DE2436010C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Anwe
senheit oder Abwesenheit eines spezifischen Proteins in einer biolo
gischen Probe mit den folgenden Stufen:
- Aufbringen eines Metallüberzugs auf ein Substratmaterial,
Inberührungbringen des überzogenen Substratmaterials mit einer Lö sung eines mit dem genannten spezifischen Protein spezifisch reagie renden Proteins, um das Substratmaterial mit dem spezifisch reagie renden Protein zu beschichten,
Inberührungbringen des beschichteten Substratmaterials mit der bio logischen Probe und
Untersuchen des beschichteten Substratmaterials, um zu bestimmen, ob das spezifische Protein daran haftet oder nicht, wobei - a) auf das Substrat ein Metallüberzug aufgebracht wird, der ausge wählt ist aus Indium, Gold, Silber, Zinn oder Blei, und
- b) das Untersuchen des mit Protein beschichteten Substrates durch einfaches Betrachten dahingehend erfolgt, um festzustellen, ob eine oder mehr Proteinschichten auf dem Substrat vorhanden sind, nach Pa tent 23 30 702.
In dem älteren Patent 23 30 702 ist ausgeführt, daß ein will
kürlich ausgewähltes Protein nur in einer monomolekularen Schicht
auf einem Substrat haften wird, so daß kein anderes willkürlich
ausgewähltes Protein auf dieser Proteinschicht haften wird. Anderer
seits wird das spezifisch reagierende Protein sich immunologisch mit
dem ersten Protein, das an dem Substrat adsorbiert ist, verbinden.
Im Einklang mit der Lehre dieses Patents wird diese Feststellung da
zu benutzt, medizinische diagnostische Apparate zu bilden, in denen
ein Substrat, an dem eine monomolekulare Schicht eines Proteins ad
sorbiert ist, verwendet wird, um Lösungen, in denen das damit spezi
fisch reagierende Protein vermutet wird, zu testen. Wenn das spezi
fisch reagierende Protein in der Lösung zugegen ist, trägt das Sub
strat nach dem Eintauchen in die Lösung eine bimolekulare Protein
schicht. Wenn das spezifisch reagierende Protein in der Lösung nicht
vorhanden ist, weist das Substrat nach dem Eintauchen lediglich die
ursprüngliche monomolekulare Proteinschicht auf. Optische, elektri
sche und chemische Vorrichtungen zur Unterscheidung zwischen einer
bimolekularen Proteinschicht und einer monomolekularen Protein
schicht werden in dem obigen Patent ebenfalls beschrieben.
In zwei Ausführungsformen der diagnostischen Apparate, wie sie
in dem obengenannten Patent beschrieben wurden, wird die optische
Unterscheidung zwischen monomolekularen und bimolekularen Protein
schichten durch Beobachtungen der Substrate mit dem bloßen Auge
durchgeführt. Der beschriebene chemische Nachweis erfolgt unter Ver
wendung eines Substrates, das eine Oberfläche eines Materials hat,
das mit Quecksilber ein sichtbares Amalgam bildet, und hängt, was
seine Durchführbarkeit anbetrifft, davon ab, daß ein Quecksilber
tropfen, der auf eine bimolekulare Proteinschicht aufgebracht wird,
etwa zehnmal so viel Zeit braucht, um durch diese Schicht zu dif
fundieren, wie ein Quecksilbertropfen, der auf eine monomolekulare
Proteinschicht aufgebracht wird. Der elektrische Nachweis beinhaltet
die Verwendung eines elektrisch leitfähigen Substratmaterials und
das Aufbringen einer Elektrode auf der Proteinschicht; die Kapazität
zwischen den beiden leitfähigen Elementen wird dann gemessen, wobei
dessen Wert die Dicke des dielektrischen Proteinfilms, die sie
trennt, angibt, und damit aussagt, ob solch ein Film monomolekular
oder bimolekular ist. Hieraus ist ersichtlich, daß die in dem obi
gen Patent beschriebenen elektrischen und chemischen Ausführungsfor
men es erforderlich machen, daß das aufzufindende Protein, wenn es
in der Testlösung zugegen ist, eine vollständige zweite monomoleku
lare Schicht auf dem Substrat bildet.
