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Verwandte
Anmeldung
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Diese
Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen Anmeldung U.S.S.N. 60/050
840, eingereicht am 26. Juni 1997.
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Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung bezieht sich auf einen Probenhalter für die chemische Analyse und
Synthese von Proben und insbesondere auf einen Probenhalter hoher
Dichte zum Halten und zum Beibehalten der Trennung von mehreren
Proben während
eines chemischen Analyse- oder Syntheseverfahrens.
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Hintergrund
der Erfindung
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Molekular-Biologie
umfasst eine breite Vielfalt von Techniken für die Analyse von biologischen Proben,
einschließlich
Nukleinsäuren
und Proteinen, von denen viele die Basis von klinischen diagnostischen
Untersuchungen bilden. Diese Techniken umfassen beispielsweise Nukleinsäure-Hybridisierungsanalyse,
Restriktions-Enzymanalyse, genetische Sequenzanalyse, Liganden/Rezeptoren-Bindungsuntersuchungen
und Trennung und Reinigung von Nukleinsäuren und Proteinen. Viele Forschungstechniken
in der Molekularbiologie beinhalten ein Durchführen von zahlreichen Vorgängen an
einer großen
Anzahl von Proben. Diese Vorgänge
sind häufig
komplex und zeitaufwendig und erfordern im allgemeinen einen hohen
Genauigkeitsgrad.
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Matrixgestützte Laserdesorptions-Ionisierung
(MALDI = matrix-assisted laser desorption ionization) ist eine Technik,
die es ermöglicht,
dass sehr große
Moleküle,
wie beispielsweise DNA-Fragmente und Proteine, aus einer festen
Probe desorbiert und ohne bedeutende Zersetzung ionisiert werden.
Gekoppelt mit Massenspektrometrie ermöglicht die MALDI-Technik, dass
Molekulargewichte von biologischen Polymeren und anderen großen Molekülen, einschließlich Industriepolymere,
genau bestimmt werden können.
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Typischerweise
enthält
bei einem MALDI-Verfahren eine Probeplatte eine oder eine Mehrzahl
von kleinen Mengen einer Mischung der zu analysierenden Probe und
eine geeignete Matrix. Nachdem die Proben auf der Probenplatte getrocknet
sind, wird die Probenplatte in eine Vakuumkammer angeordnet. Ein
Laserstrahl trifft jede Probe, um Probenmoleküle zu desorbieren und ionisieren,
wodurch eine Ionenwolke für
jede Probe erzeugt wird. Ionen in der Wolke werden durch elektrische
Felder extrahiert und laufen zu einem Detektor. Ionen unterschiedlicher
Masse erfordern unterschiedliche Zeiten, um zu dem Detektor hin
zu wandern. Daher kann man durch Messen der Zeit, die ein Ionenstrahl
benötigt,
um den Detektor zu erreichen, das Molekulargewicht der Probe bestimmen.
Der Laserstrahl trifft typischerweise jeweils einen Probenspot,
indem die Probenplatte bezüglich
des Laserstrahls bewegt wird.
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Im
allgemeinen ist eine bei einem MALDI-Verfahren verwendete Probenplatte
ein Substrat mit einer flachen Oberfläche. Eine herkömmliche Probenplatte
weist verschiedene Nachteile auf. Die herkömmliche Probenplatte kann ein
erneutes Mischen von zuvor getrennten Proben erlauben. Wenn die
Proben zuerst auf der Probenplatte angeordnet sind, können die
Proben physisch getrennt und unterscheidbar sein. Nachdem die Probenlösung auf
der Probenplatte aufgebracht ist, können sich jedoch die Proben
durch Diffusion verteilen und mit anderen Proben mischen, da es
keine Barriere zwischen den Proben gibt. Um die Diffusion und das
Mischen der Probe zu vermeiden, können Proben ausreichend voneinander
beabstandet sein. Wenn die Proben beabstandet sind, wird jedoch
die Probendichte auf der Probenplatte verringert, und somit können mehrere Platten
erforderlich sein, um eine große
Anzahl von Proben zu analysieren. Da nur eine Probenplatte in einer
MALDI-Kammer auf einmal angeordnet wird, und da es etwas dauert,
um das notwendige Vakuum in der Kammer zu erzeugen, wird eine schnelle
Analyse einer großen
Anzahl von Proben schwierig.
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Ein
weiteres Problem mit der herkömmlichen Probenplatte
besteht darin, dass Proben verschwendet werden. Ein auf der Probenplatte
angeordnetes Probentröpfchen
umfasst typischerweise einen relativ großen Oberflächenbereich verglichen mit
dem Laserstrahldurchmesser. Das Probentröpfchen kann etwa 2 mm2 abdecken, und ein Laserstrahldurchmesser
ist typischerweise ungefähr
100 μm2. Somit trifft der Laserstrahl nur einen
winzigen Bruchteil der Probe, wobei der Rest der Probe verschwendet
wird. Noch ein weiteres Problem mit der herkömmlichen Probenplatte besteht
darin, dass, wenn mehrere Proben auf der Platte angeordnet sind,
es schwierig ist, jede Probe auf der Platte zu adressieren. Die
Fähigkeit,
jede Probe zu adressieren, ist bedeutsam, da Proben, die einzeln
adressierbar sind, selektiv analysiert werden können. Noch ein weiteres Problem
mit der herkömmlichen
Probenplatte besteht darin, dass die Analyse langsam ist, da es
möglich
ist, dass die Probe die Oberfläche
der Probenplatte nicht gleichmäßig abdeckt.
Beim Erstellen von Proben für
MALDI wird typischerweise eine kleine Menge einer Probe mit einer
großen
Menge einer Matrixflüssigkeit
gemischt. Die Mischung wird auf die Probenplatte angeordnet und
es wird ihr Gelegenheit gegeben, sich auf der Probenplattenoberfläche zu verteilen
und zu trocknen. Da die Mischung eine kleine Menge der Probe umfasst,
können
bestimmte Bereiche der Plattenoberfläche gar keine Probe aufweisen,
wenn die Probe trocknet. Daher muss während einer MALDI-Analyse der
Laserstrahl mehrere Spots treffen, um genug Daten von Spots einzusammeln,
die die Probe unterstützen.
Im allgemeinen benötigt
eine MRLDI-Analyse für
eine Probe ein Minimum von 30 Sekunden.
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Das
US-Patent Nr. 5 498 545 beschreibt eine Probenplatte, die physisch
getrennte Probenspots umfasst. Die Probenspots werden entweder durch Ätzen von
mehreren Löchern
in einem Substrat, wie in 1 gezeigt,
oder durch Anordnen von Stiften auf einem Substrat getrennt. Ein
Spotdurchmesser ist im Millimeterbereich. Diese Spots sind in der
Fläche
makroskopisch und viel größer als
die Fläche
des Laserstrahls.
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Die
US-A-5 498 545 lehrt allgemein ein System zum Analysieren von mehreren
Proben. Das System umfasst ein Massenspektrometer zum Analysieren
jeder Probe, wenn sie innerhalb einer Probenaufnahmekammer angeordnet
ist, und eine Laserquelle, die jede Probe mit einem Laserimpuls
trifft, um Probenmoleküle
zu desorbieren und ionisieren. Das System umfasst ebenfalls einen
Probenträger.
