 존재를 입증하기 위해, 현재의 비색 및 형광성 방법은 통상적으로 샘플을 용액으로 적용하며, 여기서 검출은 건조 표면 상에서의 샘플 보다 더욱 민감할 수 있다. 건조하고 울퉁불퉁한 (즉, 완전히 평평하지 않음) 표면 위에서 두께가 약 50 옹스트롬 미만인 화학 기의 표면 특성규명을 수행하는 것은 어려운 작업으로도 입증되어 왔다.
비색 공명 바이오센서 표면은 아민기로 작용기화될 수 있는데, 여기서 표면은 본원에 개시된 플라스틱, 유리, 에폭시 또는 중합체 기판을 포함하는 바이오센서일 수 있다. 아민-작용기화된 표면을 커플링 완충액으로 세정할 수 있다. 커플링 완충액은 인산염 완충된 염수(PBS)에서 약 7.4의 pH로 제형화될 수 있다. 시아노보로히드라이드를 포함하는 알데히드 용액을 바이오센서 표면에 첨가할 수 있다. 알데히드 용액은 약 100 mM의 시아노보로히드라이드를 함유하는 약 10% 글루타르알데히드를 포함할 수 있다. 표면은, 예를 들어 약 4시간 동안 대략 실온에서 유효 할 수 있다. 바이오센서 표면을, 예를 들어 커플링 완충액으로 세척할 수 있다.
바이오센서 표면 상의 알데히드기의 존재를 조사하기 위해, 방사성, 비색, 형광성, X-레이 광전자 분광학 (XPS), 푸리에 변환 적외선 분광학 (FTIR), 원자간 힘 현미경 (AFM) 등을 포함하나 이로 제한되지 않는 수많은 방법을 이용할 수 있다.
알데히드-표면 작용기화에 대한 형광성 시험은, 예를 들어 알데히드-처리된 바이오센서 및 비처리된 바이오센서를 약 2x2 cm2 조각으로 절단하는 것을 포함할 수 있다. 알데히드-코팅된 표면을 가시광으로 자극될 수 있는 형광성 염료에 노출시킬 수 있다. 예를 들어, 염료의 최종 농도가 약 100 ㎍/ml이 되게 제조될 수 있는 PBS (pH 7.4) 용액 중 ALEXA 647-히드라진 (Molecular Probes, Portland, OR)과 같은 형광성 히드라진 유도체를 이용한다. 약 100 μL의 염료 용액을 커버슬립의 조각 위에서 분배시키고 바이오센서 조각을 염료 용액 위에 아래를 향하게 정위시킬 수 있다. 바이오센서를 염료와 함께 약 1시간 동안 대략 실온에서 인큐베이션할 수 있다. 커버슬립 및 염료 용액을 폐기하고 바이오센서 표면을 예를 들어 증류된 탈이온수에서 3회 세정할 수 있다. 바이오센서 조각을, 예를 들어 20 mL의 증류된 탈이온수와 함께 페트리 디시에 정위시키고 진동 플랫폼 상에서 약 1시간 동안 세척할 수 있다. 바이오센서 조각을 N2로 건조시킬 수 있다. 예를 들어 애피메트릭스(Affymetrix®) 428™ 스캐너를 이용한 스캐닝을 위해 물방울을 이용하여 바이오센서 조각을 유리 슬라이드 위로 보존할 수 있다. 각 바이오센서 조각에 대 해 형광성을 판독하여 알데히드 결합 부위의 양을 결정하였다.
비색 공명 바이오센서는, 예를 들어 본원에 개시된 낮은 굴절율 물질을 포함하는 그레이팅 상에 침착된 높은 굴절율 물질을 포함한다. 높은 굴절율 물질은, 예를 들어 황화아연, 이산화티탄, 산화주석 인듐, 산화탄탈 또는 질화규소일 수 있고, 낮은 굴절율 물질은, 예를 들어 유리, 플라스틱, 중합체 또는 에폭시일 수 있다. 일 구체예에서, 바이오센서의 높은 굴절율 물질은 SiO2로 코팅되거나 코팅되지 않는다. 사용된 비색 바이오센서의 표면 상의 알데히드-코팅은 임의의 두께일 수 있으나, 약 50 옹스트롬 미만의 두께를 포함한다. 추가로, 바이오센서 표면은 울퉁불퉁할 수 있다 (즉, 평평하지 않다), 바이오센서 표면은 알데히드 표면 활성화의 검출 이전에 건조될 수 있다.
