FI97425B - Monikerroksinen diagnostinen koe-elementti - Google Patents

Description

97425

Monikerroksinen diagnostinen koe-elementti

Keksinnön tausta

Keksintö koskee monikerroksisia, diagnostisia koe-5 elementtejä, ja erityisemmin biologisten aineiden, kuten proteiinien, immobilisoimiseen tiettyyn elementin kerrokseen sopivien aineiden käyttöä näissä elementeissä.

Useita diagnostisia koe-elementtityyppejä on kuvattu biologisissa nesteissä olevien analyyttien tai metabo-10 Hittien nopeaa analysointia varten. Tavallisesti näyte biologisesta nesteestä, esim. plasmasta, seerumista jne., viedään koe-elementtiin, ja mielenkiinnon kohteena olevan analyytin tai metaboliitin ja koe-elementissä olevan rea-genssin tai olevien reagenssien välisen vuorovaikutuksen 15 tuloksena aikaansaadaan analyyttiä tai metaboliittia vastaava havaittavissa oleva muutos. Havaittavissa oleva muutos voi olla värinmuutos, joka voidaan arvioida visuaalisesti tai lukea spektrofotometrisesti, kuten densitomet-rillä. Toisessa järjestelmässä, joka perustuu fluoresoi-20 vasti merkittyjen biologisten aineiden läsnä oloon, kehitetään fluoresoiva ulostulosignaali, joka luetaan spektro-fluorometrisesti.

Ohutkalvo-monikerroskoe-elementtejä, jotka soveltuvat immunometristen kokeiden suorittamiseen, on kuvattu 25 alalla. Nämä ohutkalvo-monikerroselementit sisältävät ta-· vallisesti tuen, joka kannattaa vähintään yhtä reagenssi- kerrosta ja valoa pidättävää kerrosta, jolloin jonkin ker- • · ’.· · roksen signaalin kehittävä aine voidaan lukea toisessa kerroksessa olevien aineiden häiritsemättä. Elementeissä 30 saattaa olla myös muita kerroksia, jotka suorittavat erilaisia toimenpiteitä, kuten esimerkiksi rekisteröintiker- . .* ros, joka pidättää signaalin kehittävän aineen, jota muo- · · .·; dostuu toisessa kerroksessa tai vapautuu toisesta kerrok sesta.

35 Useissa koemenetelmissä vaaditaan, että biologinen aine, esim. antigeeni tai vasta-aine, on immobilisoitunee- 2 97425 na reagenssikerroksessa ja että sellainen aine pysyy tietyssä kerroksessa koko kokeen ajan. On tunnettua sitoa kovalenttisesti proteiinipitoisia aineita, kuten antigeenejä tai vasta-aineita, matriisiaineeseen, kuten agaroo-5 siin, reagenssikerroksen muodostamiseksi tällaisiin koe-elementteihin. Tämä immobilisointitekniikka ei kuitenkaan riitä kaikissa tapauksissa. Immunometrisissä kokeissa, jotka suoritetaan klassisilla märkäkemian menetelmillä, on myös tunnettua käyttää proteiineja, jotka on immobilisoitu 10 sitomalla polymeerisiin helmiin. Näissä kokeissa biologiset aineet, joilla ei ole vuorovaikutusta immobilisoitu-neiden proteiinien kanssa, poistetaan tavallisesti reak-tiovyöhykkeestä pesutoimenpiteellä. Pesuvaihetta ei kuitenkaan tavallisesti käytetä ohutkalvo-monikerroskoe-ele-15 menttien kyseessä ollessa, koska pesunesteen, joka sisältäisi reagoimattomat reagenssit, poistamiseen ei ole varauduttu .

Tämän vuoksi on olemassa jatkuva tarve uusille aineille, joita voidaan käyttää useiden toimintojen suorit-20 tamiseen monikerroksisissa koe-elementeissä.

Tämän vuoksi keksinnön tavoitteena on tarjota käyttöön uusi, biologinen, diagnostinen koejärjestelmä.

Keksinnön toisena tavoitteena on tarjota käyttöön monikerroksisia biologisia, diagnostisia koe-elementtejä, 25 jotka sisältävät glyoksyyliagaroosia, ai dehydi ryhmästä % i '\m· derivoitua agaroosia, yhdessä tai useammassa kerroksessa.

*···* Edelleen tavoitteena on tarjota käyttöön moniker- • · ’.· roksisia, diagnostisia koe-elementtejä analyyteille, joi den molekyylipaino on noin 5 000 tai vähemmän.

30 Keksinnön lyhyt yhteenveto Nämä ja muut tavoitteet ja edut toteutetaan keksin- .nön mukaisesti tarjoamalla käyttöön monikerroksisia, diag- « > · , nostisia koe-elementtejä, joille on tunnusomaista, että ne sisältävät useita erillisiä kerroksia, joista vähintään 35 yksi on reagenssikerros, jolloin vähintään yksi mainituista useasta kerroksesta muodostuu glyoksyyliagaroosia si- 97425 3 sältävästä matriisiaineesta ja jolloin glyoksyyliagaroosi ei ole kyllästetyssä amiinimuodossa.

Glyoksyyliagaroosi on käyttökelpoista biologisen aineksen immobilisoimiseksi tiettyyn kerrokseen ja pidät-5 tämään tämä aines kerroksessa koetapahtuman ajan. Aine on myös käyttökelpoista suodatusaineena; toisin sanoen se voi estää aineita, kuten esimerkiksi proteiineja, eli aineita, joiden molekyylipaino on noin 10 000 tai enemmän, diffun-doitumasta kerrokseen tai siitä pois, ja samanaikaisesti 10 sallia pienempimolekyylipainoisten aineiden, kuten haptee-nien tai signaalin kehittävällä värillä merkittyjen hap-teenien, diffundoitumisen kerrokseen, siitä ulos tai sen läpi. Glyoksyyliagaroosia voidaan käyttää useammassa kuin yhdessä saman diagnostisen koe-elementin kerroksessa.

15 Glyoksyyliagaroosia voidaan esimerkiksi käyttää reagenssi-kerroksessa immobilisoimaan siinä oleva(t) reagenssi(t), ja sitä voidaan myös käyttää saman koe-elementin suodatus-kerroksessa.

Glyoksyyliagaroosia voidaan käyttää sellaisenaan 20 matriisiaineena reagenssi- tai suodatuskerroksessa tai sitä voidaan käyttää yhdessä muiden polysakkaridien, kuten derivoitumattoman agaroosin, kanssa.