Einige Partikel, deren Nachweis äußerst wichtig ist, sind in
physiologischen Proben jedoch nur in sehr verdünnten Konzentrationen
enthalten. In einem solchen Fall wird nur eine kleine Anzahl solcher
Teilchen an dem Substrat gebunden, so daß ihre Nachweisbarkeit nur
in begrenztem Umfange erfolgen kann.
In der immunologischen Literatur ist es bekannt, daß Antikör
permolekule als Antigene funktionieren, wenn sie in das System eines
Wirbeltieres, für welches sie artfremde Proteine darstellen, einge
geben werden. Dementsprechend können spezifisch reagierende Antikör
per für einen gegebenen Antikörper leicht hergestellt werden. Diese
Möglichkeit wurde in der Literatur ausgenutzt, um als Hilfsmaßnahme
zum Nachweis bestimmter Arten von Mikroorganismen fluoreszierende
Moleküle an den immunologisch komplexen Proteinen anzubringen (vgl.
"Science Progress", Nr. 3415, Seiten 417 bis 422, November 1969, und
"Ärztliches Laboratorium", 18, 133 bis 142, 1972). Beispielsweise
können Antikörper zu menschlichen Immunglobulinen hergestellt und
chemisch mit fluoreszierenden organischen Molekülen, wie beispiels
weise Isothiocyanaten, kombiniert werden. Dieser sogenannte mar
kierte Antikörper wird dann verwendet, um eine immunologische Reak
tion unter einem UV-Mikroskop sichtbar zu machen. Einer der wichtig
sten Verwendungszwecke für solche Antikörper gegenüber Antikörpern,
die in der Literatur bekannt sind, ist der serologische Test für Sy
philis gemäß dem Verfahren von Coons, das als FTA-STS-Verfahren in
der Literatur bekannt ist. Bei dem FTS-STS-Verfahren wird eine be
stimmte Menge von Treponema pallidum (T. pallidum) auf einem Sub
strat getrocknet. Das Substrat wird dann in eine Blutprobe einge
taucht. Das Substrat wird anschließend in eine Lösung von markier
tem Immunglobulin eingetaucht. Das Anti-Menschen-Immunglobulin ver
bindet sich nicht mit dem T. pallidum; entsprechend wird das Sub
strat, wenn es unter einem UV-Mikroskop beobachtet wird, nur dann
fluoreszieren, wenn die Probe Antikörper für T. pallidum enthielt.
In "J. Am. Chem. Soc.", Band 59, 1406 (1937) wird die optische
Messung der Dicke eines aus einer Lösung adsorbierten Films be
beschrieben. In diesem Zusammenhang ist ausgeführt, daß manchmal auf
einanderfolgend alternierende Schichten aufgebaut werden können.
Dies bedeutet, daß sich die beiden Schichten immer wiederholen und
setzt das Vorhandensein ausreichend großer Mengen der dafür erfor
derlichen Materialien voraus.
Die bekannten Verfahren erfordern einen relativ hohen appara
tiven Aufwand.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Nachweis
empfindlichkeit immunologischer Reaktionen auf einfachere Weise zu
verbessern.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zur
Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit das beschichtete Substrat
nach dem Inberührungbringen mit der biologischen Probe in eine Lö
sung eines dritten Protein eingetaucht wird, das mit dem nachzuwei
senden zweiten Protein immunologisch reagiert, und daß das Unter
suchen dahingehend erfolgt, daß man durch Beobachten des Substrates
zwischen der Anwesenheit dreier Schichten oder nur einer Schicht
darauf unterscheidet.
Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung finden sich in
den Unteransprüchen.
Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeich
nung näher erläutert. Im einzelnen zeigen
Fig. 1 eine schematische Darstellung des Haftens einer Viel
zahl von Proteinschichten auf dem Substrat,
Fig. 2 ein Querschnitt eines Aufrisses eines Substrates,
das vier monomolekulare Proteinschichten trägt, und
Fig. 3 eine Schnittansicht eines Aufrisses eines Substrates,
das gemäß einer Ausführungsform der Erfindung herge
stellt wurde und die Vervollständigung einer mono
molekularen Schicht auf einem Substrat zeigt.
