JPH08509857A - マススペクトロメトリーによるｄｎａ配列決定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＤＮＡの配列決定を行うための新規の方法を開示する。現存するＤＮＡ配列決定技術に勝る改善点は、高速、高処理能力、電気泳動多段階を全く使用しないため電気泳動が不要かつゲル測定人工産物が皆無、そして安定な同位体での数々の置換に係わる高価な試薬が不要であることである。本発明はサンガーの配列決定法を利用し、そして塩基特異的鎖停止化により取得されるネステットフラグメントのそれらの様々な分子量を介する、例えばＭＡＬＤＩもしくはＥＳマススペクトロメトリーのようなマススペクトロメトリーを用いる分析により配列情報を収集する。オリゴヌクレオチドプライマー、鎖停止用ヌクレオシド三リン酸、および／または鎖伸長用ヌクレオシド三リン酸に質量修飾を導入し、そして分子量を質量変異させた標識特異的プローブのハイブリッド形成による多重化を可能にする組込み化化標識配列（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｔａｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を使用することにより更に処理能力を増加させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 マススペクトロメトリーによるＤＮＡ配列決定法発明の背景 遺伝情報は４つのＤＮＡ構造ブロック、デオキシアデノシン−（ｄｐＡ）、デ オキシグアノシン−（ｄｐＧ）、デオキシシチジン−（ｄｐＣ）およびデオキシ チミジン−５’−リン酸（ｄｐＴ）の配列により表されるので、ＤＮＡ配列決定 法は分子生物学およびライフサイエンスにおいて一般的に最も基本的な技術の１ つである。ＤＮＡ配列が容易かつ速く得られることは、組換えＤＮＡ法を通して 新規治療剤ならびに新規かつ有用な様々な植物および微生物を開発および生成す るような関連技術に大きな影響を及ぼすことができる。特にＤＮＡ配列を解明す ることは遺伝疾患、ガンおよびＡＩＤＳを含むヒトの病理症状を理解するのに役 立つ。場合によっては１ヌクレオチド削除、付加または置換のような極めて微妙 な差異が深刻な、致命的な結果を生むこともある。最近、ＤＮＡの配列決定法が ヒトゲノム配列決定プロジェクトの核となる技術になった（例えばJ.E.Bishopお よびM.Waldholz,1991,ゲノム：現代の最も目覚ましい科学的冒険話−ヒト生体の すべての遺伝子地図の試み （Genome:The Story of the Most Astonishing Scien tific Advance of Our Time.The Attempt to Map All the Gene in Human Body . Simaon & Schuster、ニューヨーク）。完全なヒトゲノムＤＮＡ配列の知識は確 実にヒト疾患を理解、診断、防御するために役立つだろう。約３０億塩基対のヒ トゲノムの決定に、合理的な時間枠で、そして経済的に、迅速に、信頼性のある 、高感度にそして低価な方法で、成功裏に取り組むことができるようになるため には、全自動化の可能性を提供できるように開発される必 要もある。本発明はそのような技術を提供する。 将来の方向性および動向と共に今日の方法に関する最近の総説はBarrell（The FASEB Journal 5,40-45(1991)およびTrainor(Anal Chem.62,418-26(1990)）に 記載されている。 現在ＤＮＡの配列決定はMaxamおよびGilbert（Methods in Enzymology 65,499 -560(1980)）の化学的分解法、またはSangerら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,54 63-67(1979)）の酵素ジデオキシヌクレオチド停止法のいずれかで行われている 。化学法では塩基特異的修飾により放射活性の、または放射線標識されたＤＮＡ 断片の塩基特異的開裂を生じる。４つの別個の塩基特異的開裂反応で、４組のネ スティッド［枝分れ(nested)］断片が生成され、これらはポリアクリルアミドゲ ル電気泳動（ＰＡＧＥ）で長さにより分離される。オートラジオグラフィーの後 、ゲル中の各バンド（断片）は塩基特異的開裂により生じているため配列を直接 的に読むことができる。すなわち４つの“ラダー（ladders）”の断片長は直接 ＤＮＡ配列の特定位置を翻訳する。 酵素的鎖停止法では塩基特異的なＤＮＡ断片の４組が、プライマー／鋳型シス テムを開始することにより形成される。このシステムはプライマーを未知のＤＮ Ａ配列領域中で伸長させ、それによって鋳型を複製し、そして相補鎖を鎖停止化 試薬中のＤＮＡポリメラーゼ（大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Th ermus aquatics のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼまたは修飾 Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、シークエナーゼ（Taborら、Proc.Natl.Acad.Sci.US A 84,4767-4771(1987)のような）により合成する。ここで鎖停止は４つの別個の 反応混合物に４つの通常のデオキシヌクレオシド三リン酸、dATP、dGTP、dTTP、 dCTPに 加えて、唯一の鎖停止ジデオキシヌクレオシド三リン酸（ddATP、ddGTP、ddTTP 、ddCTP）を限定された小濃度でそれぞれ取り込む。生成する断片の４組は、Ｄ ＮＡ配列を決定できる４つの塩基特異的ラダーを電気泳動後に形成する。 サンガー配列決定法の最近の応用には、ＤＮＡポリメラーゼ媒介プライマー伸 長反応中に通常使用されるddＮＴＰｓに変えてアルファ−チオｄＮＴＰを使用す ることにより得られるホスホルチオエート−含有ＤＮＡ断片の分解が関与する（ Labeitら、DNA 5,173-177(1986)；アマシャム、ＰＣＴ−出願第GB86/00349号；E cksteinら、Nucleic Acids Res,16,9947(1988)）。ここでは４組の塩基−特異的 配列決定ラダーがエキソヌクレアーゼIIIまたはへビ毒ホスホジエステラーゼで の限定消化により得られ、続いてＰＡＧＥにより分離し、そしてプライマーまた は１つのｄＮＴＰのいずれかを放射線標識して視覚化する。さらなる修飾では、 塩基−特異的開裂が修飾ホスホジエステル結合中の硫黄原子をアルキル化し、そ の後熱処理することにより達成される（Max-Plank-Gesellschaft、独国特許出願 公開第3930312A1号明細書）。両方法ともポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介 してＤＮＡの増幅と組み合わせることができる。 まず最初に配列決定されるＤＮＡは現在シークエンシングできるわずか５００ −１０００ヌクレオチド片に断片化されなければならない。ゲノムから出発して 、これは種々の、および適当なクローニングベクター（ＹＡＣ）コスミド、プラ スミドおよびＭ１３ベクターのような：Sambrookら、モレキュラークローニング ：ア ラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning；A Laboratory Manual）、 コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、1989）を使用するクローニング およびサブクロー ニング法が関与する多工程である。最終的にサンガー配列決定法については約５ ００−１０００塩基対をＭ１３バクテリオファージ誘導体の複製的型Ｉ（replic ative formI:RFI）の特定の制限部位中に組こみ（VieriaおよびMessing,Gene 19 :259(1982)）、そして次に二本鎖状態を一本鎖の環状に転換し、未知のDNA断片 が挿入された制限部位の上流に化学的ＤＮＡ合成により得たユニバーサルプライ マーの結合部位を有するサンガー配列決定法の鋳型として使用する（Shinha,Bie rnat,McManusおよびKoster、Nucleic Acids Res.12.4539-57(1984):米国特許第4 725677号明細書。特別な条件下で、スーパーコイル状の二本鎖プラスミドＤＮＡ 中に組み込まれた未知のＤＮＡ配列はサンガー法により直接シークエンシングで きる（ChenおよびSeeburg,DNA 4、165-170(1985)およびLimら、Gene Anal,Techn.5 ,32-39(1988)、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ＰＣＲ法：方法およ び応用のガイド （PCR Methods:A Guide to Methods and Application,Innisら、 編集、アカデミック出版、サンディエゴ、(1990)）、ＰＣＲにより始めにDNAセ グメントを増幅し、そしてサンガー配列決定法に適用することにより染色体DNA を直接シークエンシングしてクローニングおよびサブクローニング工程が省略で きた（Innisら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,9436-9440(1988)）。しかしこの場 合、目的領域中の知り得るＤＮＡ配列は多くても配列決定プライマーに結合する 程度である。 ＰＡＧＥから配列を読むことができるようにするためには、検出用標識がプラ イマー（最も多くは５’−末端）または１つのデオキシヌクレオシド三リン酸（ ｄＮＴＰ）のいずれかに使用されなければならない。この方法に最も頻繁に使用 されるのは³²Ｐ、³³Ｐ、または³⁵Ｓのような 放射性同位体である。ＰＡＧＥ後、ゲルをＸ−線フィルムに暴露し、銀粒子の露 光を分析する。放射性同位体標識の使用には幾つかの問題がある。配列決定され た断片のオートラジオグラフィー検出に有用なほとんどの標識は比較的半減期が 短く、これは標識の有効性の限界である。高エネルギーベーター照射の放出は（ 特に³²Ｐから）、放射線分解により生成物の分解を引き起こすので、試料は極め て短時間に使用されなければならない。さらに、高エネルギー照射はスクリーニ ングによるバンドの鋭さを無くす。これらの問題はより低いエネルギーの同位体 （³³Ｐまたは³⁵Ｓのような、Ornsteinら、Biotechniques 3,476(1985)）を使用 することにより無くなる場合もある。しかしこれではより長時間の暴露時間に耐 えなければならない。さらにその上、放射性同位は実験者の健康に危険であり、 そして大きな配列決定プロジェクトでは除汚染および放射性廃棄物の取り扱いが 他の深刻な問題および限界となる。 