DE2330702C2 - Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Proteins in einer biologischen Probe und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Description

(a) auf das Substrat ein Metallüberzug aufgebracht wird, der ausgewählt ist aus Indium, Gold, Silber, Zinn oder Blei und

(b) daß das Untersuchen des mit Protein beschichteten Substrates durch einfaches Betrachten dahingehend erfolgt, um festzustellen, ob eine oder zwei Proteinschichten auf dem Substrat vorhanden sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung eines Metallüberzuges aus einem Metall, das mit Quecksilber ein sichtbares Amalgam bildet, zum Untersuchen ein Quecksilbertropfen auf die Proteinschicht aufgebracht wird und die Zeit gemessen wird, die zwischen dem Aufbringen des Quecksilbertropfens und dem Erscheinen eines sichtbaren Amalgams vergeht.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Metall Indium aus einem Tantaltiegel bei einem Vakuum von etwa 5 · 10~⁵ mm Hg auf ein lichtdurchlässiges Substratmaterial aufgedampft wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Untersuchen durch visuelles Betrachten des überzogenen Substratmaterials erfolgt und dabei zwischen verschiedenen Brauntönen unterschieden wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Bestimmen durch Unterscheiden zwischen drei Braunfarbtönen erfolgt.

6. Vorrichtung aus einem Substrat, das mit einem Metallüberzug versehen ist, an dem ein spezifisch reagierendes Protein haftet, zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Metallüberzug aus einem Metall aus Indium, Gold, Silber, Zinn oder Blei besteht.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat lichtdurchlässig ist und aus Glas. Kunststoff, geschmolzenem SiO₂, Glimmer, Quarz oder aus metallisiertem Glas besteht.

8. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Metallüberzug aus einer Vielzahl von Metallkügelchen gebildet wird und daß mehrere Schichten des spezifisch reagierenden Proteins vorhanden sind, deren jede einen Teil des Substrates und der Metallkügelchen überlagert.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat eine licht-

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Proteins in einer biologischen Probe, mit den folgenden Stufen:

Aufbringen eines Metallüberzuges auf ein Subsiralmaterial, Inberührungbringen des überzogenen Substraimaterials mit einer Lösung eines mit dem genannten

spezifischen Protein spezifisch reagierenden Proteins, um das Substratmaterial mit dem spezifisch reagierenden Protein zu beschichten,

Inberührungbringen des beschichteten Subslralmalcrials mit der biologischen Probe und
Untersuchen des beschichteten Substratmaterials, um zu bestimmen, ob das spezifische Protein daran haftet oder nicht

Die Erfindung betrifft weiter eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Immunologische Reaktionen sind hochspezifische biochemische Reaktionen, in denen ein alb Antigen bezeichnete«: erstes Protein sich mit einem zweiten Protein verbindet, das für dieses Antigen spezifisch ist und dessen Antikörper genannt wird, wobei ein immunologisch

komplexiertes Protein gebildet wird. Immunologische Reaktionen, die innerhalb eines biologischen Systems, wie einem tierischen Lebewesen, stattfinden, sind von großer Bedeutung für das Tier bei der Bekämpfung von Krankheit. In einem biologischen System veranlaßt der

Eintritt eines fremden Proteins, d. h. des Antigens, das biologische System zur Erzeugung der für das entsprechende Antigen spezifischen Antikörper-Proteine in einem Verfahren, das bisher noch nicht vollständig verstanden wird. Die Antikörper-Proteinmoleküle weisen verfügbare chemische Bindestellen auf, die die am Aniigenmolekül ergänzen, und so können das Antigen und der Antikörper sich chemisch unter Bildung eines immunologisch komplexierten Proteins verbinden.
Da Antikörper durch biologische Systeme als Amwort auf das Eindringen von fremden Proteinen erzeugt werden, ist der Nachweis von in einem biologischen System vorhandenen Antikörpern von medizinisch diagnostischem Wert bei der Bestimmung der Antigene, denen das System ausgesetzt wurde. Umgekehrt hat

auch der Nachweis bestimmter Antigene in einem biologischen System medizinisch diagnostischen Wert. Beispiele des diagnostischen Nachweises von Antigencn sind der Nachweis von HCG-Proteinmolekülcn im Urin zur Feststellung der Schwangerschaft und der Nachweis der mit der Hepatitis verbundenen Antigenmoleküle im Blut von in Aussicht genommenen Blutspendern.

