FI78786C - Immunokemiska snabbtest. - Google Patents

Description

1 78786

Inmunokeiniällinen pikakoe Tämä keksintö kohdistuu immunokemiallisiin pikakokeisiin, joissa käytetään kromatografisia apukeinoja ja menetelmiä sopivien proteiinien immunokemialliseksi määrittämiseksi.

Immunokemiallisten kokeiden merkitys hormonien, proteiinien, farmaseuttisten aineiden, jne, määrittämiseksi esimerkiksi veri-, virtsa- ja ulostenäytteistä, mutta myös kliinisen kemian lisäksi esimerkiksi elintarvikkeiden analytiikassa tai vesistönäytteiden analytiikassa, kasvaa jatkuvasti.

Näiden kokeiden etuna on immunoreagenssien korkea spesifisyys ja affiniteetti, joiden avulla määritettävän substraatin pienetkin määrät voidaan määrittää varmasti muiden, suhteellisen samankaltaisten yhdisteiden suurempien pitoisuuksien joukossa. Erityisesti maallikolle haittallisia o\at ne lukuisat käsittelyvaiheet, jotka perinteisissä kokeissa vaativat paljon aikaa, ja jotka voidaan toteuttaa ainoastaan runsasta labora-toriovarustusta käyttäen. Tästä syystä immunokemiallisten määritysten laajempaa käyttöä ajatellen on toivottavaa, että käytettävissä on spesifisiä toteamiskynnykseltään alhaisia kokeita, joita voidaan käyttää ilman monimutkaisia lisävarusteita, ja mahdollisuuksien mukaan ilman substraattien ylimääräisiä esi- ja jälkikäsittelyjä, ja joista tulos saadaan lyhyessä ajassa.

Tästä syystä tässä keksinnössä tehtävänä oli kehittää sellainen pikakoe, jonka avulla immunokemiallisten määritysten suorittaminen saadaan yksinkertaiseksi ja nopeaksi myös maallikolle.

Immunokemiallisissa kokeissa ovat esimerkiksi seuraavat reagointitavat tuttuja: 2 78786 1. Kilpailevan sitoutumisen menetelmä Tässä menetelmässä määritettävän antigeenin tai hapteenin (seuraavassa merkitty lyhyesti "antigeeni”) tuntemattomaan määrään lisätään vastaavasti merkityn antigeenin tarkoin tunnettu määrä, jonka annetaan tämän jälkeen reagoida kilpaa vastaavan, kiinteään kantajaan kiinnitetyn vasta-aineen ali-määrän kanssa. Kiinteä faasi ja nestemäinen faasi erotetaan, ja määritettävän antigeenin määrä saadaan epäsuorasti määrittämällä merkityn, kiinteässä tai nestemäisessä faasissa olevan antigeenin määrä.

2. IEMA-periaate Tässä määritettävän antigeenin annetaan reagoida merkityn vasta-aineen ylimäärän kanssa, ja toisessa vaiheessa regoimatta jäänyt vasta-aine sidotaan vastaavaan, kantajaan kiinnitettyyn antigeeniin. Jälleen faasien erottamisen jälkeen antigeenin määrä saadaan epäsuoraan määrittämällä kiinteässä tai nestemäisessä faasissa olevat merkityt aineet.

3. Sandwich-periaate Tässä menetelmässä kaksiarvoinen antigeeni muunnetaan toisaalta kiinteään faasiin sidotulla vasta-aineella ja toisaalta merkityllä vasta-aineella, ja jälleen nestemäisen ja kiinteän faasin erottamisen jälkeen merkityn vasta-aineen pitoisuus määritetään jommasta kummasta faasista, jolloin kaksiarvoisen antigeenin pitoisuus saadaan epäsuoraan.

Yhteistä kaikille näille menetelmille on se, että jokin reagoivista aineista on sidottu, tai sidotaan jälkeenpäin kantajaan kompleksin ja ylimääräisen reagenssin välisen erottamisen mahdollistamiseksi. Sen lisäksi, että nämä kantajaan sitomiset aiheuttavat lisäkustannuksia, ja ennen kaikkea voivat muuttaa immunokemiallisiä ominaisuuksia, näiden menetelmien läpivieminen vaatii, kuten edellä on jo esitetty, suhteellisen paljon vaivaa. Tästä johtuen ne eivät sovellu yksinkertaisiksi ja halvoiksi pikakokeiden menetelmiksi.

