DE19631413A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Präparierung von Molekülen und Partikeln - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Präparierung oder Immobilisierung von Molekülen nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 bzw. des Anspruchs 30. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein gezieltes Präparieren oder Manipulieren einer definierten Zahl von Molekülen.

Die Immobilisierung von Molekülen ist für viele chemische und biologische Prozesse von großer Bedeutung. So verlaufen chemische Synthesen häufig an katalytisch aktiven Grenzflächen; auch für chemische und biologische Trennverfahren, wie z. B. chromatographische Techniken, sind immobilisierte Moleküle erforderlich. Schließlich beruhen eine Reihe von chemischen und biochemischen Analyseverfahren auf Bindungen an feste Phasen, wie z. B. immunologische und molekularbiologische Nachweisverfahren.

Entsprechend wurden schon sehr früh erhebliche Anstrengungen unternommen, geeignete Verfahren zu entwickeln, Moleküle an feste Oberflächen zu koppeln, wobei dem Erhalt der chemischen Aktivität und der Stabilität der Bindung eine zentrale Bedeutung zukommt (siehe z. B. K. Mosbach (Hrsg.): Methods in Enzymology, Bd. 44, Academic Press, New York, San Francisco, London 1976).

Die technisch einfachste Möglichkeit ist die adsorptive Immobilisierung, die z. B. sehr häufig für die Bindung von Antikörpern in Mikrotiterplatten für Immuntests eingesetzt wird. Durch die rein adsorptive Bindung müssen die Reaktionsbedingungen und das Material sehr sorgfältig ausgewählt werden, um eine stabile Immobilisierung zu erreichen. Eine weitere Schwierigkeit ist die Reproduzierbarkeit und insbesondere die Kontrolle der Schichtstrukturen und Schichtdicken. Schließlich besteht keine Möglichkeit, die Ausrichtung der immobilisierten Moleküle zu kontrollieren.

Zur Verbesserung der Eigenschaften wurden neue Immobilisierungsverfahren -in der Regel auf Basis kovalenter Bindungen zwischen Molekül und Oberfläche- entwickelt. Hierbei können native reaktive Gruppen des Moleküls genutzt werden. Im Fall von Proteinen kann insbesondere die Aminosäure Lysin stabile Bindungen mit reaktiven Gruppen, wie Aldehyd- oder Estergruppen bilden. Oft werden zwischen aktivierter Oberfläche und Molekül noch bifunktionelle Brückenreagentien vorgesehen. Ein wichtiges Beispiel ist die Kopplung von Proteinen über Glutaraldehyd an aminosilanisierte Quarz oder Glassubstrate (siehe z. B. Seeger et al., in: Synthetic Microstructures in Biological Research, J. Schnur, M. Peckerar (eds.). Plenum Publishing Corporation, S. 53-66 (1992).

Darüber hinaus sind weniger verbreitete Immobilisierungsverfahren bekannt, wie z. B. die Sol-Gel-Technik. Mit der Sol-Gel-Technik lassen sich eine Vielzahl von Molekülen immobilisieren, allerdings ist die Herstellung ultradünner Filme im unteren Nanometerbereich bisher nicht möglich. Der Einschluß von Rezeptoren dagegen kann dazu führen, daß sie für das Analytmolekül nicht mehr zugänglich sind.

Eine weitere Möglichkeit, Moleküle zu immobilisieren, bietet sich mit der spontanen Selbstanordnung organischer Moleküle auf Oberflächen zu geordneten Filmen durch Adsorption, die als self-assembling bezeichnet wird (A. Ulman, Academic Press, Boston 1991)
Die Langmuir-Blodgett-Technik ist geeignet, eine Monolage von Molekülen als Film von einer flüssigen Phase auf ein festes Substrat zu übertragen, wobei eine zuvor hergestellte hohe Ordnung erhalten bleibt. Bekannt wurde diese Technik durch die Übertragung von hochgeordneten amphiphilen Fettsäure-Mono­ lagen, die allerdings aufgrund fehlender kovalenter Bindungen sehr instabil und auch weiteren chemischen Modifizierungen praktisch nicht zugänglich sind. Dennoch erscheint das Übertragungsprinzip aufgrund der ausgezeichneten Reproduzierbarkeit geeignet, um den oben beschriebenen Anforderungen bezüglich der definierten Schichtdicke und hoher Reproduzierbarkeit gerecht zu werden.