放射線活性標識にかかわる上記の問題で、非−放射線標識法が探査され、そし て最近、部分的に自動化されたＤＮＡシークエンシング法に組み込まれた。すべ てのこれらの改良はサンガー配列決定法を使用する。蛍光標識をプライマーに（ Smithら、Nature 321、674-679(1986)および欧州特許出願公開第87300988.9号明 細書;デュ ポン デ ノモア（Du pon t De Nemours）の欧州特許出願公開第03592 25号明細書;Ansorgeら、J.Biochem Biopys.Methods 13:325-32(1986)）または鎖 停止ジデオキシヌクレオシド三リン酸（Proberら、Science 238:336-41(1987); アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）の国際公開第91/05060号） に付けることができる。プライマーまたはｄｄＮＴＰのいずれかの標識に基づき 、システムがアプライドバイオシステムズ（Smithら、Science 235, G89(1987);米国特許第570973号および689013号明細書）、デュ ポン デノモア（ Proberら、Science 238,336-341(1987)、米国特許第881372号および57566号明細 書）、ファルマシア（Pharmacia）-LKB（Ansorgeら、Nucleic Acids Res.15,459 3-4602(1987)およびEMBL特許出願公開第DE P3724442号およびP3805808.1号明細 書）ならびに日立（Hitachi）（特開平1-90844号公報およびDE401191 A1号）に より開発された。ほぼ同様な方法がBrumbaughら、（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 ,5610-14(1988)および米国特許第4,729,947号明細書）により開発された。レー ン毎に２つの異なる特定標識を有する２つの電気泳動レーンを使用するデュポン システムの改良法が記載されている（PCT出願国際公開第92/02635号）。異なる 方法では蛍光的に標識したアビシンおよびビオチン標識プライマーを使用する。 ここではビオチンで終わる配列決定ラダーが標識アビシンと電気泳動中に反応し 、これにより個々の配列決定バンドの検出が行われる（Brumbaughら、米国特許 第594676号明細書）。 さらに最近では、酵素による化学発光誘導性および増幅性を使用して、より高 感度のＤＮＡ非−放射性標識法が開発された（Beck,OKeefe,CoullおよびKoster,Nucleic Acids Res .17,5115-5123(1989)ならびにBeckおよびKoster、Anal.Chem. 62 ,2258-2270(1990)）。これらの標識法は多様なＤＮＡ配列決定法（Churchら、Science 240,185-188(1988)）と組み合わせて、高処理量のＤＮＡ配列決定法を 目的とした方法を提供する（Kosterら、Nucleic Acids Res Symopsium Ser No.2 4 ,318-321(1991)、ユタ大学、PCT特許出願国際公開第90/15883号）；この方法は 大変繁雑で自動化が困難であるという欠点がある。 ＤＮＡ配列決定を簡単にする試みでは、固体支持体が導入された。こ れまで多くの場合、配列決定（ＰＣＲ増幅を用いて、あるいは用いずに）のため の鋳型の鎖は、固体支持体に多くは強力なビオチン−アビジン／ストレプトアビ ジン相互作用で固定化される（Orion-Yhtyma Oy、米国特許第277643号明細書:M. Uhelnら、Nucleic Acids Res.16:3025-38（1988）;Cemu Bioteknik、PCT出願国 際公開第89/09282号明細書および英国、医学研究協会、PCT出願国際公開第WO92/ 03575号）。固定化された鋳型の鎖上で合成されたプライマー伸長生成物を酵素 、他の配列決定試薬および副生物から洗浄工程により精製し、そして次に変性条 件下でワトソン−クリック塩基対間の水素結合を失うことにより遊離し、そして ＰＡＧＥ分離に供する。異なる方法では、ＤＮＡ配列決定反応のプライマー伸長 生成物（鋳型ではない）をビオチン／およびアビジンを介して支持体に結合させ る（デュ ポン デ ノモア、PCT出願国際公開第91/11533号）。上述の方法とは対 照的に、これはビオチンおよびアビジン間の結合が使用する変性条件（ホルムア ミド／ＥＤＴＡ）に耐え、シークエンシング反応のプライマー伸長生成物を固体 から遊離し、そしてＰＡＧＥ分離に供される。固体支持体として、ビーズ（例え ば磁気ビーズ(Dynabeads)）およびSepharose Besds）、フィルター、毛細管、プ ラスチック計深棒（例えばポリスチレン製棒）およびマイクロタイターウェルが 薦められる。 これまで述べたすべての方法には共通の核となる工程があり、それはポリアク リルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）である。多くの場合、これはこれらの各々 の方法の主要な欠点および制限を表す。重合による均一なゲルの調製、試料の添 加、電気泳動自体、配列決定パターンの検出（例えばオートラジオグラフィーに より）、ゲルの取り出しおよび他の ゾルを作成するためのガラスプレートの洗浄は大変繁雑で、時間がかかる方法で ある。さらに全工程で誤りが起こりがちであり、自動化することが困難で、そし て再現性および信頼性を向上するために高度に訓練された技術者が必要である。 放射性標識の場合は、オートラジオグラフィーそれ自体が数時間から数日を必要 とする。蛍光標識の場合には、すくなくとも配列決定バンドは、市販されている ＤＮＡシークエンサーに組み込まれたレーザースキャンニングデバイスを使用し て自動的に行なわれる。蛍光標識に関連した１つの問題は、断片の電気泳動の移 動度に対する４つの異なる塩基−特異的蛍光タグの影響、そして４つの異なる染 料がバンド幅で重なる可能性から隣接バンド間の識別力を減少させ、したがって 配列があいまいになる可能性が増す。ポリアクリルアミドゲルとの塩基−特異的 な相互作用によりアーティファクトも生じ（Frankお よびKoster,Nucleic Acid s Res .6,2069(1979)）、“バンドの圧縮”を起こす第二構造物の形成により、配 列を読むことができない。この問題は部分的には７−デアザデオキシグアノシン 三リン酸を使用することにより克服された（Barrら、Biotechniques 4,428(1986 )）。しかし幾つかのアーティファクトおよび顕著なバンドの理由は未だに調査 されており、さらにゲル電気泳動法の改良が必要である。 最近の電気泳動における革新はキャピラリーゾーン電気泳動法（ＣＺＥ）（Jo rgensonら、J.Chromotography 352,337(1986):Gestelandら、Nucleic Acids Res 18 1415-1419(1990)）であり、これはスラブゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）と比較 すると、分離の解像度が有意に上昇し、電気泳動時間を短縮し、そして極めて少 量の試料の分析が可能である。しかし全体の系の縮小化ゆえに、壁の影響（wall effect）および高感度な連続 的検出法の必要性というような別の問題が生じる。ＰＡＧＥに較べて、もう１つ の欠点は、ＣＺＥが“１レーン”法であるという事実であり、一方ＰＡＧＥは同 時に多くのレーンを電気泳動する。 ＰＡＧＥをＤＮＡ配列決定法に絶対に必要な、そして中心的部分として行うこ とに関連する深刻な限界および問題から、幾つかの方法では電気泳動工程を行わ ずにＤＮＡ配列決定を行うことが提案されている。１つの方法はハイブリダイゼ ーションまたは断片化シークエンシング（Bains,Biotechnology 10,757-58(1992 )およびMirzabekovら、FEBS Letters 256,118-122(1989)）と呼び、既知の短い オリゴヌクレオチド（例えば65,536種類の配列を与えるオクタデオキシヌクレオ チド）の相補的ＤＮＡ配列に対する特異的なハイブリダイゼーションを利用する 。陽性のハイブリダイゼーションは未知の配列の短い広がりを明らかにする。す べての可能なオクタデオキシヌクレオチドでハイブリダイゼーションを行うこと によりこの方法を反復すると、理論的には配列を決定できるはずである。全く異 なる方法は、１つの一本鎖、固定ＤＮＡ断片をエキソヌクレアーゼにより流動蒸 気中で一方向に分解し、そして開裂ヌクレオチドをレーザー励起を介してそれら の特異的な蛍光タグを検出する、迅速なＤＮＡ配列決定がある（Jettら、J.Biol .Chem.Biomolecular Structure & Dynamics 7,301-309(1989);米国エネルギー省 、PCT出願国際公開第89/03432号）。Hyman（Anal.Biochem.174,423-436(1988)に より別のシステムも推薦され、プライマー-鋳型系で正しいヌクレオチドが伸長 している鎖に付加したとき、生成したピロリン酸をＤＮＡ配列を決定するために 使用する。使用する酵素およびＤＮＡは固体（DEAE-SepharoseおよびSepharose ）にイオン的相互作用または共有結合により位置を固 定されている。連続的な流動系ではピロリン酸の量が生物発光（ルシフェラーゼ ）を介して測定される。ＤＮＡ配列の合成的方法もTsienら（PCT出願国際公開第 91/06678号）に使用されている。これでは入って来るｄＮＴＰを3'-末端でアセ チルまたはリン酸基のような種々のブロッキング基により保護し、そして次の伸 長が起こる前に除去するが、これはこの方法を他の標準的手法と比較すると大変 遅くする。鋳型ＤＮＡはポリマー支持体に固定化する。取り込みを検出するため に、蛍光または放射活性標識を付加的に修飾ｄＮＴＰに取り込む。同特許出願は この方法を自動化する装置も記載している。 一般的にマススペクトルメトリーは分子を真空中でイオン化し、そして揮発さ せることにより“飛ばし”て個々の分子の“質量を計る”。電場および磁場の組 み合わせの影響下で、イオンがその個々の質量（ｍ）および荷電（ｚ）に依存し た軌道を流れる。低分子量をもつ分子の範囲ではマススペクトルメトリーは長い 間、親の分子イオンの質量を測定することにより有機分子を分析および特性決定 するための日常的な物理−有機分野のレパートリーであった。さらにこの親の分 子イオンを他の粒子（例えばアルゴン原子）に衝突させることにより、分子イオ ンが断片化し、いわゆる衝突誘導解離（collision induced dissociation:ＣＩ Ｄ）により第二イオンを生成する。断片化パターン／経路は、しばしば詳細な構 造の情報を与える。