3 78786 Tästä syystä keksinnön mukaisissa pikakokeissa ei tulisi käyttää kantajiin kiinnitettyjä vasta-aineita tai antigeenejä, vaan immunoinnissa suoraan vaikuttavia vasta-aineita, mahdollisesti merkityssä muodossaan. Keksinnön mukaisesti vasta-aineella ymmärretään täydellisiä vasta-aineita, mutta myös aktiivisia kappaleita, kuten Fab-fragmentteja. Vasta-aineita voidaan käyttää sekä polyklonaalisessa että monoklonaalisessa muodossaan. Tämä on yllättävästi mahdollista, koska vasta-aineista ja antigeeneistä muodostuvat immunokompleksit voidaan erottaa toisistaan kromatografisesti niiden erilaisten molekyylipainojen tai niiden muuntamattomien vasta-aineiden tai antigeenien erilaisen koon perusteella, jonka jälkeen kromatografisesti erotettujen fraktioiden vastaava määrittäminen on helposti mahdollista.

Geelisuodatusmenetelmät, esimerkiksi Sephadex-: Sephacryl-ja Ultrogeelipylväitä käyttäen, proteiinien erottamiseksi niiden erilaisten kokojen perusteella ovat hyvin tuttuja.

Nämä menetelmät ovat kuitenkin erityisen vaativia, joten ainoastaan koulutetut henkilöt pystyvät käyttämään niitä vastaavalla laboratoriovarustuksella. Geelimateriaalia on esimerkiksi turvotettava etukäteen useita päiviä, kromatografia-pylväät on täytettävä huolella, ne on tasapainotettava ja pidettävä jatkuvasti kosteina liuottimella hyvän erottumisen aikaansaamiseksi. Tämän lisäksi pylvään lisäksi tarvitaan edelleen liuottimien varastoastioita, pumppuja, fraktionkerää-jiä, ilmaisinjärjestelmiä, jne, ja tämän lisäksi näytteiden esikäsittelyn ja kromatografiän suorittamisen ajantarve on useita tunteja, joten nämä menetelmät eivät tule kysymykseen pikakoetutkimukseksi.

Nyt todettiin yllättävästi, että kuivasta, huokoisesta, turpoama ttoma s ta, rakeisesta materiaalista koostuvaa kapillaari-aktiivista kerrosta, jolla materiaalilla on molekyyliseulan kaltaisia ominaisuuksia (esim. huokoinen lasi, kieselgeeli, ja muut vastaavat) voidaan käyttää molekyylikooltaan vastaavien substraattien nopeaan erottamiseen, kun kapillaarivoimien aikaansaamaa nesteen kuljettumista käytetään hyväksi. Huokosten halkaisijoista riippuen substraatit kromatografoituvat 4 78786 molekyylikokoaan vastaten hitaammin tai nopeammin, suurimole-kyylisten aineiden kulkiessa kromatografiapylvään läpi välittömästi liuotinrintaman jälkeen, koska nämä aineet eivät mole-kyylikokonsa vuoksi kykene tunkeutumaan huokosiin. Täten ilman edeltäviä vaivalloisia toimenpiteitä, eli tasapainottamatta pylvästä etukäteen tai käyttämättä nesteen liikuttamiseen lisäksi pumppua, vastaavien erotusten suorittaminen onnistuu suhteellisen lyhyessä ajassa - 5-30 minuutissa pylvään pituuden ollessa 5-20 cm. Pylvään vääränlaisen käyttäytymisen välttämiseksi pylvään halkaisijan tulisi olla 0,5-5 mm, mieluumin 1-2 mm. Koska immunokompleksit yleisesti ottaen ovat olennaisesti suurempia kuin niiden muodostamiseen käytettävät vasta-aineet ja antigeenit, niin sopivia molekyylisiivilöitä käyttämällä huokosten halkaisija voidaan valita siten, että immunokompleksit eivät tunkeudu lainkaan tai ne tunkeutuvat ainoastaan vähäisessä määrin huokosiin, toisin sanoen ne kromatografoituvat liuotinrintaman kanssa tai vähän sen jälkeen vasta-aineiden kyetessä tunkeutumaan huokosiin, jolloin ne pidättyvät eli kromatograf oituvat oleellisesti hitaammin. Tästä syystä edellä mainittuja kuivia kapillaaripylväitä voidaan käyttää immunologiseen pikakokeeseen.