Piirrosten lyhyt kuvaus

Keksinnön sekä sen muiden tavoitteiden ja lisäpiir-25 teiden paremmin ymmärtämiseksi viitataan seuraavaan sen i V useiden edullisten suoritusmuotojen yksityiskohtaiseen kuvaukseen yhdessä liitteenä olevien piirrosten kanssa, :Y: joissa kuvio 1 on osittain kaavamainen poikkileikkauskuva 30 keksinnön mukaisesta monikerroksisesta koe-elementistä ja kuvio 2 on osittain kaavamainen poikkileikkauskuva . toisesta keksinnön mukaisesta monikerroksisesta koe-ele- « · · mentistä.

Edullisten suoritusmuotojen kuvaus | 35 Glyoksyyliagaroosi on kuvattu US-patentissa 4 275 196, jossa myös esitetään, että aine on käyttökel- 4 97425 poista proteiinien vyöhykeimmobilisointiin elektroforeet-tisissa menetelmissä kompleksisten proteiinien erottamiseksi ja sitä seuraavaan erottuneiden proteiinien analysointiin. Patentissa ei esitetä glyoksyyliagaroosin käyt-5 töä kuivissa, ohutkalvo-monikerroskoe-elementeissä, jotka hakijat esittävät.

Glyoksyyliagaroosia voidaan valmistaa kaksivaiheisella menetelmällä. Aluksi kaupallista 4-%:ista agaroosi-geelisuspensiota käsitellään glysidolilla ja IM NaOH-10 liuoksella, joka sisältää NaBH4:a antioksidanttina. Sen jälkeen saatu glyseryyliagaroosi katkaistaan reaktiolla perjodaatin kanssa, jolloin saadaan glyoksyyliagaroosia ja formaldehydiä. Glyoksyyliagaroosissa voi olla enintään kaksi aldehydiryhmää agaroosin sokeriyksikköä kohti.

15 Aldehydistä derivoitu agaroosi reagoi reversiibe- listi primäärisen amiinin kanssa, jolloin muodostuu Sohiffin emäs, kuten seuraavassa on kuvattu

Agaroosi-0-CH2CH0 + RNH2 — ^ Agaroosi-0-CH2CH=NR + H20 20 Tämän reaktion tasapaino siirtyy oikealle, kun pH nousee. Näin ollen proteiini, kuten esimerkiksi vasta-aine, voidaan sitoa kovalenttisesti glyoksyyliagaroosiin proteiinin amiiniryhmien reagoidessa aldehydiryhmien kanssa, kuten 25 edellä on kuvattu.

: V Aldehydin määrä derivoidun agaroosin yksikköpainoa • · · kohti voi vaihdella riippuen menetelmästä, jolla derivoitu . aine on valmistettu. Vapaan aldehydin määrä derivoidun aineen grammaa kohti voidaan laskea käyttämällä hyväksi 30 aldehydiryhmien reaktiivisuutta p-nitrofenyylihydratsiinin kanssa, jolloin muodostuu hydratsoneja, kuten seuraavassa . on kuvattu • · 35 02N^O>-NHNH2 + R-CHO s 02^ NHNH=CHR + H20 97425 5

Glyoksyyliagaroosiaineen kuivatusta kalvosta saatua pyöreää näytettä (halkaisija 25,4·10'3 m), jota kannattaa polymeerinen tuki, voidaan "kelluttaa" päällystetty sivu alaspäin 50 ml:n p-nitrofenyylihydratsiinireagenssia pin-5 nalla pHrssa 4 suljetussa lasipullossa värähtelevällä alustalla, niin että kalvot sekoittuvat kevyesti. Kolmen tunnin kuluttua kalvonäytteet poistetaan, pestään hyvin vedellä, ja niiden annetaan kuivua ympäröivissä olosuhteissa. Kalvojen optinen absorbanssi 390 nm:ssä rekiste-10 röidään, ja vapaan aldehydin milliekvivalenttimäärä derivoidun agaroosin grammaa kohti lasketaan olettaen, että säteen kulkema matka on 1 cm ja hydratsonin absorptioker-roin (6) on 30 000.

Keksinnön mukainen reagenssikerros voidaan muodos-15 taa aluksi valmistamalla glyoksyyliagaroosin vesipitoinen liuos (noin 1 % kiintoainetta) kuumentamalla kiehumispisteeseen. Sen jälkeen liuos jäähdytetään 50 - 55 °C:seen ja reagenssi (reagensseja), esim. proteiinipitoista ainetta, kuten vasta-ainetta, ja puskuria sisältävä liuos lisätään.

20 Reaktio, jossa vasta-aine sitoutuu glyoksyyliagaroosiin, vaatii suhteellisen korkean pH:n, noin 8,5 tai korkeamman. Reaktiivisuusalue vaihtelee pH:n mukaan; pH:n noustessa sitoutuminen lisääntyy. Todellinen sitoutumisaste riippuu pH:sta ja glyoksyyliagaroosin aldehydipitoisuudesta. Aine 25 päällystetään niin nopeasti kuin mahdollista, jotta väl- : tettäisiin ei-toivottu vasta-aineiden denaturoituminen • « · kohonneessa lämpötilassa. Päällystämisen jälkeen kerros :: kuivataan, jonka aikana sitoutumistasapainoa suosii vesi- pitoisuuden pienentyminen. Reaktio-olosuhteet suosivat 30 myös glyoksyyliagaroosin ristisidontareaktioita, esimer kiksi aldolikondensaation kautta, jolloin muodostuu tiivis matriisirakenne. Seisotettaessa olosuhteissa, joissa on korkea pH, sitoutumis- ja ristisidontareaktiot jatkuvat.

Kuten aikaisemmin on esitetty, glyoksyyliagaroosi 35 voidaan myös yhdistää muihin polysakkarideihin, kuten de- - 97425 6 rivoitumattomaan agaroosiin. Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa derivoitumattoman agaroosin ja glyoksyyli-agaroosin seosta painosuhteessa noin 3:1 käytetään ohut-kalvo-monikerroskoe-elementissä. Seos asetetaan etusijal-5 le, koska sen käsittely on helpompaa valmistuksen ja sitä seuraavan prosessoinnin aikana. Seos voidaan valmistaa sekoittamalla glyoksyyliagaroosin liuos, jossa on tyypillisesti vähemmän kuin 5 % kiintoainetta, 50 °C:ssa agaroosi-liuoksen kanssa ja jatkamalla sekoittamista 50 °C:ssa 10 useiden minuuttien ajan. Seos, jossa edullisesti on noin 0,04 - 0,20 milliekvivalenttia vapaata aldehydiä kokonais-seoksen grammaa kohti, voidaan käyttää sellaisenaan tai sen voidaan antaa geeliytyä, ja sen jälkeen myöhemmin kuumentaa, kun ainetta halutaan yhdistää ohutkalvo-moniker-15 roskoe-elementtiin.

