DE3217032C2 - Vereinfachtes Separationsverfahren für immunologische Bestimmungen und trockene chromatografische Säule für die Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Abstract

Bei dem Separationsverfahren für die Trennung von Antigen-Antikörper-Komplexen von freien Antigenen bei immunologischen Bestimmungen erfolgt die Trennung technisch einfach dadurch, daß das flüssige Reaktionsgemisch mit einer trockenen, senkrecht angeordneten chromatographischen Säule zusammengebracht wird, welche das flüssige Reaktionsgemisch bevorzugt mit ihrem unteren Ende vollständig einsaugt und dabei gleichzeitig die gebundene und freie Phase im vorderen bzw. unteren Säulenabschnitt räumlich voneinander trennt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Separationsverfahren für immunologische Bestimmungen wie radio-, fluoreszenz- oder enzym-immunologische Uniersuchungsmethoden, bei dem der gebildete Antigen-Antikörper-Komplex von den fre:en, nicht an Antikörper gebundenen Antigenen mit Hilfe einer trockenen, chromatographischen Säule getrennt wird, die senkrecht in das flüssige Reaktionsgemisch der immunologischen Bestimmung eingeführt wird, und das gesamte flüssige Reaktionsgemisch der immunologischen Bestimmung durch Kapillarkräfte in diese trockene chromatographische Säule aufgesaugt wird, wonach gegebenenfalls eine geringe Menge Wasser in das verwendete Reaktionsgefäß gegeben wird und dieses Wasser ebenfalls in die chromatographische Säule eingesaugt wird.

so Der quantitative Nachweis kleinster biologisch bereits wirksamer Substanzmengen in Körperflüssigkeiten, Lebensmitteln, in Luft und Wasser ist von großer Bedeutung für die Medizin, Pharmakologie, Toxikologie und Ökologie. Für Forschungszwecke und für Routine-Untersuchungen wurden bereits zahlreiche Analysemethoden entwickelt, wie z. B. die Fluorometric, die Chromatographie, die Massenfragmentographie und die Neutronenaktivierungsanalyse.
Eine besondere Gruppe von Bestimmungsverfahren sind immunologische Bestimmungsverfahren, die die extrem hohe Spezifität immunologischer Reaktionen ausnutzen. Es handelt sich bei derartigen Verfahren im Prinzip um eine Konkurrenzreaktion von markiertem Antigen (Ag') und nicht markiertem Antigen (Ag) um die Bindung an einen spezifischen Antikörper (Ak) unter Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes. Aus dem Anteil an gebundenem markiertem Antigen läßt sich die zu bestimmende Menge des nicht markierten Antigens

ermitteln. Die Markierung des Antigens erfolgte bisher mit fluoreszierenden Substanzen, Enzymen und im Falle des als Radio-Immuno-Assay (RIA) bekannten Verfahrens mit Isotopen. Theoretisch sind auch andere Markierungen denkbar, sofern eine geeignete Meßmethode gefunden werden kann.

Neben der fluoreszenz- und enzym-immunologischen Bestimmungsmethode hat sich seit 1959 vor allem das radioimmunologische Untersuchungsverfahren (Radio-Immuno· Assay-RIA) von Yalow durchgesetzt Es verbindet die außerordentliche Spezifität der immunologischen Reaktion und die hohe Nachweisempfindlichkeit radioaktiv markierter Substanzen mit einer relativ einfachen Durchführbarkeit und ermöglicht erstmals eine Quantifizierung im Pico- und Femtogrammbereich.

Auf Grund der besonderen Bedeutung des Radio-Immuno-Assays wird die vorliegende Erfindung nachfolgend stets anhand ihrer Verwendung bei diesem Verfahren beschrieben, obwohl sich für den. Fachmann sofort erkennen läßt, daß die vorliegende Erfindung für alle immunologischen Bestimmungsverfahren angewendet werden kann, bei denen es um eine Trennung eines Antikörper-Antigen-Komplexes von freien Antigenen geht

Wie dem Fachmann gut bekannt ist, muß für eine radioimmunologische Bestimmung das Antigen, d. h. die nachzuweisende Substanz, zunächst aus biologischem Material oder durch Synthese gewonnen werden. Es wird teils radioaktiv markiert, teils für die Immunisierung zur Gewinnung von Antikörpern verwendet, wäh- 3ü rend die unveränderte Verbindung als Bezugsstandard für die Eichkurve benötigt wird. Für die Markierung ist die Reinheit des Antigens und der Radionukleide eine unerläßliche Voraussetzung, damit eine Mitmarkierung etwaiger Begleitsubstanzen bzw. eine Verminderung der Nachweisempfindlichkeit vermieden wird. Üblicherweise erfolgt die Markierung mit ¹²⁵J wegen dessen längerer HalLwertzeit, besserer Nachweisbarkeit und geringerer Radiolyse.