Das Prinzip der Immobilisierung von Proteinen mit Hilfe von nicht-amphiphilen Haar-Stab-Molekülen beruht darauf, vorhandene vernetzungsfähigen Doppelbindungen nicht ausschließlich zur Vernetzung der Polymere einzusetzen, sondern auch zur kovalenten Kopplung von Proteinen zu nutzen (A. Hartmann, S. Seeger, Deutsches Patentamt DE 43 32 003, 1993).

Eine Weiterentwicklung vereinfacht die Immobilisierung von Proteinen deutlich. Das Verfahren beruht auf der Langmuir- Blodgett-Technik und unter Nutzung der bereits erwähnten nicht-amphiphilen photopolymerisierbaren Haar-Stab-Polymere. Hierbei wird das oberflächenaktive Verhalten von Proteinen auf Pufferlösungen ausgenutzt. Die Idee ist, Proteine direkt mit dem Haar-Stab-Polymer auf die Flüssigkeitsoberfläche (Subphase) aufzubringen. Die anschließende Bestrahlung der Monolage, die jetzt aus Haar-Stab-Polymer- und Proteinmolekülen besteht, führt zu einer Bindung der Proteinmoleküle in einem zwei- bzw. dreidimensionalen Netzwerk. Anschließend kann dieses Netzwerk mit der Langmuir- Blodgett-Technik auf feste Substrate übertragen werden (A. Hartmann, D. Bock, S. Seeger, Sensors & Actuators 28 (2), S. 143 ff., 1995). Neben der einfachen Einschritt-Prozedur ist ein weiterer Vorteil, daß mehrere Substrate gleichzeitig beschichtet werden können. Der Parallelisierungsgrad ist lediglich von der Größe des Langmuir-Blodgett-Über­ tragungssystems abhängig.

Während bisher meist eine vergleichsweise große Zahl von Molekülen an Oberflächen gebunden wird, erfordern neue Trenn- und Analysetechniken immer kleinere Volumina, so daß häufig mikrostrukturierte Bausteile eingesetzt werden müssen. Bestehende Verfahren zur Immobilisierung von Molekülen ermöglichen nicht die räumlich definierte Bindung von Molekülen an Oberflächen, da chemische Reaktionen, die Physisorption oder die Chemisorption statistisch verteilt auf einer homogen strukturierten Oberfläche auftreten. Ist das Verhältnis von Fläche zur Zahl der immobilisierten Moleküle ausreichend klein, so sind statistische Schwankungen der Molekülzahl pro Flächeneinheit weitgehend vernachlässigbar.

Die Miniaturisierung von analytischen Systemen oder chemischen Reaktoren führt jedoch dazu, daß mit sehr wenigen Molekülen gearbeitet werden muß. In einigen Fällen ist die Bearbeitung und Manipulation eines einzigen Moleküls erforderlich (z. B. W.P. Ambrose et al., Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 97, S. 1535 ff. , 1993).

Ein bekanntes Verfahren zur Immobilisierung von wenigen oder gar nur einem Molekül besteht darin, eine große Zahl kleiner Polystyrolkugeln zusammen mit einer bestimmten Zahl von Molekülen in einer Flüssigkeit zu mischen, und durch entsprechende chemische und physikalsich-chemische Bedingungen dafür Sorge zu tragen, daß sich eine Bindung (kovalent oder nicht-kovalent) zwischen Molekül und Kugel ausbilden kann. Durch geeignete Wahl der Bedingungen, insbesondere der Konzentrationsverhältnisse zwischen Kugeln und Molekülen, kann eine statistische Verteilung erhalten werden, wobei an einige Kugeln kein, ein, zwei, usw. Moleküle gebunden sind. Die Kugeln können dann z. B. mit der optischen Pinzette manipuliert werden (T.T. Perkins et al. Science 264, 822-826 (1994)). Der Nachteil eines solchen Verfahrens ist, daß aufgrund der statistischen Verteilung nur sehr schwer eine Kugel mit einer exakt definierten Molekülzahl zu identifizieren ist. Insbesondere, wenn nur sehr wenige Moleküle zur Verfügung stehen, ist ein solches Verfahren nicht geeignet, da der Aufwand, eine Kugel mit z. B. genau einem Molekül zu finden, zu groß ist.