Tällöin keksinnön mukaisesti kaksi erilaista menettelytapaa on mahdollista: 1. Antigeenipitoiseen substraattiin voidaan lisätä vasta-aineen ylimäärä, ja sitä voidaan inkuboida edeltä käsin. Tuloksellisen muuntamisen jälkeen seos kaadetaan edellä kuvattuun molekyyli-siivilän muodostamaan pylvääseen, jonka jälkeen kromatografinen erottaminen suoritetaan joko sopivalla liuottimena, toisin sanoen tavallisesti puskurin vesiliuoksella tai reaktioliuoksen ylimäärällä. Tämän jälkeen muuntumattomista vasta-aineista vapaasta liuotinaineen vyöhykkeestä voidaan immunokompleksin pitoisuus määrittää jollakin sinänsä tunnetulla menetelmällä.

5 78786 2. Käyttäjälle on vieläkin yksinkertaisempaa käyttää ennalta valmistettuja pylväitä, joiden alaosa sisältää molekyylisiivilä-materiaalia, joka on kyllästetty sopivalla vasta-aineella, ja jonka pylvään yläosa sisältää kyllästämätöntä, kromatografiaan soveltuvaa materiaalia. Kun nyt vasta-aineella kyllästettyyn osaan istutetaan antigeenipitoista substraattia, niin liikkuvaan faasiin muodostuu immunokompleksi, joka kokonsa vuoksi ei voi tunkeutua molekyylisiivilän huokosiin, joten se liikkuu nopeammin kuin muuntumaton vasta-aine, joka pidättyy statio-näärifaasin huokosiin.

Tuntuu erittäin yllättävältä, että tällainen nopea ja käyttökelpoinen erottaminen on mahdollista näin yksikertaisin keinoin, koska kirjallisuuden tietojen perusteella olisi odotettavissa, että pylvään läpi kulkeva neste kastelee kuivan pylvään ainoastaan epätäydellisestä toisin sanoen siten, että partik-keleiden sisään ja niiden väliin muodostuu pienempiä ja suurempia ilmapusseja, jotka tekisivät erottamisen mahdottomaksi. Toisaalta oli odotettavissa, että erityisesti menetelmässä 2 diffuusion esiintyminen hidastaa suurien immunokompleksien muodostumista, jota voi tapahtua vain huokosten ulkopuolella, siten, että lyhyen, muutaman sekunnin kestävän kosketuksen aikana riittävää reaktionopeutta ei saavuteta.

Keksintö on kuvattu yksityiskohtaisemmin patenttivaatimuksissa.

Eräässä keksinnön suositeltavassa toteutusmuodossa lasista tai muovista valmistetun kapillaarin, jonka sisähalkaisija on 0,5-5 mm, mieluiten 1-2 mm, ja jonka pituus on 5-20 cm, mieluiten 10-20 cm, toinen pää suljetaan imukykyisellä, irtonaisella materiaalilla. Tämän sulkijamateriaalin päälle laitetaan merkityllä vasta-aineella kyllästetyn molekyylisiivilämateriaalin muodostama kerros, jonka paksuus on 0,2-10 mm, ja pylväs täytetään edelleen kyllästämättömällä molekyylisiivilällä, ja sen yläpää tiivistetään jälleen läpipäästävällä sulkijamateriaalilla. Kun merkittyä vasta-ainetta ei voida todeta suoraan, esimerkiksi värinsä, fluorenssinsa tai radioaktiivisuutensa perusteella, 6 78786 niin pylvään yläosa voi vielä lisäksi käsittää ilmaisemisvyö-hykkeen, joka sisältää esimerkiksi vastaavia reagensseja tuottaakseen vasta-aineen merkitsemiseen käytetyn aineen, esimerkiksi siihen liitetyn entsyymin kanssa, ilmaistavissa olevan tuotteen.

Mikäli tällaisen pylvään alapäähän istutetaan muutama ^.ul tutkittavaa liuosta, jonka jälkeen pylväs laitetaan sopivaan kehi-tysliuokseen, niin tällöin neste kulkeutuu kapillaarivoimista johtuen ylöspäin täyttäen pylvään sisällön täydellisesti. Antigeenien läsnäollessa tapahtuu, kuten on esitetty, kompleksin-muodostusta ja näiden kompleksien erottumista kapillaaripylvään yläpäässä. Koska kromatografia päättyy automaattisesti sen jälkeen, kun pylväs on kastunut täysin, niin käyttäjän suorittama erityinen valvominen on tarpeetonta. Erityisesti kvalitatiivisen kokeen ollessa kyseessä, tulos voidaan lukea vielä pitkähkönkin ajan kuluttua, ja liuotin voidaan jopa mahdollisesti haihduttaa, ja pylväs säilyttää dokumentointitarkoituk-siin.