Antikörper sind komplexe Proteinmoleküle. Sie gehören zu den Gammaglobulinen und werden bei der immunologischen Abwehrreaktion auf fremde oder körpereigene Antigene von bestimmten Antikörper bildenden Zellen produziert

Zur Stimulation der Antikörperbildung müssen die Antigene ein Molekulargewicht über 10 000 aufweisen, wie z. B. Insulin oder das Wachstumshormon. Substanzen mit niedrigerem Molekulargewicht wie Steroide, Schilddrüsenhormone und Pharmaka wie Digoxin haben primär keine Antigeneigenschaft und können erst als Derivat und gekoppelt an ein Protein eine Antikörperbildung auslösen. Derartige Substanzen werden als Haptene bezeichnet, und da die gegen die Antigene gebildeten Antikörper spezifisch auch die Haptene binden, ist auch deren Bestimmung nach immunologischen Be-Stimmungsmethoden möglich.

Bei Thyroxin ist trotz eines Molekulargewichts von 777 der Umweg über eine Proteinbindung nicht erforderlich; man kann direkt das spezifisch bindende Tränsportprotein im Serum als Antikörper verwenden, d. h. es ist eine sogenannte Proteinbindungsanalyse möglich.

In reiner Form isolierte Antikörper und Antigene gehören in der Immunreaktion spezifisch zueinander wie Schlüssel zu Schloß. Der Antikörper kann dabei zwischen den zu bestimmenden unmarkierten Antigenen (Ag) und den in bekannter Menge vorhandenen markierten Antigenen (AG') nicht unterscheiden. Bei einer ausreichenden Bindungs;."'inität stellen sich somit die folgenden Gleichgewichte ein:

Ag +Ak

AG-Ak

Ag⁷ + Ak === Ag⁷ - Ak

Für eine quantitative Bestimmung von Antigenen (Ag) müssen drei Voraussetzungen erfüllt sein:

1. Die Bindungskonstante k ist für die komplexe Ag · Ak und Ag* · Ak gleich.

2. Ak liegt im Unterschuß vor, so daß neben dem Komplex Ag" · Ak auf jeden Fall noch freies Ag⁷ vorliegt

3. Ag, die unmarkierie zu bestimmende Substanz, ist die einzige Variable. Die Konzentration von Ag⁷ und Ak bleibt konstant

Die an die Antikörper (Ak) gebundene Menge von markiertem Antigen (Ag') steht im umgekehrten Verhältnis zur Menge des zu bestimmenden Antigens (Ag). Um quantitativ festzustellen, welcher Anteil des n?arkierten Antigens nach Einsteilung des Gleichgewichts komplex gebunden ist, müssen alle Antigen-Antikörper-Komplexe (Ag · Ak, Ag" · Ak) vom freien, nicht gebundenen Antigen (Ag, Ag¹) abgetrennt werden. Dieser Trennschritt ist im allgemeinen technisch und zeitlich aufwendig und meist mit nicht unerheblichen Fehlern behaftet. Die verschiedenen angewandten Separationsverfahren stellen daher die größten Unterschiede zwischen den bekannten RIA-Systemen dar.

Zu den bekannten universell anwendbaren Trenntechniken gehören das Solid-Phase-System, die Doppelantikörpermethode und die Polyäthylenglykol- (PEG-) Fällung. Bei der Solid-Phase-Methode wird ein an einen festen Träger kovalent oder durch Adsorption gebundener Antikörper eingesetzt Dient das Inkubationsröhrchen selbst als feste Phase (coated tube), so ist zu bedenken, .daß bisweilen die Fixierung des Antikörpers unregelmäßig ist und der Antikörper sich während der Inkubations- und Waschschritte teilweise ablösen kann. Die Doppelantikörper-Trenntechnik nutzt die Vergrößerung und damit die bessere Sedimentien:ng des Antigen-Antikörper-KompIexes aus. Hierbei reagiert ein zweiter Antikörper, der seinerseits gegen den Antigen-Antikörper-Komplex gerichtet ist, unter Bildung eines sehr viel größeren hochmolekularen Komplexes. Bei dieser Methode ist die unspezifische Bindung deutlich geringer als bei der ?EG-Fällungsmethode, nachteilig ist jedoch die im Vergleich zur PEG-Fällung sehr geringe Präzipitation (Fällung) des DoppelantikörperkompleA'es. Durch Zugabe kleiner Mengen dieses PEG-Fällungsmittels läßt sich die Doppelantikörpermethode bisweilen verbessern.

