JPS63133065A - 生物活性物質の安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

本発明は、流体試料中の微量成分測定用分析素子に係り
、特に生物学的流体試料中の特定成分を分析するための
多層分析フィルムに関する。 更に詳細には、免疫学的測定に使用するための分析素子
において、該測定に必要な抗原、抗体などの固定され゛
た生物活性性質の安定化に関する。

【従来の技術】

生物学的流体試料中に極微１含有されるａＩＡ質を検出
する各種分析法の開発がされてきている。その分析方法
は、主として免疫反応をその原理とするものである。上
記原理を用いる画定法として、種々のものが開発されて
きたが、最も精度の高いものとして、免疫測定法が知ら
れている。 免疫測定法は、１９８５年、ベルソン（Ｂｅｒｓｏｎ）
とイアロウ（Ｙａｌｌｏｗ）が、放射性ヨードで標識し
たワシインシェリンと糖尿病患者血清中の抗インシュリ
ン抗体を用いて、血清中のインシュリンを測定すること
に成功して以来、放射免疫測定法が広く用いられている
。 これを契機に標識化合物として、放射性同位元素以外の
ものが種ｊ！ｉ開発されてきた。例えば標識化合物とし
て酵素、酸素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテリオ
７Ｔ−ジ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、有機
補欠分子族、化学発光性反応体及び蛍光性分子等が挙げ
られる。 しかしこれらの方法においては、測定結果の再現性を高
めるために、反応試薬を正確にはかりとったり、また遠
心分離によって沈澱と上澄液を厳密に分離しなければな
らず、高いＰＹ！！ｉ１度を要する。 このような従来の方法にかわって、高度な熟練を必要と
することなしに、簡便、迅速、及び再現性の高い方法が
提案されている。その一つにドライケミス）　ＩＪを使
った免疫学的測定法がある。 たとえばＣｌ１ｎ、Ｃｈｅｍｏ、ｖｏｌ　２８．Ｐ１８
９４（１９８２）では、補酵素を標識した薬物とアポ酵
素とを用いる方法のストリップが記載されている。 また抗体固定展開層、試薬層、透明支持体から成る多層
フィルム上に、標識した薬物と希釈検体液の混合液を滴
下し発色濃度を支持体側から反射測光し、検体液中の薬
物を測定する方法がＣｌ１ｎ。 Ｃｈｅｍ、、Ｖｏ１３１．ｐ９１０，９１１（１９８５
）に記載されている。 池にも特開昭５７−８２７６６号、同５７−８２７６７
号、同５７−１０１７６０号、同５７−１０１７６１号
、同５７−１９６１５３号、同５７−６７８６０号、同
５７−２００８６２号、同５８−１８１６７号、同５９
−７７３５６号、同５９−１７０７６８号ｌ；記載され
ている。これらの多層フィルムは抗体が固定された担体
を含有する多孔質層を有している。 該担体への抗体の固定は、物理的または化学的方法によ
って行なわれる。該担体としてはメンブランフィルタ、
ｗｔ物、不織布、水透過性の紙、繊維質。 非繊維質多孔性物質、繊維質無機材料等が用ν・られて
いる。 多孔質層は、シーＹ状担体に抗体を固定したものやガラ
ス繊維などに抗体を固定した後、該ガラス繊維分散液を
フィルタ上で濾過してシート状にしたもの等をそのまま
或は他の層上にはりつけたり、単にかさねで積層して作
成される。 もう一つの方法としては、たとえば繊維質や非繊維質を