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Das
Dokument beschreibt drei unterschiedliche Beispiele von Probenträgern. Der
erste Probenträger
umfasst eine Anzahl von photogeätzten
Wannen. Der zweite Probenträger
umfasst eine Anzahl von Probenspots, die elektroplattierte Bereiche
sind. Jede Probenwanne oder Spot wird mit einem Durchmesser von
1 bis 2,5 mm beschrieben. Der dritte Probenträger umfasst entfernbare senkrechte
Stifte.
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Die
DE-A-42 33 231 lehrt im allgemeinen ein System zum Erfassen und
Quantifizieren von organischen Verbindungen. Das System umfasst
einen Probentisch, auf dem eine oder mehrere Proben aufgebracht
werden können,
eine Lichtquelle zum Bestrahlen der Proben und eine Spektralmessvorrichtung.
Der Probentisch umfasst eine dünne
Schicht, die auf einem Infrarotstrahl reflektierenden Element angebracht
ist. Der dünne
Film kann Stiftlöcher
enthalten, die durch ihn laufen, auf denen eine die Probe enthaltende
Lösung
aufgebracht ist. Die Stiftlöcher dienen
als ein Kern zum Kondensieren der Probe, wobei Diffusion der Probe über den
dünnen
Film verhindert wird. Alternativ kann der dünne Film durch Laserbestrahlung
erzeugte denaturierte Zonen enthalten, auf denen die Lösung aufgebracht
wird.
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Die
EP-A-0 347 579 lehrt im allgemeinen eine Struktur zum Erhalten von
kleinen Mengen einer Substanz. Die Struktur umfasst einen Block
mit einer oder mehreren Vertiefungen und eine Abdeckung mit Erhebungen,
die den Vertiefungen entsprechen. Die Vertiefungen können in
die Oberfläche
des Blocks mittels eines anisotropen Ätzverfahrens geätzt sein. Bei
jedem Beispiel dieses Dokuments ist die Probe in einer Vertiefung
in dem Block angeordnet.
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Die
DE-A-44 08 034 bezieht sich im allgemeinen auf ein Verfahren zur
Massenspektrometrie-Analyse einer Probe, das ein Kontaktieren einer Elektrophoreseplatte
mit einer Transfermembran, d.h. "electroblotting", umfasst. Herkömmliche
Probenplatten und Sonden, die in der Massenspektroskopie-Analyse
beim biologischen Screening als ein Halter für eine Bibliothek von Biopolymeren
oder als eine Platte zur biologischen Synthese oder Analyse verwendet
werden, weise ebenfalls flache Oberflächen, makroskopische Probenspots
oder Wannen auf. Daher existieren einige der Proben, die mit Bezug
auf die MALDI-Probenplatten erläutert wurden, wie
beispielsweise Probendiffusion, kleine Probendichte und verschwendete
Proben, ebenfalls mit diesen Platten.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Erfindungsgemäß wird die
obige Aufgabe durch einen Probenhalter gemäß Anspruch 1, ein System zur
schnellen Analyse einer Mehrzahl von Proben gemäß Anspruch 17 und durch ein
Verfahren zum Analysieren einer biologischen Probe gemäß Anspruch
20 erreicht. Die abhängigen
Ansprüche
beziehen sich auf weitere vorteilhafte Aspekte der Erfindung.
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Bei
einem Aspekt liefert die Erfindung einen Probenhalter, der viele
der Probleme von herkömmlichen
Probenhaltern überwindet.
Der vorliegende Probenhalter trägt
eine Mehrzahl von Proben auf einem kleinen Raum, während eine
physische Trennung dieser Proben ermöglicht wird. Der vorliegende Probenhalter
ermöglicht
ferner, dass jede Probenstelle adressierbar ist, so dass eine selektive
Analyse oder Synthese einer Probe durchgeführt werden kann.
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Der
Probenhalter umfasst ein Substrat, das mikrogefertigt ist, um eine
Vielfalt von mikroskopischen Inseln fest zu legen, die durch mindestens
einen Sumpf getrennt sind. Die mikroskopischen Inseln legen grobe
Trägeroberflächen fest,
und der mindestens eine Sumpf blockiert den Transport von Proben zwischen
benachbarten Probenträgeroberflächen. Bei
einer Ausführungsform
ist der mindestens eine Sumpf eine Mehrzahl von untereinander verbundenen
Sümpfen,
die einen Ablauf bilden, und jeder Sumpf umfasst mindestens ein
Loch zur Drainage. Bei einer weiteren Ausführungsform ist die Mehrzahl von
untereinander verbundenen Sümpfen
auf einer ersten Oberfläche
des Substrats angeordnet, und der Probenhalter umfasst ferner eine
zweite Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen, die auf der zweiten
Oberfläche
des Substrats angeordnet sind. Die zweite Gruppe von untereinander
verbundenen Sümpfen
ist von der ersten Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen versetzt,
so dass sich eine Mehrzahl von senkrechten Löchern bildet, die sich durch
die Dicke des Substrats erstrecken, wobei die erste Gruppe der untereinander
verbundenen Sümpfe
die zweite Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen kreuzt.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform
umfasst die Mehrzahl von Inseln Subinseln, die durch mindestens
einen Subsumpf getrennt sind, der auf der Probenträgeroberfläche angeordnet
ist. Bei noch einer weiteren Ausführungsform ist der Probenhalter
innerhalb der Probenkammer eines matrixunterstützten Laserdesorptionsionisations-Massenspektrometers
angeordnet.
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Bei
einem weiteren Aspekt ist die Erfindung durch ein System zur schnellen
Analyse einer Mehrzahl von Proben gekennzeichnet. Das System umfasst
eine vakuumsteuerbare Kammer, einen Probenhalter zur Anbringung
innerhalb der Kammer zum Halten einer Mehrzahl von Proben, eine
Laserquelle und ein Massenspektrometer. Der Probenhalter umfasst
ein Substrat, das mikrogefertigt ist, um eine Vielfalt von mikroskopischen
Inseln fest zu legen, die durch mindestens einen Sumpf getrennt
sind. Die Inseln legen Probenträgeroberflächen fest,
und der mindestens eine Sumpf blockiert den Transport von Proben
zwischen benachbarten Oberflächen.
Die Laserquelle umfasst Mittel zum Erzeugen und Richten eines Laserstrahls
zum Treffen einer Probe auf einer Probenträgeroberfläche, um Probenmoleküle davon zu
desorbieren und zu ionisieren. Das Massenspektrometer analysiert
Proben auf dem Probenhalter, indem deren Masse erfasst wird. Bei
einer Ausführungsform
ist das optische Mittel ein Mittel zum Richten eines Laserstrahls.
Bei einer weiteren Ausführungsform
umfasst das System ferner einen Mechanismus zum Bewegen des Probenhalters
bezüglich des
Laserstrahls, so dass jede Oberfläche der Probenträgeroberflächen von
einem stationären
Laserstrahl getroffen wird. Bei noch einer weiteren Ausführungsform
umfasst jede Probenträgeroberfläche einen
Oberflächenbereich,
der ungefähr
gleich oder kleiner als der Durchmesser des jede Probe treffenden
Laserstrahls ist.
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Bei
noch einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch ein
Verfahren zum Analysieren einer biologischen Probe aus. Gemäß dem Verfahren
wird ein Probenhalter, der ein Substrat umfasst, das mikrogefertigt
ist, um eine Vielfalt von mikroskopischen Inseln bereitzustellen,
die Probenträgeroberflächen festlegen.