Mit Ausnahme des Coated-Tube-Assays ist bei allen herkömmlichen Methoden eine Zentrifugation erforderlich, was wegen dir Anschaffurcgskosten für die Zentrifuge und des Zeitaufwandes als nachteilig anzusehen ist

Zusätzlich fallen bei allen bisherigen radio-immunologischen Separationsverfahren radioaktive Flüssigkeiten an, die dekantiert bzw. aspiriert werden müssen, was neben dem Zeitaufw.'.nd vor allem eine Kontaminationsgefahr mit sich bringt.

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein präzises Verfahren zur vollständigen Trennung des Antigen-Antikörper-Komplexes von der freien, ungebundenen Antigen-Phase zu entwickeln, welches die Zentri-

fugation und das Dekantieren bzw. Aspirieren erübrigt und gleichzeitig die Bindung der flüssigen Radioaktivität ohne Kontaminationsgefahr an einen festen Träger ermöglicht, und das somit zeit- und kostensparend und gleichzeitig umweltfreundlich ist. Es ist ferner Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine für die Durchführung eines derartigen Verfahrens erforderliche neue Trennvorrichtung zu schaffen. Die Säule soll sich für einen Kit zur Erleichterung der praktischen Durchführung des Verfahrens eignen.

Diese Aufgaben werden durch ein Verfahren und eine trockene chromatographische Säule gelöst, wie sie in den Ansprüchen beschrieben sind und sich für den Fachmann aus der nachfolgenden Beschreibung ergeben.

Aus der DE-AS 27 51 588 ist eine Adsorbenssäule bekannt. Sie besteht aus Kunststoffrohr, das an jedem Rohrende von einer porösen Scheibe bündig verschlossen ist. Die Säule ist mit einem trockenen pulverförmigen Adsorbens fast gefüllt. Bei der Anwendung läßt man mindestens einen Teil des Reaktionsgemisches in diese Säule aus dem Adsorptionsmittel aufziehen in der dann die beiden Formen, also die markierte Komponente einerseits und das Verbindungsreagenz andererseits entlang der Säule voneinander getrennt werden.

Die Verwendung pulverförmiger Stoffe hat aber den Nachteil, daß bei Transport oder Lagerung im liegenden Zustand eine ungleichmäßige Verteilung des Füllgutes in der Säule auf Dauer eintreten kann oder durch Lokkerwerden des Stopfens das Füllgut herausrutschen kann. Durch die Verwendung von gerolltem Papier, was keine porösen Verschlußscheiben an den Enden erforderlich macht, da das gerollte Papier wegen der inneren Elastizität von selbst in einer Umhüllung haftet, wird ein immer gleichmäßiges Aufziehen der zu absorbierenden Flüssigkeit gewährleistet.

Die Zeichnung und die folgende Figurenbeschreibung und ein Austührungsbeispiei erläutern die Erfindung.

Die Zeichnung zeigt in schematischer Schnittansicht eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen trockenen chromatographischen Säule.