Edelleen toisessa suositeltavassa toteutusmuodossa molekyyli-siivilämateriaali levitetään paksuudeltaan noin 0,05-1 mm olevaksi kerrokseksi, mahdollisesti sitoja-aineeseen sekoitettuna, imukyvyttömälle alustalle, ja tämä jaetaan leveydeltään 5-10 mm ja pituudeltaan 50-150 mm oleviin liuskoihin. Aina käyttötarkoituksen mukaisesti näiden liuskojen toinen pää on kyllästetty lisäksi vastaavilla vasta-aineilla, jolloin tätä päätä käytetään näytteen istuttamispäänä ja toinen pää on lisäksi kyllästetty vasta-aineiden merkitsemiseen käytettävät aineet ilmaisevalla reagenssilla, jolloin tätä päätä käytetään muodostuneiden vasta-aine/antigeeni-kompleksien osoittamiseen. Mikäli nämä kolme vyöhykettä levitetään erikseen, niin on huoleh dittava siitä, että niiden väliin jää riittävä kapillaarikosketus. Kuitenkin on myös mahdollista levittää ensin kerroksen muodostava, sopivaan liuottimeen suspendoitu massa esimerkiksi pyyhkäisykaapimella, ja antaa sen kuivua, jonka jälkeen kerros kyllästetään ragens-seilla. Läpipäästämättömänä alustana käytetään mieluiten muo- 7 78786 visia levyjä, esimerkiksis polykarbonaatti-, polyesteri-, polyamidi- tai polyetyleenilevyjä, kuitenkin lasinenkin alusta saattaa olla edullinen.

Kuten edellä on esitetty, kromatografiaan käytettävien molekyyli-siivilöiden tulisi olla turpoamattomasta materiaalista. Tästä syystä kysymykseen tulevat mieluiten epäorgaaniset kantajat, ja tällöin erityisesti kaupallisesti saatavat, eri tyyppiset huokoiset lasit ja kieselgeelit, joilla on tietty huokoskoko. Kuitenkin epäorgaanisen kantajamateriaalin sisä- ja ulkopinta voi olla peitetty sopivalla orgaanisella aineella, esimerkiksi polyolilla, jolloin näiden kantajien adsorptio-ominaisuudet saadaan vastaamaan agar- tai selluloosageelin adsorptio-ominaisuuksia, ja joka aine estää epäorgaanisen kantajan vasta-aineisiin tai antigeenei-hin kohdistuvat negatiiviset vaikutukset. Koska etupäässä vesi-liuokset tulevat kromatografiässä liuottimina kysymykseen, niin käytettyjen materiaalien tulee olla riittävän hydrofiilisiä.

Mikäli materiaalien valmistaminen ei tätä omainaisuutta jo takaa, niin kantajamateriaalien suspendoiminen ennen varsinaista käyttöä kostuttavaa ainetta ja puskuria sisältävään vesiliuokseen ja puolestaan näin kyllästettyjen rakeiden kuivaaminen on osoittautunut edulliseksi.

Kostuttavana aineena voidaan käyttää kaikkia tunnettuja anioni-sia, kationisia tai ionittomia kostuttavia aineita. Suositeltavat käytettävät pitoisuudet ovat 0,01-0,1%, pienempiä pitoisuuksia voidaan myös käyttää luonnostaan hydrofiilisiä materiaaleja käytettäessä, myös suurempia pitoisuuksia voidaan käyttää, mikäli ne eivät vaikuta immunokompleksiin. Esimerkkeinä kostuttavista aineista mainittakoon glykolieetterit, kuten polyoksietyleenistearaatti tai -lauraatti, alkyylisulfaatit, kuten dodetsyylisulfaatti, rasva-alkoholipolyglykolieetteri, fenolieetterit, esimerkiksi 10,5-etoksinonyylifenoli, setyyli-trimetyyliammoniumbromidi ja lauriinihappo-bis-2-hydroksietyyli-amiini.