Mindestens ein Sumpf trennt benachbarte Trägeroberflächen und blockiert den Transport
von Proben zwischen benachbarten Oberflächen. Eine Mehrzahl von Proben
wird in Kontakt mit den Probenträgeroberflächen angeordnet, und
ein Analyseschritt wird an der biologischen Probe durchgeführt. Bei
einer Ausführungsform
umfasst der Analyseschritt eine Erfassung durch matrixgestützte Laserdesorptionsionisations-Massenspektrometrie.
Bei einer weiteren Ausführungsform
umfasst der Analyseschritt eine Immunountersuchung. Bei noch einer
weiteren Ausführungsform
umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Anfertigens einer Bibliothek
von Polymeren auf dem Probenhalter, so dass jedes Polymer auf einer
Probenträgeroberfläche angeordnet
ist. Die Bibliothek von Polymeren kann eine Bibliothek von Biopolymeren,
wie beispielsweise von Peptiden, Oligonukleotiden oder Proben zum
biologischen Screening sein.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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Diese
und weitere Vorteile der Erfindung können klarer in bezug auf die
Beschreibung und die Zeichnungen verstanden werden, in denen zeigen:
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1 eine
Querschnittsansicht eines Probenhalters des Stands der Technik;
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2A eine
perspektivische Ansicht einer Ausführungsform des Probenhalters
der Erfindung;
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2B eine
Draufsicht eines Abschnitts des Probenhalters von 2A;
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2C eine
Querschnittsansicht eines Abschnitts des Probenhalters von 2A,
der durch 2C'-2C'' geschnitten ist;
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3A eine
Draufsicht eines Abschnitts einer Ausführungsform des Probenhalters
der Erfindung;
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3B eine
Querschnittsansicht des Probenhalters von 3A, der
durch 3B'-B'' geschnitten ist;
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3C eine
Querschnittansicht des Probenhalters von 3A, der
durch 3C'-C'' geschnitten ist;
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4 die
Blockierung eines Probentransports zu benachbarten Probenträgeroberflächen mit dem
Probenhalter von C;
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5 eine
Draufsicht einer Ausführungsform
des Probenhalters der Erfindung;
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6A eine
Draufsicht eines Abschnitts einer Ausführungsform des Probenhalters
der Erfindung;
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6B eine
Querschnittsansicht des Probenhalters von 6,
der durch 6B'-6B'' geschnitten ist;
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7 eine
hintere Oberfläche
des Probenhalters von 2B;
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8 ein
schematisches Diagramm einer MALDI-Kammer;
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9 ein
Verfahren zum Transferieren von Proben auf den Probenhalter der
Erfindung; und
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10 eine
perspektivische Ansicht einer Ausführungsform des Probenhalters
der Erfindung.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Mit
Bezug auf 2A, 2B, 2C umfasst
ein Probenhalter 10, der in Übereinstimmung mit der Erfindung
aufgebaut ist, ein Substrat 11, das mikrogefertigt ist,
um eine Vielfalt von mikroskopischen Inseln 14 fest zu
legen, die obere Probenträgeroberflächen 13 festlegen.
Der Begriff "Insel" bezieht sich auf
eine Struktur, die von dem Substrat 11 hervorsteht. Eine
Probenträgeroberfläche 13 ist
eine freigelegte Oberfläche
auf einer Insel – typischerweise
im wesentlichen parallel zu der horizontalen Ebene des Substrats 11 -,
im Gegensatz zu Probenhaltern 1 des Stands der Technik
die Proben 2 in den Wannen 3 haltern. Mindestens
ein Sumpf 12 trennt die Oberflächen 13 von benachbarten
Inseln 14. Der Begriff "Sumpf" bezieht sich auf
einen ausgenommenen Bereich zwischen benachbarten Inseln 14.
Der Sumpf 12 ist eine Ausnehmung tiefer als die Oberflächen 13 der
benachbarten Inseln 14. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Sumpf 12 um mindestens 10 μm tiefer. Wie in 4 dargestellt,
blockiert der Sumpf 12 den Transport von Proben zwischen
den Oberflächen 13 der
Inseln 14, indem die wandernde Probe weg von einer Oberfläche 16 zu
einer benachbarten Inseloberfläche 17 gesammelt wird.
Somit läuft
eine auf einer Oberfläche 13 aufgebrachte überschüssige Probe
in den Sumpf 12 ab, und es ist weniger wahrscheinlich,
dass sie sich mit der Probe auf einer benachbarten Oberfläche mischt. Im
allgemeinen neigt eine auf einem Abschnitt einer Oberfläche angeordnete
Probe mit der Zeit dazu, in benachbarte Abschnitte der Oberfläche zu diffundieren.
Mit Bezug auf 2C verbinden sich die Inseln 14 untereinander an
einem ersten Ende 7 durch das Substrat 11. Der
Rest jeder Inse1 14 ist jedoch physisch von den benachbarten
Inseln 14 getrennt. Jede Insel 14 umfasst mindestens
eine freigelegte Oberfläche 13 zum
Tragen einer Probe.
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Bei
einer Ausführungsform
umfassen die Sümpfe 12 mindestens
ein Loch 5 zum Entleeren der Proben, die sich in den Sümpfen 12 sammeln,
weg von dem Probenhalter 10, wie in 2B gezeigt.
Beispielsweise kann ein Vakuum an die Rückseite des Probenhalters 10 angelegt
werden, um das sich in den Sümpfen 12 sammelnde
Material aus den Sümpfen 12 zu
saugen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Sümpfe 12 in
dem Probenhalter 10 untereinander verbunden, um einen Ablauf
zu bilden, wie in 2A, 2B und 2C gezeigt.
Ein Ablauf hindert die Proben besser daran, sich zu den benachbarten
Inseloberflächen 13 zu
bewegen, indem sich die Proben von der Probenträgeroberfläche 13 weg bewegen.
Der Ablauf ist breit genug, um Oberflächenspannung zwischen den Proben
und den Ablaufoberflächen
zu minimieren, um Proben zu veranlassen, hinab zu den Boden der
Sümpfe 12 zu
fließen,
und um die Strömung
der Proben in den Ablauf zum Entleeren zu veranlassen.
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In
den 3A, 3B und 3C entleert bei
einer bevorzugten Ausführungsform
der Probenhalter 30 die in den Sümpfen 32 gesammelten
Proben. Der Probenhalter 30 umfasst eine erste Gruppe von
untereinander verbundenen Sümpfen 32,
die einen ersten Ablauf bilden, und eine zweite Gruppe von untereinander
verbundenen Sümpfen 34,
die einen zweiten Ablauf bilden. Die erste Gruppe von untereinander
verbundenen Sümpfen 32 und
die Probenträgeroberflächen 31 sind
auf der ersten Oberfläche
des Substrats 36 und die zweite Gruppe von untereinander
verbundenen Sümpfen 34 ist
an der zweiten Oberfläche
des Substrats 38 angeordnet. Die zweite Gruppe von untereinander
verbundenen Sümpfen 34 ist
von der ersten Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen 32 versetzt
angeordnet, so dass die erste Gruppe von untereinander verbundenen
Sümpfen 32 die
zweite Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen 34 kreuzt, um
eine Mehrzahl von Löchern 37 zu
erzeugen, die im wesentlichen senkrecht zu dem Substrat sind, und
die sich durch die Dicke des Substrats erstrecken. Bei der in 3A, 3B und 3C gezeigten
Ausführungsform
ist jede Probenträgeroberfläche 31 von
vier Löchern 37 zum
Entleeren der Proben von dem Probenhalter 30 umgeben. Die
Größe und Form
der ersten Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen 32 kann,
muss jedoch nicht die gleich wie der Größe und Form der zweiten Gruppe
von untereinander verbundenen Sümpfen 34 sein.