In der Zeichnung ist eine trockene chromatographische Säule dargestellt, bei der als Säulenmaterial (1) ein unpolares Material in Form eines homogen verfilzten kreppförmigen bzw. gewellten Filterpapiers mit hohem Reinheitsgrad verwendet wird, das zu einer dichten runden Säule zusammengerollt ist und durch eine erste Umhüllung (2) in Form einer wasserfesten und wasserdichten Polymerfolie in Säulenform fest zusammengehalten wird. Es ergibt sich bei dieser Ausführungsform von selbst, daß das als Säulenmaterial verwendete Kreppapier (1) bei einer senkrechten Anordnung der Säule nicht aus der Umhüllungsfolie (2) herausrutschen kann. Als Folie für die Umhüllung (2) kommt an sich jede inerte wasserfeste und wasserdichte Polymerfolie in Frage. Als besonders vorteilhaft hat sich jedoch eine Umhüllung (2) aus einer Celluloseesterfolie, insbesondere einer Celluloseacetatfolie erwiesen. An sich kann die durch das Säulenmaterial Kreppapier (1) und die Umhüllungsfolie (2) gebildete Säule direkt in dieser Form zum Aufsaugen des Reaktionsgemisches unter Auftrennung in seine Komponenten verwendet werden. Dadurch kann die eigentliche immunologische Trennung und die quantitative Bestimmung verbessert werden. Bei Bestimmungsverfahren, die weniger empfindlich sind, beispielsweise bei fluoreszenzimmunologischen Untersuchungen kann ein festes äußeres Rohr manchmal stören. Für die größte Zahl der praktischen Fälle ist es jedoch bevorzugt, die von einer Folie (2) umhüllte Säule in einer weiteren festen Umhüllung mit rundem Querschnitt (3) anzuordnen, die an beiden Seiten offen ist, wobei das obere Ende jedoch bevorzugt durch eine s Kappe (4) so abgedeckt ist, daß ein nicht dichtender Verschluß erhalten wird, so daß am oberen Ende ein Druckausgleich zur Umgebung erfolgen kann. Die Anordnung des mit einer ersten Umhüllung (2) versehenen Säulenmaterials (1) in einer zweiten, steifen rohrförmigen Umhüllung (.3) mit einer nicht luftdicht schließenden Kappe (4) hat den Vorteil, daß die mechanische Festigkeit der erhaltenen trockenen Säule und damit deren Handhabbarkeit verbessert wird, und daß im Inneren des äußeren Umhüllungsrohres (3) mit der nicht luftdicht schließenden Kappe (4) eine stabile Umgebung für das eigentliche Säulenmaterial (1) erhalten wird, was bekanntlich die Arbeit von chromatographischen Trennsäulen und ihre Trennwirkung in der Regel verbessert. Die Abmessungen der inneren Säule aus dem trockenen inerten Material (1) mit der ersten Umhüllung (2) in Folienform sind dabei bevorzugt so auf die Abmessungen der äußeren rohrförmigen Umhüllung (3) abgestimmt, daß das Material (1) mit seiner Umhüllung (2) die Innenwand der rohrförmigen äußeren Umhüllung (3) leicht berührt, so daß die innere Säule nicht aus der äußeren Umhüllung (3) herausfällt, selbst wenn man diese mit ihrem offenen Ende nach unten anordnet. Durch leichtes Klopfen auf das Ende der steiferen äußeren Umhüllung (3) ist es aber ohne weiteres möglich, die innere Säule der äußeren Umhüllung i3) zu entnehmen. Die Abmessungen der gesamten in F i g. 1 dargestellten Säulenanordnung sind dabei bevorzugt so, daß die ganze Anordnung in ein übliches Probenröhrchen senkrecht hineingestellt werden kann, ohne zu kippen oder in Schräglage zu kommen. Typische, für übliche Verwendungen bevorzugte Maße für die Spulenanordnung betragen 50 bis 100 mm in Längsrichtung und 4 bis 6 mm im Durchmesser. Es können jedoch auch für besondere Zwecke Säulenanordnungen mit anderen Abmessungen verwendet werden. Sollte es beispielsweise erforderlich sein, ein relativ weites Probenröhrchen zu verwenden und gleichzeitig eine langgestreckte, relativ dünne Säule, so kann die entsprechende äußere steife — bevorzugt Kunststoff-, z. B. PVC- — Umhüllung (3) mit Abstandhaltern versehen sein, die für die senkrechte Anordnung der Säule im Probenröhrchen sorgen, oder es können besondere Halteteile vorgesehen sein, beispielsweise durchbohrte Stopfen, zu einem Ring zusammenbiegbare gewellte Kunststoffteile, mit einer öffnung, die gebördelt sein kann, versehene Deckel oc'sT ähnliche, auf verwandten Gebieten verwendete einfache Elemente zur Aufrechterhaltung der senkrechten Anordnung der Säulenanordnung gemäß Fig. 1 in einem Proberöhrchen. Die Kappe (4), die die äußere steife rohrförmige Umhüllung (2) nicht dicht abschließen darf, kann, wie in F i g. 1 dargestellt, ausgeführt sein, wobei zwischen dem eingeschobenen Teil der Kappe und der Innenwand der rohrförmigen Umhüllung (3) ein Spiel vorgesehen ist Es sind aber beliebige andere nicht dicht schließende Ausführungsformen für die Kappe (4) möglich, beispielsweise Kappen mit Einschubteilen, die Längsrippen oder Längskanäle aufweisen, außen auf die Umhüllung (3) aufschiebbare Kappen mit Längsrippen oder Kanälen oder Kappen beliebiger Form mit kleinen

öffnungen, bevorzugt in den seitlichen Flächen der Kappen. Es ist dann möglich, relativ festsitzende Kappen zu verwenden, an denen die gesamte Säulenanordnung gehalten und gehoben werden kann. Bevorzugt ist

auch die Kappe (4) aus einem relativ steifen Kunststoff hergestellt. In der eben unter Bezugnahme auf Fig. I geschilderten Ausführungsform war das Säulenmaterial

(1) ein homogen verfilztes, kreppförmiges Filterpapier hoher Reinheit, das dicht in Säulenform gerollt war. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung ist es besonders bevo,-/Mgt, ein derartiges Material (1) zu verwenden, das aus reinen Linters, d. h. kurzen Fasern von der Oberfläche von Baumwollsamen mit einem Polymerisationsgrad von 2000-3000 besteht und frei \on löslichen Stoffen wie Leimen und von Lignin ist. Es kann jedoch auch ein anderes ligninfreies Cellulosematerial wie beispielsweise Regeneratcellulose mit einem Polymerisationsgrad von 800 bis 3000 verwendet werden. Es ist dabei von Vorteil, wenn das Material Poren in der Größenordnung von 1 bis 14 μπι aufweist.