バインダを含有する溶媒中に分散して他の層上に連Ｉ＆
塗布して積層する方法がある。 後者の方法の方が製造、生産及びコストにおり）で有利
である。 しかしこの方法は、使用する溶媒、バインダ及び塗布乾
燥工程によって、多孔質層中の担体に固定されている抗
体または抗原の活性が低下する欠点を有している。 尚前記活性劣化は多孔質層の形態の如何を問わず作成工
程、使用までの経時に伴って多かれ少かれ問題となる所
である。

【発明の目的】

よって本発明の目的は、多孔質層中の担体に固定されて
いる生物活性物質の安定化方法を提供することである。 また、多孔質層の作成方法にかかわらず、固定された生
物活性物質の安定化方法を提供することである。

【問題点を解決するための手段】

特開昭６１−１８９４５４号には、プラスチック、ガラ
スまたは紙を用いてディスク状、ビーズ状またはチュー
ブ状に形成されたものに固定した抗体の安定化方法とし
て固定化抗体を蔗糖もしくは、マンニトールまたはそれ
らの混合物を保護剤として用い該物質を含有する水溶液
で処理した後乾燥して固定化抗体を安定化する方法が記
＠されている。更に保護剤の蔗糖もしくはマンニトール
の溶媒として微量の牛血清及び／または牛血清アルブミ
ンを含有する緩衝液を用いることが記載されているが、
牛血清及び／または牛血清アルブミンの蛍は微量であっ
て非特異的吸着を除去する点においては十分であるが、
固定化生物活性物質に対する添加量のオーダとして少な
すぎ、その安定化に効力を及さず高々前記溶液のｖｌ衝
に効果を顕すに止まる。 また特開昭６１−１７７９９７号には、多孔質層に含有
する酵素などの蛋白質の活性を保持するために、繊維質
担体とｖｔ索などの分散液に牛血清アルブミンなどを添
加し乾燥させることにより、酵素などの物質の活性を保
持したまま安定に多孔質層中に含有させる方法が記載さ
れている。 これらの方法を用いても、多孔質層中の固定化生物活性
物質の安定化には不十分であった。

【発明の構成】

前記号通り担体に固定される生物活性物質の安定性は尚
も不充分であり、しかもその安定性の保証は分析の信憑
性に係る点に鑑み、検討を進めた結果、生物活性物質が
固定された担体を含んで構成される多孔質層の少なくと
も１層を有する分析素子に於て、前記担体重量の４％以
上の重量の糖類及び７９６以上のｆｆ１ｆｉの不活性蛋
白質の三者を合有することをｖｆ徴とする前記担体に固
定された生物活性物質の安定化方法によって前記本発明
の目的が達成されることを見出した。 尚前記の如く本発明は糖類及び不活性蛋白質の共存を必
須条件としている。 また含有量は担体重量を基準にして糖類は４％以上、不
活性蛋白質は７％以上であるが、その上限は大々乾燥時
に、夫々の単体結品もしくは凝塊を生じない範囲が好し
い。即ち糖類にあっては担体重量の４〜９５％、不活性
蛋白質に於ては７〜９５％である６ 発明者らは、本発明によって固定された生物活性物質、
特に物質が蛋白質である場合の安定化は不活性蛋白質を
含有させることによる蛋白質濃度の上昇と［１による親
水効果、保水効果による相乗効果と考えている。本発明
における担体は、生物活性物質を固定するための物質で
あり、該担体は多孔質層の一部または全部を構成する。 この多孔質層は、反応時間中流体試料を保持するために
、多孔質層の一部若しくは全部に、流体試料と自由に接
触し得る相互連絡空隔孔（短径５μｍ〜３００μｍが好
ましい）を有する多孔性構造が存在していることが必要