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Bei
einer weiteren Ausführungsform
umfasst der Probenhalter ein Substrat, das eine Mehrzahl von Probenträgeroberflächen festlegt.
Jede Probenträgeroberfläche wird
von einer Mehrzahl von senkrechten Kanälen umgeben, die sich durch
das Substrat erstrecken, so dass eine auf einer Probenträgeroberfläche angeordnete überschüssige Probe
von der Probenoberfläche
weg durch die Kanäle
abläuft.
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In 10 umfasst
bei noch einer weiteren Ausführungsform
der Probenhalter 80 ein erstes Substrat 82 und
ein zweites Substrat 84, das an dem ersten Substrat 82 befestigt
ist. Das erste Substrat 82 umfasst eine Mehrzahl von Probenträgeroberflächen 86 und
eine Mehrzahl von senkrechten Kanälen 88 benachbart
den Probenträgeroberflächen 86.
Die senkrechten Kanäle 88 erstrecken
sich durch die Dicke des ersten Substrats 82. Das zweite
Substrat 84 umfasst eine Mehrzahl von Sümpfen 90 oder untereinander
verbundenen Sümpfen,
die einen Ablauf festlegen. Die Mehrzahl von Sümpfen 90 des zweiten Substrats 84 sind
in Kommunikation mit der Mehrzahl von vertikalen Kanälen 88 des
ersten Substrats 82.
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Bei
den Ausführungsformen
von 2A, 2B und 2C sind
die Inseln 14 im wesentlichen in Größe und Form identisch, und
die Sümpfe 12 sind
ebenfalls in Größe und Form
identisch. Die Gleichmäßigkeit
in der Größe oder
Form der Inseln 14, der Probenträgeroberflächen 13 oder der Sümpfe 12,
obwohl bevorzugt, ist keine Anforderung der Erfindung. Bei einer
beispielhaften Ausführungsform verändern sich
die Bereiche der Probenträgeroberfläche 13 auf
einem Probenhalter 10 abhängig von einer Eigenschaft
der auf jeder Oberfläche 13 angeordneten
Probe.
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Jede
Insel 14 umfasst einen Probenträger-Oberflächenbereich, der in der Größe mikroskopisch
ist. Der Begriff "mikroskopisch" bezieht sich auf eine
Fläche,
die geringer als etwa 10.000 μm2, vorzugsweise geringer als etwa 5.000 μm2 und am bevorzugsten geringer als etwa 1.000 μm2, und bei vielen Ausführungsformen geringer als 100 μm2 ist. Kleinere Bereiche der Probenträgeroberfläche 13 bieten zusammen
mit engen Abständen
zwischen benachbarten Inseln 14 den Vorteil einer erhöhten Probendichte
auf einem Probenhalter 10. Bei einer Ausführungsform
umfasst der Probenhalter 10 mehr als 1.000 Inseln je cm2 der Substratfläche 11. Bei einer bevorzugten
Ausführungsform
umfasst der Probenhalter 10 mehr als 10.000 Inseln je cm2 von Substratfläche. Die ausgewählte Höhe einer
Insel 14 (oder die Tiefe des Sumpfes 12) hängt teilweise
von dem beabsichtigten Probenvolumen ab, das auf die Probenträgeroberfläche 13 der
Insel 14 anzuordnen ist. Der Begriff "Höhe" bezieht sich auf
einen Abstand von einem ersten Ende 7 zu einem zweiten
Ende 9 einer Insel 14. Die Höhe einer Insel 14 ist
vorzugsweise groß genug,
um die Probe auf der Probenträgeroberfläche 13 daran
zu hindern, sich zu bewegen und die benachbarten Inseloberflächen 13 zu
erreichen. Die Höhe
einer Insel 14 und der Abstand zwischen der Insel und einer
benachbarten Insel 14 legen die Größe des Sumpfes 12 zwischen
den beiden Inseln fest. Bei einer Ausführungsform ist der Abstand
zwischen benachbarten Inseln 14 geringer als etwa 100 μm. Bei bevorzugten
Ausführungsformen
ist der Abstand zwischen benachbarten Inseln weniger als ungefähr 50 μm jedoch
groß genug,
um eine viskose Flüssigkeit daran
zu hindern, den Kanal zwischen benachbarten Inseln zu überbrücken. Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die Sümpfe 12 tief
und schmal, wie es durch den Zustand der Fertigung ermöglicht wird. Die
existierenden Fertigungstechnologien ermöglichen die Erzeugung eines
Sumpfes 12 mit einer Tiefe, die 20 mal größer als
seine Breite ist. Beispielsweise kann ein Sumpf 12 mit
einer Breite von 10 μm eine
Tiefe von bis zu 200 μm
aufweisen. Da Abmessungen eines Sumpfs 12 durch existierende
Fertigungstechnologien begrenzt sind, wird eine größere Tiefe
zusammen mit einer engeren Breite mit den Fortschritten bei derartigen
Technologien erwartet.
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Die
Inseln 14 und die Probenträgeroberflächen 13 sind erfindungsgemäß einzeln
beispielsweise mit einem Laserstrahl adressierbar. Der Probenhalter 10 kann
mindestens zwei oder mehr Bezugspunkte aufweisen, um bei der Identifikation
von Probenstellen zu helfen. Außerdem
ist eine Insel 14 oder eine Probenträgeroberfläche 13 wiederholt
adressierbar, so dass eine mehrfache Analyse oder Synthese an einer
Probe durchgeführt
werden kann, die auf einer bestimmten Probenträgeroberfläche 13 oder einer
Sammlung von benachbarten Oberflächen angeordnet
ist. Bei einer Ausführungsform
bilden die Inseln 14 auf dem Probenhalter 10 ein
Array. Bei der Ausführungsform
von 2A, 2B und 2C bilden
die Inseln 14 ein zweidimensionales Array, und die Probenträgeroberflächen 13 sind
im wesentlichen quadratisch. Erfindungsgemäß können die Probenträgeroberflächen 13 von
jeder Form sein, die ausreicht, um eine Probe zu tragen. Bei der
Ausführungsform
von 5 bilden die Inseln 14 konzentrische
Inseln 14, die Probenträgeroberflächen 13 bilden,
die ringförmig
sind. Dies ermöglicht
eine bestimmte Oberfläche
durch Rotation des Probenhalters 10 und radialer Bewegung
einer Vorrichtung zur Verwendung beim Annähern an eine bestimmte Oberfläche zu adressieren.
Bei der Ausführungsform von 6A und 6B bilden
die Inseln 14 Subinseln 22 auf jeder Probenträgeroberfläche 13.
Die Subinseln 22 werden durch mindestens einen Subsumpf 24 getrennt,
der auf der Probenträgeroberfläche 13 angeordnet
ist. Die Konfiguration umfasst Subinseln 22, die die Anordnung
von mehreren Proben auf einer Probenträgeroberfläche 13 ermöglicht. Die
Subinseln 20 können
ein Array bilden.
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Bei
einer weiteren Ausführungsform
kann eine elektrische Spannung auf spezifische Probenträgeroberflächen des
Probenhalters 10 angewendet werden. Mit Bezug auf 7 umfasst
ein Probenhalter 10 eine Mehrzahl von Ablauflöchern 5,
die sich durch die Dicke des Probenhalters 10 erstrecken.
