DE2433246C2 - Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Proteins in einer biologischen Probe - Google Patents

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Proteins in einer biologis-hen Probe, mit den folgenden-Stufeni Aufbringen eines Metallüberzuges auf ein Substratmaterial, Inberührungbringen des überzogenen Substratmaterials mit. einer Lösung eines mit dem genannten spezifischen Protein spezifisch reagierenden Proteins, um das Substratmaterial mit dem spezifisch reagierenden Protein zu beschichten, Inberührungbringen des beschichteten Substratmaterials mit der biologischen Probe und

Untersuchen des beschichteten Substratmaterials, um zu bestimmen, ob das spezifische Protein daran haftet oder nicht.

Immunologische Reaktionen sind hochspezifische biochemische Reaktionen, in denen ein als Antigen bezeichnetes erstes Protein sich mit einem zweiten Protein verbindet, das für dieses Antigen spezifisch ist und dessen Antikörper genannt wird, wobei ein immunologisch komplexiertes Protein gebildet wird. Immunologische Reaktionen, die innerhalb eines biologischen Systems, wie einem tierischen Lebewesen, stattfinden, sind von großer Bedeutung für das Tier bei der Bekämpfung von Krankheit. In einem biologischen System veranlaßt der Eintritt eines fremden Proteins, d. h. des Antigens, das biologische System zur Erzeugung der für das entsprechende Antigen spezifischen Antikörper-Proteine in einem Verfahren, das bisher noch nicht vollständig verstanden wird. Die Antikörper-Proteinmoleküle weisen verfügbare chemische Bindestellen auf, die die am Antigenmolekül ergänzen, und so können das Antigen und der Antikörper sich chemisch unter Bildung eines immunologisch komplexierten Proteins verbinden. eü

Da Antikörper durch biologische Systeme als Antwort auf das Eindringen von fremden Proteinen erzeugt werden, ist der Nachweis von in einem biologischen System vorhandenen Antikörpern von medizinisch diagnostischem Wert bei der Bestimmung der Antigene, denen das System ausgesetzt wurde. Umgekehrt hat auch der Nachweis bestimmter Antigene in einem biologischen System medizinisch diagnostischen Wert. Beispiele des diagnostischen Nachweises von Antigenen sind der Nachweis von HCG-Proteinmolekülen im Urin zur Feststellung der Schwangerschaft und der Nachweis der mit der Hepatitis verbundenen Antigenmoleküle im Blut von in Aussicht genommenen Blutspendern.

Um solche diagnostischen Untersuchungen durchführen zu können, muß das geeignete Protein mindestens eines immunologisch reagierenden Paares in konzentrierter gereinigter Form erhältlich sein. Die einzige bekannte Quelle für Antikörper-Proteine ist ein lebendes biologisches System. Darüber hinaus ist es bisher nur von Wirbeltieren bekannt, daß sie der Einführung eines Fremdproteins mit immunologischen Reaktionen begegnen. Beispielsweise wurden viele Antikörper im Blutserum von tierischen Lebewesen gefunden, die den entsprechenden Antigenen ausgesetzt worden waren. Das Blutserum ist jedoch eine sehr komplexe Mischung, in der die erforderlichen Antikörper in sehr geringen Konzentrationen bei Anwesenheit einer Vielzahl anderer Bestandteile vorkommen. Viele Antigene können andererseits in kontroJ'Jerbarer Weise in Laboratoriumskulturen hergestellt werden. Einige Antigene jedoch, wie z. B. das mit der Hepatitis verbundene Antigen, sind derzeit, wie Antikörper, nur aus höheren lebenden biologischen Systemen erhältlich.

In der derzeit praktizierten Weise basieren sowohl die Ansammlung als auch die Reinigung und die diagnostische Verwendung immunologisch aktiver Proteine auf den Ausfällungs- oder Agglutinierungseigenschaften, die für die Proteine charakteristisch sind, die aus der immunologischen Komplexierungsreaktion herrühren. Das klassische Beispiel dieser diagnostischen Verwendungen ist das Verfahren zur Feststellung der Blutgruppe, bei dem Blutproben mit Serum-Anukörpern vom Typ λ und β vermischt werden und man bestimmt die Blutgruppe durch Feststellen irgendwelcher Agglutination in den Blutproben.