Daher ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung anzugeben, mit der diese statistischen Schwankungen vermieden werden und einzelne oder eine wohldefinierte Anzahl von Molekülen oder Partikeln gezielt präpariert und manipuliert werden können.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 bzw. mit einer Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 30 gelöst.

Die Moleküle, die in ein Volumen eingebracht oder an eine Oberfläche gebunden werden sollen, sind nicht in einem Volumen frei beweglich, sondern werden so verdünnt auf einer Oberfläche fixiert, so daß sie einzeln detektiert werden können. Die Fixierung von Molekülen in einer dünnen bis hinab zu einer monomolekularen Schicht ermöglicht in einer Raumrichtung eine in molekularen Dimensionen definierte Ortsbestimmung des Moleküls. Die statistische Verteilung vieler Moleküle in einer Schicht kann einfach über das Verhältnis der Zahl der zu manipulierenden Moleküle zu der Zahl der "Matrixmoleküle", die die Schicht bilden, beeinflußt werden. Die Schicht kann sich erfindungsgemäß an mindestens einer festen oder flüssigen oder gasförmigen Oberfläche befinden.

Lassen sich die Moleküle auf der Oberfläche identifizieren, so kann - je nach Auflösung der Analysetechnik - mit hoher Wahrscheinlichkeit, in bestimmten Fällen mit Sicherheit, ein und nur ein Molekül lokalisiert werden. Dies ist die Vorraussetzung für die gezielte Manipulation von einem oder einer genau definierten Zahl von Molekülen.

Als weiteren Vorteil der Erfindung ergibt sich, daß Lösungen mit definierter Zahl an gelösten Molekülen hergestellt werden können.

Ferner ist es möglich, an eine Oberfläche gezielt genau ein Molekül, Komplex oder Molekülaggregat zu binden.

Schließlich kann eine Membran hergestellt werden, in die genau ein Molekül, Komplex oder Molekülaggregat, z. B. ein Transmembranprotein eingelagert ist.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.

Im folgenden wird die Erfindung anhand einiger Ausführungsbeispiele in Verbindung mit den Abbildungen näher erläutert. In den Abbildungen beziehen sich gleiche Bezugsziffern auf gleiche Objekte. Die Abbildungen zeigen im einzelnen folgendes:

Fig. 1 Bindung eines in einer Schicht eingelagerten Moleküls an ein an eine Oberfläche gebundenes Rezeptormolekül.

Fig. 2 Bindung eines in einer Schicht eingelagerten Moleküls an ein an eine Oberfläche gebundenes Rezeptormolekül, wobei dieses Molekül als Fangmolekül für weitere Moleküle dient.

Fig. 3 Herstellung einer Membran mit einer wohldefinierten Anzahl von spezifischen Molekülen.

Fig. 4 Hohlkörper, dessen Öffnung von einer molekularen Membran überspannt ist und ein spezifisches Molekül in die Matrixmolekülschicht eingelagert ist.

Nach dem verdünnten Auftragen kann das Molekül z. B. durch Fluoreszenztechniken, Rastersondenmikroskopie, optischer Nahfeldmikroskopie, elktromagnetische oder kalorimetrische Sonden identifiziert werden.

Im folgenden wird auf Fig. 1 Bezug genommen. Nach dem Identifizieren des Orts eines Moleküls, Komplexes oder Molekülaggregats (1) kann es von der Schicht (2) auf verschiedene Weise getrennt werden, wenn es nicht zu stark fixiert ist: So kann durch die Heranführung eines Gegenstandes bzw. dessen Oberfläche (3), die eine ausreichend starke Wechselwirkung zu dem Molekül erzeugt, z. B. durch vorherige Immobilisierung mindestens eines anderen Moleküls (4) an diese Oberfläche, das eine spezifische Wechselwirkung mit dem in der Schicht eingelagerten Molekül eingeht, eine nicht-kovalente, koordinative oder kovalente Bindung erzeugt werden, und nach der Bindungsbildung die Oberfläche, an die nun das Molekül gebunden ist, wieder von der dünnen Schicht getrennt werden, so daß das Molekül gezielt aus der dünnen Schicht entfernt wird.