Jedes Ablaufloch 5 ist in einem Sumpf zwischen zwei oder
mehr benachbarten Inseln angeordnet. Metallanschlüsse 6 sind
auf einer Rückseite 4 des
Probenhalters 10 mikrogefertigt, und jeder Anschluss 6 erstreckt
sich zu einem Ablaufloch 5. Mindestens einige der Probenträgeroberflächen und
die Wände
der Sümpfe
sind metallisiert, so dass die Spannung zu diesen Trägeroberflächen gerichtet
werden kann.
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Viele
Techniken können
die Inseln 14 und die Sümpfe 12 erzeugen.
Bei einer Ausführungsform werden
die Inseln 14 und die Sümpfe 12 durch Ätzen der
Sümpfe 12 erzeugt.
Sowohl isotropische als auch anisotropische Ätzverfahren können verwendet
werden, um die Sümpfe 12 zu
erzeugen, wobei jedoch die anisotrope Ätztechnik bevorzugt ist, da
anisotrope Ätztechniken
imstande sind, tiefe, senkrechte, enge Kanäle zu erzeugen. Anisotrope Ätztechniken umfassen
beispielsweise tiefes reaktives Ionenätzen, Elektronenstrahlätzen und
LIGA (Lithographie-Galvanoformung-Abformung). Diese Ätztechniken
sind in der Technik bekannt. LIGA ist ein Verfahren, das die Fertigung
von dreidimensionalen Strukturen mit hohen Seitenverhältnissen
ermöglicht.
Das Verfahren beinhaltet vier Schritte: Bestrahlung, Entwicklung,
Galvanoformung und Resist-Stripping. Der Bestrahlungsschritt beinhaltet
ein Bestrahlen eines Resists mittels Laser, Elektronenstrahl oder
Röntgenstrahl
von einer Synchrotronstrahlungsquelle. Bei dem Entwicklungsschritt
wird ein Muster in den Resist transferiert, und der Resist wird
geätzt,
um dreidimensionale Strukturen zu offenbaren, die das Resistmaterial
umfassen. Bei dem Galvanoformungsschritt wird eine metallische Form
um die Resiststrukturen durch Elektroplattieren erzeugt. Bei dem
abschließenden
Schritt wird der Resist entfernt, um Kanäle freizulegen. Anisotropes
nasses Ätzen
kann ebenfalls verwendet werden, um die Sümpfe 12 zu erzeugen.
Anisotropes nasses Ätzen
erfordert jedoch eine spezifische Art von Substrat 11.
Beispielsweise muss das Substrat 11 kristallin sein, und
das Ätzen findet
entlang einer spezifischen Achse statt.
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Beim
Fertigen des Probenhalters 10 durch ein Ätzverfahren
wird zuerst ein Substrat 11 bereitgestellt. Bei einer Ausführungsform
umfasst das Substrat 11 ein leitendes Material. Ein leitendes
Material oder eines, das ermöglicht,
dass Ladung zu und von der Probe fließt, ist beispielsweise zum
Fertigen eines MALDI-Probenhalters geeignet. Ein Substrat kann durch
Beschichten eines anorganischen oder organischen Substrats mit einem
leitenden Material leitend gemacht werden. Beispielsweise kann Gold auf
ein nichtleitendes Substrat, gesputtert werden. Alternativ kann
das Substrat 11 ein Metall, ein Glas, ein Kunststoff oder
jedes andere Material umfassen, das zum Tragen einer Probe geeignet
ist. Das Substrat 11 ist strukturiert, um Flächen zu
kennzeichnen, die zu ätzen
sind. Das strukturierte Substrat 11 wird geätzt, um
die Inseln 14 und die Sümpfe 12 zu
erzeugen. Für
die Ausführungsformen,
bei denen der Probenhalter 30 eine erste und eine zweite
Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen 32, 34 aufweist,
wie in 3A, 3B und 3C gezeigt, werden
sowohl eine erste als auch eine zweite Oberfläche des Substrats 11 strukturiert
und geätzt.
Für die
Ausführungsformen,
bei denen die Sümpfe 12 mindestens
ein Loch 5 zum Ablaufen umfassen, wie in 2B gezeigt,
kann ein zusätzlicher Ätzschritt durchgeführt werden,
um die Löcher 5 zu
erzeugen. Beispielsweise können
Löcher
mit Abmessungen von ungefähr
10 μm × 10 μm durch die
Dicke eines Substrats mit einer Dicke in dem Bereich von etwa 25 μm bis etwa
100 μm mittels
LIGA oder Deep-Reactive-Ionenätztechniken
geätzt
werden.
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Bei
einer weiteren Ausführungsform
werden die Inseln 14 auf dem Substrat 11 mittels
einer Mikrofertigungs-Aufbringungstechnologie
gezüchtet,
die in der Technik bekannt ist. Alternativ werden die Inseln 14 mittels
einer Technik erzeugt, die als die " LIGA des einfachen Mannes" bezeichnet wird.
Gemäß dieser
Technik wird eine 30 bis 50 μm
dicke Schicht von Photoresist auf einem Substrat 11 angeordnet,
wie bei einer herkömmlicher
Lithographie strukturiert, um Inseln 14 und Sümpfe 12 fest
zu legen, und mit einem Lösungsmittel
gewaschen. Bereiche, in denen die Photoresists weggewaschen wurden,
definieren Sümpfe 12,
und verbleibende Photoresiststrukturen definieren Inseln 14.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform
können
die Inseln 14 unabhängig
gefertigt und anschließend
an dem Substrat 11 gebondet werden.
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Bei
einer Ausführungsform
umfassen die Probenträgeroberflächen 13 eine
Oberflächenbeschichtung,
die beispielsweise ausgestaltet ist, um die Probenadhäsion an
den Trägeroberflächen 13 zu verbessern,
um selektive Adsorption von Proben in verschiedenen Regionen des
Halters vorzusehen, oder Oberflächeneigenschaften,
wie beispielsweise Benetzungseigenschaften der Oberflächen 13 zu ändern. Beispielsweise
können
kationische oder anionische Teile, Chelatoren, organische Moleküle einschließlich komplexer
Zucker und Heparin, bindende Proteine, wie beispielsweise Antikörper, Avidin
etc., hydrophobische Beschichtungen (z.B. Oktadecylsilan) die Adhäsion oder
Selektivität
der Probe auf der Probenträgeroberfläche 13 verbessern.
Diese können
die Form eines anhaftenden Beschichtungsmaterials annehmen, das
auf den Oberflächen 13 gebondet
oder einfach adsorbiert ist, und können in jeder Form, einschließlich Gele,
Fimbriae und arboriale Beschichtung, sein. Die Beschichtungsschicht
kann wie einige Angström
dünn oder
jede gewünschte
Dicke aufweisen. Jede Beschichtungstechnologie, die Fachleuten bekannt
ist (oder hiernach entdeckt wird), kann verwendet werden, um die
Probenträgeroberflächen 13 zu
beschichten. Die zum Beschichten der Probenträgeroberflächen 13 benutzte besondere
Beschichtungstechnologie bildet nach derzeitigem Verständnis keinen
Aspekt der Erfindung.