マススペクトルメトリー法の多くの応用は当該技術分野で周 知でありMethods in Enzymology、第193巻、“マススペクトルメトリー”（J.A. McCloskey、編集）、1990、アカデミック出版、ニューヨーク）に要約されてい る。 高検出感度、マス分析の正確さ、ＣＩＤとＭＳ／ＭＳ配置を組み合わ せることによる詳細な構造的情報、ならびにコンピューターへのデーター移動の オンライン化を提供するマススペクトルメトリーの明らかな分析的利点から、マ ススペクトルメトリーの核酸の構造分析への使用はかなり興味深い。この分野を 含む最近の総説はK.H.Schram“核酸成分のマススペクトルメトリー、マススペク トルメトリーの医学への応用、（Mass Spectrometry of Nucleic Acid Componen ts,Biochemical Application of Mass Spectrometry）”34 203-287(1990);およ びP.F.Crain,“核酸研究でのマススペクトルメトリー法（Mass Spectrometric T echniques inNucleic Acid Research）”Mass Spectrometry Review 9,505-554( 1990)である。マススペクトルメトリーを核酸に応用するための最大の障害はこ れらの極めて極性の生体高分子を揮発させる難しさである。したがって“配列決 定法”は、親分子イオンの質量を測定することによる低分子量のオリゴヌクレオ チドに限られ、これを通してすでに既知の配列の確認し、または既知の配列を第 二イオンの生成を通して（断片イオン）（特にイオン化および揮発のために高速 原子爆発（ＦＡＢマススペクトルメトリ）またはプラズマ脱着（ＰＤマススペク トルメトリー）法を使用するＭＳ／ＭＳ配置でのＣＩＤを介して）確認する。化 学合成オリゴデオキシヌクレオチドについて保護された二量体ブロックを分析す るためのＦＡＢの応用は記載されている（Kosterら、Biomedical Environmental Mass Spectrometry 14、111-116(1987)）。 さらに２つのイオン化／脱着法は電気スプレー／イオンスプレー（ＥＳ）およ びマトリックス−補助レーザー脱着／イオン化（ＭＡＬＤＩ）である。ＥＳマス スペクトルメトリーはFennら（J.Phys,Chem.88,4451-59(1984);PCT出願国際公開 90/14148号）に紹介され、現在の応用は最新の 総説（R.D.Smithら、Anal.Chem.62,882-89(1990)およびB.Ardrey、電気スプレー マススペクトルメトリー、Spectroscopy Europe 4，10-18(1992)）に要約されて いる。２１-merのｄ（ＡＡＡＴＴＧＴＧＣＡＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣ）（配列番 号２）のテトラデカンヌクレオチドｄ（ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＴＧ）（配列 番号１）（Coveyら、“イオンスプレーマススペクトルメトリーによるタンパク 質、オリゴヌクレオチドおよびペプチドの分子量決定（The Determination of P rotein,Oligonucleotide and Peptide Molecular Weigth by Ionspray Mass Spe ctrometry）”Rapid Communications in Mass Spectrometry,2,249-256(1988)） の分子量、および詳細ではないが７６ヌクレオチドのｔＲＮＡ（Methods in Enz ymology ,193,“マススペクトルメトリー”（McCloskey、編集）、第425頁、1990 、アカデミック出版、ニューヨーク）の分子量は報告されている。マス分析機は 四重極がもっともよく使用されている。フェントモル量の試料の分子量決定はす べてを質量の計算に使用できる多イオンピークの存在により極めて正確である。 対照的にＭＡＬＤＩマススペクトルメトリーは、飛行時間（time of flight(T OF)）配置がマス分析機に使用されたとき、大変魅力的となる。このＭＡＬＤＩ- ＴＯＦマススペクトルメトリーはHillenkampら（“マトリックス補助ＵＶ-レー ザー脱着／イオン化：巨大生体分子への新しいマススペクトルメトリー法（Matr ix Assisted UV-Laser Deposition/ionization;A New Approach to Mass Spectr ometry of Large Biomolecules）”Biological Mass Spectrometry（Burlingame およびMacCloskey、編集）、Elsevir Science出版、アムステルダム、第44-60頁 、1990）。ほとんどの場合、この方法では多イオンピークを生成しないので、マ スス ペクトルは特に、ＥＳマススペクトルメトリーと比較すると単純に見える。しか し分子量が最高410,000ダルトンまでのＤＮＡ分子は、脱着および揮発すること ができたが（Williamsら、“凍結水溶液のパルスフィールドレーザーアブレーシ ョンによる高分子量DNAの揮発（Volatilization of High Molecular Weight DNA by Plused Field Laser Ablation of Frozen Aqueous Solution）”Science 24 6,1585-87(1989)、この技術はこれまで既知の比較的小さな（例えば最高１８ヌ クレオチドのオリゴチミジル酸）オリゴヌクレオチド（Huth-Fehrｅら、“オリ ゴデオキシシミジル酸のマトリックス補助レーザー脱着マススペクトルメトリー （Matrix Assisted Laser Deposition Mass Spectrometry of Oligodeoxythymid ilic Acids）”Rapid Communications in Mass Spectrometry,6,209-13(1992)） 、および２８塩基対の二本鎖（Williamsら、凍結水性マトリックスからのレーザ ーアブレーションおよびイオン化による核酸の飛行時間マススペクトルメトリー （Time-of-Flight Mass Spectrometry of Nucleic Acids by Laser Ablation an d Ionization fromａFrozen AqueouｓMatrix）”Rapid Communications in Mass Spectrometry ,4,348-351(1999)）の分子量を決定するために使用されただけで あった。１つの報告（Huth-Fehreら、1992、同上）では、ｎ＝１２からｎ＝１８ のすべてのオリゴチミジル酸混合物が解析できた。 米国特許第5、064、754号明細書では、ＤＮＡにより伸長したＲＮＡ転写物（両 方がシークエンシングされるDNAに相補的である）が、ＮＴＰ、ｄＮＴＰおよび 停止ヌクレオチドとしてddNTP（これは糖部分の5'位が¹²Ｃ、¹³Ｃ、¹⁴Ｃ、¹Ｈ、² Ｈ、³Ｈ、¹⁶Ｏ、¹⁷Ｏおよび¹⁸Ｏの１つまたは組み合わせにより置換されている ）を取り込むことにより調製される。得 られたポリヌクレオチドは3'-ヌクレオチドを分解し、N-グリコシル結合を開裂 し、そして過ヨウ素酸塩酸化により放射線標識5'-の官能基を除去し、生成した ホルムアルデヒド種をマススペクトルメトリーで決定する。特別な放射性同位体 の組み合わせは、NTPおよびdNTPの取り込みから生じる内部ヌクレオチドと、ポ リヌクレオチド鎖の末端にｄｄＮＴＰを結合することにより生じた末端ヌクレオ チドとのヌクレオチド間を塩基−特異的に識別するのに役立つ。一連のＲＮＡ／ ＤＮＡ断片が生成され、そして１つの態様では電気泳動で分離され、そしていわ ゆるマトリックス法で配列が推定される。 特開昭59-131909号公報では電気泳動、液体クロマトグラフィーまたは高速ゲ ル濾過により分離された核酸断片を検出する装置を記載している。マススペクト ルメトリーの検出は通常天然にはＤＮＡ中に検出されないＳ、Ｂｒ、ＩまたはＡ ｇ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｏｓ、Ｈｇを核酸に取り込むことにより達成される。しかしこ の方法はサンガー法によりＤＮＡをシークエンシングする方法には応用されない 。特にそのような元素と個々のｄｄＮＴＰとの塩基−特異的相互関係を提案して いない。 ＰＣＴ出願国際公開第89/12694号（Brennanら、Proc.SPIE-Int.SOc.Pot.Eng.1 296(New Technol.Cytom.Mol.Biol.),pp60-77(1990):およびBrennan、米国特許第 5,003,059号明細書）は、³²Ｓ、³³Ｓ、³⁴Ｓ、³⁶Ｓまたは、³⁵Ｃｌ、³⁷Ｃｌ、⁷⁹ Ｂｒ、⁸¹Ｂｒのいずれかの４つの安定な同位体の組み合わせを使用することによ り鎖停止ｄｄＮＴＰを特別に標識して、ＤＮＡ配列決定にサンガー法を使用する 。硫黄同位体は塩基または三リン酸部分のアルファ−位に、一方ハロゲン同位体 は塩基または糖環の3'-位に位置している。配列決定反応混合物はＣＺＥのよう な電気泳動に より分離され、燃焼ユニットに移され、その中で取り込まれたｄｄＮＴＰ中の硫 黄同位体は酸素環境下で約９００℃に転換される。６４、６５、６６または６８ の質量で生成したＳＯ2は、例えばイオン電流を検出するための１つのイオン− マルチプライヤー（ion-multiplier）を装備した四重極のマス分析機を使用して マススペクトロメトリーによりオンライン決定される。 同様な方法が米国特許第5,002,868号明細書（Jacobsonら、Proc．SPIE-Int.So c.Opt.Eng .1435（Opt.Method Ultrasensitive Detect,Anal.Tech.Appl.,26-35(1 991)）中に記載され、これは特別に三リン酸部分のアルファ−位を上記のような ４つの安定な硫黄同位体で置換したｄｄＮＴＰを用いたサンガー配列決定法を使 用し、引き続き４つのネスティッド配列を試験管ゲル電気泳動により分離する。 唯一異なるのは共鳴イオン化分光法（ＲＩＳ）を磁気セクターマス分析機と組み 合わせ（米国特許第4、442、354号明細書のように）、特別なヌクレオチド停止に 対応する硫黄同位体を検出し、これによりＤＮＡ配列の評価を可能にする。 欧州特許出願公開第0360676号および同0360677号明細書も，ｄｄＮＴＰ中の安 定な同位体置換（Ｄ、¹³Ｃ、¹⁵Ｎ、¹⁷Ｏ、¹⁸Ｏ、³²Ｓ、³³Ｓ、³⁴Ｓ、³⁶Ｓ、¹⁹Ｆ 、³⁵Ｃｌ、³⁷Ｃｌ、⁷⁹Ｂｒおよび¹²⁷Ｉ）ならびにＣＦ₃またはSi（ＣＨ₃）₃のよ うな官能基を化学的官能性に基づき塩基、糖または三リン酸部分のアルファ位を 利用するサンガー法を記載する。