Um solche diagnostischen Untersuchungen durchführen zu können, muß das geeignete Protein mindestens eines immunologisch reagierenden Paares in konzcntrierter gereinigter Form enthältlich sein. Die einzige bekannte Quelle für Antikörper-Proleine ist ein lebendes biologisches System. Darüber hinaus ist es bisher nur von Wirbeltieren bekannt, daß sie der Einführung eines Fremdproteins mit immunologischen Reaktionen begegnen. Beispielsweise wurden viele Antikörper im Blutserum von tierischen Lebewesen gefunden, die den entsprechenden Antigenen ausgesetzt worden waren. Das Blutserum ist jedoch eine sehr komplexe Mischung,

in der die erforderlichen Antikörper in sehr geringen Konzentrationen bei Anwesenheit einer Vielzahl anderer Bestandteile vorkommen. Viele Antigene können andererseits in kontrollierbarer Weise in Laboratoriumskulturen hergestellt werden. Einige Antigene jedoch, wie z. B. das mit der Hepatitis verbundene Antigen, sind derzeit, wie Antikörper, nur lus höheren lebenden biologischen Systemen erhältlich.

In der derzeit praktizierten Weise basieren sowohl die Ansammlung als auch die Reinigung und die diagn<_>stische Verwendung immunologisch aktiver Proteine auf den Ausfällungs- oder Agglutinierungseigenschaftcn, die für die Proteine charakteristisch sind, die aus der immunologischen Komplexierungsreaktion herrühren. Das klassische Beispiel dieser diagnostischen Verwendungen ist das Verfahren zur Feststellung der Blutgruppe, bei dem Blutproben mit Serum-Antikörpern vom Typ A und B vermischt werden und man bestimmt die Blutgruppe durch Feststellen irgendwelcher Agglutination in den Blutproben.

Die derzeitige Schwangerschaftsbestimmung über das HCG-Protein ist ein Inhibitions-Test, der ausgeführt wird, indem man eine Menge des HCG-Antiserums in eine Urin-Probe einmischt. Eine Vielzahl von Polystyrolkügelchen, die mit HCG-Protein beschichtet worden sind, bringt man in eine so vorbereitete Urinprobe ein. Die Polystyrolkugeln agglutinieren, wenn, aber nur wenn in der Probe kein HCG-Protein vorhanden ist. Ist in einer Urinprobe kein HCG-Protein vorhanden, dann bildet das HCG-Protein auf den Polystyrolkugeln mit dem zuvor in die Urinprobe eingebrachten HCG-Antiserum Komplexe und die Kugeln agglutinieren. Wenn andererseits in der Urinprobe HCG-Protein vorhanden ist, dann bildet dieses mit dem zuvor eingebrachten I iCG-Antiserum einen Komplex, der aus der Probe ausfällt, so daß das vorher eingeführte Serum nicht länger für die Komplexbildung mit dem HCG-Protein auf den Kugeln verfügbar ist und so auch keine Agglutinierung der Kugeln verursachen kann.

Gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung kann die bekannte Schwangerschaftsbestimmung über das HCG-Proicin vereinfacht werden, indem man das HCG-Aniiserum auf den Polystyrolkugeln haften läßt, und eine Urinprobe direkt untersucht. In diesem Falle wurden die Polystyrolkugeln agglutinieren, wenn, aber nur wenn in der Probe HCG-Protein vorhanden ist.

Ks scheint, daß dieses einfachere Verfahren deshalb bisher nicht angewindet worden ist, weil die verfügbaren HCG-Antiseren komplexe Mischungen sind, die einen großen Anteil an Bestandteilen anderer Art als HCG-Antikörper enthalten. Der zusätzliche Aufwand, dor nach dem bekannten Verfahren erforderlich ist, um die Antikörper aus den HCG-Antiseren zu extrahieren, führt dazu, daß die Seren für den Inhibitionstext bisher direkt verwendet worden sind.

ledes Antigenmolekül bildet typischerweise Komplexe mit einer Vielzahl von Antikörpermolekülen, die mit verschiedenen Teilchen verbunden sein können und bilden dabei sichtbare Klumpen von z. B. beschichteten l'olystyrolkügelchen oder roten Blutzellen. Eine Unzulänglichkeit von Agglutinierungs-Untersuchungen ist die, daß die beteiltigten Teilchen aus irgendeinem einer Vielzahl von Gründen agglomerieren können, die mit der immunologischen Agglutinierung nichts zu tun haben, und auf diese Weise die Zuverlässigkeit der Untersuchung vermindern. Üblicherweise werden Agglutinierungs-Untersuchungen mit größter Sorgfalt von ausgebildeten Fachkräften durchgeführt, doch treten trotzdem gelegentlich diagnostische Fehler auf.