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Bei
einer weiteren Ausführungsform
umfassen die Oberflächen
eine MALDI-Matrix eines per se bekannten Typs, die bereit ist, eine
Probe zur Analyse in einem MALDI-Massenspektrometer
aufzunehmen.
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Bei
einer Ausführungsform
sind die Probenträgeroberflächen 13 glatt.
Bei einer anderen Ausführungsform
sind die Probenträgeroberflächen 13 unregelmäßig. Eine
unregelmäßige Oberfläche erhöht den Oberflächenbereich
und somit die Menge der auf der Oberfläche angeordneten Probe. Unregelmäßige Oberflächen verbessern
ebenfalls die Adhäsion
der Probe auf den Probenträgeroberflächen 13 durch Verbessern
der physikalischen Bindung zwischen den Proben und den Oberflächen 13.
Eine Vielfalt von Verfahren kann die Probenträgeroberflächen 13 unregelmäßig machen.
Bei einer beispielhaften Ausführungsform
können
mehrere Ätzschritte
durchgeführt
werden, um Sümpfe
mit abweichender Tiefe zu erzeugen. Der erste Ätzschritt kann Subsümpfe erzeugen,
die 10 μm
tief sind, und der zweite Ätzschritt kann
Sümpfe
erzeugen, die 100 μm
tief sind, so dass jede Insel 14 eine Mehrzahl von Subsümpfen umfasst,
die die Probenträgeroberfläche auf
der Insel 14 unregelmäßig machen.
Bei einer weiteren beispielhaften Ausführungsform wird eine organische
Beschichtung, wie beispielsweise eine fimbriatierte organische Beschichtung
auf den Probenträgeroberflächen 13 aufgebracht.
Eine fimbriatierte organische Beschichtung kann die Belastungsfähigkeit
um das drei- bis fünffache
erhöhen.
Bei noch einer weiteren beispielhaften Ausführungsform werden die Probenträgeroberflächen 13 bei
einem Eloxalverfahren geätzt,
um Poren zu erzeugen, die eine Tiefe von 1 bis 2 μm, einen
Durchmesser von 100 bis 500 Angström, eine Porosität von 50
bis 70% und einen Oberflächenbereich
größer als
100 qm/g aufweisen. Das Eloxalverfahren wird in L.T. Canham, "Biactive Silicon
Structure Fabrication Through Nanoetching Techniques", Advanced Materials,
7:1033 (1995) beschrieben.
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Bei
einer Ausführungsform
kann der Ablauf oder die Oberflächen
der Sümpfe 12 behandelt
werden, um die Benetzungseigenschaften dieser Oberflächen zu
modifizieren. Um die Benetzbarkeit zu verbessern und um es dadurch
Proben zu ermöglichen, sich
zu verteilen und an dem Boden der Sümpfe 12 zu sammeln,
können
die Sumpfoberflächen
beispielsweise mit einem grenzflächenaktiven
Stoff oder einer hydrophobischen Substanz beschichtet sein. Jede
Oberflächenbehandlungstechnologie,
die Fachleuten bekannt ist (oder die hiernach entdeckt wird) kann
verwendet werden, um die Benetzungseigenschaften der Sumpfoberflächen zu
modifizieren. Das besondere Verfahren zum Modifizieren der Benetzungseigenschaften
der Sumpfoberflächen
bildet keinen Aspekt der Erfindung.
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Der
Probenhalter 10 der Erfindung kann verwendet werden, um
eine große
Anzahl von dicht angeordneten Proben zur Verwendung bei eine chemischen
Analyse oder einer biologischen Synthese zu tragen.
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Mit
Bezug auf 8 wird der Probenhalter 10 der
Erfindung als eine Probenplatte bei einer MALDI-Vorrichtung 40 verwendet.
Eine MALDI-Vorrichtung 40 umfasst eine Vakuumkammer 44,
einen Probenhalter 10, der innerhalb der Probe 44 zum Halten
einer Vielzahl von Proben angeordnet ist, eine Laserquelle 46 und
ein Massenspektrometer 48. Die Laserquelle 46 erzeugt
einen Laserstrahl 42 zum Treffen einer adressierten Probe
auf einer ausgewählten
Probenträgeroberfläche 13,
um darin angeordnete Probenmoleküle
zu desorbieren und ionisieren. Das Massenspektrometer 48 analysiert
seriell die Vielzahl von Proben durch Erfassen der desorbierten
und ionisierten Probenmoleküle
an einer entsprechenden Vielfalt von Inseln. Der Probenhalter 10 ermöglicht die
Anordnung einer großen
Anzahl von Proben, die voneinander auf einer kleinen Oberfläche physisch
getrennt sind. Beispielsweise kann ein Probenhalter 10 mit
einer Abmessung von 2 Zoll mal 2 Zoll (4,4 × 4,4 cm) etwa 250.000 Proben
(oder mehr) tragen, wobei jede Probe wirksam auf einer Probenträgeroberfläche 13 einer
Insel 14 oder einer Gruppe von derartigen Trägeroberflächen isoliert
ist. Die für
die Probenträgeroberfläche 13 ausgewählten Abmessungen
können
teilweise von dem Durchmesser des auf eine Probe auftreffenden Laserstrahls 42 abhängen. Bei
einer Ausführungsform
weist jede Probenträgeroberfläche 13 einen
Fläche
auf, die ungefähr
gleich oder geringfügig
kleiner als die Fläche des
Laserstrahls 12 ist, so dass im wesentlichen die gesamte,
auf der Trägerstruktur 14 angeordneten Probe
durch den Laserstrahl 42 beleuchtet wird, wenn die Adresse
genau spezifiziert ist. Der Durchmesser eines gegenwärtig bei
der MALDI-Analyse verwendeten typischen Laserstrahls 42 beträgt ungefähr 100 μm2. Es ist jedoch möglich, den Laserstrahldurchmesser
auf etwa 5 μm2 zu verringern. Alternativ kann ein Laserstrahl
mit kleiner Fläche
verwendet werden, um Spezies auf einer adressierten Insel bei mehreren
Stellen zu desorbieren und ionisieren. Bei einer weiteren Ausführungsform
ist eine Probenträgeroberfläche 13 gefertigt,
um eine kleine Oberfläche aufzuweisen,
um eine Probe auf der Probenträgeroberfläche 13 zu
konzentrieren. Während
einer Trocknungsstufe der Probenherstellung kann sich die Probe überall dahin
verteilen, wo es die Flüssigkeitsmatrix
gibt. Daher kann sich die Probe auf einer größeren Oberfläche auf
eine weitere Fläche
verteilen, wobei eine weniger konzentrierte Probe erzeugt wird, während sich
auf einer kleineren Oberfläche
die Probe auf eine engere Fläche
verteilt, wobei eine konzentriertere Probe erzeugt wird. Die konzentrierte Probe
kann zu MALDI-Spektren mit besserer Auflösung führen.