상기 알데히드 작용기화 프로토콜 및 형광성 조사 방법을 이용하여, 알데히드-코팅되고 착색된 바이오센서는 비-알데히드 표면 작용기화된 바이오센서에 비해 통상적으로 적어도 10배를 초과하는 형광성을 나타낸다. 표 2는 알데히드 작용기화되지 않고 (블랭크) 알데히드-작용기화된 바이오센서를 갖는 플라스틱 바이오센서의 비교를 나타내며, 이들 모두는 형광성 조사 절차로 처리되었다. 상기 프로토콜 및 방법은 코팅된 알데히드의 표면 밀도가 상업적인 판매자에 의해 이용되는 방법으로 수득된 것 보다 높았음을 나타낸다 (예컨대, CEL Associates, Pearland, TX and NoAb BioDiscoveries, Mississauga, ON, Canada). 표 3은 본 발명의 방법 및 상업적인 판매자에 의해 수득되는 알데히드 작용기화되지 않고 (블랭크, 4개 샘플 의 제시된 평균) 알데히드-작용기화된 슬라이드를 갖는 유리 슬라이드의 비교를 나타내며, 이들 모두는 형광성 조사 절차로 처리되었다.
표 2
플라스틱 바이오센서 샘플 형광 세기 (카운트)
블랭크 1 - 알데히드 없음 785
블랭크 2 - 알데히드 없음 746
샘플 1 - NoAb에 의해 코팅된 알데히드 6431
샘플 2 - NoAb에 의해 코팅된 알데히드 5070
샘플 3 - 본 발명의 방법을 이용하여 코팅된 알데히드 17280
샘플 4 - 본 발명의 방법을 이용하여 코팅된 알데히드 14109
표 3
유리 슬라이드 샘플 형광 세기 (카운트)
블랭크 1 - 알데히드 없음 825±85
샘플 그룹 1 - 셀 어쏘시에이트로 코팅된 알데히드 7684±796
샘플 그룹 2 - NoAb로 코팅된 알데히드 15847±2020
샘플 그룹 3 - 본 발명의 방법을 이용하여 코팅된 알데히드 35486±7664
알데히드 표면 작용기화는 단백질-결합 시험을 이용하여 조사될 수도 있다. 예를 들어, PBS 중 약 100 ㎍/mL의 단백질 A 용액을 약 7.4의 pH에서 제조하고 알데히드-코팅된 바이오센서 조각 및 비처리된 바이오센서 조각에 첨가하고 약 1시간 동안 대략 실온에서 인큐베이션할 수 있다. 바이오센서를 1% (w/v) BSA를 포함하는 PBS 용액으로 약 3회 세척할 수 있다. 바이오센서 조각을 세척액에 두어 약 15분 동안 대략 실온에서 세척할 수 있다. 바이오센서 조각을 PBS 완충액으로 약 pH 7.4에서 대략 실온으로 세정할 수 있다. 적합한 항체의 표지된 용액을 바이오센서의 표면에 첨가하고 인큐베이션한다. 예를 들어, 약 20 ㎍/mL의 토끼 항-염소 IgG-ALEXA 647 (Molecular Probes) 용액을 이용할 수 있고, 바이오센서를 어두운 곳에서 약 30분 동안 인큐베이션할 수 있다. 바이오센서를 약 0.05% 트윈(Tween™) 20을 포함하는 PBS 완충액에서 약 pH 7.4에서 (PBST 용액) 대략 3회 세척할 수 있다. 바이오센서를 탈이온수로 세척하고 N2로 건조시킬 수 있다. 검출은, 예를 들어 바이오센서를 애피메트릭스® 428™ 스캐너로 스캐닝하여 형광성 판독치를 수득하는 것을 포함할 수 있다.