Die Schwangerschaftsbestimmung über das HCG-Protein. wie sie derzeit durchgeführt wird, ist ein Inhibitions-Test, der ausgeführt wird, indem man eine Menge des HCG-Antiserums in eine Urin-Probe einmischt. Eine Vielzahl von Polystyrolkügelchen, die mit HCG-Protein beschichtet wordeti sind, bringt man in eine so vorbereitete Urinprobe ein. Die Polystyrolkugeln agglutinieren, wenn, aber nur wenn in der Probe kein HCG-Protein vorhanden ist. Ist in einer Urinprobe kein HCG-Protein vorhanden, dann bildet das HCG-Protein auf den Polystyrolkugeln mit dem zuvor in die Urinprobe eingebrachten HCG-Antiserum Komplexe und die Kugeln agglutinieren. Werin andererseits in der Urinprobe HCG-Protein vorhanden ist, dann bildet dieses mit dem zuvor eingebrachten HCG-Antiserum einen Komplex, der aus der Probe ausfällt, so daß das vorher eingeführte Serum nicht langer für die Komplexbildung mit dem HCG-Protein auf den Kugeln verfügbar ist und so auch keine Agglutinierung der Kugeln verursachen kann. Gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung kann die bekannte Schwangerschaftsbestimmung über das HCG-Protein vereinfacht werden, indem man das HCG-Antiserum auf den Polystyrolkugeln haften läßt, und eine Urinprobe direkt untersucht. In diesem Falle würden die Pölystyrolkugeln agglutinieren, wenn, aber nur wenn in der Probe HCG-Protein vorhanden ist.

Es scheint, daß der Grund, weshalb dieses einfachere Verfahren bisher nicht angewendet worden ist, der ist., daß die verfügbaren HCG-Antiseren komplexe Mischungen sind, die einen großen Anteil an Bestandteilen anderer Art als HCG-Antikörper enthalten. Die zusatzliehe Bemühung, die nach dem bekannten Verfahren erforderlich ist, um die Antikörper aus den HCG-Antiseren zu extrahieren führen dazu, daß die Seren für den Inhibitionstest bisher direkt verwendet worden sind.

Jedes Antigenmolekül bildet typischerweise Komplexe mit einer Vielzahl von Antikörpermolekülen, die mit verschiedenen Teilchen verbunden sein können und bildet dabei sichtbare Klumpen von z. B. beschichteten Polystyrolkügeichen oder roten Blutzellen. Eine Unzulänglichkeit von Agglutinierungs-Untersuchungen ist die, daß die beteiligten Teilchen aus irgendeinem einer Vielzahl von Gründen agglomerieren können, die mit der immunologischen Agglutinierung nichts zu tun haben, und auf diese Weise die Zuverlässigkeit der Untersuchung vermindern. Üblicherweise werden Agglutinierungs-Untersuchungen mit größter Sorgfalt von ausgebildeten Fachkräften durchgeführt, doch treten trotzdem gelegentlich diagnostische Fehler auf.

Beim derzeitigen Verfahren zur Gewinnung gereinigter Anreicherungen von Antikörpern wird zuerst durch Einführung des Antigens in das tierische System die Erzeugung von Antikörpern in einem tierischen Lebewesen angeregt, dann entnimmt man dem Tier Blutserum, welches die Antikörper in hochverdünnter Form enthält und vermischt eine bestimmte Menge des spezifischen Antigens mit dem Serum. Die Mischung aus Antigen und Antikörper bildet Komplexe und fällt aus der Serumlösung aus. Die verbleibenden Bestandteile des Serums werden abgezogen und der Niederschlag aus Antikörper und Antigen wird in einer Säure gelöst, welehe die Kompiexbindungen trennt, fvian erhall dadurch eine Lösung der Antigen- und Antikörpermoleküle in der Säure. Da die Antikörper- und Antigenmoleküle unierschipdliche physikalische Eigenschaften haben, z. B. unterschiedliches Gewicht, können sie voneinander mechanisch, z. B. durch Zentrifugieren, getrennt werden.