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Außerdem ermöglicht der
Probenhalter 10 eine Identifikation jeder Probenposition
auf dem Probenhalter 10, so dass jede Probe selektiv adressierbar
ist. Auf diese Art und Weise kann die MALDI-Analyse selektiv an
einer gewünschten
Probe durchgeführt
werden. Die Probenposition bezüglich
des Laserstrahls 42 kann vielfältig eingestellt werden. Bei einer
Ausführungsform
ist der Probenhalter 10 auf einem xy-Tisch angeordnet,
und die xy-Position wird von einem oder mehreren Schrittmotoren
gesteuert, die herkömmlicherweise
mit xy-Tischen verwendet werden. Mit der Computersteuerung der Schrittmotoren
ermöglicht
dieses System, dass jeder ausgewählte
Punkt des Probenhalters 10 genau an dem optischen Pfad
des Laserstrahls 42 positioniert wird. Bei einer weiteren
Ausführungsform
wird herkömmliche
Optik verwendet, um die Richtung des Laserstrahls 42 mit
Bezug auf den Probenhalter 10 zu ändern, wodurch ermöglicht wird,
dass unterschiedliche Probenträgeroberflächen 13 bestrahlt
werden. Verfahren zum Verändern
der Probenposition oder der Laserstrahlposition sind in der Technik
bekannt und sind keine Aspekte der Erfindung.
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Die
Tiefe, Breite und Länge
der Sümpfe 12 hängt von
zahlreichen Faktoren ab, einschließlich der gewünschten
Probendichte an dem Probenhalter 10, dem an jeder Probenträgeroberfläche 13 angeordneten
Probenvolumen und dem minimalen inkrementalen Abstand, bei dem der
Laserstrahl bezüglich den
Probenträgeroberflächen 13 manövriert werden kann.
Ein schmalerer Sumpf 12 (oder kürzerer Abstand zwischen benachbarten
Inseln 14) ermöglicht, dass
eine größere Anzahl
von Inseln 14 auf einem Probenhalter 10 erzeugt
werden können.
Ein kürzerer
Abstand zwischen Inseln 14 führt jedoch ebenfalls zu einem
kleineren Sumpfvolumen, es sei denn, dass der Sumpf 12 tief
ausgeführt
werden kann. Ein kurzer Abstand zwischen Inseln 14 kann
ebenfalls viskosen Flüssigkeiten
ermöglichen,
den Kanal zwischen benachbarten Inseln 14 zu überbrücken. Gegenwärtige Mikrofertigungstechnologien
ermöglichen
die Erzeugung von Kanälen
mit einem Seitenverhältnis
von bis zu etwa 100. Ein Seitenverhältnis bezieht sich auf das
Verhältnis
einer Tiefe zu einer Breite eines Kanals, wobei die Tiefe eine Abmessung
senkrecht zu einem Substrat und die Breite eine kürzeste Abmessung
parallel zu dem Substrat ist. Die aktuelle typische Mikrofertigungstechnologie
ermöglicht
eine Auflösung
bei der Herstellung von Masken und dem Ätzen bis auf etwa 0,1 μm. Daher
beträgt
die untere Grenze für
eine Kanalbreite etwa 0,5 ± 0,1 μm. Da Sumpfabmessungen
durch Fertigungsbeschränkungen
und nicht durch Ausgestaltung begrenzt sind, werden Sümpfe 12 mit
größeren Seitenverhältnissen erwartet,
wenn Fertigungstechnologien voranschreiten. Bei Ausführungsformen,
bei denen die Sümpfe 12 Ablauflöcher 5 aufweisen,
wird durch eine effiziente Entfernung der transportierten Proben
die Notwendigkeit für
tiefere und breitere Sümpfe
vermieden. Bei Ausführungsformen,
die Sümpfe 12 ohne
die Ablauflöcher 5 aufweisen,
müssen
jedoch die Sümpfe 12 groß und tief
genug sein, um diffundierte Proben am Erreichen weiterer Proben
zu hindern, die auf benachbarten Probenträgeroberflächen 13 angeordnet sind.
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Die
MALDI-Analyse mit dem Probenhalter 10 der Erfindung liefert
eine schnelle Analyse einer großen
Anzahl von Proben, indem ermöglicht
wird, dass eine Vielzahl von Proben auf einer kleinen Oberfläche ohne
ineinander zu diffundieren angeordnet werden. Bei einer Ausführungsform
benötigt
die Analyse für
eine Probe weniger als ungefähr
1 Sekunde, wobei jede Analyse ein Beaufschlagen der Probe mit mehr
als ungefähr
10 Laserstrahl-Impulsen umfasst. Bei einer weiteren Ausführungsform
benötigt
die Analyse für
eine Probe weniger als ungefähr
100 ms, wobei jede Analyse ein Beaufschlagen der Probe mit ungefähr 100 Laserstrahl-Impulsen
umfasst.
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Physisch
getrennte unterscheidbare Proben können auf dem Probenhalter 10 mittels
vieler Verfahren beladen werden. Bei einer Ausführungsform werden die Proben,
die mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese getrennt sind, auf
den Probenhalter 10 mittels Elektroblotting oder Elution
geladen.
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Die
zweidimensionale Gelelektrophorese beinhaltet zwei sequentielle
Trennungen, die orthogonal in einem Gelmedium durchgeführt werden,
wobei typischerweise zwei unterschiedliche Trennungskriterien, z.B.
isoelektrisches Fokussieren gefolgt von Gelelektrophorese, genutzt
werden. Das isoelektrische Fokussieren trennt Proteine gemäß der Ladung,
und die Gelelektrophorese trennt Proteine mittels Molekülgröße. Die
zweidimensionale Gelelektrophorese erzeugt ein zweidimensionales
Muster von Spots, wobei jeder Spot typischerweise aus einem spezifischen
Protein besteht. Zweidimensionale Elektrophorese ist in der Technik
bekannt.
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Elektroblotting
beinhaltet den Transfer von Proteinen von dem Gel auf eine andere
Oberfläche mittels
eines elektrischen Stroms, um ihre Wanderung auf einer Art und Weise ähnlich der
ursprünglichen
Elektrophorese, jedoch in einer senkrechten Richtung, zu treiben.
Elektroblotting ist in der Technik bekannt. Herkömmliches Punkt-Blotting kann
ebenfalls verwendet werden, wenn die Oberflächen 13 des Halters
behandelt werden, um eine Probe zu adsorbieren oder absorbieren.
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Für die Elektroblotting-Ausführungsform kann
der Probenhalter 10 eine Vielzahl von Elektroden umfassen,
die während
der Herstellung des Halters 10 mittels herkömmlicher
Festkörperschaltungs-Mikrofertigungstechniken
mikrogefertigt wurden, die ermöglichen,
eine biologische Probe selektiv zu elektroblotten, die in einem
zweidimensionalen Feld, z.B. durch 2D-Elektrophorese, zuvor getrennt wird.
Jede Oberfläche 13 oder
eine Untermenge davon kann ausgestaltet sein, um einzeln adressiert
zu werden, um eine Probe elektrisch anzuziehen oder nicht, wie gewünscht. Die
Proteine oder andere Moleküle
werden auf der Probenträgeroberfläche 13 selektiv
elektrogeblottet, so dass jede auf einer Probenträgeroberfläche 13 angeordnet
wird.
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Bei
einer Elektroblotting-Ausführungsform können die
Probenträgeroberflächen 13 des
Probenhalters 10 eine gesputterte Goldschicht, die als
die Elektroden arbeitet, und eine hydrophobische Beschichtungsschicht
mit einer Mischung aus CH3(CH2)7SH und HS-CH2CO2H, die über
der Goldschicht angeordnet ist, umfassen. Die Mischung stellt Löcher in
der hydrophobischen Beschichtung bereit, so dass der Strom die Goldschichtoberfläche erreichen
kann. Blotting tritt durch Anlegen von Spannung an die Goldschicht
auf. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
findet das Blotting in einer Kammer unter Heliumdruck statt. Diese
Umgebung löst
das durch Elektrolyse an der Goldoberfläche erzeugte Gas auf, das andernfalls
die Elektrophorese behindern würde.