である。 上記の条件を満たしていれ１ｒ、多孔質層に使用される
担体は特に限定されない。 好ましい例としてはサイズ１０乃至３５０ミクロンの粒
状体あるいは４０乃至４００メツシユのａ維から１つ以
上選ばれた素材により構成される溝遺体が挙げられる。 該粒状体の材料としては、珪藻土、二酸化チタン、硫酸
バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、徽結品セルロース、珪砂
、ガラス、シリカゾル、架橋デキストラン、架橋ポリア
クリル７ミド、アガロース、架橋アガロース、各種合成
樹脂（ポリスチレンなと）などの他、次のような反応性
基を持つ化合物から成る自己結合型粒子が挙げられる。 例示化合物 （１）ポリ（スチレンーコーグリシノルメタクリレー　
ト　）　（９０／１０　）　　。 （２）ポリ（スチレンーコーメチルアクリレートーコー
グリシジルメタクリレート） （８０／１５１５　］　。 （３＞ポリ（スチレン−ツーｎ−ブチルメタクリレート
−コーグリシジルメタクリレート）（７５／１５／１０
　）。 （４）ポリ（スチレン−ツービニルベンツルクロライド
−コーグリンノルメタクリレート）［８０／１０／１０
　）　。 （５）ポリ（スチレン−コーンビニルベンゼン−コーグ
リシジル７クリレート） ［９０／２／８　）。 （６）ポリ（ｐ−ビニルトルエン−コーグリシジルメタ
クリレート （７）ポリ（メタクリレートーコーグリシノルメタク　
リ　し　ー　ト　）　（　　８０／２０　）　　。 （８）ポリ（スチレンーフーＮ，Ｎ−ジメチルアミノエ
チルメタクリレート０９５１５）。 （９）ポリ（スチレンーコーアノリノルエチルメチクリ
レー））［９５１５）。 （１０）ポリ（スチレンーコ−メチル７クリレートーフ
ーアク口レイン）　（　９０１５１５　）。 （１１）ポリ（スチレンーコーアクリルアミド）　Ｃ　
９５１５　）（１２）ポリ（スチレンーコービニルチオ
ール）　（　９５１５　）（１３）ポリ（スチレンーコ
ー７チロール化アクリルアミド）　（　９５１５　）。 （１４）ポリ（スチレンーコーＬーブチルアクリレート
−グリシジルメタクリレート）　Ｃ　９０１５１５　）
（１５）ポリ（スチレン−ツービニルイソシアネート）
（　９５１５　）　。 （１６）ポリ（メチルアクリレート〜コースチレンーコ
ーＮ−メチロールアクリル７ミド）（　５０／３５／１
５　）。 （１７）ポリ（スチレンーコーグリシノルメタクリレー
トーコーＮ，Ｎ−ツメチルアミ／エチルメチクリレート
）　（　９０１５１５　）。 （１８）ポリ（スチレンーコーメタクリル酸−コ−７ク
リルアミド）　（　９５／２／３　〕。 （１９）ポリ（スチレンーコーＮーメチロールアクリル
７ミドーコーアクリル酸メトキシエチル）　（　９０１
５１５　）　。 （２０）ポリ（ｐ−ビニルトルエンーコーＮ−メチロー
ルアクリルアミドーコーアクリル酸）（９０／８／２　
）　。 （２１）ポリ（メチルメタクリレートーコーグリシノル
メタクリレートーコ−ｔ−ブチルアクリ　し　−　ト　
）　（８０／１０／１０　）　　。 （２２）ポリ（スチレンーコーｐ−ビニルペンシルクロ
ライドーコーアクリル酸−コーアクリル酸ウレイドエチ
ル）　（７５／１０１５／１０　）　。 （２３）ホ１７　（スチレンーコーメタクロレインーコ
ーα−ヒドロキシエチルメタクリレート） （９０１５１５）　。 （２４）　ポリ（スチレンーコーアクロレインーコーア