Die Oberfläche (3) muß nicht zwingend die Oberfläche eines Festkörpers sein: So kann ein Tropfen, z. B. ein Öltropfen, einer in der Subphase, auf der das Zielmolekül in einer Matrixschicht eingebettet ist, nicht löslichen Flüssigkeit z. B. mit einer optischen Pinzette an den Ort des Zielmoleküls herangeführt werden, bis das Zielmolekül in dem Tropfen aufgenommen wird. Nach dem Transfer des Zielmoleküls kann der Tropfen auf die gleiche Weise von der Molekülschicht wegtransportiert werden.

Ferner kann auch ein Gegenstand, z. B. eine Kapillare, mit einem Tropfen einer Flüssigkeit an der Spitze an das Zielmolekül herangeführt werden. Hierbei wird das Zielmolekül mit der Oberfläche des Tropfens in Kontakt gebracht, wobei es zum Transfer des Zielmoleküls in den Tropfen kommt.

Es ist in vielen Fällen unerheblich, wenn hierbei einige Matrixmoleküle (2′) aus der Molekülschicht (2) zusammen mit dem Zielmolekül (1) entfernt werden, solange das Zielmolekül seine Aktivität nicht einbüßt.

Als Oberfläche ist jede planare, konvexe, oder zylindrische Geometrie geeignet, besonders jedoch die Spitze einer Nadel, eine Elektrode, eine Glasfaser, einer Kapillare, oder die Oberfläche einer Kugel.

Neben der direkten Heranführung der Oberfläche an die Molekülschicht durch mechanische Kräfte, sind insbesondere Lichtgradienten, z. B. die "Optische Pinzette", wie auch andere elektromagnetische Felder geeignet. Ferner kann die Oberfläche gleichzeitig als Sonde dienen, um das bzw. die zu manipulierenden Moleküle zu identifizieren, z. B. durch Rastersondenmikroskopie, optische Nahfeldmikroskopie, Fluoreszenzspektroskopie, kalorimetrische, elektrische oder magnetische Detektionstechniken.

Sind in der oder an die Schicht Moleküle, Komplexe oder Molekülaggregate gebunden, die mindestens zwei gleiche oder verschiedene Bindungsstellen besitzen, so können diese als Brücke zwischen einer Oberfläche und einem einzigen oder einer der Anzahl der Bindungsstellen entsprechenden Zahl von Molekülen dienen (Fig. 2). Das Zielmolekül (1), welches sich in einer Schicht (2) befindet, wird über ein Molekül, das an das Zielmolekül bindet und an eine Oberfläche gebunden ist an die Oberfläche gebunden. Das Zielmolekül wird nun aus der Schicht (2) entfernt. Die zweite Bindungsstelle kann nun zur spezifischen Bindung eines weiteren Moleküls genutzt werden. So kann z. B. als Molekül (1) ein Antikörpermolekül verwendet werden, wobei Molekül (4) und (5) identische Antigenmoleküle sind. Es lassen sich auch andere Moleküle verwenden, auch synthetisch hergestellte Moleküle mit einer definierten Anzahl von gleichen oder verschiedenartigen Bindungsstellen. An eines der spezifischen Moleküle (5) können weitere Moleküle gebunden sein, z. B. DNS-Moleküle, die dann z. B. einzeln an eine Oberfläche gebunden sind und beispielsweise als einzelnes Molekül für eine Sequenzierung oder Hybridisierung zur Verfügung stehen. Auf diese Weise lassen sich selbstverständlich auch andere Moleküle binden. Die Bindung des Moleküls (6) kann auch vor der Entfernung des Moleküls (1) erfolgen, wobei dann die aneinander gebundenen Moleküle (1), (5) und (6) von der Schicht (2) entfernt werden. Die Schicht (2) kann auch zusammen mit den aneinander gebundenen Molekülen (1), (5) und (6) auf eine feste Oberfläche übertragen werden, bevor sie entfernt werden.