Fig. 1 zeigt ein Substrat 10, das eine Oberfläche eines dia
gnostischen Objektträgers bildet, an der eine Vielzahl von will
kürlich ausgewählten Proteinmolekülen oder anderen Partikeln, wie
beispielsweise Viren oder Hepatitis assoziierte Antigenpartikel 11,
adsorbiert ist. Eine Vielzahl von Molekülen oder anderen Parti
keln 11 sind immunologisch mit ihren spezifisch reagierenden Anti
körpermolekülen, wie allgemein bei 21, 22 gezeigt, komplexiert.
Die Antikörpermoleküle 21 und 22 sind schematisch dargestellt, um
eine Erklärung ihrer Struktur zu erleichtern. Die ursprüngliche
Partikelschicht wird im Anschluß hieran der Einfachheit halber mit
"Moleküle" bezeichnet, es sei denn, daß dies durch den spezifischen
Zusammenhang anders erforderlich ist, wobei es sich versteht, daß
andere Partikel auch mit in den Umfang der vorliegenen Erfin
dung eingeschlossen sind.
Die fünf Hauptklassen von Antikörpern enthalten die Immunglobuline,
die mit IgG, IgM, IgA, IgD und IgE bezeichnet wurden. Der über
wiegende Anteil an Immunglobulin ist IgG, welches etwa 85% der
Immunglobuline im normalen menschlichen Serum darstellt und das
auch in einem, überschlagmäßig geschätzt, ähnlichen Überschuß im
normalen Serum anderer Wirbeltiere gefunden wurde. Ein IgG-Par
tikel enthält zwei schwere (lange) Peptidketten und zwei leichte
(kurze) Peptidketten, die mittels Disulfidbindungen miteinander
so verbunden sind, daß sie ein allgemein wie ein "Y" gestaltetes
Antikörpermolekül bilden. Die IgG-Antikörpermoleküle sind immuno
logisch zweiwertig; d. h. jedes Molekül hat zwei aktive Antikör
perstellen. Die Antikörperstellen 21 a 1 und 21 a 2
des Moleküls 21
und 22 a 1 und 22 a 2 des Moleküls 22 sind an den extremen Enden der
Arme des Y-förmigen Moleküls angeordnet. Die aktiven Stellen er
möglichen die immunologische Bindung des Antikörpers an ein Mole
kül von dessen assoziiertem Antigen, wie es beispielsweise in Fig. 1
gezeigt wird, wo die aktiven Stellen 21 a 1, 22 a 1 und 22 a 2 an eine
Vielzahl von Proteinmolekülen 11 gebunden sind. Wie schon oben
angegeben, wirken Antikörpermoleküle auch als Antigen, wenn sie
in das System eines Wirbeltieres eingeführt werden, für welches sie
ein artfremdes Protein darstellen. Dadurch stimulieren sie die
Herstellung von Antikörpern, die spezifisch für den Antikörper
als Antigen sind. Ein Antikörper zum IgG-Antikörper ist ein wei
terer IgG-Antikörper, der deshalb also auch zwei aktive Stellen
hat. Diese aktiven Stellen verbinden sich mit spezifischen, immuno
logisch aktiven Stellen am ersten Antikörper. Die immunologisch
aktiven Stellen sind andererseits als immunologische Determinanten
oder Epitopen bekannt. Wie oben angegeben, beträgt die Anzahl der
aktiven Stellen im Antikörper von einem IgG-Antikörper zwei. Die
Anzahl von Epitopen, die mit einem IgG-Molekül assoziiert sind,
ist nicht genau bekannt, aber man weiß, daß die Anzahl von Epi
topen wenigstens zwei beträgt. Es ist bekannt, daß Epitopen am
Schwanz des Y-förmigen Moleküls vorhanden sind und daß sie wahr
scheinlich auch an dessen Armen zugegen sind. Zum Zwecke der
Illustration des Prinzips des erfindungsgemäßen Verfahrens sind
drei Epitope entlang der schweren (langen) Peptidketten jedes
Antikörpermoleküls, wie sie in Fig. 1 illustriert werden, gezeigt.
Die Epitopen des Antikörpermoleküls 21 sind mit 21 e 1, 21 e 2 und
21 e 3 bezeichnet. Die Epitopen des Antikörpermoleküls 22 sind mit 22 e 1,
22 e 2 und 22 e 3 bezeichnet.