Beim derzeitigen Verfahren zur Gewinnung gereinigter Anreicherungen von Antikörpern wird zuerst durch Einführung des Antigens in das tierische System die Erzeugung von Antikörpern in ej.nem tierischen Lebewesen angeregt, dann entnimmt man dem Tier Blutserum, welches die Antikörper in hochverdünnter Form enthält und vermischt eine bestimmte Menge des spezifischen Antigens mit dem Serum. Die Mischung aus Antigen und Antikörper bildet Komplexe und fällt aus der Serumlösung aus. Die verbleibenden Bestandteile des Serums werden abgezogen und der Niederschlag aus Antikörper und Antigen wird in einer Säure gelöst, weiche die Komplexbindungen trennt. Man erhält dadurch eine Lösung der Antigen- und Antikörpermoleküle in der Säure. Da die Antikörper- und Aritigenmoleküle unterschiedliche physikalische Eigenschaften haben, z. B. unterschiedliches Gewicht, können sie voneinander mechanisch, z. B. durch Zentrifugieren, getrennt werden.

Es ist bekannt, daß die Antikörper-Antigen-Komplexierungsreaktion stattfindet, wenn ein Antigen an einer Oberfläche absorbiert ist. Die Komplexierungsreaktion an einer Oberfläche ist mittels eines Eilipsometers beobachtet worden. Ein Eilipsometer ist ein komplexes, speziell zur Bestimmung der Elliptizität polarisierten Lichtes brauchbarps optisches Instrument, mit dessen Hilfe man Filmdicken in der Größenordnung von 0,1 Ä messen kann. Eilipsometer sind teuer und erfordern ausgebildetes Bedienungspersonal. Bei Untersuchungen immunologischer Reaktionen unter Verwendung von Ellipsometern, soweit sie bisher durchgeführt wurden, verwendete man zwei Verfahren. Nach dem einen Verfahren ließ man die zu untersuchende Reaktion ablaufen und ordnete dann den Objektträger, auf dem die Reaktion stattgefunden hatte, in einem Eilipsometer an, um die Filmdicke zu bestimmen. Bei dem anderen Verfahren wurde der Objektträger von vornherein im Ellipsometer befestigt und man beobachtete mit dem Ellipsometer die sich mit dem Fortschreiten der immunologischen Reaktion ändernde Filmdicke. Die Bestimmung der absoluten Dicke erfordert eine außerordentliche Sorgfalt. Ist andererseits die Konzentration der Antikörper in der Lösung gering, dann erfordert die Messung der relativen Dickenänderung, obwohl sie leichter durchzuführen ist als die Bestimmung der absoluten Dicke, eine lange Zeit. Aus wirtschaftlichen Gründen ist daher der Nachweis immunologischer Reaktionen auf einer Oberfläche unter Verwendung eines Ellipsometers nicht für diagnostische Zwecke verwendet worden. Es ist auch schon das als Radioimmunoassay bekannte Verfahren angewendet worden, um die Anwesenheit und Menge eines Proteins in einer Probe zu bestimmen (vergl. US-PS 36 46 346, die Zeitschrift »Science«, Band 158, Seiten 1570-1572 vom 22.12.1967 und in dem Buch »Radioimmunoassay Methods«, Herausgeber K. E. Kirkham und W. M. Hunter, Churchill Livingstone Verlag, 1971, den Artikel von Leif Wide »Solid Phase Antigen-Antibody Systems«, Seiten 405—412). In diesem Verfahren, für das es mehrere Ausführungsformen gibt, adsorbiert man z. B. ein radioaktiv markiertes Protein an einem mit Antikörper überzogenen Rohr, bestimmt das adsorbierte, radioaktiv markierte Protein anhand seiner Strahlung und errechnet daraus seine Konzentration in der zu untersuchenden Probe. Allen Ausführungsformen ist der Einsatz radioaktiv markierter Proteine gemeinsam. Das heißt, daß man immer die zum Markieren erforderlichen Isotope sowie die zur

Messung der radioaktiven Strahlung erforderlichen Vorrichtungen benötigt. Damit ist dieses Verfahren relativ aufwendig.

In der wissenschaftlichen Mitteilung von Irving Langmuir und Vincent J. Schaefer über »Optical Measurement of the Thickness of a Film Adsorbed from a Solution«, veröffentlicht in J. Am. Chem. Soc, Bd. 59, S. 1406 (1937), ist die Konditionierung einer Platte beschrieben, um sie adsorptionsfähig für viele organische Substanzen zu machen, die polare Gruppen enthalten. Das in der genannten Mitteilung beschriebene Verfahren zum Konditionieren der Platte besteht darin, darauf eine A-Schicht aus Stearinsäure von einer Wasseroberfläche abzuscheiden und diese dann in eine Aluminiumchloridlösung einzubringen, woraufhin die Platte gewaschen wird und bereit ist zum Adsorbieren der genannten Substanzen.