Jos glyoksyyliagaroosikerros päällystetään toisella kerroksella tai toisilla kerroksilla tai glyoksyyliagaroo-sikerrosta käsitellään edelleen jollakin tavalla, esimerkiksi pesemällä kuivatun kerroksen pH:n alentamiseksi, on 20 huomattu, että ensin muodostetun kerroksen tulisi antaa palautua jonkin aikaa, muutamasta tunnista yhteen tai useampaan päivään.

Kokeet ovat osoittaneet, että keksinnön mukaisesti saatavat tulokset riippuvat osittain reagenssi-, suodatus-· 25 tai jonkin muun kerroksen matriisiaineen (glyoksyyliaga- • · • · roosi tai glyoksyyliagaroosin ja jonkin muun polysakkari- *... din seos) aldehydipitoisuudesta. Aldehydin määrä matrii- • « V siaineen yksikköpainoa kohti, mikä johtaa haluttuihin tu loksiin missä tahansa erityisessä koe-elementissä, voi 30 vaihdella laajalla alueella riippuen muuttujista, kuten esimerkiksi kerroksen muodostavan päällystysnesteen pH:sta ..· sekä päällystysnesteessä käytetystä erityisestä puskuris ta. Kuten edellä on esitetty, on suositeltavaa käyttää matriisiaineena noin 3:1 seosta derivoitumatonta agaroosia 35 ja glyoksyyliagaroosia. Sopiva seos, jossa on noin 0,04 - 97425 7 0,20 milliekvivalenttia vapaata aldehydiä seosgrammaa kohti, voidaan valmistaa sekoittamalla yksi osa glyoksyyli-agaroosia, jonka vapaan aldehydin määrä on noin 0,16 - 0,8 milliekvivalenttia grammaa kohti, kolmen osan kanssa aga-5 roosia. Rutiiniseurantakokeita voidaan käyttää varmistamaan se aldehydipitoisuus, joka johtaa haluttuihin tuloksiin missä tahansa tietyn monikerroksisen koe-elementin kerroksessa.

Keksinnön mukaisissa monikerroksisissa koe-elemen-10 teissä voi olla tarpeen päällystää glyoksyyliagaroosiker-ros toisella kerroksella tai toisilla kerroksilla, ja kerroksen (kerrosten) tehtävästä ja erityisistä aineista riippuen voi joskus olla tarpeen päällystää yksi tai useampia näistä kerroksista suhteellisen matalassa pH:ssa, 15 eli neutraalin pH-arvon alapuolella. Näissä tapauksissa Schiffin emästuotteen tulisi reagoida reversiibelisti vapaaksi amiiniksi (proteiini) ja polymeeriseksi aldehydik-si. Jopa näissä tapauksissa on kuitenkin huomattu, että glyoksyyliagaroosikerros jatkaa tehokkaasti proteiinipi-20 toisen aineen sitomista. Tämä päällystettyjen glyoksyyli-agaroosikerrosten ominaisuus on näytetty kokeellisesti. Vaikka ei ole tarkoitus rajoittaa keksintöä mihinkään teoreettiseen mekanismiin, teoretisoidaan, että glyoksyyli-agaroosiaine muodostaa hyvin tiiviin matriisirakenteen, 25 joka sitoo reagenssin tai muita aineita hyvin tehokkaasti • tyypillisissä koeolosuhteissa, jotka yleensä käsittävät neutraalin pH:n.

Mitä tahansa sopivaa ja biologisesti yhteensopivaa emäksistä puskuriainetta, joka, kun sen annetaan jäädä 30 kerrokseen sen muodostumisen jälkeen, ei osallistu tiet-tyyn, mielenkiinnon kohteena olevaan kokeeseen, voidaan käyttää glyoksyyliagaroosikerrosten valmistuksessa. Kuten edellä on todettu, päällystysnesteen, josta glyoksyyliagaroosikerros päällystetään, pH voi vaikuttaa Schiffin emäk-: 35 sen muodostavan glyoksyyliagaroosin ja primaarisen amiinin 8 97425 välisen reaktion tasapainoon ja myöskin glyoksyyliagaroo-sin ristisidontareaktioihin. Tavallisia sopivia puskureita ovat Bicine, Bis-Tris-propaani, natriumkarbonaatti ja nat-riumboraatti. Puskurin valinta näyttää riippuvan jonkin 5 verran glyoksyyliagaroosin aldehydisubstituution asteesta.

Esimerkiksi näyttää siltä, että jos glyoksyyliagaroosin aldehydisubstituutio on suhteellisen pieni, saadaan parempia tuloksia, jos käytetään puskureita, joiden pKa-arvo on suhteellisen korkea, tai epäorgaanisia puskureita, kuten 10 esimerkiksi natriumkarbonaattia. Yleisesti ottaen käytet täessä samaa puskuria korkeampi pH johtaa parempaa sitoutumiseen. Erilaiset puskurit, kun niitä käytetään samassa pHrssa, saattavat kuitenkin osoittaa eroja saaduissa tuloksissa.