Die Adsorption der Moleküle 11 am Substrat 10 und das Ein
tauchen des proteinbeschichteten Substrates in eine Lösung
von Antikörpern gegenüber dem Protein 11, um Moleküle 21 und 22
immunologisch daran zu binden, bildet den Kern der in der obigen
DT-PS beschriebenen Erfindung. Gemäß der Praxis der vorliegenden
Erfindung wird eine bestimmte Menge einer Lösung von Antikörpern
vom Typ, wie sie durch 21 und 22 repräsentiert werden, an ein
Wirbeltier verabreicht, um die Produktion von Antikörpern dazu
zu stimulieren. Die hergestellten Antikörper werden mit Hilfe
von bekannten Verfahren gesammelt und eine Lösung davon wird beim
verbesserten diagnostischen Verfahren gemäß der vorliegenden Er
findung verwendet. Das Substrat wird in eine Lösung von Anti-
Antikörpern getaucht, und wenn Moleküle 21 und 22 an Moleküle 11
gebunden werden, wird eine Vielzahl von Molekülen 31, 32, 33, 34
und 35 immunologisch an Moleküle 21 und 22 gebunden. Wenn anderer
seits Antikörper vom Typ der Moleküle 21 und 22 nicht in der Lösung
vorhanden sind, in welche das Substrat zuerst eingetaucht
wird, werden auch nach dem Eintauchen in die Lösung, die solche
Moleküle enthält, keine Moleküle 31 bis 35 auf dem Substrat
vorhanden sein, weil Moleküle 31 und 35 spezifisch mit Molekülen
21 und 22 reagieren und sich nicht mit den Molekülen 11 verbinden.
Zu diesem Zeitpunkt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die
Nachweisbarkeit der Moleküle 21 und 22 dadurch entsprechend ver
bessert, daß ihre Gegenwart bestimmt wird, indem man zwischen
einer Schicht von Molekülen 11 und einer Schicht von Molekülen 11,
21, 22, 31, 32, 33, 34 und 35 unterscheidet, im Gegensatz zu der
Bestimmung, bei welcher man zwischen einer Schicht von Molekü
len 11 und einer Schicht von Molekülen 11, 21 und 22 unterschei
det. Erfindungsgemäß kann das Verfahren wiederholt werden, um
zusätzliche Proteinschichten aufzutragen, um die Sensitivität
des Nachweises weiter zu steigern, wie beispielsweise durch die
selektive Bindung der Moleküle 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,
49, 50, 51, 52 und 53 an die Moleküle 31, 32, 33, 34 und 35.
Antikörpermoleküle 31, 32, 33, 34 und 35 haben die aktiven Stel
len 31 a 1, 31 a 2 bzw. 32 a 1, 32 a 2 bzw. 33 a1,
33a 2, bzw. 34 a 1, 34 a 2
bzw. 35 a 1 und 35 a 2. Antikörper 31 ist durch die Befestigung der
aktiven Stelle 31 a 2 an Epitop 21 e 2 immunologisch an Antikörper
21 gebunden. Antikörper 32 ist durch die Verbindung der aktiven
Stelle 32 a 1 an Epitop 21 e 1 immunologisch gebunden an Antikörper
21. Antikörper 33 ist durch die Verbindung der aktiven Stelle
33 a 2 an Epitop 22 e 2 immunologisch an Antikörper 22 gebunden;
Antikörper 34 ist durch die Verbindung der aktiven Stelle 34 a 1
an Epitop 22 e 1 an Antikörper 22 gebunden; Antikörper 35 ist
durch die Verbindung der aktiven Stelle 35 a 1 an Epitop 22 e 3 an
Antikörper 32 gebunden. Wie auf der linken Seite von Fig. 1 im
Hinblick auf die Proteinkette, die mit Antikörper 21 beginnt,
gezeigt, ist jeder Antikörper mit zwei aktiven Epitopen ange
geben. Das bedeutet, daß jeder Antikörper als Antigen zwei Anti
körper bindet. Somit hat Antikörper 21 Antikörper 31 und 32
gebunden, die wiederum Antikörper 41, 42, 43 und 44 an sich ge
bunden haben. Dies stimmt mit der bekannten Minimalzahl von
aktiven Epitopen pro IgG-Antikörpermolekül überein. Auf der
rechten Seite von Fig. 1 hat die Proteinkette, die mit Anti
körper 22 beginnt, drei aktive Epitopen pro Antikörper. So ist
ersichtlich, daß die Verbesserung der Empfindlichkeit, wie sie in
Übereinstimmung mit dieser Erfindung erhalten wird, proportional
der Anzahl an aktiven Epitopen pro Antikörper-Molekül und der
Anzahl von Eintauchvorgängen des Substrates in aufeinander
folgende Lösungen mit Antikörpern ist.