セトアセトキシエチルノチクリレート） （８５１５／１０　）　。 （２５）ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ノメチルアミン
エチルアクリレートーコービニルスルホニルエチルメタ
クリレート’）　［９０１５１５）　。 （２６）ポリ（ｐ−ビニルトルエンーコー７ミノスチレ
ンーコービニルスルホニルエチルメタクリレート）（８
５／１０１５）。 （２７）ポリ（スチレンーフーＮ、Ｎ−ツメチルアミ／
エチルメタクリレート）　Ｃ９０／１０　）　。 （２８）ポリ（スチレンーコーアクリル酸）（９７／３
）。 （２９）ポリ（スチレン−ツーアクリルアミド）　［９
７／３　：。 （３０）ポリ（ｐ−ビニルトルエンーフ−ｔ　−７’チ
ルアクリレート）（９５１５）。 （３１）ポリ（メチルアクリレートーコーメタクリルア
ミド）（９５１５）。 （３２）ポリ（スチレン−ツーＮ−メチロールアクリル
アミド）（９５１５）。 （３３）ポリ（１１１−ビニルベンノルクロライト−ツ
ーＮ−メチロールアクリルアミド）　［９６／４　：。 （３４）　　ポリ（スチレンーコーイタコン酸）　（９
８／２　）。 （３５）　　ポリ（スチレンーコーし一ブチル７クリレ
ー　　）　　）（９２／８）　　。 （３６）　　ポリ（メチルアクリレートーコースチレン
ーコーアクロレイン）　Ｃ３０／６５１５　）　。 （３））　ポリ（メチルメタクｌ、レートーコースチレ
ンーコ−２−ヒドロキシエチルメタクリレ−）　　＞　
（２５／７０１５　）　　。 （３８）　　ポリ（スチレンーコービニルスルホニルエ
チルアクリレート）　（８０／２０　］　。 （３９）　　ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−）メチルア
ミ７エチルアクリレー）　）（９０／１０）　。 （４０）　　ポリ（スチレンメチルアクリレートーコー
７セトアセトキシエチル７クリレート）［９０１５１５
］。 （４１）　　ポリ（スチレンーコーメタクリル＠　）　
１９５１５　：。 各例示化合物の後の括弧内は重合反応に用いた単量体の
重量％を示す。 あるいは、これら数種の粒子を混合して用いることもで
きる。 また、本発明の担体に用いる繊維としては、バルブ、粉
末濾紙、綿、麻、絹、羊毛、キチン、キトサン、セルロ
ースエステル ン、銅アンモニアレーヨン、ポリアミド（６−ナイロン
、６，６−ナイロン、６，１０−ナイロンなど）、ポリ
エステル（ポリエチレンテレフタレートなど）、ポリオ
レフィン（ポリプロピレン、ビニロンなど）、ガラス繊
維、石綿などの植物性，動物性，鉱物性。 合成，半合成，再生繊維を用いることができ、あるいは
これらを混合して用いても良い。 あるいは別の態様としては吸水性の洋紙、和紙、濾紙、
プランシュポリマ、あるいはガラス繊維、鉱物性繊，！
（石綿など）、植物性繊維（木綿、麻、パルプなど）、
動物性ａｍ（羊毛、絹など）、合成繊維（各種ナイロン
、ビニロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピ
レンなと）、再生ａｍ（レーヨン、セルロースエステル
など）などを単独あるいは混合して製造した織物、不織
布、合成紙などを担体に用いることもできる。 このような粒状体、繊維、あるいは粒状体と繊維の混合
物を塗布及び／又はｇｉ膜することにより、流体試料と
自由に接触し得る相互連絡空隙孔を有する多孔性構造を