15 Kuvioissa 1 esitetään erityisen edullinen keksinnön mukainen koe-elementti. Koe-elementti 10 käsittää läpinäkyvän tukikerroksen 12, joka kannattaa reagenssikerrosta 14, valoa pidättävää kerrosta 16 ja valinnaista kerrosta 18, joka voi olla reagenssikerros, suodatuskerros, esim. 20 proteiineille, kulumista ehkäisevä kerros jne. Eräässä suoritusmuodossa reagenssikerros 14 sisältää immunokomp-leksin, jossa vasta-aine on kompleksoitunut fluoresoivasti merkityn antigeenin kanssa ja joka on dispergoitunut gly-oksyyliagaroosimatriisiin tai glyoksyyliagaroosin ja toi-25 sen matriisiaineen, kuten esimerkiksi agaroosin tms., • * * • seosmatriisiin. Reagenssikerros 14 muodostetaan kuten • · · edellä on kuvattu; tässä tapauksessa fluoresoivasti merki- :Y tyt antigeenit yhdistetään päällystyskoostumukseen yhdessä vasta-aineiden kanssa. Valoa pidättävä kerros 16 sisältää 30 mitä tahansa sopivaa ainetta, kuten esimerkiksi rautaoksidia, titaanidioksidia tms. dispergoituneena sidosainee-seen, kuten agaroosiin. Kerros 18 on valinnainen ja voi käsittää kulumista ehkäisevän kerroksen sellaisesta aineesta, kuten agaroosista, kun reagenssikerros 14 sisältää 35 immunokompleksin, tai se saattaa sisältää useita aineita, 97425 9 kuten puskuri-, pidätys- ja/tai syrjäytysaineita jne. Kerros 18 voidaan jättää pois silloin, kun inununokompleksi on reagenssikerroksessa 14. Toisessa suoritusmuodossa fluore-soivasti merkitty antigeeni voi olla dispergoituneena 5 kauttaaltaan kerrokseen 18 ja kerros 14 sisältää immobili-soidun vasta-aineen. Koe-elementti 10 sisältää päällystetyn kerroksen tai muita välineitä (ei esitetty) nestemäisen näytteen levittämiseksi tasaisesti kerroksen 18 pinnalle. Mitä tahansa sopivaa nesteenlevitysmenetelmää voi-10 daan käyttää, mukaan lukien esimerkiksi partikkelikerrok-set, polymeeriset kerrokset, kuitumaiset kerrokset, kudotut tekstiilikerrokset sekä nesteenkuljetusjärjestelmät, jotka on esitetty alalla tähän tarkoitukseen sopiviksi. Alalla tunnetaan useita tällaisia levitysaineita, joiden 15 avulla nestenäyte voidaan levittää tasaisesti koe-elemen-tin pinnalle, ja sen vuoksi tässä ei tarvita laajaa keskustelua tällaisista aineista. Erityisen edullinen nesteenkul jetus järjestelmä on kuvattu siirretyssä, vireillä olevassa hakemuksessa numero 210 732, haettu 23.6.1988.

20 Levitysvälineen, olipa se kerros kuitumaista ainetta jne. tai nesteenkuljetusjärjestelmä, tulisi olla suhteellisen paksu reagenssikerrokseen 14 verrattuna.

Käytännössä nestenäyte levitetään koe-elementin 10 pinnalle, ja neste diffundoituu kauttaaltaan kerroksiin 25 14, 16 ja 18 sekä levityskerrokseen tai -järjestelmään, ja • · • · tasapaino vakiintuu. Jos analyytti, tässä valaisevassa • · · ·... esimerkissä mielenkiinnon kohteena oleva antigeeni (tai • · V hapteeni), on läsnä, se kilpailee fluoresoivasti merkityn antigeenin (sama antigeeni kuin näytteen antigeeni tai sen 30 analogi) kanssa sopivista kerrokseen 14 immobilisoitunei-den vasta-aineiden sitoutumiskohdista. Tapauksessa, jossa . .· fluoresoivasti merkitty antigeeni on aluksi kompleksoitu- • · neena kerroksen 14 vasta-aineeseen, edellinen dissosioituu siitä ja korvautuu näytteen antigeenillä suhteessa, joka i 35 on suurin piirtein sama kuin näytteen antigeenin ja fluo- - 97425 10 resoivasti merkityn antigeenin suhteelliset määrät. Jos fluoresoivasti merkittyä antigeeniä on aluksi kerroksessa 18, se diffundoituu kerrokseen 14 yhdessä nestemäisen näytteen kanssa ja kilpailee näytteen antigeenin kanssa 5 immobilisoituneen vasta-aineen sitoutumiskohdista. Näin ollen jokaisessa suoritusmuodossa, näytteessä olevan antigeenin määrästä riippuen, jokin prosenttiosuus fluoresoivasti merkityistä antigeeneistä sitoutuu immobilisoitunei-siin vasta-aineisiin, jotka eivät ole sitoutuneena näyt-10 teen antigeeneihin. Loput merkityistä antigeeneistä jakautuvat kauttaaltaan muuhun koe-elementtiin. Reagenssiker-roksessa 14 oleviin immobilisoituneisiin vasta-aineisiin sitoutuneiden merkittyjen antigeenien määrä minä ajankohtana tahansa on kääntäen verrannollinen näytteen antigee-15 nimäärään. Näytteen antigeenin kvantitatiivinen määritys saadaan säteilyttämällä immobilisoitunutta vasta-aineker-rosta läpinäkyvän tukikerroksen 12 läpi riittävällä kiih-dytysenergialla. Koska immobilisoitu vasta-ainekerros 14 on hyvin ohut verrattuna kerroksien 16 ja 18 yhteispaksuu-20 teen yhdessä levityskerroksen tai nesteenkuljetusjärjestelmän kanssa, eli suhde on tyypillisesti noin 1:20 - noin 1:100, ja koska valoa pidättävä kerros 16 estää kiihdytys-energiaa pääsemästä kerrokseen 18 tai mihinkään sen yläpuolella, optinen lukujärjestelmä mittaa immobilisoitunei- ; 25 siin vasta-aineisiin sitoutuneen merkityn antigeenin ja • · » · kauttaaltaan muuhun koe-elementtiin jakautuneen vapaan • · · ·... merkityn antigeenin hyvin pienen prosenttiosuuden määrää.

• ·

Kuten edellä on esitetty, lukusignaali on kääntäen verrannollinen näytteen antigeenin määrään eli signaali piene-30 nee, kun näytteen antigeenin määrä lisääntyy.

Huomataan, että glyoksyyliagaroosikerros 14 pidät- . .· tää siihen immobilisoituneet vasta-aineet kokeen aikana, • · kun taas näytteen antigeenit ja fluoresoivasti merkityt antigeenit, joiden molempien molekyylipaino on pienempi 35 kuin vasta-aineen molekyylipaino, pystyvät diffundoitumaan 97425 11 reagenssikerrokseen 14 ja siitä pois elementissä vallitsevan tasapainon mukaisesti. Näin ollen koe-elementti, joka on esitetty kuviossa 1, soveltuu erityisen hyvin suhteellisen pienten molekyylien, esim. niiden, joiden molekyyli-5 painot ovat korkeintaan 1 500, analysointiin. Erityisen edullisia pieniä molekyylejä ovat lääkeaineet, kuten teo-fylliini, fenytoiini, karbamatsepiini, fenobarbitaali jne.