In einem Beispiel von serumimmunologischen Reaktionen, die er
findungsgemäß durchgeführt wurden, wurde eine Schicht von Rinder
serum-Albumin an einem Substrat adsorbiert. Das Substrat
wurde dann in eine Lösung von Kaninchen-Antiserum gegenüber dem
Rinderserum-Albumin eingetaucht, wonach das Substrat die
ursprüngliche Rinderserum-Albumin-Schicht aufwies, die immuno
logisch gebunden dazu eine Schicht von Kaninchen-IgG-Immun
globulin-Antikörper zum Rinderserum-Albumin enthielt. Das Sub
strat wurde als nächstes in eine Lösung von Ziegen-Antiserum
zum Kaninchen-IgG getaucht, wonach das Substrat eine Schicht
von Rinderserum-Albumin, eine Schicht von Kaninchenanti-BSA-IgG
und eine Schicht von Ziegenanti-Kaninchen-IgG-Antikörpern aufwies.
Der nächste Schritt war das Eintauchen des Substrates in eine
Lösung von Kaninchen-Antiserum zum Ziegen-IgG, um eine vierte
Schicht von Kaninchenanti-Ziegen-IgG-Molekülen auf dem Sub
strat hinzuzufügen. Es versteht sich, daß die letzten beiden
Schritte, d. h. das Eintauchen in Ziegen-Antiserum zum Kaninchen-
IgG gefolgt von Kaninchen-Antiserum zum Ziegen-IgG, beliebig oft
wiederholt werden können, um einen Film zu bilden, der eine n-mole
kulare Proteinschicht enthält.
In einem weiteren Beispiel gemäß dem vorliegenden Verfahren wurde
eine bestimmte Menge von Hepatitis-assoziierten Antigenparti
kelchen an einem Substrat adsorbiert. Das Substrat wurde
dann in eine Probe mit menschlichem Serum eingetaucht. Das Sub
strat wurde als nächstes in eine Lösung von Kanichen-Antikörpern
gegenüber dem menschlichen Hepatitis-Antikörper eingetaucht.
Wenn das menschliche Testserum also Hepatitis-Antikörper ent
hielt, wies das Substrat Hepatitis-assoziertes Antigen auf,
an welchem Hepatitis-Antikörper immunologisch gebunden waren,
und außerdem Kaninchen-Anti-Menschenhepatitis-Antikörper, die
immunologisch an die Hepatitis-Antikörper gebunden waren. Wenn
andererseits die Serumprobe negativ wäre, würde das Substrat le
diglich die ursprünglich aufgebrachten Hepatitis-assoziierten
Antigenpartikel aufweisen. Es wurde gefunden, daß dies Verfahren
der vorliegenden Erfindung die Nachweisbarkeit von menschlicher
Hepatitis gegenüber dem Verfahren, in welchem der Hepatitis-Anti
körper allein an das Hepatitis-assoziierte Antigen gebunden wurde,
wesentlich verbesserte. Dieses Beispiel zeigt auch, daß das er
findungsgemäße Verfahren eine besondere Anwendbarkeit in solchen
Fällen hat, in denen das ursprüngliche proteineinschließende
Partikel, das auf dem Substrat aufgebracht wird, wesentlich
größer ist als dessen spezifisch reagierendes Protein.