Kyllästysliuoksen muut komponentit vastaavat suurinpiirtein myöhemmin käytettävässä kehiteliuoksessa olevia komponentteja, 8 78786 toisin sanoen puskureita, suoloja, kompleksin muodostajia, sterilointiaineita, jne, jotka molekyylikooltaan pienempinä komponentteina kromatografoituvat hitaammin kuin liuotinaine-rintama, millä saavutetaan se, että myös liuotinainerinta-massa vallitsee stationääriolosuhteet.

Edelleen edulliseksi on osoittautunut lisäksi mahdollisimman hienojakoisen, inertin ja mahdollisesti hydrofobisen täyte-massan sekoittaminen kromatografiamateriaaliin, jolloin hyviksi ovat osoittautuneet erityisesti talkki, hydrofobiseksi tehty lasi, kieselgeeli ja muut vastaavat. Tämä materiaali pienentää toisaalta kantajapartikkeleiden välistä tyhjää tilaa, ja johtaa täten parempaan erottumiseen, ja toisaalta se hidastaa nestemäisen faasin liikkumisnopeutta, jolloin tasapainoon asettuminen paranee liikkuvan ja stationäärifaasin välisen diffuusion parantuessa, jolloin puolestaan erottuminen paranee. Tämän lisäksi pylvään täyte on homogeenisempaa, millä lisäksi vältetään mahdollinen ilmapussien muodostuminen.

Kerroksilla varustettujen kantajien valmistamiseen käytettäviä sideaineita valittaessa on kiinnitettävä huomiota siihen, että nämä toisaalta johtavat stabiileihin kerroksiin, mutta toisaalta ne eivät saa muuttaa oleellisesti kantajamateriaalin kuljettamis-ominaisuuksia, toisin sanoen erityisesti ne eivät saa tukkia huokosia. Tämä onnistuu yllättävästi siten, että käytetään veteen valmistetun muovidispersion, esimerkiksi polyvinyyli-propionaatin tai polyakrylaatin dispersion ja veteen hyvin liukenevan tai turpoavan sideaineen muodostamaa seosta. Tuloksellisesti on käytetty agar-agaria, hydroksipropyyliselluloosaa ja muita samankaltaisia suurimolekyylisiä materiaaleja.

Vaikka useissa tapauksissa onkin riittävää todeta, onko kyseeseen tulevaa antigeeniä läsnä substraattiliuoksessa vai ei, niin useissa tapauksissa on kuitenkin toivottavaa suorittaa puolikvantitatiivinen tai kvantitatiivinen määritys. Mikäli immunokompleksi ei sinänsä ole värillinen, niin tällöin on välttämätöntä merkitä vasta-aine jollakin osoitettavissa olevalla tavalla.

9 78786

Eräs vanhimmista tällaisista menetelmistä on merkitseminen radioaktiivisilla isotoopeilla, esimerkiksi jodilla (125) tai tritiumilla ja vasta-aine/antigeenikompleksin sisältävän vyöhykkeen radioaktiivisuuden määrän määrittäminen radioalfciivisuus-laskurilla. Koska radioaktiivisten aineiden käsitteleminen vaatii puolestaan erityisiä laboratorioita, niin nykyään merkitseminen suoritetaan mieluummin fluoresenssiä aikaansaavilla väriaineilla, jolloin vasta-aine tai immunokompleksi voidaan määrittää ja havaita fluoresenssin avulla.

Erityisesti pieninä pitoisuuksina esiintyvien proteiinien tapauksessa vasta-aine yhdistetään mieluiten sopivaan entsyymiin, ja toteamisreaktioon käytetään sopivien substraattien muuntamista tämän entsyymin katalyyttisen vaikutuksen avulla. Tämä osoitusreaktio voidaan suorittaa joko suoraan kantaja-materiaalissa, kuten edellä on esitetty, tai se voidaan suorittaa fotometrisesti kyvetissä kompleksin sisältävän vyöhykkeen erottamisen, ja sopivaan liuottimeen suspendoimisen jälkeen.

Tämän lisäksi puolikvantitatiivinen määrittäminen on mahdollista siten, että kantajamateriaalin loppuvyöhykkeeseen sekoitetaan määrätty määrä spesifistä adsorptioainetta merkitsemiseen käytettyä entsyymiä ja/tai kantajaan kiinnittyvässä muodossa olevaa kompleksia varten, jolloin immunokompleksissa oleva alkuperäinen entsyymimäärä voidaan päätellä kehittyvän adsorptio-vyöhykkeen leveydestä.