Es ist bekannt, daß die Antikörper-Antigen-Komplexierungsreaktion stattfindet, wenn ein Antigen an einer Oberfläche absorbiert ist. Die Komplexierungsreaktion an einer Oberfläche ist mittels eines Eilipsometers beobachtet worden. Ein Eilipsometer ist ein komplexes, speziell zur Bestimmung der Elliptizität polarisierten Lichtes brauchbares optisches Instrument, mit dessen Hilfe man Filmdicken in der Größenordnung von 0,1 Ä messen kann. Eilipsometer rind teuer und erfordern ausgebildetes Bedienungspersonal. Bei Untersuchungen immunologischer Reaktionen unter Verwendung von Ellipsometern, soweit sie bisher durchgeführt wurden, verwendete man zwei Verfahren. Nach dem einen Verfahren ließ man die zu untersuchende Reaktion ablaufen und ordnete dann den Objektträger, auf dem die Reaktion stattgefunden hatte, in einem Eilipsometer an, um die Filmdicke zu bestimmen. Bei dem anderen Verfahren wurde der Objektträger von vornherein im Ellipso* meter befestigt und man beobachtete mit dem Ellipsometer die sich mit dem Fortschreiten der immunologischen Reaktion ändernde Filmdicke. Die Bestimmung der absoluten Dicke erfordert eine außerordentliche Sorgfalt. Ist andeierseits die Konzentration der Antikörper in der Lösunp gering, dann erfordert die Messung der relativen Dickenänderung, obwohl sie leichter durchzuführen ist als die Bestimmung der absoluten Dicke, eine lange Zeit. Aus wirtschaftlichen Gründen ist daher der Nachweis immunologischer Reaktionen auf einer Oberfläche unter Verwendung eines Ellipsometers nicht für diagnostische Zwecke verwendet worden.

Die vorliegende Erfindung schließt die Feststellung ein, daß irgendein willkürlich ausgewähltes Protein sich an einem Substrat nur in einer monomolekularen Schicht absorbiert und daß ein spezifischer Antikörper (oder Antigen) für ein solches willkürlich ausgewähltes Protein sich mit diesem unter Bildung einer bimolekularen Proteinschicht auf dem Substrat verbinden wird.

Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis immunologischer Reaktionen mit verstärktem Kontrast zu schaffen, die auf einer Oberfläche stattfinden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man das überzogene Substrat mit dem Metallüberzug und der/den Proteinschicht/en nach unten auf der Oberfläche einer Licht reflektierenden Flüssigkeit anordnet

Gemäß einer vorteilhaften Ausfuh-'ungsform ist die Licht reflektierende Flüssigkeit Quecksilber und das Untersuchen ist das visuelle Untersuchen des überzogenen Substrates im reflektierten Licht, während sich das Subs'rat im Kontakt mit dem Quecksilber befindet.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert. Im einzelnen zeigt

Fig. 1 die Stufen zur Herstellung einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und

F i g. 2 eine Seitenansicht einer Vorrichtung, die die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung der Vorrichtung nach F i g. 1 illustriert.

Bei der Herstellung einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens beginnt man zum Beispie! mit einer Platte eines Substratmatcrials, das Metall, Glas, Glimmer, Kunststoff, gesintertes Siliziumdioxid, Quarz oder ein ähnliches Material üin kann, wobei Metall bevorzugt ist, da es den größten Unterschied im Brechungsindex gegenüber Protein hat, und vorzugsweise wird ein metallisierter Glas-Objektträger benutzt, den man in eine Lösung eintaucht, die ein erstes interessierendes Protein enthält, das biologisch ein Antigen oder ein Antikörper sein kann und das in relativ konzentrierter Lösung erhältlich ist und das verwendet werden soll, sein entsprechendes spezifisch reagierendes Protein nachzuweisen, v/obei letzteres biologisch ein Antikörper bzw. ein Antigen ist. Das erste Protein wird an dem Substrat in einer monomolekularen Schicht adsorbiert. Jedes Protein wird in einer solchen monomolekularen Schicht adsorbiert, wobei eine weitere. Adsorption nicht stattfindet. Das heißt das Protein haftet an. Substrat, nicht jedoch an sich selbst. Nachdem sich eine monomolekulare Schicht des Proteins auf der ganzen Oberfläche aes Substrates gebildet iiat, wird das beschichtete Substrat aus der Lösung des ersten Proteins herausgenommen. Die für die vollständige Beschichtung des Substrates erforderliche Zeit ist eine Funktion der Konzentration des Proteins in der Lösung und des Maßes, mit dem die Lösung gerührt wird, Beispielsweise beschichtet eine 1%ige Rinderserum-Albumirrlösung einen Objektträger in ungefähr 30 Minuten mit einer monomolekularen Proteinschicht vollständig.