Fig. 2 zeigt einen Schnitt eines Aufrisses, der einen multi
molekularen Proteinfilm auf einem Substrat zeigt. Am Sub
trat 60 kann beispielsweise, in Übereinstimmung mit dem ersten,
oben angegebenen Beispiel, eine monomolekulare Schicht 61 aus
Rinderserum-Albumin adsorbiert sein. Das Eintauchen in Kaninchen-
Antiserum zum Rinderserum-Albumin wird eine zweite monomolekulare
Schicht 62 über der Schicht 61 durch spezifische immunologische
Reaktionen aufbringen. Das anschließende Eintauchen in Ziegen-
Antiserum zum Kaninchen-IgG wird eine monomolekulare Schicht 63
immunologisch an Schicht 62 binden, wenn Schicht 62 vorhanden
ist. Auf ähnliche Weise wird Schicht 64, die Kaninchenanti-Ziegen-
IgG enthält, gebildet, indem IgG durch Eintauchen in Kaninchen-
Antiserum zum Ziegen-IgG an das Substrat gebunden wird. Wie oben
angegeben, kann dieses Verfahren fortgesetzt werden. Aber da
das Binden von Schichten eine spezifische, immunologische Reak
tion ist, wird das Verfahren unwiderruflich unterbrochen, wenn
eine der Schichten nicht gebildet wird. Die Struktur von Fig. 2
hat eine spezifische Verwendbarkeit zum hochempfindlichen Nach
weis des Proteins, das in Schicht 62 enthalten ist. Schicht 61
ist durch Adsorption, das ein nicht spezifisches Verfahren ist,
auf Substrat 60 aufgetragen. Alle nachfolgenden Verfahren sind je
doch spezifisch. Wenn also eine Testprobe das spezifisch rea
gierende Protein zu dem Protein von Schicht 61 enthält, wird
Schicht 62 gebildet und entsprechend der vorliegenden Erfindung
kann eine Proteinschicht in n-molekularer Ausführung darauf ge
bildet werden. Wenn andererseits die Testprobe kein immunoligisch
reaktionsfähiges Protein zu dem Protein von Schicht 61 enthält,
wird Schicht 62 nicht gebildet und weitere Schichten können
deshalb auch nicht gebildet werden. Deshalb kann ein Protein,
das von besonderem Interesse in einer Probe ist, mit jedem be
liebigen Grad der Empfindlichkeit nachgewiesen werden, indem man
zwischen einer monomolekularen Proteinschicht auf einem Substrat
und einer Schicht von irgendeiner beliebigen Dicke unter
scheidet.
Fig. 3 zeigt einen Querschnitt eines Aufrisses eines Substrates,
der eine weitere Verwendbarkeit für das erfindungsgemäße Ver
fahren illustriert. Fig. 3 illustriert die Verwendbarkeit der
vorliegenden Erfindung zum Nachweis von Proteinen, die in
physiologischen Proben in Konzentrationen vorhanden sind, die
zu verdünnt sind, um eine vollständige Schicht auf einem Substrat
zu bilden. Als ein Beispiel für die Verwendung spezifischer
Proteine, ohne dieses Beispiel auf diese Proteine zu begrenzen,
hat Substrat 70 eine monomolekulare Schicht von menschlichen
Hepatitis-Antikörpern 71 adsorbiert. Dieses Substrat wird
in eine Blutprobe eingetaucht und eine Vielzahl von Hepatitis-
assoziierten Antigenpartikeln 77 werden immunologisch daran
gebunden, wenn sie in der Probe zugegen sind. Das Substrat
wird dann in eine Lösung von Affen-Hepatitis-Antikörpern getaucht,
um eine Schicht von Molekülen 72 daraus an die Hepatitits-asso
ziierten Antigenpartikel zu binden, so daß eine weitere Schicht
auf dem Substrat aufgebracht wird. Das Substrat wird
als nächstes in eine Lösung von Kaninchen-Antiserum zum Affen-IgG
getaucht, um eine Schicht von Molekülen 73 über den Affen-Hepa
titis-Antikörpermolekülen zu binden. Es versteht sich, daß die
Schicht von Molekülen 72 auch aus menschlichen Hepatitis-Anti
körpern 71 gebildet werden könnte. Wenn dies jedoch getan würde,
müßte die nächste Schicht aus Anti-Menschen-IgG-Molekülen be
stehen, die jedoch nicht nur mit jenen Antikörpern, die die
Hepatitis-assoziierten Antigenpartikel 77 umgeben, sondern auch
mit der ursprünglichen Schicht von Molekülen 71 reagieren würden,
wodurch der Zweck des erfindungsgemäßen Verfahrens verfehlt wäre.