Kuviossa 2 esitetään toinen keksinnön mukainen edullinen koe-elementti, joka käsittää läpinäkyvän tuki-10 kerroksen 20, reagenssikerroksen 22, suodatuskerroksen 24, valoa pidättävän kerroksen 26 ja valinnaisen kerroksen 28. Tässä suoritusmuodossa reagenssikerroksessa 22 voi olla matriisi polysakkaridista, kuten agaroosista, jossa on dispergoituneena immunokompleksi, joka on muodostunut 15 fluoresoivasti merkitystä antigeenistä tai sen analogista ja vasta-aineesta ko. antigeenille. Suodatuskerros 24 sisältää glyoksyyliagaroosia tai sen seosta, kuten edellä on kuvattu. Valoa pidättävä kerros 26 ja valinnainen kerros 28 vastaavat kuviossa 1 esitettyjä kerroksia 16 ja 18 mai-20 nitussa järjestyksessä. Käytännössä kun nestemäinen näyte levitetään koe-elementin päälle ja se diffundoituu elementin läpi, vasta-aineet diffundoituvat reagenssikerroksen 22 läpi ja suodatuskerros 24 "pyydystää" ne. Tässä suoritusmuodossa reagenssikerros 22 voidaan päällystää matalam-25 massa pH:ssa, mikä voi olla edullista erityisten reagens- • · * * sien ollessa kyseessä.

• · · *«.. Tietenkin ymmärretään, että vaikka erityiset ohut- • · ·.♦ kalvo-monikerroselementit, jotka on esitetty kuvioissa 1 ja 2, ovat keksinnön mukaisia edullisia koe-elementtejä, 30 muita tällaisia koe-elementtejä sisältyy keksintöön. Yleisesti ottaen, keksinnön mukaiset ohutkalvo-monikerroskoe- . .* elementit sisältävät yhden tai useampia reagenssikerrok- sia, mahdollisen valoa pidättävän kerroksen ja mahdollisen « suodatuskerroksen, ja ainakin yksi reagenssikerros sisäl- : 35 tää reagenssin immobilisoituneena matriisiin, joka sisäl- 97425 12 tää glyoksyyliagaroosia ja/tai toinen kerros muodostuu matriisiaineesta, joka sisältää glyoksyyliagaroosia. Keksinnön mukaisten ohutkalvo-monikerroselementtien paksuus on tyypillisesti korkeintaan noin 0,1 mm.

5 Kuten edellä on todettu, glyoksyyliagaroosi on ku vattu US-patentissa 4 275 196, jossa lisäksi on esitetty, että se on käyttökelpoista biologista alkuperää olevien proteiinien, kuten esimerkiksi antigeenien, vasta-aineiden jne., vyöhykeimmobilisointiin. Patentinhaltija esittää 10 aineistoa sovellutuksista, kuten esimerkiksi kompleksisten proteiinien erottamista elektroforeesilla ja sitä seuraa-vaa eristetyn biologisen aineen analysointia. Siinä esitetään kuitenkin, että glyoksyyliagaroosi on pelkistettävä esimerkiksi pelkistävällä aineella, esim. syaaniboorihyd-15 ridi-ionilla, tai se on siirrettävä korkeaan pH:hon (> 10,0). Tämä keksintö käsittää kuivan monikerroksisen koe-elementin, jossa voidaan suorittaa pysyvä immobili-sointi, ja siksi kerroksen pH:ta voidaan alentaa sen jälkeen, ilman että glyoksyyliagaroosia on tarpeen pelkis-20 tää. Tämä keksinnön mukaisesti muodostettujen reagenssi-kerrosten ominaisuus kuvataan kokeilla, jotka on esitetty esimerkissä 11 alla.

Keksintöä kuvataan nyt lisää yksityiskohtaisesti esimerkeissä esitettyjen erityisten edullisten suoritus-25 muotojen avulla ymmärtäen, että näiden on tarkoitus olla « » vain valaisevia ja että keksintö ei rajoitu niissä mainit- '··· tuihin aineisiin, olosuhteisiin, menetelmäparametreihin • « jne.

Esimerkki I

30 Glyoksyyliagaroosi valmistettiin glyseryyliagaroo- sia perjodaatilla hapettamalla. Tuotteen havaittiin sisäl-. tävän 0,533 milliekvivalenttia vapaata aldehydiä derivoi dun aineen grammaa kohti, kun se analysoitiin menetelmällä, jossa muodostui hydratsonia, kuten edellä on kuvattu. 35 Päällystysneste valmistettiin 50 °C:ssa lisäämällä seuraavat aineet 0,10 g:aan agaroosia, joka oli liuotet-

• I

97425 13 tuna 9,45 g:aan tislattua vettä: 300 μΐ 0,25 M natriumkar-bonaattipuskuria, pH 9,0, 20 μΐ 10 % Tween 20:tä (pinta-aktiivinen aine, jota saadaan Rohm ja Haas*ilta) ja 200 μΐ glukoosioksidaasin kantaliuosta, joka sisälsi 40 μΐ 0,5 M 5 Hepes-puskuria, pH 7,5, 7,5 mg glukoosioksidaasia ja 7,5 mg naudan seerumin albumiinia, jotka oli täydennetty tislatulla vedellä kokonaispainoon 3 g. Päällystysnestettä laitettiin aluspäällystetylle polyetyleenitereftalaatti-pohjakerrokselle vetosauvalla, ja sen jälkeen se kuivat-10 tiin huoneen lämpötilassa. Kuiva kerros sisälsi noin 600 mg/m2 agaroosia ja noin 3 mg/m2 glukoosioksidaasia.

4,82 cm2:n näyttettä elementistä eluoitiin 5 ml:11a fosfaattipuskuria, pH 7,0, sekoittamalla kevyesti 30 minuutin ajan. Otettiin 1 ml:n erä puskuria, ja siitä määri-15 tettiin glukoosioksidaasiaktiivisuus saattamalla se reagoimaan glukoosin, piparjuuriperoksidaasin ja o-fenyleeni-amiinin kanssa pH:ssa 7,0 30 minuutin ajan. Hapettuneen o-fenyleenidiamiinisubstraatin absorbanssi 492 nm:ssa rekisteröitiin.

20 Glukoosioksidaasikerroksia muodostettiin myös gly- oksyyliagaroosin sekä sen ja agaroosin seoksien ollessa matriisiaineena. Saadut tulokset on esitetty taulukossa I.