Bei der nächsteT Stufe wird das protein-beschichtete Substrat in eine Lösung eingetaucht, in der man das mit dem ersten Protein spezifisch reagierende Protein vermutet. Diese Lösung kann und tut es üblicherweise auch, viele Bestandteile außer dem spezifisch reagieren-

den Protein enthalten, dessen Anwesenheit man nachweisen möchte, Es wird jedoch kein anderes als ein spezifisch reagierendes Protein an der ersten Proteinschicht auf dem Substrat haften. Ist demgemäß das spezifisch reagierende Protein nicht vorhanden, dann weist das Substrat nach dem Eintauchen in die zweite Lösung immer noch nur eine monomolekulare Proteinschicht auf. Ist andererseits das spezifisch reagierende Protein in der Lösung vorhanden, dann findet ein immunologisches Komplexieren zwischen dem ersten Protein und seinem spezifisch reagierenden Protein statt und das Substrat trägt nach einer bestimmten Zeit eine bimolekulare Proteinschicht. Die für die Adhäsion einer vollständigen zweiten molekularen Schicht an dem beschichteten Substrat erforderliche Zeit ist wieder eine Funktion der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der Lösung. Für Antikörper in Blutserum kari" diese Zeit bis zn ! Tag betrag?"

Das Aufbringen des Metallüberzuges auf das Substratmaterial kann durch Aufdampfen eines Metalles, z. B. Indium, erfolgen. Das Indium z. B. wird langsam aus einem Tantaltiegel in einem Vakuum von etwa 5 · IfJ-⁵ mm Hg auf das Glassubstrat aufgebracht. Da die !ndiumatome auf der Oberfläche des Substrates eine hohe Beweglichkeit haben und das Glassubstrat nicht merklich benetzen, agglomeriert das auf das Substrat aufgedampfte Indium zu kleinen Teilchen. Jedes Metall, das ähnliche Eigenschaften hat und Kügelchen auf dem Substrat bildet, wenn es durch Aufdampfen dort aufgebracht wird, kann hier verwendet werden. Außer Indium sind Gold, Silber, Zinn und Blei erfolgreich verwendet worden. Das Aufdampfen des Metalles wird fortgesetzt, bis das Substrat eine leicht bräunliche Farbe hat. Zu diesem Zeitpunkt haben die Metallkügelchen Durchmesser in der Größenordnung von 1000 Ä. Die genaue Größe der Kügelchen ist nicht kritisch, doch müssen sie Durchmesser haben, die einem großen Anteil der Wellenlänge des sichtbaren Lichtes entsprechen. Beim nächsten Schritt wird das mit den Kügelchen bedeckte Substrat in eine Lösung eines ersten Proteins eingetaucht, wie in Block 13 der F i g. 1 dargestellt. Das erste Protein haftet wieder in einer monomolekularen Schicht an dem Substrat und den darauf befindlichen Metallkügelchen. Nachdem sich eine monomolekulare Proteinschicht gebildet hat. kann das beschichtete Substrat dazu verwendet werden. Lösungen auf die Anwesenheit eines mit dem ersten Protein spezifisch reagierenden Proteins zu untersuchen, indem man das beschichtete Substrat in eine solche Lösung eintaucht, in der ein solches spezifisch reagierendes P'otein erwartet wird. War das erwartete spezifisch reagierende Protein vorhanden, dann weisen das Substrat und die Metallkügelchen eine bimolekulare Proteinschicht auf; war das spezifisch reagierende Protein dagegen nicht vorhanden, dann werden das Substrat und die Metallkügelchen nur von einer monomolekularen Proteinschicht bedeckt. Das beschichtete Substrat wird dann im reflektierten Licht betrachtet.

Bei einer Modifikation dieser Ausführungsform, die ein medizinisches diagnostisches System schafft, wird das die Metallkügelchen aufweisende Substrat teilweise bis zu einer ersten Tiefe in eine Lösung eines ersten Antigens eingetaucht. Das Substrat wird in einer monomoleku'aren Schicht durch das erste Antigen in dem Bereich beschichtet, der in die Lösung eingetaucht war. Dann trocknet man das Substrat und taucht bis zu einer zweiten Tiefe tiefer in eine Lösung eines zweiten Antieens ein. Das zweite Antigen haftet nicht an dem ersten Antigen, wohl aber an dem durch das erste Antigen nicht bedeckten Teil des Substrates, der in die Lösung des zweiten Antigens eingetaucht wird. Danach trocknet man das Substrat wieder und taucht bis zu einer dritten und größeren Tiefe in eine Lösung eines dritten Antigens ein. Das dritte Antigen haftet an dem Teil und nur an dem Teil des Substrates, der noch nicht mit dem ersten oder zweiten Antigen bedeckt ist. Das Verfahren kann für irgendeine Zahl interessierender Antigene wie-

lü derholt werden. Man erhält ein Substrat, das mit einer Vielzahl von monomolekularen streifenförmigen Schichten verschiedener Antigene bedeckt ist. Dieser beschichtete Objektträger ist das für die diagnostische Zwecke einsetzbare Werkzeug. Bei dem medizinisch diagnostischen Verfahren wird dieser Objektträger in eine Probe von z. B. Blut üblicherweise mehrere Stunden lang eingetaucht.