알데히드 코팅 공정 및 단백질-결합 시험 방법을 이용하여, 알데히드-코팅된 바이오센서가 동일한 단백질 A/IgG 처리되었던 비-코팅된 바이오센서에 비해 약 5배 양호하게 단백질 A/IgG에 결합되는 것으로 나타났다 (표 4 참조).
표 4
플라스틱 바이오센서 샘플 형광 세기 (카운트)
블랭크 1 - 알데히드 없음 4249
블랭크 2 - 알데히드 없음 3525
블랭크 3 - 알데히드 없음 4572
블랭크 4 - 알데히드 없음 3976
샘플 1 - 알데히드 코팅됨 18759
샘플 2 - 알데히드 코팅됨 22212
샘플 3 - 알데히드 코팅됨 15170
샘플 4 - 알데히드 코팅됨 19525
표 5는 PBS, BSA 및 항-BSA에 차례로 노출시킬 때 알데히드-작용기화된, 플라스틱-기재, 비색 공명 바이오센서 어레이가 어떻게 반응하는지를 나타낸다. 6개의 바이오센서를 동시에 모니터링하였다. 단계 1에서, 모든 바이오센서를 PBS (pH 7.4) 용액에 노출시켜 바이오센서에 대한 기준선을 수득하였다. 이후 단계 2에서, 센서 3-6을 0.5 mg/mL의 BSA (PBS에서 제조됨)에 노출시키는 한편 바이오센서 1 및 2 (참조로서 이용됨)를 PBS에만 노출시켰다. 약 0.38 nm의 평균 시그널이 BSA-결합된 바이오센서 상에서 관찰되는 한편, 참조 바이오센서는 여전히 기준선이었다. 마지막으로, 단계 3에서, 바이오센서 3 및 4를 0.5 mg/mL의 항-BSA에 노출시키는 한편, 바이오센서 1 및 2를 다시 PBS에만 노출시켰다. BSA 상에서 항-BSA의 결합이 (바이오센서 3 및 4) 기준선 보다 ~1.4 nm 더 높은 추가의 시그널을 부여한 것으로 나타났다. 대조군으로서, 이 단계에서, 바이오센서 5 및 6을 PBS 및 0.5 mg/ml의 BSA에 각각 노출시켰으며, 이들의 반응은 여전히 단계 2 수준이었다.
표 5
용액에 노출 단계 1 시그널 파장 시프트 (nm) 단계 2 시그널 파장 시프트 (nm) 단계 3 시그널 파장 시프트 (nm)
센서 1-참조 단계 1 PBS + 단계 2 PBS + 단계 3 PBS 0.000 -0.009 -0.020
센서 2-참조 단계 1 PBS + 단계 2 PBS + 단계 3 PBS 0.000 0.009 0.020
센서 3-샘플 단계 1 PBS + 단계 2 BSA + 단계 3 항-BSA -0.002 0.384 1.473
센서 4-샘플 단계 1 PBS + 단계 2 BSA + 단계 3 항-BSA -0.002 0.350 1.425
센서 5-대조군 단계 1 PBS + 단계 2 BSA + 단계 3 PBS 0.000 0.389 0.398
센서 6-대조군 단계 1 PBS + 단계 2 BSA + 단계 3 BSA -0.002 0.380 0.390
본원에 개시된 공정, 방법 및 결과는 이에 제한하는 것은 아니나 단백질, 펩티드, 핵산, 세포, 소분자, 소형 유기 분자, 기타 화학적 및/또는 생물학적 분자 등의 결합을 포함하는, 알데히드 코팅된 표면을 이용하여 수행될 수 있는 광범한 범위의 검출 응용으로 인해 일반적으로 적용될 수 있다. 이러한 응용은 단백질분석, 게놈분석, 제약, 약물 발견, 진단, 환경, 화학 등을 포함하나 이로 제한되지 않는 다수의 분야에서 흥미롭다.