Neben der Fixierung einer definierten Zahl von Molekülen auf Oberflächen ist es auch möglich, eine Lösung herzustellen, die eine definierte Zahl von gleichartigen oder eine definierte Mischung verschiedener Moleküle enthält. Befindet sich die Molekülschicht auf der Oberfläche einer Flüssigkeit, so können die Zielmoleküle aus der Matrixschicht in die Lösung gebracht werden, z. B. durch die Ausübung einer mechanischen Kraft, vorzugsweise durch eine Spitze, wobei die Adhäsion des Moleküls an die Spitze durch eine geeignete Oberflächenbeschaffenheit verhindert werden muß. Ferner ist auch ein Gegenstand geeignet, der eine Öffnung besitzt, z. B. eine Kapillare. So wird gezielt ein oder eine wohldefinierte Anzahl von Molekülen, Komplexen oder Molekülaggregaten aus der Schicht entfernt. Hierbei wird sichergestellt, daß sich die bzw. das Molekül(e), Komplex(e) oder Molekülaggregat(e) im Bereich der Öffnung befinden, wobei durch mechanischen Druck der Teil der Schicht, der sich über der Öffnung befindet von der Schicht entfernt wird. Hierbei kann z. B. auch ein Unterdruck im Hohlraum des Gegenstandes genutzt werden, um die bzw. das Molekül(e), Komplex(e) oder Molekülaggregat(e) in den Hohlraum zu ziehen, oder ein Überdruck kann dazu genutzt werden, die bzw. das Molekül(e), Komplex(e) oder Molekülaggregat(e) aus der Schicht zu entfernen. Hierbei ist es unerheblich, wenn Matrixmoleküle mit aus der Schicht entfernt werden. Darüber hinaus ist auch ein Laserstrahl geeignet, die bzw. das Molekül(e), Komplex(e) oder Molekülaggregat(e) aus der Schicht zu entfernen, dessen Lichtdruck die Matrixmolekülschicht lokal begrenzt zerstört und somit das Molekül freisetzt.

Ferner ist diese Technik geeignet, definierte Membranen herzustellen, in die eine definierte Zahl von Molekülen eingelagert sind. Hierbei wird eine mit einer Öffnung (7) versehene Oberfläche (3) langsam an das bzw. die Moleküle herangeführt (Fig. 3). Durch geeignete Fixierung der Matrixmoleküle an der Fläche wird erreicht, das Matrixmoleküle die Öffnung überspannen (Fig. 4). Sind Zielmoleküle eingelagert, so können diese über der Öffnung angeordnet werden. Eine Polymerisierung der Matrixmoleküle, z. B. durch Photopolymerisationsreaktionen führt dabei zu besonders stabilen Membranen. Auf diese Weise lassen sich molekulare Filter konstruieren, die z. B. einen Reaktorraum vom gereinigten Filtrat abtrennen. Die in der Membran gebundenen Zielmoleküle können jedoch auch selbst als Reaktoren wirken (z. B. Enzyme), so daß das Edukt- vom Produktvolumen getrennt ist und keine Reinigungsschritte erforderlich sind. Schließlich können -ähnlich wie Membranenzyme in biologischen Zellen- die so fixierten Zielmoleküle auch als molekulare Informationsübermittler zwischen zwei abgetrennten Räumen dienen.

Ausführungsbeispiel 1 Herstellung von Lösungen

Auf einer Grenzfläche, z. B. einer flüssig/Gas-Grenzfläche wird eine Schicht beispielsweise durch das bekannte Langmuir- Blodgett-Verfahren erzeugt, die aus schichtbildenden Molekülen, sog. Matrixmolekülen, und darin befindliche Molekülen, Komplexen oder Molekülagregaten besteht. Die Matrixmoleküle können amphiphile oder nicht-amphiphile Moleküle sein, wie z. B. Fettsäuren oder Stab-Haar-Polymere, z. B. Copolyglutamat oder Cellulosederivate. Die Moleküle, Komplexe oder Molekülaggregate sind in der Weise verdünnt, daß sie soweit voneinander entfernt in der Schicht vorliegen, daß sie mit der gewählten Detektionstechnik getrennt voneinander identifiziert werden können. So können z. B. fluoreszenzmarkierte Moleküle, Komplexe oder Molekülagregate in oder an die Schicht gebracht werden, wobei diese dann durch z. B. eine konfokale Fluoreszenzdetektion einzeln identifiziert werden. Als Molekül, Komplexe oder Molekülagregat sind z. B. Proteine wie Streptavidin, Antikörper, Antikörperfragmente, Protein A oder Protein G aber auch andere in Anspruch 1 erwähnte Moleküle geeignet.