なす多孔質層を形成する。自己結合性を有しない粒子は
適当な接着剤を用いて粒子同志が点接着する形で製膜す
ることができ、例えば特開昭４９−５３８８８号、同５
５−９０８５！］号、同５７−６７８６０号の方法を適
用することができる。自己結会性を有する有機ポリマ粒
子は特開昭５７−１０１７６０号、同５７−１０１７６
１号、同５８−７０１６３号に記載の方法により同様に
製膜できる。ａ維又は繊維及び粒子の混合物については
特開昭５７−１２５８４７号、同５７−１９７４６６号
に記１ｉ１されたｍ識号散液を塗布することにより多孔
質層を形成できる。また特開昭６０−１７３４１号で行
なわれている方法のようにゼラチンやポリビニルピロリ
ドンのような水溶性バインダを使用した繊維分数液を塗
布することも可能である。このような分散液を製造する
ためには、多くの方法を単独または組合わせて用いるこ
とが可能である。例えば有用な方法の一つとして界面活
性剤を液体キャリヤへ添加し粒状体及び／又は、繊維の
分散液中における分布および安定化を促進することがで
きる。 使用可能な代表的な界面活性剤の例としては、トライト
ン■Ｘ　−１００（ロームアントノ・−ス社製；オクチ
ルフェノキシポリエトキシエタノール）サーファクタン
トＩＯＧ■（オリーン社製；ニルフェノキシポリグリシ
ドール）等の非イオン性界面活性剤がある。 上記界面活性剤の使用量は殆ど自由であるが、粒状体及
び／又は繊維の重量に対して１０重項八−セント（ｗｔ
％と標記）乃至０，００５ａ＋ｔ％、好ましくは６ｗｔ
％乃至０．０５ｗＬ％用いることがでさる。更に別の方
法として該粒子単位と液体キャリの音波処理、物理的混
合および物理的攪拌処理、ｐＨ調整がある。これらは前
記の方法と組合わせることにより、さらに有用である。 生物活性物質生物活性物質の担体への固定化は、種々の
公知の方法により、生物活性物質を担体の表面に物理的
に吸着させるか、化学反応により直接あるいは間接的に
結合させることにより達成される。その際、物質の該特
定成分に対する特異的結合性が失われないように留意す
る必要があり、例えば石川栄治、河合　忠、宮井　画報
「酵素免疫測定法（第２版）」（医学書院、１９７８年
刊）や千畑一部、土佐哲也、松尾雄志着［実験と応用　
アフイニテイクロマＦグラフィ」（講談社：１９７６年
刊）に記載されている方法を、好ましい方法の例としで
挙げることができる６また担体へのこれらの物質の固定
化は、特異結合部位が保持されており、かつ流体試料中
に遊離、溶解した状態でなければよく、流木試料中に不
溶の状態で分散されていてもよい。 これらの固定化操作は、前述の担体にあらかじめ行って
おいた後、多孔質反応層を形成しても良く、あるいは多
孔質層を形成した後に該固定化繰作を行へことも可能で
ある。 前者の場合、前記物質を固定化した担体の他に前述の特
異的反応に関与しない蛋白質のみを固定化した担体を調
節のために加えることも可能である。 二種の固定化物の混合比は、各々に固定化された特異結
合物質の量と結合定数に応じて定められて、必要に応じ
ては更に、特異的結合物質を固定していない担体を調整
のために加えてもよい。 本発明における生物活性物質としては、抗体、抗原レク
チン、アビノン、プロティンＡなどの蛋白質があげられ
る。また抗体の場合は、活性抗体７ラグメントであるＦ
　ａｂＳＦ　ａｂ’又はＦ（ａｂ’）２もあげられる。 本発明における糖類としては、シクロデキストリン類（