Zur Sicherung des eigentlichen Säulenmaterials (1), das gegebenenfalls eine crsic Umhüllung (2) aufweist, in der äußeren steifen Kunststoffumhüllung (3) sind an sich beliebige konstruktive Ausführungsformen möglich. Außer der schon oben beschriebenen Sicherung durch Einpassen ist es z. B. auch möglich, zwischen dem eigentlichen Säulenmaterial (1) mit der ersten Umhüllung

(2) und der äußeren Umhüllung (3) einen gewissen Abstand vorzusehen, wobei in einem derartigen Fall die innere Säule (1,2) gegen ein Herausfallen aus der äußeren Umhüllung (3) z. B. durch eine Schicht eines porösen Materials, ein geeignetes Gitter, nach innen weisende Vorsprünge oder auch einen Querstag oder dergleichen am u/.ieren Ende der Umhüllung (3) gesichert sein kann.

Zur weiteren Vereinfachung des eigentlichen radioimmuno-logischen Bestimmungsverfahrens kann es ferner vorteilhaft sein, auf das Säulenmaterial des Endabschnitts der Säule, der in das Reaktionsgemisch taucht, eines der in konstanter Konzentration verwendeten Reagenzien aufzutragen. Beispielsweise kann es vorteilhaft sein, die erforderliche Menge an Antikörper oder an markiertem Antigen (Tracer) in den unteren Säulenabschnitt einzuimprägnieren und zu lyophilisieren. Es ist in einem solchen Falle nur noch die Pipettierung der restlichen Substanzen, d. h. der Standards bzw. der Seren und Antikörper bzw. Tracer erforderlich. Ein besonderer Vorteil wird erhalten, wenn man den radioaktiven Tracer an das poröse Material lyophilisiert, da dann der freie Umgang mit radioaktivem Material und damit die Kontaminationsgefahr völlig vermieden wird. Da es in der Praxis schwierig ist, eine kontinuierliche Säule abschnittweise definiert zu imprägnieren bzw. auf der Säule auf homogene Weise Substanzen zu lyophilisieren, ist es aus praktischen Gründen bevorzugt, die Säule schichtweise aufzubauen, wobei die lyophilisierte Schicht und die Schicht aus neutralem Säulenmaterial getrennt erzeugt werden und erst anschließend zu einer homogenen Säule vereinigt werden können.

' Das Verfahren läuft generell — unabhängig davon, ob es sich um die Bestimmung der Eichkurve unter Verwendung einer Standardlösung oder um die eigentliche Messung handelt — so ab, daß man in an sich bekannter üblicher Weise ein flüssiges radioaktives Reaktionsgemisch aus Antikörper, markiertem und unmarkiertem Antigen sowie gegebenenfalls Hilfssubstanzen erzeugt, dieses Gemisch die erforderliche Zeit inkubiert, und daß man dann gemäß der vorliegenden Erfindung die erfindungsgemäße trockene, chromatographische Säule in das erhaltene Reaktionsgemisch eintaucht Infolge der Wirkung von Kapillarkräften wird das Reaktionsgemisch dann in die chromatographische Säule aufgesaugt Da diese Säule so bemessen ist, daß sie das ge samte Reaktionsgemisch aufnehmen kann, bleibt nach dem Eintauchen der chromatographischen Säule ein trockenes Probenröhrchen zurück. Um dieses gänzlich von zurückgebliebenen Substanzen zu reinigen, und um ferner die während der Adsorption erfolgende Trennung in Antigen-Antikörper-Komplex und freie Antigene zu verbessern, wird nach dem Aufsaugen der ursprünglichen Reaktionslösung noch etwas destilliertes Wasser, beispielsweise in einer Menge von t,0 ml, zuge geben, das ebenfalls von der Säule aufgesaugt wird. Die Säule enthält nunmehr in schichtweiser Auftrennung die gesamte Reaktionsmischung, und die Radioaktivität der verschiedenen Zonen der Säule kann exakt gemessen werden. Bei der bevorzugten Ausführungsform des er findungsgemäßen Verfahrens taucht die chromatogra phische Säule mit ihrem unteren Ende in die Reaktionsmischung, es ist jedoch ohne weiteres auch möglich,