Fig. 1 gibt eine stark vergrößerte Seitenansicht eines Teiles des in der vorgenannten Ausführungsform dieser Erfindung beschriebenen diagnostischen Apparates wieder. F i g. 2 zeigt einen Teil des Substratmaterials 31 mit einer Vielzahl von darauf durch Verdampfen aufgebrachten Metallkügelchen 32. Die Teilchen 32 sind vorzugsweise durch Aufdampfen von Indium auf das Substrat 31 hergestellt, wie oben beschrieben, doch können sie auch durch Verdampfen von Gold, Silber, Zinn, Blei oder eines anderen Metalles hergestellt sein, das ähnliche nicht benetzende und eine atomare Beweglichkeit aufweisende Eigenschaften hat. Irgendeines einer gro-Ben Zahl von Metallen zeigt solche Eigenschaften, wenn die Temperatur des Substrates verändert wird. Nach dem Eintauchen in eine Lösung eines ersten Proteins wird das Segment des Objektträgers, der das Substrat 31 und die Metallkügelchen 32 umfaßt, mit einer monomolekularen Schicht von Molekülen 34 des eisten Proleins bedeckt, wie in F i g. 1 allgemein bei 33 angegeben. Der mit S3 bezeichnete Apparat ist das diagnostische Instrument, das zum Untersuchen von Lösungen auf die Anwesenheit des mit den Proteinmolekülen 34 spezifisch reagierenden Proteins verwendet wird. Wird der allgemein mit 33 bezeichnete Apparat dem mit dem Potein der Moleküle 34 spezifisch reagierenden Protein ausgesetzt, dann nimmt der Apparat ein Aussehen an, wie es allgemein bei 35 gezeigt ist, bei dem das Substrat 31 und die Metallkügelchen 32 mit einer bimolekularen Proteinschicht bedeckt sind, welche die Moleküle 34 des ersten Proteins, die die erste monomolekulare Schicht auf dem Substrat 31 und den Kügelchen 32 bilden und eine zweite monomolekulare Schicht eines Proteins aus den Molekülen 36 des mit dem ersten Protein spezif'r-h reagierenden Proteins umfaßt, wobei die Moleküle 36 immunologisch mit den Molekülen 34 des ersten Proteins verbunden sind und diese erste Proteinschicht, die Metallkügelchen und das Substrat überlagern.

Fig.2 illustriert die Anwendung dieser Vorrichtung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, die einen stärkeren Kontrast in dem beschichteten diagnostischen Objektträger schafft. In F i g. 2 wird der Objektträger 31. der Metallkügelchen 32 darauf trägt und mit Proteinmolekülen 34 beschichtet ist, eingetaucht in eine Menge 71 einer Iichtreflektierenden Flüssigkeit, wobei die beschichtete Seite nach unten gerichtet ist. Der Objektträger 31 wird dann von seiner oberen Oberfläche mit reflektiertem Licht betrachtet. Um eine totale Reflexion des auf den diagnostischen Apparat der F i g. 2 einfallenden Lichtes zu schaffen, ist die reflektierende Flüssigkeit 71 vorzugsweise eine metallische Flüssigkeit und besonders bevorzugt Quecksilber. Wird eine nicht-metallische

Flüssigkeit verwendet, dann werden die optischen Einfalls- und Betrachtungswinkel bei Verwendung der Ausführungsform der Fig. 2 kritisch, wenn Totalreflexion beobachtet werden soll.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

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Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Proteins in einer biologischen Probe, mit den folgenden Stufen:
Aufbringen eines Metallüberzuges auf ein Substratmaterial, Inberührungbringen des überzogenen Substratmaterials mit einer Lösung eines mit dem genannten spezifischen Protein spezifisch reagierenden Proteins, um das Substratmaterial mit dem spezifisch reagierenden Protein zu beschichten, Inberührungbringen des beschichteten Substratmaterials mit der biologischen Probe und

Untersuchen des beschichteten Substratmaterials, um zu bestimmen, ob das spezifische Protein daran haftet oder nicht, dadurch gekennzeichnet, daß man das überzogene Substrat mit dem Metallüberzug and der/den Proteinschicht/en nach unten auf der Oberfläche einer Licht reflektierenden Flüssigkeit anordnet

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Licht reflektierende Flüssigkeit Quecksilber ist und das Untersuchen das visuelle Untersuchen des überzogenen Substrates im reflektierten Licht umfaßt, während sich das Substrat im Kontakt mit dem Quecksilber befindet