サンガー配列決定反応混合物は試験管ゲル電気 泳動により分離する。流出物を電機スプレー／熱スプレー噴霧法によりエアゾー ルとし、そして次にプラズマ（7000-8000°Ｋ）により原子化およびイオン化し 、そして簡単なマス分析機で分析する。このサンガー反応混合物の分析を自動 化できるとして提案された装置は試験管電気泳動、噴霧器およひきマス分析機か ら成る。 ハイブリダイゼーション／断片化法（上記）によりＤＮＡ配列決定を行うマス スペクトロメトリーの応用が最近提案された（Brains,“マススペクトロメトリ ーによるDNAの配列決定:将来的に可能性のある応用の概要“Chimicaoggi 9,13-1 6(1991)。発明の要約 本発明はＤＮＡを配列決定するための新規方法に関する。現存するＤＮＡ配列 決定法に較べて改良された点は、高速、高処理量、電気泳動の必要性が無く（そ してすなわち、電気泳動工程が全く無いのでゲルのアーティファクトを読む事が 無い）、ならびに安定な同位体で種々の置換を行うので高価な試薬が必要ない。 本発明はサンガー配列決定法、ならびにマススペクトロメトリーを使用して（例 えばＭＡＬＤＩまたはＥＳマススペクトロメトリー）種々の分子の質量を介する 塩基−特異的な鎖停止法により得られるネスティッド断片の分析による配列情報 の集積を使用する。さらにこのオリゴヌクレオチドプライマー中にマス修飾を取 り入れることにより処理量を増大することができ、鎖−停止ヌクレオシド三リン 酸および／または鎖伸長ヌクレオシド三リン酸ならびに組み込みタグ配列を使用 して、分子量を変えた質量をもつタグ特異的プローブのハイブリダイゼーション により多重化を可能とする。図面の簡単な説明 第１図はマススペクトロメトリーにより分析される試料の生成法を示している 。この方法は未知の配列のＤＮＡ断片を、Ｍ１３誘導体、ｐＵＣまたはファゲミ ド（phagemid）のようなクーニングベクター中へ挿入 し、二本鎖状態を一本鎖状態に転換し、４つサンガーの配列決定反応を行い、塩 基-特異的停止ネスティッド断片の一族を一時的に固体支持体に結合し、洗浄工 程によりすべての副生物を除去し、ネスティッドＤＮＡまたはＲＮＡ断片を例え ば陽-イオン交換または修飾試薬によりコンディショニングし、そして固定化し たネスティッド断片を直接的にマススペクトロメトリー分析に与えるか、または 生成した断片族を支持体から開裂させて開裂試薬を蒸発させることを必要とする 。 第２Ａ図は５０ヌクレオチド長（配列番号３）の仮想のＤＮＡ断片の停止デオ キシヌクレオシド三リン酸としてｄｄＴＴＰを約等量的に平衡化した塩基組成物 と一緒に使用するサンガー配列決定生成物を示す。様々な鎖停止断片の分子の質 量を与える。 第２Ｂ図はそのようなＤＮＡ断片混合物の理想的なマススペクトルを表す。 第３Ａおよび３Ｂ図は第２Ａおよび２Ｂと同様に、ｄｄＡＴＰを鎖停止剤とし て使用した同じモデル配列（配列番号３）のデータを表す。 第４Ａおよび４Ｂ図は第２Ａおよび２Ｂと同様にｄｄＧＴＰを鎖停止剤として 使用したときの同じモデル配列（配列番号３）のデータを表す。 第５Ａおよび５Ｂ図は第２Ａおよび２Ｂと同様に、鎖停止がｄｄＣＴＰを鎖停 止剤として使用したときの同じモデル配列（配列番号３）のデータを表す。 第６図は第２Ａから５Ｂの結果を要約し、４つのネスティッド断片族とＤＮＡ配 列（配列番号３）との間の分子量の相関を示す。 第７Ａおよび７ＢはサンガーＤＮＡまたはサンガーＲＮＡ配列決定のいずれか のための、質量−修飾配列決定核酸プライマーまたはタグ配列 決定プローブの一般的構造を説明する。 第８Ａおよび８Ｂ図はサンガーＤＮＡまたはサンガーＲＮＡ配列決定のいずれ かのための、質量−修飾三リン酸の一般的構造物を表す。鎖−伸長および鎖−停 止ヌクレオシド三リン酸を示している。 第９図は様々な結合化学（Ｘ）を、ポリエチレングリコールまたは三級モノア ルキル化ポリエチレングリコール（Ｒ）を例として説明する。 第１０図は第８Ａおよび８Ｂ図に示すような同様な結合化学を説明し、そして 種々のマス修飾部分（Ｒ）を表す。 第１１図は多重マススペクトロメトリー配列決定法がどのようにして作用する かを質量−修飾核酸プライマー（ＵＰ）を使用して概説する。 第１２図は質量−修飾鎖−伸長および／または停止ヌクレオシド三リン酸を使 用して多重マススペクトロメトリー配列決定法の工程を表す。 第１３図は質量−修飾タグ配列特異的プローブのハイブリダイゼーションが関 与する多重マススペクトロメトリー配列決定法を表す。 第１４図はオリゴチミジル酸、ｄ（ｐＴ）_12-18混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＥ スペクトルを表す。 第１５図は５０−ｍｅｒの（配列番号３）（５００ｆｍｏｌ） およびｄＴ（ｐｄＴ）９９（５００ｆｍｏｌ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＥスペクトル の重複を示す。 第１６Ａ−１６Ｍ図はすべての１３ＤＮＡ配列のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクト ルを表し、第２図のサンガーＤＮＡ配列決定模擬実験のネスティッドｄＴ−停止 断片を表す。それぞれ５００ｆｍｏｌの以下のものを表 す。１６Ａは７−ｍｅｒ；１６Ｂは１０−ｍｅｒ；１６Ｃは１１−ｍｅｒ；１６ Ｄは１９−ｍｅｒ；１６Ｅは２０−ｍｅｒ；１６Ｆは２４−ｍｅｒ；１６Ｇは２ ６−ｍｅｒ；１６Ｈは３３−ｍｅｒ；１６Ｉは３７−ｍｅｒ；１６Ｊは３８−ｍ ｅｒ；１６Ｋは４２−ｍｅｒ；１６Ｌは４６−ｍｅｒそて１６Ｍは５０−ｍｅｒ である。 第１７Ａおよび１７Ｂ図は第１６図のスペクトルの重複を表す。２つのパネル は２つの異なるスケールおよびそのスケールで分析したスペクトルを表す。第１ ７Ａ図は１６Ａ−１６Ｆのスペクトルの重複を表す。各ピーク上の文字は第１６ 図の断片のもとのスペクトルに対応する。例えばピークＢは第１６Ｂ図、ピーク Ｃは第１６Ｃ図、等である。 第１８図は実施例２１に記載した質量−修飾オリゴヌクレオチドのＭＡＬＤＩ −ＴＯＦ分析からの重複ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表す。 第１９図は強力な静電的相互作用を介する固体支持体（Ｐ）と核酸プライマー （ＮＡ）間の種々の結合化学を説明する。 第２０Ａおよび２０Ｂ図は電荷移動受容体（Ａ）および電荷移動供与体（Ｄ） 間の電荷移動複合体を介する固体支持体（Ｐ）と核酸プライマー（ＮＡ）間の種 々の結合化学を説明する。 第２１図は安定な有機基を介する固体支持体（Ｐ）と核酸プライマー（ＮＡ） 間の種々の結合化学を説明する。 第２２図はワトソン−クリック塩基対を介する固体支持体（Ｐ）と核酸プライ マー（ＮＡ）間の可能な結合化学を説明する。 第２３図は光分解的（photolytically）開裂性結合を介する固体支持体（Ｐ） と核酸プライマー（ＮＡ）間の可能な結合化学を説明する。発明の詳細な説明 本発明はＤＮＡの改良された配列決定法を記載する。特に、本発明はマトリッ クス−補助レーザー脱着／イオン化（ＭＡＬＤＩ）またはエレクトロスプレー（ ＥＳ）マススペクトロメトリー（ＭＳ）のようなマススペクトロメトリーを使用 してサンガー反応混合液を分析する。 サンガー配列決定法は、４つの鎖−停止断片族が得られる。このヌクレオチド 付加あたりのマス差はそれぞれｄｐＣは289.19、ｄｐＡは313.21、ｄｐＧａ329. 21そしてｄｐＴは304.2である。 １つの態様では、４つの塩基−特異的停止断片族の別個の分子量測定を通して 、ＤＮＡ配列を４つの別個の実験の分子量ピークの重複（例えば補間）により行 うことができる。別の態様では４つの特異的停止断片族の分子量を、少なくとも ２つの別個の反応容器中で反応したすべての４つの反応を混合するか（すなわち 、すべてを別個に行う、または２つを一緒に行う、あるいは３つを一緒に行う） 、あるいはすべての４つの鎖−停止ヌクレオチド（例えばｄＴＴＰ、ｄｄＴＴＰ 、ｄＡＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄｄＧＴＰを含ん で成る反応混合物）を有する反応を１つの反応容器中で行うかのいずれかにより 、ＭＳで決定できる。すべての４つ塩基−特異的停止反応生成物を同時に分析す ることにより、その結果、分子量値は補完される。測定された断片間の質量差を 鎖−停止ヌクレオチド中の既知のマスと比較して、配列の評価を行うことができ る。場合によっては質量を上記のように修飾して、鎖−停止ヌクレオチドの各ヌ クレオチド間の分子量に差をつけることもできる。当業者には鎖−停止ヌクレオ チドの質量−修飾が望ましく、かつ例えば使用される特定のスペクトロメーター の解像能に依存しうる ことが明らかである。例として、使用する特定のスペクトロメーターによりお互 いが分解され得る分子量を有するように、ｄｄＣＴＰ¹、ｄｄＡＴＰ²およびｄｄ ＧＴＰ³がマス−修飾された４つの鎖停止ヌクレオチド、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴ Ｐ¹、ｄｄＡＴＰ²およびｄｄＧＴＰ³を生成するのが望ましいかもしれない。 鎖−伸長ヌクレオチドおよび鎖−停止ヌクレオチドという用語は当該技術分野 で周知である。ＤＮＡについては、鎖−伸長ヌクレオチドは2'-デオキシリボヌ クレオチドを含み、そして鎖−停止ヌクレオチドは2',3'-ジデオキシリボヌクレ オチドを含む。ＲＮＡについては、鎖−伸長ヌクレオチドはリボヌクレオチドを 含み、そして鎖−停止ヌクレオチドは3'-デオキシリボヌクレオチドを含む。ヌ クレオチドという用語も当該技術分野で周知である。本発明の目的のために、ヌ クレオチドはヌクレオシド モノ−、ジ−およびトリホスフェイトを含む。ヌク レオチドはホスホロチオエートヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドも含む。 現在使用されている数種の試料を平行して処理できるスラブゲル気泳動とは対 照的にマススペクトルメトリーは連続的な方法なので、別の態様では１以上のＤ ＮＡまたはＲＮＡ断片を同時に配列決定するために多マススペクトルメトリーＤ ＮＡ配列決定によりさらに改良することができる。さらに詳細に以下に記載する ように、あらかじめ定めた様式で配列決定される特定のＤＮＡまたはＲＮＡ種の 塩基−特異的停止断片の分子量をシフトさせるように、質量−修飾核酸配列決定 プライマーまたは鎖−伸長および／または停止ヌクレオシド三リン酸を採用して １ヌクレオチド付加毎に約３００質量単位の範囲を使用することができる。初め てで、数種の配列決定反応を平行してマススペクトロメトリー分析すこ とができる。本発明の別の態様では、多重マススペクトルメトリ−ＤＮＡ配列決 定を、各断片族内の特別なタグ配列とハイブリダイズする特異的なオリゴヌクレ オチド（タグプローブ）を介して断片族の質量を修飾することにより行うことが できる。