Eine weitere Konditionierung der Oberfläche bestand im Aufbringen einer Schicht aus Eialbumin, ebenfalls von einer Wasseroberfläche, wobei diese Eialbuminschicht einen Film aus Tabakprotein adsorbieren konnte.

Mittels dieser Adsorptionstechnik konnten molekulare Dimensionen gemessen werden.

In dem Artikel »Immunological Reactions Carried out at a Liquid-Solid Interface« von A. Rothen und C. Mathot, veröffentlicht in Helvetica Chemica Acta, Bd. 54, S. 1208-1217 (1971) wird die Kinetik der Adsorption von Antikörpern an Antigen studiert, die an einem mit einer Chromschicht überzogenen Objektträger adsorbiert sind. Dabei wurde festgestellt, daß Antikörper sehr viel rascher an dem antigen-überzogenen Objektträger adsorbiert werden, wenn dieser feucht und nicht trocken in die Antiserumlösung eingeführt wird (vergl. S. 1211, Zeilen 34 bis 36).

Dieses experimentelle Ergebnis führte die Autoren zu der Schlußfolgerung, daß die Wechselwirkung von Antikörper zu Antigen stark genug ist, um den Antikörpermolekülen das Durchdringen des eine Sperre bildenden Wasserfilms zu gestatten und mit dem darunter liegenden Antigenfilm zu reagieren, während sie diese Sperre nicht überwinden konnten, wenn der darunter liegende Film aus einem heterologen Protein bestand (vergl. S. 1211. Zeilen 31 bis 34).

Weiter wurde von den Autoren experimentell festgestellt, daß die immunologischen Reaktionen mit außerordentlich verdünnten Antigenlösungen beobachtet werden können, wenn ein elektrischer Strom während der Adsorption aus dem Immunserum angewendet wird, wobei der Objektträger positiv geladen ist (vergl. S 1211 Ahsat??).

Nach Auffassung der Autoren zeigen die experimentellen Ergebnisse, daß die Immobilisierung einer großen Zahl von Antikörpermolekülen um ein einzelnes Antigenmolekül herum abhängig ist von einem gut definierten kristallinen Muster der Metallschicht, auf der die Reaktion stattfindet (vergl. S. 1215, die letzten beiden Zeilen bis S. 1216, Zeile 1) und daß dies überraschend für Immunologen ist, die daran gewöhnt sind, sich mit den in wäßriger Phase stattfindenden Reaktionen zu befassen, so daß völlig neue Bedingungen herrschen, wenn die Reaktionen an einer Flüssigkeits/Festkörper-Grenzfläche stattfinden, wobei das Antigen an der festen Oberfläche adsorbiert ist. Die Ergebnisse zeigen weiter, daß stöchiometrische Beziehungen zwischen Antigen und Antikörpern nicht ausreichen, die immunologischen Reaktionen zu erklären, die an einer solchen Grenzfläche zwischen Flüssigkeit und Festkörper stattfinden, bei der Aggregate erhalten werden, die wenige Anitgenmoleküle, aber eine große Zahl von Antikörpern enthalten und die als Berthollide bezeichnet werden können (vergl. den Abschnitt »Conclusions«, S. 1216 unten bis 1217 oben).

Somit befaßt sich der obige Artikel weniger mit der Schaffung eines Verfahrens zum Bestimmen der Anwesenheit oder der Abwesenheit eines spezifischen Proleins in einer biologischen Probe als vielmehr mit der ίο Kinetik immunologischer Reaktionen, die darüber hinaus auf die Systeme aus menschlichem ^-Globulin und dem Polysaccharid der Pneumokokken III und IV.sowie die entsprechenden Antikörper dazu beschränkt sind.

Auch benötigt die in dem genannten Artikel bcschriebene Untersuchung ein Eilipsometer (vergl. S. 1209, Absatz 3, Zeile 1), das ein sehr aufwendiges Instrument ist und durch die vorliegende Erfindung gerade vermieden werden soll.

Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, Verfahren und Vorrichtung zum wirtschaftlichen Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Proteins in einer biologischen Probe zu schaffen.