UIbAi ttUI \ßUtt VtSVI V a-IIIUV UWt UUUIV UUIbUgVI/Vlli Überraschenderweise hat es sich herausgestellt, daß

bei Verwendung der erfindungsgemäßen chromatographischen Säule in vielen Fällen eine solche Auftrennung des Reaktionsgemisches erfolgt, daß der hochmolekulare Antigen-Antikörper-Komplex nach oben in den oberen Säulenabschnitt wandert, während im Gegensatz zu den üblichen Erfahrungen und Erwartungen die niedermolekularen Bestandteile (Ag, Ag', Ak) im unteren Säulenabschnitt zurückbleiben. Die Ursachen für diese ungewöhnliche Art der Bindung an die Adsorbentien innerhalb der chromatographischen Säule sind nicht ge- nau bekannt Wahrscheinlich überwiegen bei den verwendeten unpolaren Adsorbentien, insbesondere bei dem gerollten Filterpapier, van der Waals' und hydrophobe Wechselwirkungen, die das Wanderungsverhalten erklären können.

Das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen trockenen chromatographischen Säule ist in der Praxis besonders einfach durchzuführen, wenn alle erforderlichen Reagenzien zusammen mit der Säule in Form eines Testsatzes oder Kits vorlie gen, da bei derartigen Kits die Möglichkeit besteht, die Konzentrationen und das Verhalten von Antikörpern, Standardantigenzubereitungen und markierten Antigenen genau aufeinander abzustimmen, so daß optimale Ergebnisse erhalten werden. Die Kits werden spezifisch

für die zu bestimmenden Substanzen zusammengestellt und enthalten in der Regel in definierten Konzentrationen Antikörper, markierte Antigene, eine Reihe von Standard-Antigenzubereitungen, gegebenenfalls Hilfssubstanzen wie Puffer oder Substanzen zum Freisetzen der eigentlichen zu messenden Substanz sowie mindestens ein, in der Regel jedoch mehrere, üblicherweise 100 erfindungsgemäße chromatographische Säulen. Derartige Kits können beispielsweise für die Bestimmung von Thyreotropin (TSH), Triiodthyronin fT3), Te-

trajodthyronin fT4), Progesteron, östriol, Lutropin, FoI-Iitropin, Cortisol, Digoxin u. a. ausgelegt sein.

Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand eines konkreten Ausführungsbeispiels noch näher erläutert

·

Beispiel

Bestimmung von Thyreotropin (TSH) durch Radio-Immuno-Assays

Zur Bestimmung des ThyFeoidea stimulierenden Hormons (TSH) Thyreotropin werden die folgenden, alle

zweckmäßig in einem Kit enthaltenen Reagenzien verwendet:

1. Antiserum: Da» hochspezifische Antiserum gegen TSH wurde durch Immunonisierung von Kaninchen mit hocngereinigten humanem Thyreotropin gewonnen. Die Kreuzreaktion mit anderen Hypophysenhormonen ist unbedeutend. Ein Kit enthält 22 ml Antiserum.

2. Mit ¹²⁵J markiertes TSH (Tracer), 11 ml. Das markierte TSH liegt in einer gebrauchsfertigen Lösung in Puffer vor.

3. TSH-Standards, lyophilisiert. 1,0 ml/Flasche. Hochgereinigtes humanes TSH, lyophilisiert in TSH-freicni Humanserum, kalibriert mit der WHO First International Reference Preparation of Thyreoid Stimulating Hormon. Ein Kit enthält S Standards mit folgenden Konzentrationen (μυ/ml): O, 1, 2, 5, 10, 25.50,75.

4. Trockene chromatographische Trennsäulen, die als Säulenmaterial ein gekrepptes Filterpapier von hohem Reinheitsgrad enthalten, das eine homogene Verfilzung aufweist und aus reinen Unters besteht und frei von löslichen Stoffen ist. Das Säulenmaterial ist in einer oben und unten offenen Umhüllung aus Cellulose-Acetatfolie angeordnet, und die erhaltene patronenartige Säule ist in ein durch eine lose sitzende Kappe abgedecktes rundes Kunststoffröhrchen eingeschoben.