ａ−１β−１ｙ−シクロデキストリン）、非還元糖類（
シュクロース、トレハロース）、マンニトール等があげ
られる。 好ましい例として、シュクロースがあげられる。 またこれらを二種以上の混合物で使用してもよい。 本発明における不活性蛋白質としては、ゼラチン、ゼラ
チン分解物、アルブミン、牛血清、牛血清アルブミン等
があげられ、好ましい例と仁で牛血清アルブミンがあげ
られる。 生物活性物質が固定された担体にＷＩ類及び不活性蛋白
質を共存させる方法としては、単に混合する方法、担体
に糖類及び不活性蛋白質の７８液に含浸させた後、乾燥
（好ましくは凍結乾燥）する方法や、担体、糖類及び不
活性蛋白質の分散液を乾燥（好ましくは、凍結乾燥）す
る方法があげられる。

【実施例】

以下に本発明の実施例について述べられるが、本発明は
これらの実施例によって限定されるものではない。 実施例１ （１）ヤギ抗ヒ）ＩｇＧ抗体固定化セルロース繊維の作
成 粉末濾過Ｄ（東洋濾紙社ｇＩ）１ｏｏｙを、ブタンノオ
ールノグリシノルエーテル（アルドリッチ社９９）２５
０ｚｌと２ｇｇ／ｘｉの水素化ホウ素ナトリウムを含む
０．６Ｍ水酸化ナトリウム水溶液２５０ｚＮとの混合液
中に懸濁し、４０°Ｃで６時間振盪攪拌した後、純水お
よびアセトンで洗浄し乾燥してエポキシ基を導入した粉
末１１紙りを得た。 この粉末濾紙Ｄ　５０ｇを５００ｍｇのヤギ抗ヒ）　Ｉ
ｇＧ抗体（カッペル社製）を含む０．５８炭酸ナトリウ
ム−炭酸水素ナトリフム緩衝液（ｐｌｌｌｏ、０＞５０
０Ｒｉ！に懸濁し、４０°Ｃで２０時間振盪攪拌した。 これを濾取し、純水２．５１１’Ｓ０．５Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ１１４．
ｏ）２．５１．０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ
炭酸水素ナトリウム水溶液２．５１にて交互に洗浄した
後、１Ｍトリス−塩酸ｕＬ衝ｎ　（ｐＨ８，５＞１．０
／Ｉ：懸濁し、室温にて２４時間振盪攪件して未反応基
をブロックした。これを濾取し、純水で充分に洗浄し、
ヤギ抗ヒ）ＩｇＧ抗体固定化粉末濾紙りを得た。 （２）　　多孔質層塗布液の調整および固定化抗体の活
性測定 ０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５８燐酸緩ｗＩ
液（ｐｔ１７．４）６．Ｏｇに、下表に示した量のウシ
血清フルブミンおよび／または蔗糖を加えて溶解し、こ
れらの溶液に各々前記（１）項（以後１−（１）の形で
、引用する実施例と項を示す。）で作成したヤギ抗ヒ）
　ＩｇＧ抗体固定化粉末濾紙Ｄ２，０９（含水率を測定
し、固形分として２．０ｇとなるように秤量した）を加
えて、懸濁後、凍結乾燥し、さらに粉末化して凍結乾燥
品を得た。 次に、加えたウシ血清フルアミン量および／または蔗糖
量による換算をして、抗体固定化粉末濾紙りが１．Ｏｆ
ｆとなるように各試料の秤量を行い、下記組成の多孔質
層塗布液を調整した。 トライトンＸ−１０００，１０ｇ コポリ（スチレン−グリシツルメタクリレート）（９０
／１０　］　　　　　　　　　　Ｑ、２５ｇ抗体固定化
粉末濾紙Ｄ　　　　　１．Ｏｆｆ相当量キシレン　　　
　　　　　　３．１゜ 各塗布液を室温で３時間攪拌した後、厚さ１８０μ屑の
ポリエチレンテレフタレートフィルム上に展開させ、・
１０℃で１時間乾燥し、形成した多孔質層をフィルムか