Diese Aufgabe wird hinsichtlich des Verfahrens crfindungsgemäß dadurch gelöst, daß

a) auf das Substrat ein Metallüberzug aufgebracht wird, der ausgewählt ist aus Indium, Gold, Silber, Zinn oder Blei, und

b) daß das Untersuchen des mit Protein beschichteten Substrates durch einfaches Betrachten dahingehend erfolgt, um festzustellen, ob eine oder zwei Proteinschichten auf dem Substrat vorhanden sind.

Hinsichtlich der Vorrichtung aus einem Substrat, das mit einem Metallüberzug versehen ist, an dem ein spezifisch reagierendes Protein haftet zur Durchführung des Verfahrens wird die Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß der Metallüberzug aus einem Metall aus Indium, Gold, Silber, Zinn oder Blei besteht

Vorteilhafte Ausführungsformen sowohl des Verfahrens als auch der Vorrichtung finden sich in den Untcranspriichen.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert Im einzelnen zeigt

Fig. 1 einen Ablaufplan für die Verfahrensstufen der verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung und

Fi g. 2 eine Seitenansicht der diagnostischen Vorrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die das Verfahren zu dessen Herstellung und seine Anwendung darstellt.

F i g. 1 gibt einen Ablauf plan wieder, der die einzelnen Verfahrensstufen bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung zeigt Beim Lesen des Ablaufplancs von oben nach unten gibt jede vertikale Stufe eine in der Zeit nachfolgende Stufe des Verfahrens wieder. Die einzelnen horizontal angeordneten Stufen auf einer gegebenen vertikalen Höhe im Ablaufplan zeigen die alternativen Möglichkeiten für eine der angegebenen Stufen gemäß den verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung beginnt das Verfahren mit dem Block 11 oder 12 der Fig. 1, bei dem eine Platte eines Subslralmalcrials, das Glas, Glimmer, Kunststoff, gesintertes Siliciumdioxid, Quarz oder ein ähnliches Material sein kann, mit Metall überzogen oder bedampft wird, so daß man vorzugsweise einen metallisierten Glas-Objektträger erhält, der

gemäß Block 13 in eine Lösung eingetaucht wird, die ein erstes interessierendes Protein enthält, das biologisch ein. Antigen oder ein Antikörper sein kann und das in reiner Form erhältlich ist und das verwendet werden soll, sein entsprechendes spezifisch reagierendes Protein nachzuweisen, wobei letzteres biologisch ein Antikörper bzw. ein Antigen ist. Das erste Protein wird an dem »Substrat in einer monomolekularen Schicht adsorbiert. Jedes Protein wird in einer solchen monomolekularen Schicht adsorbiert, wobei eine weitere Adsorption nicht stattfindet. Das heißt das Protein haftet am Substrat, nicht jedoch an sich selbst Nachdem sich eine monomolckulare Schicht des Proteins auf der ganzen Oberfläche des Substrates gebildet hat, wird das beschichtete Substrat aus der Lösung des ersten Proteins herausgenommen. Die für die vollständige Beschichtung des Substrates erforderliche Zeit ist eine Funktion der Konzentration des Proleins in der Lösung und des Maßes, mit dem die Lösung gerührt wird. Beispielsweise beschichtet eine l"/oige Rinderserum-Albuminlösung einen Objektträger in ungefähr 30 Minuten mit einer monomolekularen Proleinschicht vollständig.

Bei der nächsten Stufe, die in Block 14 der Fig. 1 dargestellt ist, wird das Protein-beschichtete Substrat in eine Lösung eingetaucht, in der man das mit dem ersten Protein spezifisch reagierende Protein vermutet. Diese Lösung kann, und tut es üblicherweise auch, viele Bestandteile außer dem spezifisch reagierenden Protein enthalten, dessen Anwesenheit man nachweisen möchte. Es wird jedoch kein anderes als ein spezifisch reagierendes Protein an der ersten Proteinschicht auf dem Substrat haften. 1st demgemäß das spezifisch reagierende Protein nicht vorhanden, dann weist das Substrat nach dem Eintauchen in die zweite Lösung immer noch nur eine monomolekulare Proteinschicht auf. Ist andererseits das spezifisch reagierende Protein in der Lösung vorhanden, dann findet ein immunologisches Komplcxiercn /wischen dem ersten Protein und seinem spezifisch reagierenden Protein statt und das Substrat trägt nach einer bestimmten Zeit eine bimolekulare Proteinschicht.

F.s ist zu erwähnen, daß die in den Blocks 13 und 14 der F i g. 1 dargestellten Schritte für alle Ausführungsfonnen der Erfindung die gleichen sind. Die für die Adhäsion einer vollständigen zweiten molekularen Schicht an dem beschichteten Substrat erforderliche Zeit ist wieder eine Funktion der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der Lösung. Für Antikörper in Blutserum kann diese Zeit bis zu 1 Tag betragen.