TAULUKKO I

25 Agaroosi:Glyoksyyliagaroosi Absorptio (paino-osa) 492 nm (Abs.) 1:0 1,69 ’ 0:1 0,00 1:1 0,00 30 2:1 0,00 3:1 0,01 : 5:1 0,03

Tulokset osoittavat, että agaroosimatriisi salli 35 suuren määrän glukoosioksidaasia diffundoitua reagenssi-kerroksesta, kun taas glyoksyyliagaroosi, sellaisenaan 97425 14 sekä seoksina, mukaan lukien suhde 3:1, saivat aikaan erittäin tehokkaan glukoosioksidaasin immobilisoitumisen. Huomataan myös, että 5:l-seos, vaikkei se ollutkaan yhtä tehokas kuin glyoksyyliagaroosikerros ja kerrokset, jotka 5 oli valmistettu muista seoksista, siitä huolimatta oli merkittävästi tehokkaampi kuin agaroosikerros glukoosioksidaasin immobilisoimiseksi.

Esimerkki II

Valmistettiin kontrollipäällystysneste, joka sisäl-10 si 1 paino-% agaroosia, 10 mM Hepes-puskuria, pH 7,0, ja 125I:llä merkittyjä IgG-vasta-aineita vedessä. Päällystys-nestettä laitettiin aluspäällystetylle polyetyleenitere-ftalaattipohjakerrokselle vetosauvalla, ja sen jälkeen vasta-ainekerros kuivattiin huoneen lämpötilassa. Kuiva 15 kerros sisälsi noin 1 000 mg/m2 agaroosia ja noin 15 mg/m2 125I:llä merkittyjä IgG-vasta-aineita.

Valmistettiin myös päällystysnesteitä, joissa oli 1 % 3:l-seosta agaroosia ja glyoksyyliagaroosia (0,092 milliekvivalenttia aldehydiä seosgrammaa kohti) Hepes-20 puskurissa (A & B), jonka pH oli 7,0 ja 8,0 mainitussa järjestyksessä, sekä myöskin natriumkarbonaattipuskurissa (C & D), jonka pH oli 9,0 ja 10,0 mainitussa järjestyksessä. Kuivat kerrokset sisälsivät noin 1 000 mg/m2 agaroosi/-glyoksyyliagaroosiseosta ja noin 15 mg/m2 merkittyjä vasta-25 aineita.

Päällystetyt vasta-ainekerrokset luettiin aluksi ’··· Microstat Gamma Counter -gammalaskurilla (Micromedic

Systems, Inc.), ja sitten ne upotettiin 2 ml:aan Hepes-puskuria, pH 7,0, 30 minuutiksi. Elementit luettiin gamma-30 laskurilla 10 ja 30 minuutin upotusajan kuluttua. Tulokset esitetään taulukossa II.

• · · • · .1 . UL.L ami I i i Oi 1 97425 15

TAULUKKO II

Suhteellinen signaali

Elementti pH Puskuri 10 min 30 min

Kontrolli 7,0 Hepes 0,05 0,04 5 A 7,0 Hepes 0,92 0,52 B 8,0 Hepes 1,04 0,87 C 9,0 Natrium- karbonaatti 1,00 0,97 D 10,0 Natrium- 10 karbonaatti 0,98 1,00 Nämä tulokset havainnollistavat pH:n vaikutusta immobili-soitumiseen eri puskureilla. Nähdään, että melkein kaikki 125I:llä merkityt vasta-aineet diffundoituivat pois kontrol-15 likerroksesta kymmenen minuutin kuluttua. Ne vasta-aine-kerrokset, jotka sisälsivät glyoksyyliagaroosia, pidättivät olennaisesti kaikki merkityt vasta-aineet kymmenen minuutin kuluttua. Edelleen vasta-ainekerrokset, joissa oli natriumkarbonaattipuskuria, pidättivät olennaisesti 20 kaikki merkityt vasta-aineet jopa 30 minuutin jälkeen pH:ssa 9,0 ja kaikki vasta-aineet pH:ssa 10,0. On myöskin ilmeistä, että glyoksyyliagaroosikerros, joka sisälsi Hepes-puskuria, pidätti olennaisesti enemmän vasta-aineita pH :ssa 8,0 kuin pHrssa 7,0 30 minuutin upotuksen jälkeen.

25 Esimerkki III

• mm· Kontrollipäällystysneste valmistettiin 50 °C:ssa ’··· lisäämällä seuraavat aineet 0,10 g:aan agaroosia, joka oli V liuotettu 9,48 g:aan tislattua vettä: 400 μΐ 0,25 M Bis-

Tris-propaanipuskuria, pH 11,3, 20 μΐ 10-%:ista Tween 30 20:tä ja 200 μΐ glukoosioksidaasin kantaliuosta, joka si sälsi 40 μΐ 0,5 HEPES-puskuria, pH 7,5, 5,0 mg glukoosiok-; sidaasia ja 5,0 mg naudan seerumin albumiinia, jotka oli täydennetty tislatulla vedellä kokonaispainoon 2,0 g. Koostumusta levitettiin aluspäällystetylle polyesterite-35 reftalaatti pohjakerrokselle vetosauvalla, ja elementti ·... kuivattiin huoneen lämpötilassa. Kuiva kerros sisälsi noin 97425 16 * 1 000 mg/m2 agaroosia ja noin 300 mg/m2 puskuria. Glukoosi-oksidaasikerros saatettiin kosketukseen 5 ml:n kanssa 0,1 M natriumfosfaattipuskuriliuosta (pH 7,0), ja tämä yhdistelmä asetettiin ravistelupöydälle, jossa sitä ravis-5 teltiin kevyesti. Puskuriliuoksesta otettiin näytteitä erilaisin väliajoin, ja niistä määritettiin GOD-pitoisuus.

Muodostettiin myös testikerroksia, joissa oli vaih-televia agaroosi/glyoksyyliagaroosiseoksia ja vaihteleva aldehydipitoisuus. Testikerrokset myös puskuroitiin lisää-10 mällä 400 μΐ 0,25 M natriumkarbonaattipuskuria, pH 9,0, edellä mainitun Bis-Tris-propaanipuskurin sijasta, jolloin saatiin kerros, joka sisälsi 90 mg/m2 natriumkarbonaattia. Saadut tulokset on esitetty taulukossa III:

15 TAULUKKO III

Agaroosi:Gly- meku/g Suhteellinen oksyyliagar. Aldehydi- liuosaktiivi-

Elementti (paino-osa) pit. Puskuri suus - GOD

20 Kontrolli 1:0 - PTB 1,00 A 3:1 0,092 PTB 0,29 B 7:1 0,046 PTB 0,47 C 3:1 0,164 PTB 0,00 D 3:1 0,092 Natrium- 0,00 25 karbonaatti E 7:1 0,046 Natrium- 0,02 karbonaatti • · F 3:1 0,164 Natrium- 0,00 karbonaatti 30

Testielementtien glukoosioksidaasin aktiivisuudet : ;* esitetään suhteellisina arvoina kontrolliin nähden, joka oli normalisoitu l,00:ksi. Huomataan, että natriumkarbo-naattipuskurilla valmistetut glyoksyyliagaroosikerrokset 35 olivat hyvin tehokkaita glukoosioksidaasin pitämisessä immobilisortuneena reagenssikerroksessa. On myöskin il- 97425 17 meistä, että kaksi 3:l-seosta, joissa oli erilaiset alde-hydipitoisuudet, olivat yhtä tehokkaita glukoosioksidaasin immobilisoimisessa. Huomataan myös, että Bis-Tris-propaa-nipuskurilla valmistettujen glyoksyyliagaroosikerrosten 5 tehokkuus lisääntyi, kun matriisiaineen aldehydipitoisuus lisääntyi.