실시예 3
스트렙타비딘 ( SA ) 표면을 5% 트레할로오스로 차단
40 ㎕의 5% 트레할로오스 용액을 SA 고정된 웰 (0.05 mg/ml SA 및 0.2 mg/ml SA) 및 대조군 웰 (트레할로오스 단독)에 첨가하고 2시간 동안 결합되게 하였다. 플레이트를 세척하고 피크 파장 값(PWV) 시프트를 측정하였다 (표 6 및 도 2 참조). SA 시프트는 알데히드 표면에 결합되는 SA 결합의 PWV인 한편, 차단제 시프트는 차단제가 SA-고정된 알데히드 표면 상에서 비처리된 알데히드 작용기에 결합되게 한 후 수득된 PWV 시프트였다. 비처리된 알데히드는 더 큰 SA 분자에 비해 소형 차단제 분자에 의해 보다 용이하게 접근된다. 차단제 시프트는 더 높은 SA 농도에서 더 낮은데, 그 이유는 아마도 이러한 웰에서 차단제를 결합시키는데 이용될 수 있는 알데히드가 더 적기 때문이다.
표 6
고정하는 동안 SA 농도 SA 시프트 차단제 변화
Nm 5% 트레할로오스
0.05 mg/mL SA 2.00 2.96
0.2 mg/mL SA 5.81 2.19
알데히드 표면 (스트렙타비딘 없음) - 2.91
실시예 4
비-특이적인 결합을 감소시키는 트레할로오스 효능
비-특이적인 결합을 감소시키는 트레할로오스 효능을 조사하기 위해, SA 표 면에 결합되는 우태아혈청 (FBS)을 감소시키는 트레할로오스의 능력을 측정하였다. 10% 및 100% 시판되는 FBS가 2 nm의 PWV 시프트 또는 5.8 nm의 PWV 시프트로 SA 표면과 반응하도록 하고, 초래된 변화를 측정하였다 (표 7 및 도 3 참조). 표면을 제로 또는 기준선으로 차단한 후 생성된 시그널을 고려하여 시프트를 트레할로오스 시프트에 대해 표준화하였다. 이후 FBS에 존재하는 단백질로 인한 결합의 변화를 측정하고 비-특이적 결합으로서 기록하였다.
표 7
결합되는 FBS 10% 결합되는 FBS 100%
SA 시프트, nm 5% 트레할로오스 트레할로오스 없음 5% 트레할로오스 트레할로오스 없음
2 2.41 5.13 1.27 4.65
5.8 0.62 2.64 0.07 2.28
상기 결과는 FBS가 표면 상에서 비반응된 알데히드에 결합되는 것을 나타낸다. 추가로, 이러한 결과는, 여전히 이용가능한 더 많은 비반응된 알데히드기를 표면 상에 지니는 심지어 낮은 SA의 고정 밀도에서도, 트레할로오스를 이용한 차단이 비-특이적인 결합을 감소시켰음을 입증한다.
트레할로오스는 SA 표면에 대한 FBS로부터의 단백질의 비-특이적인 결합을 감소시켰다. 가장 높은 시프트 감소는 5.8 nm SA 표면에서 나타났는데, 이는 차단제의 최적 선택이 고정된 표적 단백질의 표면 밀도에 의존적임을 나타낸다. 바꾸어 말해, 낮은 표면 밀도의 경우, 표면이 엉성하게 커버될 때, 소분자 차단제 또는 큰 분자 차단제, 예를 들어 비활성 단백질이 이용될 수 있었다. 그러나, 높은 표면 밀도에서, 표면에 높은 단백질 적용범위가 존재할 때, 차단제는 단백질 층을 관 통하여 비반응된 알데히드에 결합되기에 충분하게 작아야 한다.