Die Bindung der Moleküle, Komplexe oder Molekülaggregate an oder in die Matrixmolekülschicht kann durch bekannte Verfahren erfolgen. Besonders geeignet sind jedoch die in A. Hartmann, S. Seeger, Deutsches Patentamt DE 43 32 003, 1993 und A. Hartmann, D. Bock, S. Seeger, Sensors & Actuators 28(2), S. 143 ff., 1995 beschriebenen Verfahren. Von Bedeutung ist allerdings, das eine Reaktion zur Sabilisierung der Schicht nur in der Weise eingesetzt wird, daß die Moleküle, Komplexe oder Molekülagregate nicht so stark in der Schicht fixiert sind, daß sie nicht mehr entfernt werden können. Eine geeignete Menge von Molekülen, Komplexen oder Molekülaggregaten ist z. B., daß sie sich in einem durchschnittlichen Abstand von 5 Ám in bzw. an der Schicht befinden. Es sind jedoch auch alle andere Abstände geeignet, so lange gewährleistet ist, daß sie einzeln identifiziert werden können. Bei der Auswahl des Langmuir-Blodgett-Ver­ fahrens zur Herstellung der Schicht wird z. B. Copolyglutamat und das ausgewählte Molekül, der Komplex oder das Molekülaggregat in Chloroform gelöst und als Tropfen auf eine wäßrige Subphase gegeben. Nach der Spreitung des Films und dem Verdampfen des organischen Lösungsmittels wird die Schicht komprimiert. Die Moleküle, Komplexe oder Molekülaggregate bleiben nun in der Schicht eingefangen und können z. B. Fluoreszenz durch Abrastern detektiert werden. Selbstverständlich können auch andere Techniken zur Detektion eingesetzte werden.

Aus der so hergestellten Schicht kann nach der Identifizierung eines Moleküls, Komplexes oder Molekülaggregats dieses aus der Schicht entfernt werden. Dies ist möglich, indem z. B. durch einen Lichtpuls, z. B. durch einen Nd:YAG-Laser, mechanischer Druck auf die Schicht ausgeübt wird, und so das Molekül, der Komplex oder das Molekülaggregat aus der Schicht entfernt und in die Subphase gedrückt wird. Natürlich können auch geeignete mechanische Kräfte durch Oberflächen mit und ohne Öffnungen ausgeübt werden. Besonders geeignet sind Kapillaren, die durch die Schicht hindurchgestoßen werden, wobei ein Molekül, Komplex oder Molekülaggregat ggf. zusammen mit Matrixmolekülen in die Subphase gedrückt wird.

In der Subphase befindet sich nunmehr genau ein Molekül, Komplex oder Molekülaggregat.

Ausführungsbeispiel 2 Präparierung von einzelnen Molekülen zur Sequenzierung von DNS

Die Immobilisierung von einzelnen DNA- oder RNA-Molekülen wird in der Weise vorgenommen, daß Matrixmoleküle, z. B. Copolyglutamat zusammen mit Streptavidin auf eine Pufferlösung aufgebracht und nach dem Langmuir-Blodgett-Prinzip als Monolage komprimiert werden. Das Verhältnis der einnehmenden Fläche von Matrixmolekülen kann z. B. so gewählt werden, daß zwischen den einzelnen Streptavidinmolekülen ein Abstand von im Mittel 5 Ám besteht. Schließlich wird ein in der Subphase befindliches biotinyliertes DNS-Molekül an das Streptavidin- Molekül gebunden. Mit beispielsweise einer Polystyrolkugel, deren Oberfläche Biotinmoleküle trägt, wird nun an genau ein Streptavidinmolekül gebunden und dieses durch Bewegen der Kugel aus der Monolage entfernt. Es können jedoch auch andere Oberflächen gewählt werden. Hierbei wird die Polystyrolkugel von der der Lösung gegenüberliegenden Seite an das Streptavidinmolekül herangeführt. Das Streptavidinmolekül kann z. B. identifiziert werden, in dem es vor der Herstellung der Schicht fluoreszenzmarkiert wurde. Sodann ist die Detektion z. B. mit einem konfokalen Aufbau auf der Grenzfläche möglich. Es können jedoch auch andere Moleküle zur Markierung eingesetzt werden: So kann beispielsweise an das DNS-Molekül ein oder mehrere Fluoreszenzfarbstoffmoleküle angekoppelt direkt oder beispielsweise über eine Hybridisierungsreaktion angekoppelt werden. Es besteht aber auch die Möglichkeit, andere Detektionstechniken einzusetzen, die geeignet sind, einzelne Moleküle nachzuweisen.