ら剥離し、再び粉末化して固定化抗体の活性測定用試料
を作成した。 固定化抗体の活性測定は塗布液調整で使用した凍結乾燥
粉末を比較として、ヒ）　ｒｇＧおよびベルオキシター
ゼ標識つサギ抗ヒ）Ｉｇに抗体（カッペル社製）を用い
たサンドインチイム７アツセイ法で行った。すなわち、
添加物による換算をして抗体固定化粉末１１１紙りが１
０１２となるように、上記塗布液調整から作成した各試
料を秤量し、ヒ）　ｒｇｃと３７℃１時間反応させ、洗
浄後さらにベルオキシターゼ標識つサギ抗ヒ）　ＩｇＧ
抗体と３７℃１時間反応後洗浄して過酸化水素および０
−フェニレンノアミンによる発色反応を行い、４９２ｎ
ｍで吸光度測定をした。また凍結乾燥粉末を比較として
同様のアンセイを行い、吸光度測定し、下記の式から固
定化抗体の保持活性率（％）を求めた。 この結果を第１表に示す。　　　　　　　−８以ケ、余
、白 ゝ、゛ 第１表 表中（）内の数値は、抗体固定化粉末濾紙Ｄ２．　Ｏｌ
ｌに対する騙ｔ％を表す。 上表から明らかなように、抗体固定化粉末濾紙りにウシ
血清アルブミンおよび蔗糖をそれぞれ７％以上、４％以
上共存させることにより、多孔質層中の固定化抗体の活
性をよく保持できることがわかった、 実施例２ （１）試薬層の作成 厚さ１８０μｌの透明な下引きγ斉ポリエチレンテレフ
タレートフィルムの上に下記の組成の発色試薬層を塗布
、乾燥により作成した。 Ｌ−グルタミン酸ナトリウム　　　　　Ｚ、５ｇ７ｍ２
ノ７ホラーゼ（東洋醸造社！＋り　　　　２５００ｖ／
肩２酸化型ニコチン７ミドアデニンノヌクレオチドホス
７エート　　　　　　　　１．７ｇ７ｘ２Ｎｅｏ−７８
本　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．２Ｈ／ｚ
２１．２−ビス（ビニルスルホニル）エタン０、２Ｈ／
ｚ２ Ｐ−オクチルフェノキシボリエトキシ 工タ／−ル　　　　　　　　　　　　２．Ｏｇ／ｉ２脱
イオン化ゼラチン　　　　　　　　２５．０ｇ／＊２＊
　　Ｎｅｏ−ＴＯ：　３．３’−（４，４’−ビフェニ
レンンービス（２，５−シフ１ニルー２Ｈテトラゾリウ
ムクロライド） （２）緩衝剤含有層の作成 前記の試薬層の上に下記の組成の４１衝剤含有層をブタ
／−ル溶液により塗布、乾燥して作成した。 トリス（ヒドロキシメチル）アミ／メタン１１．５ｙ／
ｚ’ トリス（ヒドロキシメチル）アミ／メタン塩酸塩　　　
　　　　　　　　　　　２．４ｇ／ｚ２コポリ（酢酸ビ
ニル−ビニルピロリドン）Ｃ８０／２０　）　　　　　
　　　　　　　　　７．５９７ａ’ｐ−オクチルフェノ
キンポリエトキシ エタノール　　　　　　　　　　　　１．０Ｈ／ｚ２（
３）ヤギ抗ヒ−）　■、、Ｃ抗体固定化セルロース繊維
の作成 １−（１）で作成したヤギ抗ヒ）ＩｇＧ抗体固定粉末濾
紙Ｄ　１０ｇ１．２．のウシ血清アルブミンと１．０ｇ
の蔗糖を含有ｔ　６０．０５Ｍ燐酸Ｈ，衝ｅ、（ｐＨ７
，４）３２．２ｙ中に加えて懸濁し、凍結乾燥した後、
粉末化して抗体固定粉末１１紙りを得た。 （４）　ｐ−７ミ７フエニルマーキユリンクアセテート
のセルロース繊維への固定化 粉末濾紙Ｄ（東洋濾紙社製）１００．を、エビクロロヒ
ドリン（関東化学社！ｌり３０ｓｊ！と０，６８水酸ナ
リトウム水溶液４３０ｍ１との混合液中に懸濁し、４０
℃にて６．０時間振盪攪拌した後、濾取し、純水２１で
洗浄し、さらにアセトン１１で洗浄し乾燥させた。 この官能基を持つ粉末１１紙Ｄ　５０．を、１０％ツメ