차단제의 선택을 위한 또 다른 고려 사항은 표면의 의도된 적용에 있다. 단백질-단백질 상호작용, 예를 들어 항체의 스크리닝과 같은 적용에 이용된 표면은 일반적으로 낮은 밀도의 표적 단백질을 지니는 한편, 고-고정 밀도 표면은, 예를 들어 약물 스크리닝과 같은 소분자 결합을 검출하는데 이용된다.
실시예 5
특정 단백질-단백질 상호작용에 대한 트레할로오스의 영향
특정 단백질-단백질 상호작용에 대한 트레할로오스의 영향을 조사하기 위해, SA 표면에 대한 비오틴의 결합력을 방해하는 트레할로오스의 능력을 측정하였다. 10% 또는 100% FBS 중의 비오틴이 5.8 nm의 PWV 시프트로 SA 표면과 반응하도록 하고, 초래된 변화를 측정하였다 (표 8 참조). 괄호로 표시된 비오틴 결합으로부터 초래된 이론상의 시프트를 하기 식으로부터 산출하였다: (비오틴의 Mol. Wt. / SA의 Mol. Wt) x SA 상에서 비오틴에 대한 결합 부위의 # x SA 시프트, 또는 (244/55000) x 4 (결합 부위) x 5.8 nm (SA 시프트). 뚜렷한 비오틴 결합 시그널이 모든 경우에 관찰되었다. 따라서, 트레할로오스는 다른 차단제에서 보여지는 것과 같이 비오틴 결합을 방해하지 않는 것으로 보인다.
표 8
FBS 10% FBS 100%
SA 시프트 5% 트레할로오스 트레할로오스 없음 5% 트레할로오스 트레할로오스 없음
5.8 nm 0.09 (0.104) 0.08 (0.104) 0.1 (0.104) 0.12 (0.104)
실시예 6
HSA - 와파린 단백질- 소분자 시스템에 대한 트레할로오스의 영향
트레할로오스를 이용하여 다른 단백질-소분자 시스템 상에서의 비-특이적 결합을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 트레할로오스는 인간 혈청 알부민(HSA) 및 와파린의 상호작용과 관련된 비-특이적 결합을 차단할 수 있다. 1% DMSO에서 검정을 수행하였다. HSA를 5% 트레할로오스로 차단하였다. 결과는 표 8 및 도 4에 제시된다. 표면에 대한 와파린의 비-특이적 상호작용의 트레할로오스 차단은 1 μM 미만의 HSA에 대한 특이적 결합을 검출할 수 있게 하였다. 트레할로오스가 첨가되지 않는 경우 결합을 이렇게 낮은 농도로 검출하기는 어렵다.
표 9
Figure 112009032922742-PCT00001
실시예 7
카르보닉 탈수효소( CA )- 카르복시설폰아미드 ( CBS ) 단백질- 소분자 시스템에 대 한 트레할로오스의 영향
트레할로오스를 이용하여 다른 단백질-소분자 시스템 상에서의 비-특이적 결합을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 트레할로오스는 CBS와 카르보닉 탈수효소의 상호작용과 관련된 비-특이적 결합을 차단할 수 있다. CA 표면을 5% 트레할로오스로 차단하였다. 결과를 표 9 및 도 5에 제시한다. 표면에 대한 CBS의 비-특이적 상호작용의 트레할로오스 차단은 1 μM 미만의 CA에 대한 특이적 결합을 검출할 수 있게 하였다. 트레할로오스가 첨가되지 않는 경우 결합을 이렇게 낮은 농도로 검출하기는 어렵다.
표 10
Figure 112009032922742-PCT00002
실시예 8
바이오센서 표면 상에서 비-특이적 단백질 결합의 차단
트레할로오스와 같은 이당류 분자를 이용하여 단백질 또는 다른 분자의, 예 를 들어 단백질 코팅된 바이오센서 표면, 예컨대 BIND™ 센서 플레이트에 대한 비-특이적 결합을 차단할 수 있다.