Esimerkki IV

Valmistettiin keksinnön mukainen koe-elementti, joka sisälsi läpinäkyvän aluspäällystetyn polyetyleeni-10 tereftalaattitukikerroksen, joka kannatti järjestyksessä: 1. reagenssikerrosta, joka sisälsi noin 500 mg/m2 agaroosi/glyoksyyliagaroosiseosta 3:1, noin 21,5 mg/m2 natriumkarbonaattia (pH 9,1) ja noin 10 mg/m2 kompleksia, joka oli muodostunut teofylliinivasta-aineista ja fluoresoivas-15 ti merkitystä teofylliinikonjugaatista, jolla on kaava 0O3S (CHj) jHN0CCH2 CH2C0NH (CH2) 2S0j° 90 1 1 NH( CHj )3® Λλ\χ \\ }^c“-

25 I

• · CH,

• · · J

97425 18 kuvattu yksityiskohtaisesti siirretyssä, vireillä olevassa hakemuksessa, numero 133 071, haettu 21.12.1987, sisälsi myöskin suodatuselementin nestekontaktissa uurretun pinnan kanssa. Näyte, jossa oli tunnettu määrä teofylliiniä, lai-5 tettiin suodatuselementille. Välinettä inkuboitiin sitten 37 °C:ssa 30 minuuttia. Lukemat otettiin joka toinen minuutti säteilyttämällä koe-elementtiä pohjakerroksen läpi xenon-lampun 550 nm:n kiihdytysenergialla. Fluoresoiva signaali luettiin 580 nm:ssä. Testattujen näytteiden teo-10 fylliinipitoisuudet (yg/ml) olivat 0, 2,5, 5,0, 10,0 ja 40,0.

Näytteiden signaalin intensiteetti pieneni teofyl-liinipitoisuuden kasvaessa osoittaen näin koe-elementtien toimivan tarkoitetulla tavalla. Lisäksi jokaisen näytteen 15 kyseessä ollessa tietyn aloitusajan (kaksi minuuttia kontrollille ja kuusi minuuttia teofylliininäytteille), jonka aikana saavutettiin tasapaino, jälkeen jännitesignaali pysyi olennaisesti samana osoittaen näin, että vasta-aineet pysyivät immobilisoituneina reagenssikerroksessa 30 20 minuutin ajanjakson.

Piirrettiin standardikäyrä, joka perustui lukemiin, jotka saatiin näytteistä kuuden minuutin inkubointiajan jälkeen. Lukemat olivat: 25 Teofylliinipitoisuus Signaali (pg/ml) (volttia) '·/· 0,0 1,242 2,5 0,970 5,0 0,848 30 10,0 0,698 20,0 0,533 : 40,0 0,362

Standardikäyrä oli lineaarinen koealueella (2,0 -40 pg/ml), ja sen kulmakerroin oli koealueella suhteelli-• 35 sen suuri.

97425 19

Esimerkki V

Valmistettiin keksinnön mukainen koe-elementti, joka sisälsi läpinäkyvän, aluspäällystetyn polyetyleeni-tereftalaattitukikerroksen, joka kannatti järjestyksessä: 5 1. reagenssikerrosta, joka sisälsi noin 15 mg/m2 kompleksia, joka oli muodostunut fenytoiinivasta-aineista ja fluoresoivasti merkitystä fenytoiinikonjugaatista, joka koostui rodamiiniväriaineesta, joka on esitetty esimerkissä IV kuvatussa teofylliinikonjugaatissa, fenytoiiniin si-10 toutuneena sekä noin 84 mg/m2 natriumkarbonaattia (pH 9,0), dispergoituneena noin 1 000 mg/m2: iin agaroosi/glyoksyyli-agaroosiseosta 3:1; 2. valoa pidättävää kerrosta, joka sisälsi noin 6 000 mg/m2 rautaoksidia ja noin 212 mg/m2 2'-(N-morfoli-15 no)etaanisulfonihappo (pH 5,75) noin 2 000 mg/m2:ssä aga-roosia; ja 3. päällyskerrosta, joka sisälsi noin 4 000 mg/m2 agaroosin ja polyakryyliamidin siirrännäiskopolymeeriä.

Noin 40 μΐ plasmanäytteitä, jotka sisälsivät tun- 20 nettuja määriä fenytoiinia (0, 2,0 ja 50,6 pg/ml) vietiin koe-elementin levyille (halkaisija 3,5 cm) asettamalla näyte ensin aluspäällystetylle polyetyleenitereftalaatti- kerrokselle ja sitten asettamalla koe-elementti päällys- kerros alaspäin nestemäisen näytteen päälle. Näin muodos- 25 tetut koevälineet asetettiin laboratoriolaitteeseen *..* 37 °C:ssa, ja fluoresoiva signaali luettiin kahden minuu- *;·; tin välein säteilyttämällä koe-elementtiä pohjakerroksen • · ’·* läpi xenon-lampun 550 nm:n kiihdytysenergialla ja kerää mällä fluoresenssisignaali 580 nm:ssä. Koe-elementistä, 30 johon oli lisätty kontrolliainetta (0 pg/ml fenytoiinia), saatu signaali pysyi olennaisesti samana 30 minuutin aika- : ;* välein osoittaen näin, etteivät vasta-aineet diffundoitu- • ♦ · neet reagenssikerroksesta. Lisäksi signaali pieneni välittömästi, kun fenytoiinipitoisuus kasvoi osoittaen näin, 35 että koe-elementti toimi kuten sen oli tarkoitus toimia.