Keksinnön mukaiset pikakokeet on esitetty tarkemmin seuraavissa esimerkeissä, niillä kuitenkaan keksintöä rajoittamatta.

Esimerkkejä

Esimerkki 1 hCG:n (human Chorionic Gonadotropin) osoittaminen virtsasta koekapillaarin avulla_

Liuokset A. 3 mg indolyyligalaktosidia liuotetaan 1 ml:aan metanolia.

B. Fab-Anti-hCG- β-galaktosidaasi-konjugaatti valmistettiin lammas-anti-hCG-seerumista (Immunointi: D.M. Weir, Handbook 10 78786 of Experimental Immunology, A 2.8; Fab-halkaiseminen: M.E. Davis, A.J. Barrett, R.M. Hernbry, J. of Immunological Methods, 2^, 305 (1978); Konjugointi: T. Kitagawa teoksessa Immuno Assay, Toimittajat: E. Ishikawa, T. Kawai, K. Miyai, Kustantaja: Igaku-Shoiu, Tokio - New York 1981), ja sitä liuotettiin 575 U/ml liuokseen, joka koostui 10 mM KP^stä, 5 mM MgC^iSta, 25 mM NaCl:sta, 2%:sta sakkaroosista, 0,5%:sta härän veren albumiinista, 0,l%:sta NaN3:sta, pH 7,0.

Materiaalit ^/Huokoinen lasi: Glyceryl-Glas, Controlled Pore (Sigma, St. Louis2?r huokosten halkaisija 259 Ä, partikkelikoko 200-400 me sh.

Lasikapillaari: pituus 12 cm, sisähalkaisija 1 mm, suljettu toispuoleisesti selluloosavanulla (korkeus 2 mm).

Kapillaarin täyttäminen

Kapillaari tiivistetään alapäästään pienellä määrällä sellu-loosavanua, ja se täytetään huokoisella lasilla (täyttökor-keus 7 cm). 500 mg huokoista lasia sekoitetaan 1 ml:aan liuosta A, jonka jälkeen sitä kuivataan 60°C:ssa. Tähän huokoisella lasilla osittain täytettyyn kapillaariin muodostetaan uusi kerros tällä huokoisen lasin ja indolyyligalakto-sidin-substraatin muodostamalla seoksella (täyttökorkeus 1 cm). Kapillaarin alapäässä oleva selluloosavanu kyllästetään 3yU:lla liuosta B ja se kuivataan.

Kokeen suorittaminen

Kapillaari asetetaan näytteeksi tarkoitettuun virtsaan. Noin viiden minuutin kuluessa neste saavuttaa ylemmän substraatti-kerroksen. Ainoastaan hCG:n läsnäollessa immunokompleksista peräisin oleva galaktosidaasi saavuttaa tämän substraattiker-roksen. Väritön indolyyligalaktosidi hydrolysoituu ja muuttuu hapen läsnäollessa indigoksi, joka muuttuu visuaalisesti havaittavaksi siniseksi värjäytymisensä ansiosta.

li 78 786

Esimerkki 2 hCG:n osoittaminen virtsasta koeliuskojen avulla Liuokset A. 20 ml 0,3%:sta Agar-agaria 150 mM:ssa NaClrssä 10 mM KPif pH 7,2 + 400 Triton X-100 + 2,3 ml vettä + 2 g 50 prosenttista, vedessä olevaa polyvinyylipropio-naattidispersiota (Propiofan 70 D, BASF, Ludwigshafen) B. Fab-Anti-hCG-β -galaktosidaasi-konjugaatti, joka on peräisin lammas-anti-seerumista, kuten esimerkissä 1.

Materiaalit

Kieselgeeli (Daltosil, SP 300, huokoskoko noin 300 A, partikkelikoko 120-200 mesh, valmistaja: Serva).

Kieselgeelin ja indolyyligalaktosidin välinen seos (liuos, joka on valmistettu laittamalla 3 mg indolyyligalaktosidia 1 ml saan metanolia, sekoitetaan 250 mg:aan edellä mainittua kieselgeeliä, ja näin saatu tahna kuivataan ilmavirralla 60-70°C:ssa).

Polykarbonaattikelmu (Pokalon, valmistaja Lonza, Lörrach). Kerrostaminen

Valmistetaan seuraavat seokset: a) 8 ml liuosta A + 1,5 g kieselgeeliä b) 1 ml liuosta A + 0,19 g kieselgeelin ja indolyyligalaktosidin välistä seosta c) 0,15 ml liuosta A + 0,05 ml liuosta B + 0,04 g kiesel-geeliä.