別の態様ではプローブはマススペクトルメトリーの前に別々の、そして 特別なタグ配列に共有的に結合させることができる。 本発明の１つの態様では、少なくとも２つの塩基−特異的停止化断片の分子量 値が現在使用されているマススペクトルメトリーを使用して決定される。好まし い分子量値は少なくとも５、そしてより好ましくは少なくとも１０塩基−特異的 停止化断片をマススペクトルメトリーにより決定できる。本発明は少なくとも２ ０塩基−特異的停止化断片および少なくとも３０塩基−特異的停止化断片の分子 量値の決定も含む。さらに特別な組のネスティッド塩基−特異的停止化断片はす べての反応物および副生物から精製できるが、互いに分離しない。ネスティッド 塩基−特異的停止化断片の全部の組を同時に分析し、そして分子量値を決定する 。少なくとも２つの塩基−特異的停止化断片は断片が同じ試料中に含まれればマ ススペクトルメトリーにより同時に分析される。 一般的にマススペクトルメトリーのＤＮＡ配列決定法の全体は、第一に無作為 または特異的にゲノムＤＮＡを大きな片に切断して次に数回のサブクローン化工 程でサイズを小さくして得た小さいゲノム断片のライブラリーから始まり、そし てこれらをＭ１３またはｐＵＣ（例えばＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９） 誘導体のようなベクター中に挿入することになるだろう（第１図参照のこと）。 異なる方法では、Ｍ１３のようなベクター中に挿入された断片は、ｃＤＮＡライ ブラリーから出発 するサブクロー化により得られる。さらに別の方法では、配列決定されるＤＮＡ 断片はポリメラーゼ連鎖反応（例えばHiguchiら、“ＤＮＡ断片のインビトロ調 製および突然変異誘発法の一般的方法:タンパク質およびＤＮＡ相互作用の研究 （A General Method of invitro Preparation and Mutsgenesis of DNA Fragmen t:Study of Protein and DNA Interactions”Nucleic Acids Res.16,7351-67(19 88)）で生成される。当該技術で周知であるように、サンガー配列決定法は、プ ラス−鎖に結合する１つの核酸プライマー（ＵＰ）、または反対のマイナス−鎖 に結合する別の核酸プライマーから出発できる。したがって与えられた未知のＤ ＮＡ配列の両鎖の相補的配列を得ることができる（配列決定のあいまいさが減る ことになる）か、あるいは未知のベクター−挿入ＤＮＡ断片の両末端からの配列 情報が得られるため、１つのクローンから得られる配列情報の長さが伸びる。 核酸配列プライマーは好ましくは５’末端に結合官能基（Ｌ）を持っており、 固体支持体上の適当な官能基（Ｌ’）と相互反応できる十分な長さのスペーサー を含むことができ、これは光分解性結合のような可逆的連結を形成する。各々の ４つのサンガー配列決定族は核酸プライマー（Ｌ−ＵＰ；第１図）から出発する ので、この族は固体支持体の表面の官能基Ｌ’と反応することにより固体に結合 し、そして次にすべての緩衝塩、三リン酸、酵素、反応副生物等を徹底的に洗浄 する。さらにマススペクトロメトリー分析のためには、ヌクレオチド単位ごとに 結合している陽イオンの異質性によりピークの幅が広くなることを排除するため に、この段階ではＤＮＡ断片のリン酸骨格で陽イオンを交換することが極めて重 要である。Ｌ−Ｌ’結合はネスティッドＤＮＡまたはＲＮＡ断 片を捕らえる目的の一時的な性質のものであるので、それらをマススペクトロメ トリー分析に適当な条件にコンディショニングするために、この目的を補助する 異なる化学がある。マススペクトロメトリー分析のためにネスティッド断片を共 有結合的に支持体に固定し、洗浄し、そして支持体から開裂するために与えた例 に加えて、一時的な結合はマススペクトロメトリーの条件下（すなわち電荷移動 複合体または安定な有機ラジカルのような光開裂性結合）で開裂するようにでき るようなものである。さらに、結合は四級アンモニウム基であるＬ’（第１９図 にいくつかの例がある）で形成できる。この場合は好ましくは固体支持体の表面 が陰性の荷電をもち、これは陰性に荷電した核酸骨格と反発し、そして脱着させ る。脱着はレーザーパルスによる加熱により、および／またはＬ’に応じてＬ’ クロモフォア共鳴中の特別なレーザーエネルギーの吸収のいずれかにより起こる （例えば第１９図にある例を参照にされたい）。官能基ＬおよびＬ’は電荷移動 複合体も形成することができ、そしてこれにより一時的なＬ−Ｌ’結合を形成す る。受容体または供与体特性のいずれかを持つ様々な適当な官能基の例は、限定 するわけではないが第２０Ａおよび２０Ｂ図に表されている。多くの場合“電荷 −移動バンド”はＵＶ／ｖｉｓスペクトロメトリーで測定できる（R.Foster,Org anic Change Transfer Comp1exes ,アカデミック出版、1969）ので、レーザーエ ネルギーは対応する電荷−移動波長のエネルギーに向けられ、すなわち固体支持 体からの特別な脱着を始めることができる。当業者は幾つかの組み合わせがこの 目的を補助し、そして供与体の官能基が固体支持体の上にあることができるか、 あるいはネスティッドＤＮＡ／ＲＮＡ断片と結合するか、またはその逆になるか を認識するだろう。 さらに別の方法は一時的なＬ−Ｌ’結合は実施例２１に例示される比較的安定 な基をホモリシス的に形成することにより生成できる。第２１図の４では電荷− 移動複合体と安定な有機基との組み合わせを表している。ここではネスティッド サンガーＤＮＡ／ＲＮＡ断片が電荷移動複合体に補足される。レーザーパルスの 影響下で、脱着（上記）ならびにイオン化はラジカル位で起こる。第２１図の他 の例ではレーザーパルスの影響下で、Ｌ−Ｌ’結合は開裂し、そしてネスティッ ドサンガーＤＮＡ／ＲＮＡ断片は脱着し、そして続いて形成されたラジカル位で イオン化される。当業者は他の有機基を選択してホモリシス的な結合開裂に必要 な解離エネルギーに関連して、対応するレーザー波長を選択できること認識する だろう（例えば、Wentrup.John Wiley & Sons,1984による反応性分子（Reactive Molecules を参照にされたい）。さらに別の方法ではネスティッドサンガーＤＮ Ａ／ＲＮＡ断片はワトソン-クリック塩基対を介して核酸配列プライマーまたは タグオリゴメクレオチド配列のいずれかの配列に相補的固体支持体−結合オリゴ ヌクレオチドに補足される（第２２図を参照にされたい）。形成された二重鎖は レーザーパルスの影響下で開裂し、そして脱着を始まることができる。固体支持 体−結合塩基配列は天然のオリゴリボ−またはオリゴデオキシリボヌクレオチド ならびに類似体（例えばチオ−修飾ホスホジエステルまたはホスホロチオエステ ル骨格）を介して与えられるか、あるいはＰＮＡ類似体（例えばNielsenら、Sci ence 254,1497(1991)を参照にされたい）のようなオリゴヌクレオチド擬態を使 用することにより、塩基配列を酵素分解に対する感受性をより低くし、したがっ て固体支持体−結合補足塩基配列の全体の安定性を増す。適切な結合（Ｌ−Ｌ’ ）で、レーザーを結合開裂 に必要なエネルギーに変えて直接的に開裂を得ることができる。したがって固定 化ネスティッドサンガー断片はマススペクトルメトリー分析中に直接変化する。 マススペクトルメトリーの性能を上げるために、ホスホジエステル結合骨格を ＭＳ分析前に修飾する必要があるかもしれない。これは例えばアルファ−チオ修 飾オリゴヌクレオチドを鎖伸長および停止に使用することにより達成できる。ア ルキルオジド、イオドアセトアミド、β−イオドエタノール、2,3-エポキシ-1- プロパノール（第１０図を参照にされたい）のようなアルキル化剤を使用して、 ネスティッドサンガー断片のモノチオホスホジエステル結合をホスホロチオエス テル結合に転移させる。この場合のマス修飾による多重化は、核酸プライマー（ ＵＰ）またはヌクレオシド三リン酸を糖または塩基部分で質量−修飾することに より得られる。当業者はネスティッドサンガー断片の他の修飾を構想することが できる。本発明の１つの態様では、結合化学はそのように精製されたネスティッ ドＤＮＡを酵素的、化学的または物理的にに開裂させる。例として、Ｌ−Ｌ’化 学はジスルフィド結合（例えばメルカプトエタノールまたはジチオスレイトール により化学的に開裂可能）、ビオチン／ストレプトアビジンシステム、緩和な酸 性条件下で開裂するこができるチトリチルエーテル基のヘテロ官能性誘導体（Ko sterら、“合成生体分子の修飾用の汎用性酸-不安定性リンカー（A Laboratory Manual Versatile Acid-Labile Linker for Modification of Synthetic Biomol ecules）”Tetrahedron Letters 31 7095(1990)）、ほぼ中性の条件下でヒドラ ジニウム／酢酸緩衝液により開裂可能なレブリニル基、エンドペプチダーゼ様ト リプシンにより開裂可能なアルギニン−アルギニンまたは リシン−リシン結合、あるいはピロホスファターゼにより開裂可能なピロリン酸 塩結合、例えば物理的に開裂できる光開裂性結合などがあり（第２３図を参照に されたい）、あるいは別の陽イオン交換をマススペクトロメトリー分析前に行う ことができる。この場合は、ネスティッド断片を固定化するために酵素−開裂性 結合が使用され、結合を開裂に使用する酵素はＭＳ分析中に内部質量標準として 役立つ。 精製工程および／またはイオン交換工程は固体支持体上への固定化の変わりに 、または固定化に加えて多くの他の方法で行うことができる。例えば塩基−特異 的停止化生成物を反応物から透析、濾過（限外濾過を含む）およびクロマトグラ フィーにより分離できる。同様にこれらの技術はリン酸骨格の陽イオンを、ピー クの幅広化を減らす対−イオンに交換するために使用できる。 塩基−特異的停止化断片族は、大腸菌ポリメラーゼＩの巨大クレノー断片、シ ークエナーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびこの目的に適する（すなわち ネスティッドＤＮＡ断片をマススペクトロメトリー分析に使用する）他のＤＮＡ ポリメラーゼを使用して標準的なサンガー配列決定法により生成することができ る。しかし、配列決定されるＤＮＡ断片の塩基−特異的停止化ＲＮＡ転写物もマ ススペクトロメトリーの配列決定に使用できることは本発明の一部である。この 場合、ＳＰ６またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのような種々のＲＮＡポリメラー ゼをＳＰ６またはＴ７プロモーター（例えばAxelrodら、“3'-デオキシリボヌク レオシド5’-三リン酸鎖停止剤の存在下でのバクテリオファージT7およびSP6 RN Aポリメラーゼプロモーターの転写（Transcription from BacteriｏphageT7 and SP6 RNA Polymerase Promoter in the presence of 3'-deoxyribonucleoside5'-triphosphate Chain Terminaters）”Biochemistry 24 ,571-23(1985)を含む適当なベクターに使用できる。