97425 20

Esimerkki IV

Valmistettiin keksinnön mukainen koe-elementti, joka käsitti aluspäällystetyn polyetyleenitereftalaatti-pohjakerroksen, joka kannatti järjestyksessä: 5 1. reagenssikerrosta, joka sisälsi noin 10 mg/m2 kompleksia, joka muodostui teofylliinivasta-aineista ja fluoresoivasti merkitystä teofylliinikonjugaatista, joka on kuvattu esimerkissä IV, noin 500 mg/m2:ssä agaroosia; ja 10 2. suodatuskerrosta, joka sisälsi 1 000 mg/m2 aga- roosi/glyoksyyliagaroosiseosta 3:1.

Valmistettiin myös koe-elementtejä, joilla oli tämä rakenne ja joista suodatuskerros oli valmistettu liuoksista, jotka oli puskuroitu eri pH-tasoilla. Valmistettiin 15 kontrollikoe-elementti, jossa suodatuskerros sisälsi noin 1 000 mg/m2 agaroosia agaroosi/glyoksyyliagaroosiseoksen sijasta.

3,3 cm2:n kappaletta jokaisesta koe-elementistä "kellutettiin" 30 minuuttia suodatuskerros alaspäin noin 20 2 ml:ssa fosfaattipuskuria, pH 7,0. Sen jälkeen koe-ele- mentit kuivattiin ja fluoresenssiemissiosignaali mitattiin. Samanlaiset kokeet suoritettiin fosfaattipuskurissa, jonka pH oli 7,0 ja joka sisälsi 10"3 M teofylliiniä. Saadut tulokset on esitetty taulukossa IV: 25

TAULUKKO IV

Agaroosi:Gly- Signaali *·' oksyyliagar. Ei teofyl- 10-3 M teofyl- (paino-osa) Puskuri pH liiniä liiniä 30 1:0 Hepes 7,0 0,03 0,02 3:1 Hepes 8,0 0,51 0,03 ; 3:1 Natrium- 9,0 0,99 0,05 • · karbonaatti 3:1 Natrium- 10,0 1,02 0,04 35 karbonaatti 97425 21

Koe-elementeistä, jotka olivat "kelluneet" puskurissa, joka ei sisältänyt teofylliiniä, saadut tulokset osoittavat, ettei agaroosista muodostunut suodatuskerros estänyt konjugaattia diffundoitumasta pois reagenssiker-5 roksesta, kun taas suodatuskerrokset, jotka sisälsivät agaroosi/glyoksyyliagaroosiseosta 3:1, erityisesti ne, jotka oli puskuroitu pH:ssa 9,0 ja 10,0, tehokkaasti estivät teofylliinivasta-aineita diffundoitumasta. Kun koe-elementit olivat kosketuksessa 10'3 M teofylliiniä sisältä-10 vien liuoksien kanssa, tapahtui kilpaileva reaktio ja saatiin hyvin matalia signaaleja. 10‘3 M teofylliinipitoisuu-den laskettiin riittävän syrjäyttämään olennaisesti kaikki alunperin kerroksissa olleet merkityt teofylliinikonjugaa-tit.

15 Vaikka keksintö on kuvattu erityisten edullisten suoritusmuotojen suhteen, ei ole tarkoitus rajoittaa sitä niihin, vaan pikemmin, että alan ammattimies huomaa, että muutoksia ja modifikaatioita, jotka ovat keksinnön luonteen sekä siihen liittyvien patenttivaatimusten puitteiden 20 mukaisia, voidaan tehdä.

• · • · · ··· • · » · • » « · • ·

Claims (14)

97425

1. Monikerroksinen diagnostinen koe-elementti, tunnettu siitä, että se sisältää useita erillisiä 5 kerroksia, joista vähintään yksi on reagenssikerros, jolloin vähintään yksi mainituista useasta kerroksesta muodostuu glyoksyyliagaroosia sisältävästä matriisiaineesta ja jolloin glyoksyyliagaroosi ei ole kyllästetyssä amiini-muodossa .

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen diagnostinen ele mentti, tunnettu siitä, että matriisianne sisältää glyoksyyliagaroosin ja jonkin toisen polysakkaridin seoksen.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen diagnostinen ele- 15 mentti, tunnettu siitä, että matriisiaine sisältää agaroosin ja glyoksyyliagaroosin seosta painosuhteessa 3:1.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen diagnostinen elementti, tunnettu siitä, että mat- 20 riisiaine sisältää noin 0,04 - 0,20 milliekvivalenttia käytettävissä olevaa aldehydiä seoksen kokonaispainogram-maa kohti.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen diagnostinen elementti, tunnettu siitä, että rea- 25 genssikerros muodostuu matriisiaineesta.

*.,* 6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen **·♦ diagnostinen elementti, tunnettu siitä, että rea- • * *·' genssikerros sisältää proteiinia.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen diagnostinen ele- 30 mentti, tunnettu siitä, että proteiini on vasta- aine tai vasta-ainefragmentti.

: ;* 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen diagnostinen koe- • · · elementti, tunnettu siitä, että vasta-aine tai vasta-ainefragmentti on spesifinen analyytille, jonka mo- ; 35 lekyylipaino on korkeintaan noin 5 000. 97425

9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen monikerroksinen diagnostinen koe-elementti, tunnettu siitä, että se sisältää tukikerroksen ja valoa pidättävän kerroksen ja reagenssi on immobilisoitu matriisimateriaa- 5 liin.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen diagnostinen koe-elementti, tunnettu siitä, että lisäksi se sisältää päällyskerroksen.

11. Monikerroksinen diagnostinen koe-elementti, 10 tunnettu siitä, että se käsittää: tukikerroksen; reagenssikerroksen; reagenssin diffundoitumista estävän kerroksen, joka muodostuu glyoksyyliagaroosia sisältävästä matriisiainees-15 ta, jolloin glyoksyyliagaroosi ei ole kyllästetyssä amii- nimuodossa; ja valoa pidättävän kerroksen.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen diagnostinen koe-elementti, tunnettu siitä, että lisäksi si- 20 sältää toisen reagenssikerroksen.

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen diagnostinen koe-elementti, tunnettu siitä, että se sisältää vähintään yhden missä tahansa patenttivaatimuksessa 2-8 määritellyn piirteen.

14. Jonkin patenttivaatimuksista 1-12 mukainen a a •mt· monikerroksinen diagnostinen koe-elementti, tunnet- '»·· t u siitä, että sen paksuus on enintään noin 0,1 mm. • · • · • · • • I f 4 < I f I I < « « » I · 97425