Eine spezielle Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vereinfacht den Nachweis des spezifisch reagierenden Proteins, indem sie die Möglichkeit schafft, seine Anwesenheit durch visuelle Beobachtung mit dem bloßen Auge festzustellen. Diese Ausführungsform wendet ein Metallsubstrat an, das mit Quecksilber ein Amalgam bildet, oder es wird ein anderes Substratmaterial verwendet, wie Glas, das, wie in Block 11, mit einem dünnen Melaliriilm beschichtet wird, welches ein Amalgam mit Quecksilber bildet, vorzugsweise Gold. Das Substrat wird dann nach den in Block 13 und Bock 14 beschriebenen Stufen behandelt, und es wird ein Quecksilbertropfen auf der oberen Proteinschicht angeordnet, wie in Block 16 angegeben. Bei dieser Ausführungsform ist die nächste Stufe, das beschichtete Substrat gemäß Block 20 visuell zu betrachten und die Zeit zu bestimmen, die vergeht, bevor ein sichtbares Amalgam von dem Quecksilber mit dem auf dem Substrat befindlichen Metallfilm Kcbildet wird. Diese Ausführungsform der Erfindung beruht auf der erfindungsgemäßen Feststellung, daß Quecksilber durch eine monomolekulare Proteinschicht in ungefähr 1 Minute diffundiert, daß das Quecksilber jedoch 10 Minuten oder mehr braucht, um durch eine bimolekulare Proteinschicht zu diffundieren. Da das Quecksilber durch die Proteinschicht oder -schichten diffundieren muß, um mit dem Metallfilm auf dem Substrat ein sichtbares Amalgam zu bilden, gibt die Zeit, die zwischen dem Anordnen des Quecksilbertropfens auf

ίο der oberen Proteinschicht und dem Erscheinen des sichtbaren Amalgams vergeht, an, ob eine monomolekulare oder eine bimolekulare Proteinschicht auf dem Substrat vorhanden ist und demgemäß ob die Lösung, die zu untersuchen war, tatsächlich das mit dem ersten Protein spezifisch reagierende Protein enthielt oder nicht.

Durch Herstellen einer Vielzahl von Substraten nach der in Block 13 beschriebenen Stufe und deren gleichzeitiges Eintauchen in die Lösung, in der ein spezifisch reagierendes Protein erwartet wird, wie in Block 14 angegeben, wobei man die einzelnen Substrate jedoch während einer gewissen Dauer nacheinander aus der Lösung herauszieht, kann man eine rohe quantitative Bestimmung der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins durchführen. Da die Geschwindigkeit, mit der sich die Schicht aus spezifisch reagierendem Protein bildet, eine Funktion der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der Lösung ist, kann ein Vergleich der Diffusionszeiten für den Quecksilbertropfen durch die Proteinschichten auf einer Reihe von Substraten, die der Lösung, in der man das spezifisch reagierende Protein vermutet, verschiedene Zeiten ausgesetzt worden sind, eine rohe quantitative Angabe der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der entsprechenden Lösung ergeben.

Bei einer anderen Ausführungsform wird ein Substrat mit einem Metallfilm überzogen, wie in Block 11 der Fi g. 1 abgebildet und wie bei der letzten Ausführungsform beschrieben. Dann taucht man das Substrat in Lösungen ein, wie in den Blöcken 13 und 14 dargestellt und oben beschrieben. Die nächste Stufe nach dieser Ausführungsform besteht im Beschichten der oberen Proteinschicht mit einer zweiten Metallschicht, wie in Block 17 der F i g. 1 dargestellt, und dann wird die so erhaltene Struktur mit reflektiertem Licht betrachtet, wie in Block 21 der Fig. 1 dargestellt. Das zweite Metall wird vorzugsweise durch Elektroplattieren aufgebracht. Im wesentlichen führt diese Ausführungsform zu einer Struktur, die als Diffraktionsraster arbeitet und der Unterschied zwischen einer monomolekularen und einer bimolekularen Protein-lsolationsschicht ist bestimmbar -aus den Spektralanteilsn, die irn reflektierten Licht fest gestellt werden können.

Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt die in der F i g. 1 in den Blöcken 12,13, 14 und 18 beschriebenen Stufen. Bei dieser Ausführungsform muß das Substrat ein lichtdurchlässiges Substrat sein, wie Glas, Kunststoff, gesintertes Siliciumdioxid, Glimmer, Quarz und ähnliches und vorzugsweise wird Glas verwendet, wobei Objektträger ein bequem erhältliches Substrat darstellen, das zuerst mit einer Vielzahl von Metallkügelchen beschichtet wird, indem man ein Metall, z. B. Indium, wie in Block 12 der F i g. 1 angegeben, durch Verdampfen auf das Substrat aufbringt Das Indium z. B. wird langsam aus einem Tantaltiegel in einem Vakuum von etwa 5 · 10-⁵mm Hg auf das Glassubstrat aufgebracht. Da die Indiumatome auf der Oberfläche des Substrates eine hohe Beweglichkeit

haben und das Glassubstrat nicht merklich benetzen, agglomeriert das auf das Substrat aufgedampfte Indium zu kleinen Teilchen. Jedes Metall, das ähnliche Eigenschaften hat und Kügelchen auf dem Substrat bildet, wenn es durch Aufdampfen dort aufgebracht wird, kann hier verwendet werden. Außer Indium sind Gold, Silber, Zinn und Blei erfolgreich verwendet worden. Das Verdampfen des Metalles wird fortgesetzt, bis das Substrat eine leicht bräunliche Farbe hat. Zu diesem Zeitpunkt haben die Metallkügelchen Durchmesser in der Größenordnung von 1000 A. Die genaue Größe der Kügel- *chen ist nicht kritisch, doch müssen sie Durchmesser haben, die einem großen Anteil der Wellenlänge des sichtbaren Lichtes entsprechen. Beim nächsten Schritt wird das mit den Kügelchen bedeckte Substrat in eine Lösung eines ersten Proteins eingetaucht, wie in Block 13 der F i g. 1 dargestellt. Das erste Protein haftet wieder in einer monomolekularen Schicht an dem Substrat und den darauf befindlichen Metallkügelchen. Nachdem sich eine monomolekulare Proteinschicht gebildet hat, kann das beschichtete Substrat dazu verwendet werden. Lösungen auf die Anwesenheit eines mit dem ersten Protein spezifisch reagierenden Proteins zu untersuchen, indem man das beschichtete Substrat in eine solche Lösung eintaucht, in der ein solches spezifisch reagierendes Protein erwartet wird, wie in Block 14 der F i g. 1 angegeben. War das erwartete spezifisch reagierende Protein vorhanden, dann weisen das Substrat und die Metallkügelchen eine bimolekulare Proteinschicht auf; war das spezifisch reagierende Protein dagegen nicht vorhanden, dann werden das Substrat und die Metallkügelchen nur von einer monomolekularen Proteinschicht bedeckt. Das beschichtete Substrat wird dann entweder im reflektierten oder durchfallenden Licht betrachtet, wie in Block 18 der F ι g. 1 angegeben und vom Aussehen des beschichteten Substrates hinsichtlich der Dicke der anhaftenden Proteinschicht und demgemäß der Anwesenheit oder Abwesenheit des erwarteten spezifisch reagierenden Proteins wird letzteres bestimmt. Der Nachweis der Proteinschichten beruht auf Änderungen des Farbtones des leicht braunen Substrates, die in dem beschichteten Substrat beobachtbar sind. Diese Änderungen sind sehr ausgeprägt, und der Nachweis der Proteinschichten ist in diesem Falle ein sehr einfaches Verfahren. Die Teilchen allein auf dem Substrat erscheinen als ein erster Farbton von Braun, die mit einer monomolekularen Proteinschicht belegten Teilchen erscheinen als ein dunkleres Braun und die mit einer bimolekularen Proteinschicht belegten Teilchen erscheinen als ein noch dunklerer Braunton. Dieses Nachweisverfahren beruht auf der Tatsache, daß elektromagnetische Strahlung in einem starken Maße durch leitende Kügelch;n mit Durchmessern gleich einem großen Anteil einer Wellenlänge der einfallenden Energie zerstreut wird und daß im Falle des Zerstreuens durch solche Kügelchen das Zerstreuen stark durch eine dünne auf den Kügelchen befindliche dielektrische Schicht beeinflußt wird.