チルスルホキシド水溶１（１５００贋！中に入れ、さら
にツメチルスルホキシド１００ｍＮに溶解した９−７ミ
７フエニルマーキユリノク７セテー）　１０ｙと０．５
Ｍ炭酸バッフ　ｒ　−（Ｐ１１ｆＯ５Ｏ）３２＋＋１を
加えて、室温にて２０ｒＬｙ間振盪、攪拌した。これを
濾取し、５０％ツメチルスルホキシドＩＰで洗浄後、さ
らに純水２１で洗浄し、乾燥させ、ｐ−７ミノフ工ニル
マーキユリノクアセテート固定化粉末濾紙りを得た。こ
のｐ−アミ７フ工ニルマーキエリンクアセテート固定粉
末濾紙Ｄ　ｔｏ、、を２−（３）と同様に凍結乾燥し、
粉末化した。 （５）　　多孔質層のｆ乍成 ２−（３）で作成した抗ヒ）　ＩｇＧ抗体固定化粉末ｌ
＆ｉ紙り及び２−（４）で作成したｐ−７ミ／フ工ニル
マーキユリンクアセテート固定化粉末紙りを、下記の組
成の分散液にて２−（２）の緩衝剤含有層の上に、塗布
し乾燥後２Ｘ２Ｃ１の大きさに裁断し、分析素子とした
。 抗体固定化粉末１１紙Ｄ　　　　　　　　５．ＯｇＰ−
７ミノフ工ニルマーキユリツクアセテート固定化粉末濾
紙［１５，ｏ、。 コポリ（スチレン−グリシジルメタクリレート）（９０
／１０　〕２．５９ ）　ラインＸ−１００１，０ｇ キシレン　　　　　　　　　　　　３０゜（６）グルタ
ミン酸デヒドロデナーゼ楳識ヒ）　ＩｇＧの作成 グルタミン酸デヒドロデナーゼ（ＥＣ１１，４，１，４
）１０Ｒ９を１％のグルタルアミデヒドを含む０．１１
４燐酸級＋１１１ｉ液（ｐＨ６，８）０．２這ｌに加え
、４°Ｃにて６時間反応させた。これを０．１５Ｍ塩化
ナリトウムを含む０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）で
平衡化したセファデックスＣ−２５カラムに通し、グル
タルアルデヒド活性化グルタミン酸デヒドロデナーゼ画
分を得た。この両分に５Ｂのヒ）　ＩｇＧを溶解した０
、１５Ｍ塩化ナトリウム溶液１．０１１１お上り１Ｍ炭
酸ナトリウム緩衝液（ｐｌ＋９．５）０．１１１を加え
、４℃２４時間反応させた。この溶液に０．２Ｍリノン
をＯ，ｌｘｌ加え、さらに４℃　２時間反応させた後０
．１５Ｍ塩化す）　ｌ）ラムを含む０．１Ｍ燐酸緩衝液
（ｐＨ７，４）で平衡化したＶｅｔｒｏｇｅｌ＾Ｃ＾３
４カラムに通して精製し、グルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ標識ヒトＩｇＧを得た。 （７）ヒト１．Ｇの測定 ２−（６）で作成したグルタミン酸デヒドロデナーセａ
ｎ　ヒ）　ＩｇＧトに−）　！＋？［；溶液（０−６４
０μｇ／ｗｅ、０．０ＩＭ燐酸ナトリウム４１衝液（ｐ
）１７．６）　）とを混合後、そのｌＯμＩを５−（５
）で作成した分析素子に滴下し、３７°Ｃで１５分間密
閉状態でインキエベーションした後、支持体側から５４
０ｎｍの反射濃度を測定した。 その結果を第２表に示す。 以下余Ｆ白 多孔質層にウシ血清アルブミンおよび蔗糖を含有させた
分析素子によりヒ）　１８Ｇ　Ｏ〜６４０μｇ７ｍｌの
測定を行うことができた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 生物活性物質が固定された担体を含んで構成される多孔
   質層の少くとも１層を有する分析素子に於て、前記担体
   重量の４％以上の重量の糖類及び７％以上の重量の不活
   性蛋白質の二者を含有することを特徴とする前記担体に
   固定された生物活性物質の安定化方法。