Ausführungsbeispiel 3 Herstellung von Membranen

Die Herstellung definierter Membranen wird in der Weise durchgeführt, daß eine Fläche mit einer Öffnung in der Weise an die Monolage, die vorzugsweise vernetzt oder vernetzbar ist und sich z. B. auf einer wäßrigen Phase befindet und mittels der Langmuir-Blodgett-Technik komprimiert wird und z. B. aus Cinnamoylbutylethercellulose besteht, herangeführt wird, daß sich das in die Monolage eingelagerte Molekül über der Öffnung befindet. Der Kontakt der Oberfläche mit der Monolage führt zur Bindung an diese und der gesamte Ausschnitt aus der Monolage wird aus der Monolage entfernt und haftet auf der Oberfläche, wobei der Ausschnitt die Öffnung in der Fläche bedeckt. Das eingelagerte Molekül kann nun je nach Funktion selektive Transportprozesse durch die Membran hindurch oder chemische Reaktionen katalysieren, wobei Edukte und Produkte räumlich voneinander getrennt sind.

Auf diese Weise lassen sich Transmembran-Proteine, wie z. B. Carrier- oder Ionenanäle in Membranen einbetten, die zwei Reaktionsräume voneinander trennen.

Claims (31)

1. Verfahren zum gezielten Präparieren von einzelnen oder einer wohldefinierten Anzahl von Molekülen, Komplexen oder Molekülaggregaten für eine gezielte Handhabung, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

• a) Die verdünnte Auftragung von Molekülen, Komplexen oder Molekülaggregaten in oder auf einer Schicht, so daß sie soweit voneinander entfernt sind, daß mindestens eines von ihnen isoliert lokalisiert werden kann.
• b) Die Feststellung des Ortes von isoliert vorliegenden Molekülen, Komplexen oder Molekülaggregaten.
• c) Die Entfernung von mindestens einem Molekül, Komplex oder Molekülaggregat von dem festgestellten Ort aus oder von der Schicht für eine gezielte Handhabung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt c) eine zur Bindung von mindestens einem Molekül, Komplex oder Molekülaggregat geeignete Oberfläche eines Objekts an die Schicht angenähert und eine bestimmte Anzahl von eingelagerten Molekülen, Komplexen oder Molekülaggregaten an die Oberfläche gebunden wird und durch anschließendes Entfernen der Oberfläche von der Schicht die eingelagerten Moleküle, Komplexe, Molekülaggregate aus der Schicht entfernt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche die Spitze einer Nadel oder Kapillare ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt c) eine zur Aufnahme von mindestens einem Molekül, Komplex, Molekülaggregat geeignete Oberfläche eines Objekts an die Schicht angenähert wird und eine bestimmte Anzahl von eingelagerten Molekülen, Komplexen, Molekülaggregaten durch die Oberfläche aufgenommen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche Bestandteil einer Kugel ist.