この場合、未知のＤＮＡ 配列断片をそのようなプロモーターの下流に挿入する。転写も核酸プライマーに より開始され得る（Pitu1lら、““化学的および酵素的ＲＮＡ合成の組み合わせ のための開始剤オリゴヌクレオチド（Initiator Oligonucleotides for the Com ibation of Chemical and Enzymatic RNA Synthesis）”Gene 112,101-105(1992 )）。この核酸プライマーは本発明の１つの態様として、マススペクトロメトリ ー分析前に精製および／または適当な修飾および／またはコンディショニングの ために、上記のようにネスティッドＲＮＡ断片を固定化する官能基Ｌを持つ。 マススペクトロメトリー分析のため、ＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定生成物の固定化 工程用に、様々な固体支持体が使用でき、例えばビーズ（シリカゲル、調節孔ガ ラス、磁気ビーズ、Sephadex/Sepharoseビーズ、セルロースビーズ等）、毛細管 、ガラスファイバーフィルター、ガラス表面、金属表面またはプラスティック材 料がある。有用なプラスティック材料の例には、フィルター膜またはマイクロプ レート形態、後者はマイクロタイタープレートを使用して精製工程の全自動化を 可能とし、マイクロタイタープレートは本発明の１つの態様として、ウェルの底 がＬ’で官能化されている透明な膜をもつ。膜はポリエチレン、ポリプロピレン 、ポリアミド、ポリビニリデンフルオリド等を基本とする。適当な金属表面の例 には鋼、金、銀、アルミニウムおよび銅を含む。精製、陽イオン交換および／ま たは、ネスティッドサンガー断片に結合したＬ−Ｌ’のホスホジエステル骨格の 修飾後、化学的、酵素的または物理的にそれらを固体支持体から開裂することが できる。またＬ−Ｌ’結合断片は上記 ならびに第１９−２３図に記載した適当に選択したＬ−Ｌ’結合および対応する レーザーエネルギー／強度を使用してマススペクトルメトリーに供される時は、 支持体から開裂させることができる。 高度に精製された４つの塩基−特異的停止化ＤＮＡまたはＲＮＡ断片族は、次 に断片長に基づきＭＡＬＤＩまたはＥＳマススペクトルメトリーによりそれぞれ の分子量決定を通して分析される。 ＥＳについては、水または揮発性緩衝液に溶解した試料を連続的また断続的に 大気圧イオン化インターフェイス（ＡＰＩ）に注入し、そして次に四重極により 分析する。コンピュータープログラムの補助により、分子量ピークが既知の核酸 プライマー（ＵＰ）について調査され、ＵＰに付加された４つの鎖−停止ヌクレ オチドのいずれかが決定される。これは未知配列の初めのヌクレオチドを表す。 次に第二、第三、第ｎ伸長生成物が同様に同定され、そしてヌクレオチド配列が 評価される。ＥＳマススペクトルメトリーを使用して得られる多イオンピークは 質量測定の正確さを増すことができる。 ＭＡＬＤＩマススペクトルメトリーでは、種々のマス分析機を使用でき、例え ば１つまたは３つの四重極モードの磁気セクター／磁気デフレクション装置があ る（ＭＳ／ＭＳ）。フーリエ変換および飛行時間（ＴＯＦ）配置はマススペクト ルメトリーの技術分野で周知である。第２から６図にかけて、５０ヌクレオチド 長（配列番号３）で分子量が15,344.02ダルトンの仮想のＤＮＡ断片を配列決定 して得られたデータを示す。ｄｄＴ（第２Ａおよび２Ｂ図）、ｄｄＡ（第３Ａお よび３Ｂ図）、ｄｄＧ（第４Ａおよび４Ｂ図）ならびにｄｄＣ（第５Ａおよび５ Ｂ図）停止生成物について計算された分子量が与えられ（配列番号３の断片に対 応 する）、そして理想化された４つのＭＡＬＤＩマススペクトルを表す。 すべての４つのスペクトルが重ねられ、そしてこれからこのＤＮＡ配列を作成で きた。これを第６図に要約して表し、いかに分子量がＤＮＡ配列と相関している かを実証する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルは第２図に対応するｄｄＴ停止生 成物（第１６Ａ−１６Ｍ図）について作成され、これらのスペクトルは重ねられ た（第１７Ａおよび１７Ｂ図）。ｄｄＴ断片の計算された分子量とそれらの実験 的に確認された重量との相関を表Ｉに表す。同様に、４つのすべての鎖−停止反 応が組合わされ、そしてマススペクトルメトリーで分析されれば、２つの隣接ピ ーク間の分子量差を配列決定に使用できる。脱着／イオン化法については、多く のマトリックス/レーザ一組み合わせを使用できる。 高容量のゲノムおよびｃＤＮＡ配列決定プロジェクトに必要なレベルに処理量 を増加させるために、さらに本発明の態様では１つ以上の配列を同時に決定する 多重マススペクトルメトリーを使用する。これは数種の、しかし異なる方法を使 用することにより達成され、基本的な原理は核酸プライマー（ＵＰ）の質量修飾 、鎖−伸長および／または停止ヌクレオシド三リン酸であるか、または特別なタ グ配列にハイブリダイズ可能な質量−差別化タグプローブの使用による。本明細 書で使用する“核酸プライマー”という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡサンガー配 列決定法の両方のプライマーを包含する。 実施例のように、第７Ａ図は核酸プライマー（ＵＰ）およびタグプローブ（Ｔ Ｐ）の一般式を表す。質量修飾部分は、例えばオリゴヌクレオチド（Ｍ¹）の5' −末端、ヌクレオベース（または塩基）（Ｍ²、Ｍ⁷）、リン酸骨格（Ｍ³）およ びヌクレオシド（１つまたは複数）の2'-位（Ｍ⁴、Ｍ⁶）あるいは／および3'-末 端位（Ｍ⁵）のいずれかに付加することができる。プライマー長は１から５０ヌ クレオチド長の範囲で可変である。ＤＮＡサンガー配列決定のプライミング（pr iming）のためには、プライマーは好ましくは約１５から３０ヌクレオチド長で ある。ＲＮＡポリメラーゼー媒介サンガー配列決定反応で、人工的に転写をプラ イミングするためには、プライマー長は好ましくは約２から６ヌクレオチド長で ある。タグプローブ（ＴＰ）を鎖−停止断片族に組み込まれたタグ配列にハイブ リダイズさせるならば、その好適な長さは約２０ヌクレオチドである。 第７Ｂ図の表はＤＮＡおよびＲＮＡ、サンガー配列決定の質量−修飾プライマ ー／タグプローブ配置の例を描いたものである。しかしオリゴ ヌクレオチド分子中の質量−修飾機能および位置について多くの他の組み合わせ が可能であり、それらは本発明の一部であると見なすので、この一覧に限定され ることを意味しない。質量−修飾官能基は、例えばハロゲン、アジド、またはＸ Ｒ種（ここでＸは結合基であり、そしてＲは質量−修飾官能基である）であるこ とができる。したがって質量−修飾官能基はオリゴヌクレオチド分子に定めた増 分を導入するために使用できる。 別の態様では、鎖−伸長および／または停止に使用されるヌクレオチドが質量 −修飾される。そのような修飾オリゴヌクレオチドを第８Ａおよび８Ｂ図に示す 。ここでは質量−修飾部分ＭをヌクレオベースＭ²（ｃ⁷-デアザヌクレオシドの 場合はC-7、Ｍ⁷も）に、アルファーリン酸の三リン酸Ｍ³に、またはヌクレオシ ド三リン酸Ｍ⁴およびＭ⁶の糖環の2^'-位のいずれかに付加することができる。さ らに質量−修飾官能基は、それをヌクレオシド三リン酸Ｍ⁵中の糖環の3'一位に 付加することなどにより鎖停止に影響するように付加することができる。第８Ｂ 図の一覧はＲＮＡまたはＤＮＡサンガ一配列決定法に関し、鎖−停止ヌクレオシ ド三リン酸を生成するための配置について可能な例を表す。しかし当業者には他 の多くの組み合わせも本発明の目的に同様に良く役立つことが明らかである。こ のように当業者は鎖−伸長ヌクレオシド三リン酸も同様に多くの変種および組み 合わせを使用して官能基および付加位置を質量−修飾することができると認識す るだろう。 本発明の範囲を制限することなく、第９図はどのように質量−修飾ＭをＸＲ中 のＸに導入し、そしてＲにオリゴー／ポリエチレングリコール誘導体を使用する かをより詳細に記載している。この場合質量−修飾増 分は４４であり、すなわち５つの異なる質量−修飾種がｍを０から４に変化する だけで生成でき、このように質量単位４５（ｍ＝０）、８９（ｍ＝１）、１３３ （ｍ＝２）、１７７（ｍ＝３）および２２１（ｍ＝４）のを核酸プライマー（Ｕ Ｐ）、タグプローブ（ＴＰ）あるいはヌクレオシド三リン酸にそれぞれ付加する 。オリゴ−／ポリエチレングリコールは、低級アルキル（メチル、エチル、プロ ピル、イソプロピル、ｔ−ブチル等のような）によりモノアルキル化されること もできる。結合官能基Ｘの選択も説明されている。他の化学も質量−修飾化化合 物に使用でき、例えば最近、オリゴヌクレオチドおよび類似体。実験法（oligon ucleotides and Anslogues.A Practical Approach. ）F.Eckstein編集、IＲＬ出 版、オックスフォード、1991に記載されたものがある。 さらに別の態様では、オリゴー／ポリエチレングリコール以外の種々の質量− 修飾化官能基Ｒを選択し、そして適当な結合化学を介してＸに付加することがで きる。限定することを意味するわけではないが、幾つかの例を第１０図に表す。 単純な質量−修飾はＨをＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、および／またはＩのようなハロゲンに 、あるいはＳＣＮ、ＮＣＳのような擬ハロゲンに置換することにより達成でき、 あるいはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ヘキシル、フ ェニル、置換フェニル、ベンジルのような種々のアルキル、アリールまたはアラ ルキル部分を使用することにより、あるいはCH₂F、CHF₂、CF₃、Si(CH₃)₃、Si(CH₃ )₂(C₂H₅)、Si(CH₃)(C₂H₅)₂、Si(C₂H₅)₃を使用することにより達成できる。さら に別の質量−修飾はホモ−またはヘテロペプチドをＸを介してＵＴ，ＴＰまたは ヌクレオシド三リン酸にそれぞれ付加することにより得られる。マス増分が５７ の質量−修飾種を生成する有用な例はオリゴ グリシン類の付加である。その結果、増分７４（ｒ＝１、ｍ＝０）、１３１（ｒ ＝１、ｍ＝２）、１８８（ｒ＝１、ｍ＝３）、２４５（ｒ＝１、ｍ＝４）が得ら れる。単純なオリゴアミドも使用できる。例えばその例は７４（ｒ＝１、ｍ＝０ ）、８８（ｒ＝２、ｍ＝０）、１０２（ｒ＝３、ｍ＝０）、１１６（ｒ＝４、ｍ ＝０）等を得ることができる。