Bei einer Modifikation dieser Ausführungsform, die eine medizinisch diagnostische Vorrichtung schafft, wird das die Metailkügelchen aufweisende Substrat teilweise bis zu einer ersten Tiefe in eine Lösung eines ersten Antigens eingetaucht. Das Substrat wird in einer monomolekularen Schicht durch das erste Antigen in dem Bereich beschichtet, der in die Lösung eingetaucht war. Dann trocknet man das Substrat und taucht bis zu einer zweiten Tiefe tiefer in eine Lösung eines zweiten Antigens ein. Das zweite Antigen haftet nicht an dem ersten Antigen, wohl aber an dem durch das erste Antigen nicht bedeckten Teil des Substrates, der in die Lösung des zweiten Antigens eingetaucht wird. Danach trocknet man das Substrat wieder und taucht bis zu einer dritten und größeren Tiefe in eine Lösung eines dritten Antigens ein. Das dritte Antigen haftet an dem Teil und nur an dem Teil des Substrates, der no-h .licht mit dem ersten oder zweiten Antigen bedeckt ist. Das Verfahren kann für irgendeine Zahl interessierender Antigene wiederholt werden. Man erhält ein Substrat, das mit einer Vielzahl von monomolekularcn slrcifenförmigen Schichten verschiedener Antigene bcdecki ist. Dieser beschichtete Objektträger ist das fur diagnostische Zwecke einsetzba.·. werkzeug. Bei dem mcdi/inisch diagnostischen Verfahren wird dieser Objckllrätrpj· jn pjne Probe von z. B. Blut üblicherweise mehreren Stufen lang eingetaucht. Danach nimmt man den Objektträger Eius der Probe heraus und betrachtet ihn nach dem Waschen in Wasser mittels reflektiertem oder durchfallendem Licht. Der Objektträger zeigt ein Muster hellerer und dunklerer Streifen, welche die in der Probe vorhandenen Antikörper anzeigen und gestattet so eine entsprechende medizinische Diagnose.

F i g. 2 gibt eine stark vergrößerte Seitenansicht eines Teiles des in der vorgenannten Austührungsform dieser Erfindung beschriebenen diagnostischen Vorrich;·.".' wieder. F i g. 2 zeigt einen Teil des Substratmatcrials 31 mit einer Vielzahl von darauf durch Aufdampfen aufgebrachten Metallkügelchen 32. Die Teilchen 32 sind vorzugsweise durch Aufdampfen von Indium auf das Substrat 31 hergestellt, wie oben beschrieben, doch können sie auch durch Verdampfen von Gold, Silber, Zinn, Blei oder eines anderen Metalles hergestellt sein, das ähnliche nicht benetzende und eine atomare Beweglichkeit aufweisende Eigenschaften hat Irgendeines einer großen Zahl von Metallen zeigt solche Eigenschaften, wenn die Temperatur des Substrates verändert wird. Nach dem Eintauchen in eine Lösung eines ersten Proteins wird das Segment des Objektträgers, der das Substrat 31 und die Metallkügelchen 32 umfaßt, mit einer monomolekularen Schicht von Molekülen 34 des ersten Proteins bedeckt, wie in F i g. 2 allgemein bei 33 angegeben. Die mit 33 bezeichnete Vorrichtung ist das diagnostische Instrument, das zum Untersuchen von Lösungen auf die Anwesenheit des mit den Proteinmolekülen 34 spezifisch reagierenden Proteins verwendet wird. Wird die allgemein mit 33 bezeichnete Vorrichtung dem mit dem Protein der Moleküle 34 spezifisch reagierenden Protein ausgesetzt dann nimmt die Vorrichtung ein Aussehen an, wie es allgemein bei 35 gezeigt ist, bei dem das Substrat 31 und die Metallkügelchen 32 mit einer bimolekularen Proteinschicht bedeckt sind, welche die Moleküle 34 des ersten Proteins, die die erste monomolekulare Schicht auf dem Substrat 31 und den Kügclchen 32 bilden und eine zweite monomolekulare Schicht eines Proteins aus den Molekülen 36 des mit dem ersten Protein spezifisch reagierenden Proteins umfaßt wobei die Moleküle 36 immunologisch mit den Molekülen 34 des ersten Proteins verbunden sind und diese erste Proteinschicht die Metallkügelchen und das Substrat überlagern.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Proteins in einer biologischen Probe, mit den folgenden Stufen: Aufbringen eines Metallüberzuges auf ein Substratmaterial, Inberührungbringen des Überzogenen Substratmaterials mit einer Lösung eines mit dem genannten spezifischen Protein spezifisch reagierenden Proteins, um das Substratmaterial mit dem spezifisch reagierenden Protein zu beschichten, Inberührungbringen des beschichteten Substratmaterials mit der biologischen Probe und
Untersuchen des beschichteten Substratmaterials, um zu bestimmen, ob das spezifische Protein daran haftet oder nicht, dadurch gekennzeichnet, daß

durchlässige Platte ist, und daß die Mctallkügclchen Indiumteilchen mit einem Durchmesser im Bereich von 10 Abis 2000 Ä sind.