Das nächste Eintauchen des Substrates könnte beispielsweise
in Ziegen-Antiserum zum Kaninchen-IgG erfolgen, um eine Schicht
von Molekülen 74 daran zu bilden. Dieses Verfahren wird mehrfach
wiederholt, wie allgemein durch das Volumen 75 angegeben ist,
bis ein Punkt erreicht wird, bei welchem eine letzte monomole
kulare Proteinschicht 76 alle freien Räume zwischen den Par
tikeln 77 auf dem Substrat ausfüllt. Dies Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung zeigt die Bildung einer Proteinschicht
von wenigstens bimolekularer Dicke auf der Gesamtoberfläche des
Substrates und ist insbesondere verwendbar für chemische und
elektrische Nachweismethoden, wie sie in der oben angegebenen
älteren Patentanmeldung beschrieben sind.
Claims (8)
1. Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit ei
nes spezifischen Proteins in einer biologischen Probe mit den fol
genden Stufen:
- Aufbringen eines Metallüberzuges auf ein Substratmaterial,
Inberührungbringen des überzogenen Substratmaterials mit einer Lösung eines mit dem genannten spezifischen Protein spezifisch reagierenden Proteins, um das Substratmaterial mit dem spezifisch reagierenden Protein zu beschichten,
Inberührungbringen des beschichteten Substratmaterials mit der biologischen Probe und
Untersuchen des beschichteten Substratmaterials, um zu be stimmen, ob das spezifische Protein daran haftet oder nicht, wobei - a) auf das Substrat ein Metallüberzug aufgebracht wird, der ausgewählt ist aus Indium, Gold, Silber, Zinn oder Blei, und
- b) das Untersuchen des mit Protein beschichteten Substrates durch einfaches Betrachten dahingehend erfolgt, um festzu stellen, ob eine oder mehr Proteinschichten auf dem Substrat vorhanden sind, nach Patent 23 30 702,
dadurch gekennzeichnet, daß
zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit das beschichtete Sub
strat nach dem Inberührungbringen mit der biologischen Probe in
eine Lösung eines dritten Proteins eingetaucht wird, das mit dem
nachzuweisenden zweiten Protein immunologisch reagiert, und
daß das Untersuchen dahingehend erfolgt, daß man durch Beobachten
des Substrates zwischen der Anwesenheit dreier Schichten oder nur
einer Schicht darauf unterscheidet.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
gekennzeichnet durch die weiteren
Stufen:
- Zubereiten einer Lösung von Antikörpern für das Protein,
das immunologisch mit dem nachzuweisenden Protein reagieren
kann, und
Eintauchen des Substrates in diese Antikörper-Lösung.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das nachzuweisende Protein in physiologischen Flüssigkeitsproben in so stark ver
dünnten Konzentrationen zugegen ist, daß innerhalb einer
annehmbaren Zeit eine nachweisbar vollständige bimolekulare
Schicht auf dem Substrat nicht gebildet wird, sondern vielmehr
an jedes Partikel auf dem Substrat immunologisch
gebunden wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3,
gekennzeichnet durch die weiteren
Stufen:
- Zubereiten einer Reihe von Lösungen von Antikörpern, in
welcher jede Lösung der Reihe Antikörper für die Antikörper
der unmittelbar vorangegangenen Lösung der Reihe enthält,
und
nacheinander Eintauchen des Substrates in jede Lösung der Reihe.
5. Verfahren nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet, daß
eine Vielzahl von monomolekularen Proteinschichten des nach
zuweisenden Proteins an jedes Partikelchen auf dem Substrat
immunologisch gebunden wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Vielzahl von monomolekularen Proteinschichten ausreicht,
um das Substrat mit wenigstens einer bimolekularen Protein
schicht auf den gesamten Oberflächen zu überziehen.
7. Verfahren nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet, daß
eine Vielzahl von monomolekularen Proteinschichten an einer
bimolekularen Proteinschicht immunologisch gebunden wird,
wenn die bimolekulare Schicht auf dem Substrat vorhanden
ist, so daß der Nachweis des nachzuweisenden Proteins da
durch erreicht wird, daß man zwischen einer monomolekularen
Proteinschicht und einer multimolekularen Proteinschicht
auf dem Substrat unterscheidet.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US388407A US3904367A (en) | 1973-08-15 | 1973-08-15 | Contrast enhancement for immunological film detection |
US440712A US3904362A (en) | 1973-08-15 | 1974-02-08 | Toothbrush sterilization holder and container |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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