Bei einer weiteren Blotting-Ausführungsform
umfasst der Probenhalter 10 eine mit C18 beschichtete
Silikaplatte. Die Silikaplatte umfasst Löcher, die sich durch die Dicke
der Platte erstrecken, die ungefähr
alle 100 Mikrometer positioniert sind. Das Gel, das getrennte Proteine
umfasst, ist über
der Silikaplatte angeordnet, und eine Spannung wird über die
hintere Oberfläche
des Probenhalters 10 und des Gels angelegt. Der Halter
der Probe 10 umfasst Metallanschlüsse, die auf der hinteren Oberfläche mikrogefertigt
sind. Wenn Proteine seitlich wandern um die Löcher zu erreichen, kontaktieren
sie die Probenträgeroberfläche 13 und
adsorbieren daran. Eine vollständig
flache Oberfläche
würde Kreise
von Analyten um die Löcher
erzeugen.
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9 veranschaulicht
das Eluieren von Proben von einem zweidimensionalen Gel 54 zu
dem Probenhalter 10 der Erfindung. Ein Gitter 52,
das ein zweidimensionales Gel 54 mit getrennten Biopolymer-Molekülen trägt, ist über einem
Probenhalter 10 angeordnet. Eine Lösung 56 läuft durch
das Gitter 52 und den Probenhalter 10, um Biopolymer-Moleküle selektiv
zu eluieren und getrennte Biopolymer-Moleküle auf die Trägeroberflächen 13 des
Probenhalters 10 zu transferieren. Die Lösung 56 wird
von dem Probenhalter 10 durch Laufen durch die Sümpfe 12 und die
Löcher 5 entleert.
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Alternativ
kann ein mikroskopischer Punktdrucker die Proben auf die Probenträgeroberflächen 13 laden.
Bei einer Ausführungsform
umfasst der mikroskopische Druckmechanismus eine robotergesteuerte
Ausgabeeinrichtung, die sich von einer Probenträgeroberfläche 13 zu einer anderen
Oberfläche 13 auf
dem Probenhalter 10 bewegt, wobei eine gewünschte Probe
auf jeder Probenträgeroberfläche 13 aufgebracht
wird. Beispielsweise kann eine Ausgabeeinrichtung eine Mikropipette,
die eine Probe enthält,
und ein Robotersystem, das die Position der Mikropipette bezüglich dem
Probenhalter 10 steuert, umfassen. Die Ausgabeeinrichtung
kann eine Reihe von Mikropipetten oder ein Array von Mikropipetten aufweisen,
um mehrere Proben zu liefern. Bei einer anderen Ausführungsform
umfasst die Ausgabeeinrichtung eine Tintenstrahldruckvorrichtung.
Jedes geeignete Mittel zum Laden einer Probe oder Proben auf dem
Probenhalter 10, das in der Technik bekannt ist, kann in Übereinstimmung
mit der Erfindung verwendet werden. Das US-Patent 5 599 695 beschreibt viele
mikroskopische Druckmechanismen.
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Bei
anderen Ausführungsformen
kann der Probenhalter 10 ebenfalls als ein Substrat bei
proteomer oder genomer Forschung verwendet werden. Die Begriffe "Proteomik" oder "Genomik", wie hier verwendet,
beziehen sich auf die Wissenschaft von Proteinen oder DNAs, um mehrere
unterschiedliche Substanzen mehr oder weniger gleichzeitig zu synthetisieren
oder zu untersuchen. Der Probenhalter 10 der Erfindung
ermöglicht
eine selektive Analyse oder Synthese einer Probe aus einer Vielzahl
von Proben, die auf einem einzigen Substrat angeordnet sind. Der Probenhalter 10 erlaubt
ferner eine wiederholte Adressierung einer auf einer Probenträgeroberfläche 13 angeordneten
Probe zur mehrfachen Analyse.
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Bei
einer Ausführungsform
trennt eine zweidimensionale Gelelektrophorese zuerst biologische Polymere
in einer komplexen Probe, und die getrennten Polymere werden auf
den Probenhalter 10 der Erfindung geblottet. Entweder vor
oder nach dem Blotting wird jedes Polymer zersetzt (digested), um
mehrere Fragmente jedes Biopolymers, z.B. eine Leitersequenz, zu
erzeugen. Die getrennten fragmentierten Proteine oder DNAs werden
dann auf eine von zahlreichen Arten, wie beispielsweise Massenspektrometrie,
analysiert, um beispielsweise ihre Sequenz zu bestimmen.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
wird der Probenhalter 10 der Erfindung als ein Chemiesubstrat
zum Fertigen einer Bibliothek von Polymeren (z.B. PNAs) und genauer
gesagt, einer Bibliothek von Biopolymeren, verwendet. Die Biopolymere
umfassen beispielsweise, wobei sie jedoch nicht darauf begrenzt
sind, Peptide, Oligonukleotide und organische Moleküle. Eine
Bibliothek von Biopolymeren kann beispielsweise angefertigt werden,
indem zuerst mehrere Reaktionsstoffe auf die Probenträgeroberflächen angeordnet
werden, so dass jeder Reaktionsstoff auf einer oder einige wenige
benachbarte Probenträgeroberflächen 13 angeordnet
ist. Die Reaktionsstoffe werden dann unterschiedlichen Monomeren
ausgesetzt, die potentiell mit den Reaktionsteilnehmern wechselwirken.
Die Reaktionsteilnehmer können
beispielsweise Vernetzungsmoleküle
sein. Auf diese Art und Weise kann eine unterschiedliche chemische
Reaktion bei jeder Probenträgeroberfläche 13 beliebig
erzeugt werden. Ein Array, das eine Bibliothek von Biopolymeren
umfasst, kann bei einem Analyseverfahren, wie beispielsweise Hybridisierung
oder Medikamentenscreening, verwendet werden. Das US-Patent 5 605
662 beschreibt mikroelektronische Systeme zum Ausführen von molekularen
biologischen Reaktionen, wie beispielsweise Nukleinsäurehybridisierung,
Antikörper/Antigenreaktionen,
klinische Diagnostik und biopolymere Synthese.
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Bei
noch einer weiteren Ausführungsform umfasst
der Probenhalter 10 Bibliotheken unimolekularer, doppelsträngiger Oligonukleotide,
die auf den Probenträgeroberflächen 13 ausgebildet
sind. Die doppelsträngigen
Oligonukleotiden können
gebildet werden, indem zuerst ein Teil eines Oligonukleotids auf
einer Probenträgeroberfläche 13 angeordnet wird,
und anschließend
der erste Teil einem zweiten Teil des Oligonukleotiden ausgesetzt
wird. Diese Bibliotheken sind bei der pharmazeutischen Forschung für das Screening
von zahlreichen biologischen Proben für spezifische Wechselwirkungen
zwischen den doppelsträngigen
Oligonukleotiden und Peptiden, Proteinen, Arzneimitteln und RNA
nützlich.
Das US-Patent 5 556 752 beschreibt eine Fertigung von unimolekularen
doppelsträngigen
Oligonukleotiden auf einem Substrat.
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Es
ist ersichtlich, dass die gezeigten Ausführungsformen beispielhaft sind
und es beabsichtigt ist, den Schutzumfang der Erfindung nur durch
den Schutzumfang der beigefügten
Ansprüche
einzuschränken.