Seokset a-c levitetään väliseinämillä (toinen puoli pyöristetty) jaetulla pyyhkäisykaapimella leveydeltään 15 cm olevan polykarbonaattikalvon päälle toisiaan koskettaviksi kerroksiksi (kerrospaksuus 400 ^um). Tällöin kerrosten leveydet, ja niiden järjestys on seuraava: 12 78786

Kerros a 1 cm, kerros c 0,5 cm, kerros a 8 cm, kerros b 1 cm ja yli jäävän, kosketuspintana toimivan polykarbonaattikalvon leveys on 4,5 cm.

Kalvo kuivataan 45°C:ssa, ja se leikataan kerroksia vastaan kohtisuoraan 0,5 cm leveiksi koeliuskoiksi (pituus 6 cm).

Kokeen suorittaminen

Koeliuskan alapää kastetaan virtsaan.

Kuvaus

Kuuden minuutin kuluessa neste on saavuttanut koeliuskan yläpään, ja hCG:n läsnäolo johtaa värireaktioon, kuten esimerkissä 1.

Esimerkki 3

Kostuttavien aineiden vaikutus huokoisten lasien erotuskykyyn Huokoisten, käsittelemättömien lasien erotusominaisuudet ovat huonot. Esikäsittelyllä saadaan aikaan huomattavaa parantumista. Laseja esikäsitellään 30 minuuttia liuoksessa, jonka koostumus on 0,025% Tween 20, 10 mM Na^HPO^, 25 mM NaCl, 0,01% NaN^, pH 7,2, jonka jälkeen ne kuivataan imusuodattimella, ja kuivataan lämpökaapissa 35°:ssa varisevan kuivaksi.

Erotuksen hyvyyden mittaamiseksi eluutiotilavuus määritetään molekyylikooltaan pienellä aineella, klooritenolipunalla, 11 cm pituisella, täytetyllä kapillaaripylväällä.

Huokoinen lasi: Yhtiöstä Sigma, 120-200 mesh.

Panos: 4 ^,ul väriliuosta, kromatografointi suoritettiin vedellä. Kapillaaripylvään täyttökorkeus: 11 cm.

13 78786 Käsittelemätön Impregnoitu materiaali materiaali

Huokosten värimaksimin piikin värimaksimin piikin halkaisija kohta leveys kohta leveys 240 A 8,0 cm 1,2 cm 5 cm 0,8 cm 350 A 10,0 cm 2,0 cm 5 cm 1,2 cm 500 A 7,5 cm 4,0 cm 4,8 cm 1,2 cm 700A 7,2 cm 1,7 cm 4,9 cm 1,2 cm 1000 A 10,3 cm 1,3 cm 4,8 cm 0,8 cm

Valmistajan antamien tietojen mukaan tässä esimerkissä pitäisi teoreettisesti, eli huolellisesti nesteeseen liuotetulla ja pylväässä tasapainotetulla materiaalilla, saavuttaa arvo 4,7 cm.

Esimerkki 4

Mukana olevien inerttien aineiden vaikutus huokoisten lasien erottamisominaisuuksiin_

Geelikromatografiän erottamisen hyvyys riippuu myös kromato-grafian nopeudesta. Liian nopea kromatografia johtaa alentuneeseen erottumiseen. Kuivalla, huokoisella lasilla täytetyllä kapillaaripylväällä suoritetun kromatografiän nopeutta voidaan alentaa lisäämällä täyteaineeseen hydrofobisiksi tehtyjä partikkeleita. Seuraavassa taulukossa esitetään hydrofobiseksi tehdyn kieselgeelin (Octyl-SP 500, 40-100 ^um, yhtiöstä Serva) mukaan sekoittamisen vaikutus huokoisella lasilla (Controlled Pore Glass, 240 A, 200-400 mesh, yhtiöstä Serva) täytetyn kapillaari-pylvään (halkaisija 1 mm, pituus 10 cm) eluoitumisnopeuteen.

i4 78786

Taulukko % (W/W) Kromatografiän vaatima

Octyl-SP 500 aika, min_ 0 3,4 3 7,8 5 12 7 16 10 19 13 20 14 21 17 24 20 52 22 58 25 175

Esimerkki 5

Erottaminen molekyylipainon perusteella esikäsitellyllä lasilla Huokoinen lasi CPG, yhtiöstä Serva, 200-400 mesh, pylväiden täyttökorkeus: 10 cm, panos: kulloinkin 3 yul proteiiniliuosta (2 mg proteiinia/ml), piikin leveys: 0,5-0,7 cm. Liuotin: vesi.