当業者には、あらかじめ定めた方法によりＤＮＡ およびＲＮＡサンガー配列決定法に許容できる多くの様々な質量−修飾官能基を 、ＵＰ、ＴＰおよびヌクレオシド三リン酸に導入するにために、様々な可能性が 第１０図および上記文献（オリゴヌクレオチド類似体、F.Eckstein,1991）に加 えて明らかである。 本明細書で使用するように、上つき文字０−ｉはｉ＋ｌ質量−変化ヌクレオチ ド、プライマーまたはタグを言う。上つき文字０（例えばＮＴＰ⁰、ＵＰ⁰）は特 定反応物の非修飾種を呼び、そして上つき文字ｉ（例えばＮＴＰⁱ、ＮＴＰ¹、Ｎ ＴＰ²等）はｉ回修飾された反応種を言うことができる。例えば１つ以上の核酸 （例えばＤＮＡクローン）を同時に多重ＤＮＡ配列決定で配列決定し、次にｉ＋ ｌの異なる質量−修飾核酸プライマー（ＵＰ⁰、ＵＰ¹．．．．ＵＰⁱ）を各々の 塩基−特異的停止断片組を識別するために使用することができ、ここで質量−修 飾化ＵＰⁱの各種は残りのものからマススペクトロメトリーにより識別できる。 本発明の説明的な実施例として、記載された質量−修飾試薬を使用する多重マ ススペクトロメトリーＤＮＡ配列決定法の３つの異なる基本的工程を以下に記載 する： Ａ）サンガーＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定のために、質量−修飾核酸プライマ ー（ＵＰ）を使用することによる多重化（第１１図）； Ｂ）サンガーＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定のために質量−修飾リボヌクレオシ ド三リン酸を鎖伸長剤および／停止剤として使用することによる多重化（第１２ 図）；および Ｃ）４つのサンガーＤＮＡ／ＲＮＡ塩基特異的停止化断片族の一部に組み込ま れたタグ配列に特異的にハイブリダイズするタグプローブの使用による多重化。 この質量−修飾は第７Ａ、７Ｂ、９および１０図に記載されるように行うか、あ るいは同じ、または異なる長さを持つ様々なオリゴヌクレオチド配列を非修飾ヌ クレオチド（これは予め定めた方法で適当に識別化された分子量を生成する）で 設計することにより行う（第３図）。 ４つの異なるＤＮＡクローンを同時にマス分析するための質量−修飾核酸プラ イマー（ＵＰ）による多重化の方法は、第１１図に例として説明されている。第 一の反応混合物は、適当なベクター（例えばＭ１３ｍｐ１８）に組み込まれた未 知ＤＮＡ断片１（クローン１）を有する標準的なサンガーＤＮＡ配列決定法によ り得られ、非修飾核酸プライマーＵＰ⁰および標準的な４つの非修飾デオキシヌ クレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ⁰）、ならびに１／１０倍の４つのジデオキシヌ クレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ⁰）の１つを使用する。ＤＮＡ断片２（クロー ン２）のための第二反応混合物は、質量−修飾核酸プライマー（ＵＰ¹）、およ び上記のように４つの非修飾デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ⁰）を使 用することにより得られ、それぞれの別個のサンガー反応に１／１０倍の鎖−停 止修飾ジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ⁰）を含有する前記の４つ の非修飾ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ⁰）を使用する。他の２つの実験では 、４つのサンガー反応は以下の組成で ある：ＤＮＡ断片３（クローン３）、ＵＰ²、ｄＮＴＰ⁰、ｄｄＮＴＰ⁰およびＤ ＮＡ断片４（クローン４）、ＵＰ³、ｄＮＴＰ⁰、ｄｄＮＴＰ⁰。マススペクトロ メトリーのＤＮＡ配列決定法について、４つのクローンのすべての塩基−特異的 停止反応物はプールされ、そして分析される。４つのジデオキシ−停止（例えば ｄｄＴ−停止）化断片族に属する種々のマスピークは、特異的に伸長し、そして ｄｄＴ−停止断片が、４つのうちの１つのジデオキシヌクレオシド三リン酸（Ｕ Ｐ⁰−ｄｄＮ⁰、ＵＰ¹−ｄｄＮ⁰、ＵＰ²−ｄｄＮ⁰およびＵＰ³−ｄｄＮ⁰）により 伸長した既知のＵＰ⁰、ＵＰ¹、ＵＰ²およびＵＰ³分子イオンピークを調査（コン ピータープログラムによる）することにより評価される。このように、クローン １から４の４つの未知ＤＮＡ配列の第一ヌクレオチドが測定される。４つの配列 が評価されるまで４つの特別な第一伸長生成物の分子マスを記憶させながら、こ の工程を繰り返す。４つの質量−修飾核酸プライマーが同じジデオキシヌクレオ シド三リン酸により伸長するような最悪の場合でも、伸長生成物は例えばＵＰ⁰ −ｄｄＴ、ＵＰ¹−ｄｄＴ、ＵＰ²−ｄｄＴおよびＵＰ³−ｄｄＴであり、それら は４つの核酸プライマーを差別する既知のマス増分により識別されるので明確な 質量／配列評価が可能である。本発明の別の態様では例えばＳＰ６および／また はＴ７プロモーター配列を含有するような種々のベクターを使用して、核酸プラ イマーＵＰ⁰、ＵＰ¹、ＵＰ²およびＵＰ³で転写するか、ならびにＲＮＡポリメラ ーゼ（例えばＳＰ６またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ）と鎖−伸長および停止化 非修飾ヌクレオシド三リン酸ＮＴＰ⁰および3'-ｄＮＴＰ⁰を使用して、類似技術 が行われる。これもＤＮＡ配列はサンガーＲＮＡ配列決定法により決定される。 第１２図は、３つの異なるＤＮＡ断片（３クローン）を中に含む質量−修飾鎖 −伸長または／および停止化ヌクレオシド三リン酸による多重化工程が同時に分 析されることを説明している。第一のＤＮＡサンガー配列決定反応（ＤＮＡ断片 １、クローン１）は非修飾核酸プライマー（ＵＰ⁰、ｄＮＴＰ⁰）、および４つの 各反応に４つのｄｄＮＴＰ⁰の１つを使用する標準的混合物である。第二（ＤＮ Ａ断片２、クローン２）および第三（ＤＮＡ断片３、クローン３）は次のような 組成である：それぞれＵＰ⁰、ｄＮＴＰ⁰、ｄｄＮＴＰ¹およびＵＰ⁰、ｄＮＴＰ⁰ 、ｄｄＮＴＰ²。この工程の変法で、質量−修飾伸長ＤＮＡ断片中の質量−増分 の増幅は、等しく質量−修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸（すなわちｄ ＮＴＰ¹、ｄＮＴＰ²⁾のみを鎖伸長に使用するか、あるいはホモロガスな等しく 質量−修飾されたジデオキシヌクレオシド三リン酸とを組み合わせるかのいずれ かを使用して達成できる。上記３つのクローンに関し、反応混合物の内容は以下 の通り：ＵＰ⁰／ｄＮＴＰ⁰／ｄｄＮＴＰ⁰、ＵＰ⁰／ｄＮＴＰ¹／ｄｄＮＴＰ⁰およ びＵＰ⁰／ｄＮＴＰ²／ｄｄＮＴＰ⁰あるいはＵＰ⁰／ｄＮＴＰ⁰／ｄｄＮＴＰ⁰、Ｕ Ｐ⁰／ｄＮＴＰ¹／ｄｄＮＴＰ¹およびＵＰ⁰／ｄＮＴＰ²／ｄｄＮＴＰ²。上記のよ うに、ＤＮＡ配列決定はサンガーＲＮＡ配列決定により、非修飾核酸プライマー （ＵＰ⁰）および適当量の鎖−伸長および停止ヌクレオシド三リン酸を使用する ことにより行い得る。質量−修飾は再度、鎖−停止化ヌクレオシド三リン酸のみ 、または鎖−伸長ヌクレオシド三リン酸と組み合わせるかのいずれかであり得る 。多重化は３つの塩基−特異的停止化配列決定反応（例えばｄｄＴＴＰ停止生成 物）をプールし、そして同時にプールした生成物をマススペクトルメトリーで分 析することにより行う。再度、 既知の核酸プライマー配列の第一伸長生成物を評価（例えばコンピュータープロ グラムによる）する。質量／配列評価は、３つのすべてのクローンで同じヌクレ オチド（例えばｄｄＴ）により核酸プライマーが伸長／停止しているような最悪 の場合でも可能である。このようにして得た以下の配置はそれらの異なる質量− 修飾により良好に識別できる：ＵＰ⁰−ｄｄＴ⁰、ＵＰ⁰−ｄｄＴ¹、ＵＰ^0-ｄｄＴ² 。 本発明の別の態様では、多重マススペクトルメトリーによるＤＮＡ配列決定は 配列決定するＤＮＡ断片を、特別な“タグ配列”を含有する“plexベクター”中 にクローニングし（Kosterら、“化学発光検出を使用するオリゴヌクレオチド合 成および多重ＤＮＡ配列決定（Oligonucleotide Synthesis and Multiplex DNA Sequencing Using Chemiluminescent Detection)”Nucleic Acids Res.シンポジ ウム、第24回、318-321(1991)）;次にＤＮＡ調製および標準的なｄＮＴＰ⁰／ｄ ｄＮＴＰ⁰および核酸プライマーＵＰ⁰を使用する４つの別個のサンガー配列決定 反応のために、種々plex-ベクターからのクローンをプールし；結合基（Ｌ）に より固体支持体にＵＰの５’末端で結合している４つの多重断片を族を精製し； すべての副生物を洗浄し、そして精製した多重ＤＮＡ断片を支持体から開裂する か、あるいはＬ−Ｌ’結合ネスティッドサンガー断片を使用して（上記のような マススペクトルメトリー分析用の）；特別な“タグプローブ”の個々のハイブリ ダイゼーションによりデマルチプレキシング（demultiplexing）を行い；そして 引き続きマススペクトルメトリーで分析する、ことにより行われる（例えば第１ ３図を参照にされたい）。参考点として、４つの塩基−特異的停止化多重ＤＮＡ 断片族はマススペクトルメトリーで処理され、そしてすべてのｄｄＴ⁰−、ｄｄ Ａ⁰ −、ｄｄＣ⁰−、ｄｄＧ⁰−停止分子イオンピークがそれぞれ検出され、そして記 憶される。例えば特別な断片族に対するｄｄＴ⁰−停止化ＤＮＡ断片の評価は、 特別なタグプローブ（ＴＰ）の対応するタグ配列（こ特別な断片族中に含まれて いる）へのハイブリダイゼーション後に別のマススペクトルメトリーで行われる 。特別なタグプローブにハイブリダイズすることができる分子イオンピークだけ が同じ既知の質量増分（例えばタグプローブの）により、より高い分子質量にシ フトする。これらのシフトしたイオンピークは特別なタグプローブへのすべての ハイブリダイズにより、同じ断片族に属する。所定の断片族に関して、残りの鎖 停止断片族族を同じタグプローブで反復し、完全なＤＮＡ配列を評価する。この 工程はｉ−ｌ回、ｉクローンの数に対応して反復する（第ｉ番目のクローンは欠 如により同定）。 様々な多重クローンに関しタグプローブの識別は、ＤＮＡ配列およびそのタグ に対するワトソン−クリック塩基対を形成する能力だけで得ることができる。当 該技術分野では、所定のタグプローブが所定のタグ配列と特異的にハイブリダイ ズするためのストリンジェンシー条件をどのように算出するかは周知である（例 えばモレキュラークローニング：アラボラトリーマニュアル、第二版、Sambrook ,FritschおよびManiatis（コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニュ ーヨーク、第11章を参照にされたい）。