6. Verfahren nach Anspruch 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche Bestandteils eines Partikels ist, daß durch Lichtgradienten manipuliert wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche des Objekts in ihren räumlichen Dimensionen so gewählt wird, daß eine vorher festgelegte Anzahl von eingelagerten Molekülen, Komplexen, Molekülaggregaten aus der Molekülschicht entfernt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht sich an mindestens einer Flüssigkeitsoberfläche befindet.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht sich an mindestens einer Festkörperoberfläche befindet.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht sich an mindestens einer gasförmigen Grenzfläche befindet.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht aus linearen oder verzweigten Polymeren, Copolymeren, Langmuir-Blodgett- Transfer-fähigen Substanzen, amphiphilen Substanzen, nichtamphiphilen Substanzen oder Lipiddoppelschichten besteht.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht aus Matrixmolekülen aufgebaut ist, die vernetzbar sind.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Molekülschicht aus einer definierten Zahl von Moleküllagen besteht.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß verschiedene Moleküle, Komplexe oder Molekülaggregate in oder auf der Matrixschicht gebunden sind.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Moleküle, Komplexe oder Molekülaggregate Vitamine, wie z. B. Biotin, organische Moleküle, Proteine, Peptide, Polymere, Polymere mit spezifischen Bindungsstellen, Oligonukleotide, Desoxyribonukleinsäure, Ribonukleinsäuren oder Metallkomplexe sind.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Moleküle, Komplexe oder Molekülaggregate geeignet sind, mindestens ein Molekül, Komplex oder Molekülaggregat oder eine biologische Zelle zu binden.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Moleküle, Komplexe oder Molekülaggregate mindestens ein Molekül aus dem Volumen auf einer Seite der Schicht binden und die so aneinander gebundenen Moleküle zur anderen Seite der Schicht entfernt werden.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Moleküle, Komplexe oder Molekülaggregate zu chemischen Reaktionen befähigt sind oder diese katalysieren.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß Moleküle, Komplexe oder Molekülaggregate gemeinsam mit Matrixmolekülen übertragen werden.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß in der Oberfläche eine Öffnung ausgebildet ist, so daß in Schritt c in der Öffnung eine Membran entsteht, in die ein oder eine andere definierte Zahl von Molekülen, Komplexen oder Molekülaggregaten eingelagert sind.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß das bzw. die Moleküle, Komplexe oder Molekülaggregate Kanalproteine sind und somit den Transport von Substanzen von einer auf die andere Seite der Membran ermöglichen.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß einzelne Moleküle, Komplexe oder Molekülaggregate in Schritt c aus der Schicht direkt ohne Anbindung an eine Oberfläche in eine über- oder unterstehende Lösung bewegt werden, wodurch Lösungen mit einer exakt definierten Molekülzahl erzeugt werden können.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß zur Entfernung nach Schritt c ein fokussierter Lichtstrahl, vorzugsweise ein Laser eingesetzt wird, der das Molekül, den Komplex oder das Molekülaggregat aus der Molekülschicht mechanisch herausdrückt, ggf. durch direkte Fokussierung des Lichts auf das Molekül, den Komplex oder das Molekülaggregat oder durch die Fokussierung des Lichts auf einen Punkt bzw. Fläche in der Nähe des Moleküls.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß zur Entfernung nach Schritt c eine Oberfläche mit oder ohne Öffnung an das Molekül, den Komplex oder das Molekülaggregat angenähert wird und dieses mechanisch aus der Schicht gegebenenfalls zusammen mit Matrixmolekülen herausgedrückt oder herausgezogen wird.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22 und Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß zur Entfernung nach Schritt c eine Oberfläche mit oder ohne Öffnung an das Molekül, den Komplex oder das Molekülaggregat angenähert wird und dieses mechanisch aus der Schicht gegebenenfalls zusammen mit Matrixmolekülen herausgedrückt oder herausgezogen wird.

26. Verfahren nach Anspruche 25, dadurch gekennzeichnet, daß zur Entfernung nach Schritt c eine Oberfläche mit Öffnung an das Molekül, den Komplex oder das Molekülaggregat angenähert wird und dieses mechanisch aus der Schicht gegebenenfalls zusammen mit Matrixmolekülen unter Einwirkung eines Unterdrucks in der Öffnung von der Schicht entfernt und in die Öffnung gezogen wird.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Moleküle, Komplexe oder Molekülaggregate auf eine Weise markiert sind, daß sie einzeln detektiert werden können (fluoreszierende Moleküle, magnetische Partikel, andere durch Scanning Mikroscopie detektierbare Substanzen).

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion der Moleküle, Komplexe oder Molekülaggregate in Schritt b in der Weise erfolgt, daß eine von eins verschiedene Zahl von Molekülen, Komplexen oder Molekülaggregaten identifiziert und von nur einem Molekül, Komplex oder Molekülaggregat unterschieden werden kann und nur solche Moleküle, Komplexe oder Molekülaggregate für Schritt c ausgewählt werden, die als ein einziges Molekül, Komplex oder Molekülaggregat in Schritt b identifiziert werden können.

29. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Moleküle, Komplexe oder Molekülaggregate über eine photochemisch spaltbare Bindung an einer festen Oberfläche gebunden sind, diese einzeln detektiert werden und durch Bestrahlung von der Oberfläche abgetrennt werden.

30. Vorrichtung, insbesondere zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Detektor zur Identifikation einzelner Moleküle, Komplexe oder Molekülaggregate auf oder in einer Schicht, sowie eine Vorrichtung zur Entfernung identifizierter Moleküle, Komplexe oder Molekülaggregate besteht.

31. Vorrichtung zur Anwendung nach den Ansprüchen 1 und 30, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Detektor zur Identifikation einzelner Moleküle, Komplexe oder Molekülaggregate auf oder in einer Schicht, einer Vorrichtung zur Herstellung der Schicht sowie eine Vorrichtung zur Entfernung identifizierter Moleküle, Komplexe oder Molekülaggregate besteht.