5. Puffer, 25 ml, gebrauchsfertige Lösung.

Zur Bestimmung einer unbekannten Menge von TSH werden zu Serumsproben von 20 bis 600 μΐ, vorzugsweise 100 μ! 0,1 ml TSH-Antikörper zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei 37° C oder Ober Nacht bei Zimmertemperatur inkubiert Anschließend werden 0,1 ml Tracer (markiertes TSH-Antigen) hinzugefügt, und es wird noch einmal 2 Stunden bis zur Einstellung des Reaktionsgleichgewichts inkubiert Nach Erreichen des Reaktionsgleichgewichts erfolgt die Trennung der gebundenen Phase, d. h. des Antigen-Antikörper-Komplexes von der freien Phase, d.h. den nichtgebundenen Antigenen und Antikörpern dadurch, daß die trockene chromatographische Säule senkrecht in das flüssige radioaktive Reaktionsgemisch eingetaucht wird. Die im Probenröhrchen enthaltene Flüssigkeit wird vollständig von der Säule aufgesaugt Um die Trennung während der Adsorbtion zu verbessern, werden nach dem vollständigen Aufsaugen noch einmal 1,0 ml destilliertes Wasser zugesetzt Das Wasser wird ebenfalls von der Säule aufgesaugt

Es zeigte sich, daß im unteren Abschnitt der chromatographischen Säule die freie Phase gebunden ist, während sich die gebundene Phase räumlich davon getrennt im oberen Säulenbereich befindet Die Radioaktivität der verschiedenen Phasen konnte im Gammacounter exakt gemessen werden.

Die Auswertung der Meßergebnisse erfolgte unter Verwendung einer Eichkurve aus 6 Standards. Zur Erstellung der Standard-Eichkurve wurde die gemessenen Prozent-Bindung gegen die entsprechende Standardkonzentration nach der Spline-Approximation-Standardkurve aufgetragen.

Der Mittelwert zur Bestimmung der Nachweisempfindlichkeit liegt bei 0,1 μυ/ml TSH, d. h. TSH Konzentrationen unter 0,2 μυ/ml TSH können ebenfalls mit guter Reproduzierbarkeit gemessen werden. Die Bestimmung der Intercept-Werte gibt an, ob das Verhält nis der einzelnen Testkomponenten (Ak, Ag, Ag') und die Diskriminierungsfähigkeit des Testsystems in einem idealen Bereich liegen. Die gefundenen TSH-Werte für den 90%- und den 50%-imerceptpunkt liegen mit 0,5 bis 1,5 μυ/ml TSH bzw. 15 bis 25 μυ/ml TSH im optimalen Bereich. Die Wiederfindung zugesetzter TSH-Mengen verläuft über den gesamten Meßbereich annähernd linear. Die relative Wiederfindung schwankt dabei zwischen 98 bis 105%.

ίο Als ein wichtiger erwünschter Nebeneffekt der radioimmunologischen Bestimmungen mit der erfindungsgemäßen Säule ist anzusehen, daß die gesamte Radioaktivität der Probe zusammen mit dem Reaktionsgemisch in die Säule aufgesaugt wurde. Nach der Auszählung der

is Probe liegt somit die Radioaktivität in einer bequem handhabbaren Form vor und die Gefahr einer Kontaminisrüng mit Rester, des flüssigen R?3ktions£Rniisrhs ist gegenüber den üblichen Verfahren stark gesenkt, auch wenn der Antikörper stationär an eine Trägersubstanz innerhalb des Proberöhrchen gebunden ist, wird die gesamte flüssige Radioaktivität in der Säule absorbiert und dabei werden gleichzeitig die freien Antigene im unteren Säulenabschnitt gebunden. In diesem Fall verbleibt der Antigen-Antikörper-Komplex innerhalb des flüssigkeitsfreien Probenröhrchens an die Trägersubstanz gebunden und kann nach Herausnahme der Säule gemessen werden. Es ist darauf hinzuweisen, daß die erfindungsgemäßen trockenen chromatographischen Säulen so preiswert hergestellt werden können, daß sie auch zum Aufsaugen von ähnlichen radioaktiven Gemischen verwendet werden können, die nicht ausgezählt werden sollen, sondern die nur unschädlich gemacht werden sollen. Obwohl in der obenstehenden Beschreibung das er findungsgemäße Verfahren insbesondere an Hand eines Radio-Immuno-Assays beschrieben wurde, ist es für den Fachmann aufgrund der für ihn gut übersehbaren Wirkung einer Trennung mit einer erfindungsgemäßen chromatographischen Säule selbstverständlich, daß die se Säule eine Trennung aller anderen bei immonulogi- schen Bestimmungsverfahren erhaltenen Gemische ermöglicht daß sie also genauso für fluoreszenz- und enzym-immunologische Untersuchungsverfahren geeignet ist

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße Separationsverfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen trockenen Säule äußerst präzise und im Vergleich zu den bisher bekannten Trennverfahren für radio-immunologische Bestimmungen einfa- eher, wirtschaftlicher und umweltfreundlicher ist, und daß es aufgrund seiner Anwendbarkeit für andere immunologische Untersuchungen auch sehr vielseitig ist

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (11)

Patentansprüche:

1. Separationsverfahren für immunologische Bestimmungen wie radio-, fluoreszenz- oder enzymimmunologische Untersuchungsmethoden, bei dem der gebildete Antigen-Antikörper-Komplex von den freien, nicht an Antikörper gebundenen Antigenen mit Hilfe einer trockenen, chromatographischen Säule getrennt wird, die senkrecht in das flüssige Reaktionsgemisch der immunologischen Bestimmung eingeführt wird, und das gesamte flüssige Reaktionsgemisch der immunologischen Bestimmung durch Kapillarkräfte in diese trockene chromatographische Säule aufgesaugt wird, wonach gegebenenfalls eine geringe Menge Wasser in das verwendete Reaktionsgefäß gegeben wird und dieses Wasser ebenfalls in die chromatographische Säule eingesaugt wird, dadurch gekennzeichnet, daß eine chromatwgraphische Säule verwendet wird, die ein unpoiares Säuienmateriai in Form eines homogenen verfilzten, kreppförmigen und in Säulenform dicht gerollten Filterpapiers mit hohem Reinheitsgrad enthält

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Filterpapier aus reinen Linters, d. h. kurzen Fasern von der Oberfläche der Baumwollsamen mit einem Polymerisationsgrad von 2000 bis 3000, oder aus Regeneratcellulose mit einem Polymerisationsgrad von 800 bis 3000, besteht und frei von lö: liehen Stoffen ist

3. Verfahren nach Anspruch \ oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Filterpapier eine gleichmäßige Textur mit Peren in- der Größenordnung von 1 bis 14 μπι sowie über Qie Höhe der Säule eine gleichmäßige Saugfähigkeit aufweist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Endabschnitt der trockenen chromatographischen Säule die erforderlichen Mengen aller zur immunologischen Bestimmung der gewünschten Substanzen bestimmten Reagenzien einimprägniert oder lyophilisiert enthält.

5. Trockene chromatographische Säule zum Separieren der Antigen-Antikörper-Komplexe von den freien, nicht an Antikörper gebundenen Antigenen und/oder zur vollständigen Bindung aller radioaktiven Substanzen bei der immunologischen Bestimmung γοη Antigenen bzw. Haptenen nach radio-, fluoreszenz- oder enzym-immunologischen Bestimmungsmethoden, bei der in einer säulenförmigen wasserfesten und wasserdichten Umhüllung ein trockenes Adsorptionsmittel so angeoi dnet ist, daß es bei senkrechter Anordnung der Säule nicht aus dieser herausfallen kann, dadurch gekennzeichnet, daß das trockene Adsorptionsmittel (1) ein unpolares Material in Form eines homogen verfilzten, kreppförmigen und zu einer dichten Säule gerollten Filterpapiers mit hohem Reinheitsgrad ist.

6. Säule nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Filterpapier aus reinen Linters, d. h. kurzen Fasern von der Oberfläche der Baumwollsamen mit einem Polymerisationsgrad von 2000 bis 3000, oder aus Regeneratcellulose mit einem Polymerisationsgrad von 800 bis 3000 besteht und frei von löslichen Stoffen ist.

7. Säule nach einem der Ansprüche 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Filterpapier (1) eine gleichmäßige Textur mit Poren in der Größenordnung von 1 bis 14 μπι und eine über die Höhe der Säule einheitliche Saugfähigkeit aufweist

8. Säule nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Filterpapier (1) von einer oben und unten offenen Umhüllung (2) aus einer wasserfesten und wasserdichten Celluloseacetatfolie umhüllt ist und dieses umhüllte Fiherpapier (1) in ein steifes, beidseitig offenes rundes Runststoffröhrchen (3) eingeschoben ist, das an seinem oberen Ende durch eine nicht dicht schließende Kappe (4) abgedeckt ist

9. Säule nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet daß das Kunststoffröhrchen (3) Abstands- und/ oder Führungselemente aufweist die seine senkrechte Anordnung in einem Probenröhrchen gewährleisten.

10. Säule nach einem der Ansprüche 5 bis- 9, dadurch gekennzeichnet, daß einer der Endabschnitte des Filterpapiers (1) mit der für die jeweilige Bestimmung erforderlichen Menge von Antikörpern oder Antigenen, die mit Isotopen, Enzymen, fluoreszierenden oder anderen Substanzen markiert sein können, imprägniert oder lyophilisiert ist

11. Säule nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet daß der mit lyophilisierten Substanzen beladene Endabschnitt und der nicht-beladene Endabschnitt des Säulenmaterials (1) zwei verschiedene kurze Säulen aus gerolltem Filterpapier sind, die nachträglieh zu einer G esamtsäule vereinigt wurden.