Huokosten Maksimikohta

halkaisija_240 A_350 A

Sytokromi C

MP = 12000 5,3 cm 5,4 cm

Fluoreseiinillä merkitty vasta-aine (anti-albumiini) MP = 150 000 6,5 cm 5,6 cm

Ferritiini MP = 450 000 7,1 cm 6,2 cm

Dekstraanisini MP noin 6 milj. rintama rintama

Fluoreseiinillä merkitty vasta-aine (anti-albumiini) kromatografiässä 1 mg 1) 2) albumiinia/ml PBS 6,5 + 8,1 cm 1) vasta-aine, 2) vasta-aine/antigeeni-kompleksi

Claims (14)

1. Tuote immunokemiallisen pikakokeen toteuttamiseksi, tunnettu siitä, että se koostuu kuivan, huokoisen, turpoamat-toman, rakeisen materiaalin, jolla on molekyylisiivilän kaltaisia ominaisuuksia, muodostamasta kapillaariaktiivisesta kerroksesta, jolloin molekyylisiivilän huokoskoko sallii antigeenin immunokemialliseen määrittämiseen käytettävän, liukoisen vasta-aineen tunkeutumisen huokosiin, mutta joka ei salli tai sallii vain vähäisessä määrin antigeenistä ja vasta-aineesta muodostuneiden liukoisten immunokompleksien tunkeutumisen huokosiin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen tuote, tunnettu siitä, että kapillaariaktiivinen kerros koostuu kapillaaripyl-väästä, jonka halkaisija on 0,5-5 mm ja pituus 5-20 cm.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen tuote, tunnettu siitä, että kapillaariaktiivinen kerros on inertin kantaja-materiaalin päällä, ja että se on 0,05-0,5 mm paksu, 5-10 mm leveä ja 5-20 cm pitkä.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen tuote, tunnet-t u siitä, että molekyylisiivilän alaosa, on kyllästetty vasta-aineella, tai että se on ennalta käytettävässä huokoisessa kerroksessa.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen tuote, tunnet-t u siitä, että vasta-aine on merkitty radioaktiivisesti, fluoresoivasti tai että se on merkitty väriä muodostavalla aineella.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen tuote, tunnet-t u siitä, että vasta-aine on merkitty entsyymillä.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen tuote, tunnettu siitä, että materiaalin yläosa on kyllästetty reagenssijärjestelmällä, jonka kanssa merkitsemiseen käytetty entsyymi reagoi siten, että reaktio voidaan havaita ilmaisimella. i6 78 786

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen tuote, tunnet-t u siitä, että molekyylisiivilämateriaaliin on sekoitettu lisäksi inerttiä, hydrofobista, hienorakeista materiaalia.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen tuote, tunnet-t u siitä, että molekyylisiivilämateriaali on hydrofiilista ja/tai se on kyllästetty kostuttavalla aineella, jonka määrä on 0,01-0,1%.

10. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen tuote, tunnettu siitä, että molekyylisiivilämateriaali on lisäksi kyllästetty puskureilla ja/tai suoloilla ja/tai kompleksin muodostajilla tai muilla vaikuttavilla aineilla.

11. Menetelmä immunokemiallisen reaktion toteamiseksi antigeenien ja vasta-aineiden välisellä kompleksin muodostuksella, tunnettu siitä, että seos kromatografoidaan sopivaa liuotinta käyttäen patenttivaatimuksen 1-3 mukaisella tuotteella, ja että mahdollisesti tuotteen yläosaan muodostunut immunokompleksi todetaan.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 4 mukaisen tuotteen alaosaan laitetaan antigeenipitoista substraattia, jonka jälkeen tuote viedään sopivaan liuottimeen, joka kulkee tuotteen läpi ylöspäin kapillaarivoimien avulla ja erottaa vasta-aineen ja mahdollisesti muodostuneen immunokompleksin.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antigeenipitoista substraattiliuosta käytetään myös kromatografiässä eluenttina.

14. Jonkin patenttivaatimuksen 11-13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromatografisen erottamisen jälkeen itse immunokompleksi tai siihen liitetty merkitsevä entsyymi todetaan ilmaisimella. i7 78786