이당류 분자는 단백질-코팅된 플레이트를 담는 저장 용액으로서도 이용될 수 있다. 요망되는 단백질을 바이오센서 표면 상에 고정시키며, 예컨대 스트렙타비딘을 BIND™ 센서 표면 상에 고정시킨다. 트레할로오스와 같은 이당류 분자의 용액을 플레이트의 웰에 첨가하고 패키징한다. 따라서, 사용자가 바이오센서를 받을 때, 표면은 이당류 분자로 미리 차단되어 있다.
실시예 9
아민 표면에 대한 당 결합
물 중의 각각 5% 및 2.5%의 락토오스 및 글리세르알데히드 용액을 아민 작용기로 2시간 동안 작용기화된 BIND™ 센서 플레이트에 첨가하였다. 이후 플레이트를 물로 충분히 세척하고 물에서 밤새 저장하였다. 플레이트를 다시 물로 세척하고 당의 결합을 측정하였다. 하기 표는 밤새 인큐베이션하기 전 및 인큐베이션 후의 시프트 간의 차이를 나타낸다. 시프트가 밤새 현저하게 변화되지 않은 것은, 당 차단제와 표면 상의 아민 작용기 간의 안정한 결합을 나타냄에 주목한다.
아민 표면에 결합되는 당 용액 2시간 인큐베이션 및 세척 후 PWV 변화, nm 밤새 인큐베이션 및 세척 후 PWV 변화, nm
락토오스 5% 용액 4.86 4.82
글리세르알데히드 2.5% 용액 1.75 1.72

Claims (25)

  1. 표면을 당(sugar) 분자로 처리함으로써 표면 상에서의 비-특이적 결합을 감소시키는 것을 포함하여, 알데히드-작용기화되거나, 아민-작용기화되거나, 또는 이들의 조합에 의해 작용기화된 표면 상에서 비-특이적 결합을 감소시키는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 당 분자가 이당류를 포함하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 이당류가 트레할로오스 분자이거나 트레할로오스 분자를 포함하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 당 분자가 덱스트란 설페이트이거나 덱스트란 설페이트를 포함하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 표면이 바이오센서 표면인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 바이오센서가 비색 공명 반사 바이오센서(colorimetric resonant reflectance biosensor)인 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 당 분자가 단당류, 이당류, 다당류, 삼당류, 사당류, 오당 류 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 표면이 아민-작용기화된 표면인 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 당 분자가 락토오스, 글리세르알데히드, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 당 분자가 트레할로오스 및 락토오스를 포함하는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 당 분자가 트레할로오스 및 글리세르알데히드를 포함하는 방법.
  12. 표면-부착된 알데히드기에 결합된 다수의 특이적 결합 물질 및 표면-부착된 알데히드기에 결합된 다수의 당 분자를 포함하는 바이오센서.
  13. 제 12항에 있어서, 당 분자가 이당류를 포함하는 바이오센서.
  14. 제 13항에 있어서, 이당류가 트레할로오스 분자인 바이오센서.
  15. 제 15항에 있어서, 당 분자가 이당류인 바이오센서.
  16. 제 13항에 있어서, 이당류가 트레할로오스 분자인 바이오센서.
  17. 제 12항에 있어서, 당 분자가 덱스트란을 포함하는 바이오센서.
  18. 제 12항에 있어서, 당 분자가 덱스트란인 바이오센서.
  19. 제 12항에 있어서, 특이적 결합 물질이 단백질인 바이오센서.
  20. 제 19항에 있어서, 단백질이 스트렙타비딘을 포함하는 바이오센서.
  21. 표면-부착된 알데히드기에 결합된 특이적 결합 물질 및 당 분자를 포함하는 저장 용액을 지니는 바이오센서를 함유하는 패키지.
  22. 제 21항에 있어서, 당 분자가 이당류를 포함하는 패키지.
  23. 제 22항에 있어서, 이당류가 트레할로오스를 포함하는 패키지.
  24. 제 21항에 있어서, 당 분자가 덱스트란을 포함하는 패키지.
  25. 제 21항에 있어서, 당 분자가 덱스트란인 패키지.
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