さらに識別化は、各plexベクターsl組成 物の長さまたは塩基を変更するだけで、または第７Ａ、７Ｂ、９および１０によ る質量−修飾で独自となるような十分な質量差異を有するように、タグ配列を設 計することにより得ることができる。マススペクトロメトリー中にタグ配列とタ グプローブとの間の二重鎖を完全に保つために、本発明 の別の態様は例えばプソラレンおよびエリプチシンのような光反応性基および他 の当該技術分野に周知な方法（例えば、Heleneら、Nature 344,358(1990)および Thuongら、“内部添加剤に付加したオリゴヌクレオチド。光反応性および開裂剤 （Oligonucleotides Attached to Intercalator.Photoreactive and Cleavage A gent）”F.Eckstein、オリゴヌクレオチドおよび類似体：実験的手法（Oligonuc leotides and Anslogues:Practical Approach ）、ＩＲＬし出版、オックスフォ ード1991、283-396）により媒介される共有結合を提供する。 ＤＮＡ配列は既知のＵＰ⁰-タグ配列／タグプローブ分子量に対応する最小分子 量イオンピークに加えて、第一伸長物（例えばｄｄＴ⁰）、次に第二、第三等を 調査することにより再度、解明される。 後者の手法をすでに記載した多重化工程と組み合わせると、タグプローブ／タ グ配列相互作用、質量−修飾核酸プライマー（第７Ａおよび７Ｂ図）および／ま たは質量−修飾デオキシヌクレオシド（ｄＮＴＰ^0-i）および／またはジデオキ シヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ^0-i）を使用してさらに多重化のが増加が 達成できる。当業者はタグ配列／タグプローブ多重化法は、ネスティッドＤＮＡ 断片をＤＮＡポリメラーゼで生成するサンガーＤＮＡ配列決定法には限定されな いことを認識するだろう。ＤＮＡ配列は適当なプロモーター含有ベクター（上記 ）由来の未知のＤＮＡ配列を、様々なＲＮＡポリメラーゼおよびＮＴＰ^0-i／3'- ｄＮＴＰ^0-iで転写することにより決定することもでき、なわちネスティッドＲ ＮＡ断片を生成する。 さらに本発明の別の態様では、質量−修飾官能基を２つ、または多重工程によ り導入できる。この場合、核酸プライマー、鎖−伸長または停 止ヌクレオシド三リン酸および／またはタグプローブは第一工程にあり、アジド 、−Ｎ₃のような前駆体官能基により修飾されるか、またはＸＲ（第７Ａ、７Ｂ 、９図）中のＲがＨである官能基で修飾され、これにより一時的な官能基（例え ば限定するわけではないが、-0H、-NH₂、-NHR、-SH、-NCS、-OCO(CH₂)rCOOH(r=1 -20)、-NHCO(CH₂)rCOOH(r=1-20)、-OSO₂OH、-OCO(CH₂)rl(r=1-20)、-OP(O-Alkyl )N(Alkyl)₂）を提供する。これらの嵩の低い官能基は、ＤＮＡ配列決定法の酵素 的ＤＮＡまたはＲＮＡ合成によりよい基質特性をもたらす。適当な質量−修飾官 能基は次にネスティッド塩基−特異的停止化ＤＮＡまたはＲＮＡ断片の生成後、 マススペクトルメトリー前に導入される。質量−修飾官能基として役立ついくつ かの例を第９および１０図に示すが、これは本発明を制限するものではない。 本発明の範囲はマススペクトロメトリーによる核酸の配列決定のためのキット にも関するが、それは上記配列決定反応物を含む。例えば１つの態様では、この キットは幾つかの異なる核酸種の多重マススペクトロメトリー配列決定のための 反応物を含む。キットは結合官能基（Ｌ¹）を塩基−特異的停止生成物の固定化 のために有する固体支持体；プライマーと固体支持体間を可逆的または一時的に 結合する結合基（Ｌ）を有する少なくとも１つ核酸プライマー、例えば光開裂性 結合；鎖−伸長ヌクレオチドの組（例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよび ｄＴＴＰまたはＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＴＴＰ）；鎖−停止ヌクレオチド の組（ＤＮＡ合成のための２'，３'-ジデオキシヌクレオチドまたはＲＮＡ合成 のための3'-デオキシヌクレオチド）；そして相補的ヌクレオチドを合成するた めの適当なポリメラーゼを含むことができる。プライマー および／または停止化ヌクレオチドを、配列決定される核酸種の１つから生成し た塩基−特異的停止断片がマススペクトロメトリーにより他のすべてから識別で きるように質量−修飾することができる。質量−修飾合成反応物を使用する代わ りに、１組のタグプローブ（上記）をキットに含めることができる。このキット は適当な緩衝液ならびに同時に多種の核酸を配列決定するための多重マススペク トロメトリーを行うための指導書も含むことができる。 別の態様では核酸配列決定キットは上記の固体支持体、相補的核酸断片の合成 を始めるためのプライマー、１組の鎖−伸長ヌクレオチドおよび適当なポリメラ ーゼを含んで成ることができる。この質量−修飾鎖停止化ヌクレオチドは１つの 鎖停止化剤を伸長している相補的核酸に付加することによりマススペクトロメト リーで識別できるように選択される。 実施例１ ジスルフィド結合を介するマススペクトル分析のためサンガーのＤＮＡ配列決定 用反応のプライマー伸長産物の固定化 イソチオシアン酸フェニル基を有する固体支持体としてのセクエロン（Ｓｅｑ ｕｅｌｏｎ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ） を出発物質として使用する。直径８ｍｍであるこの膜ディスクをＮ−メチルモル ホリン／水／２−プロパノールの溶液（ＮＭＭ溶液）（２／４９／４９／ ｖ／ ｖ／ｖ）で湿らせ、余分な液体を濾紙で除去し、そして５５℃に設定した加熱用 ブロック（ｈｅａｔｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）に設置してあるプラスチックフィルム もしくはアルミホイルの細片上に乗せる。ディスク当たり、ＮＭＭ中の１ｍＭの ２−メルカプトエチルアミン（システアミン）もしくは２，２’−ジチオービス （エチルアミン）（システアミン）もしくはＳ−（２−チオピリジル）−２−チ オ−エチルアミン（１０μｌ、１０ｎモル）の溶液を添加し、そして５５℃で加 熱する。１５分後に、ディスク当たり１０μｌのＮＭＭ溶液を添加し、そして更 に５分間加熱する。余剰のイソチオシアネート基を、１０μｌのＮＭＭ溶液中の グリシンの１０ｍＭ溶液での処理により除去することができる。システアミンに 関しては、これらのディスクを１０μｌのジチオスレイトール（ＤＴＴ）／２− プロパノール（１：１ ｖ／ｖ）の１Ｍ水溶液での、室温で１５分間の処理によ り除去する。その後にこれらのディスクを、各１ｍｌのＮＭＭ溶液の５アリコー ト、次いで１ｍｌのアセトニトリル／水（１／１ ｖ／ｖ）の５アリコートを用 いる濾過用多岐管（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍａｎｉｆｏｌｄ）内で完全に洗浄 し、そしてその後に乾燥させる。直ぐに使用しない場合にはこれらのディスクを チオール基を遊離にさせた状態で1Ｍのジチオスレイトール／２−プロパノール （１：１ ｖ／ｖ）水溶液中に保存し、そして使用前には各１ｍｌのＮＭＭ溶液 で３回洗浄することによりＤＴＴを除去する。５’−ＳＨの官能基を有するプラ イマーオリゴヌクレオチドは種々の方法により調製することができる（例えば、 Ｂ．Ｃ．Ｆ．Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、 １４、５５９１−５６０３（１９８６）、Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃ ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． 、１５、４８３７−４８（１９８７）、および Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ ｐｒａ ｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、ｅｄｉｔｏｒ）、Ｉ ＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｏｘｆｏｒｄ、１９９１）。サンガーの実験法に従う配列決 定用反応は標準法において実施する（例 えば、Ｈ．Ｓｗｅｄｌｏｗ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ． １８、１４１５−１９（１９９０））。約７−１０ｍＭのＤＴＴの存在下 では遊離の５’−チオールプライマーを使用することができ、他の場合ではＳＨ 官能基を、サンガーの配列決定用反応中に例えばトリチル基により保護し、そし て支持体に固定化させる前に以下に示す方法でそれを除去することができる。４ つの配列決定用反応（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管内で各１５０μ ｌ）をＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ（Ｋｌｃｎｏｗ）フラグメント、セクエナ ーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）のようなもの）を変性させるための７０℃での１０ 分間のインキュベーションにより停止させ、そしてこの反応混合物をエタノール で沈殿させる。上清を除去し、そしてペレットを２５μｌの１Ｍ硝酸銀水溶液と 共にボルテックスミキサーにかけて混合させ、そして室温で１時間置いた後に、 ５０μｌの１Ｍ ＤＴＴ水溶液を添加し、そしてボルテックスミキサーにより混 合させる。１５分後にこの混合物を遠心し、そしてペレットを２回、１０μｌの 酢酸エチルでボルテックスミキサーによる混合および遠心により洗浄して余剰の ＤＴＴを除去する。５’−チオールが遊離の状態になっているプライマー伸長産 物を今度は緩和な酸化条件下でチオール化膜支持体に結合させる。一般的には１ ０μｌの１０ｍＭの脱気させた酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＡ） ｐＨ７．２中に溶かした５’−チオール化プライマー伸長産物をチオール化膜支 持体に添加することで十分である。結合は、冷風送風機を用いて膜ディスク上で 試料を乾燥させることにより実施する。この過程は、この膜を１０μｌの１０ｍ Ｍ ＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ７．２で湿らせ、そして前述のように乾燥させることに より繰り返すことができる。 ２−チオピリジル誘導体化合物を使用する場合には固定化を、３４３ｎｍにおけ るピリジン−２−チオンの放出により分光測光法的にモニターすることができる 。 この方法の他の変法においては、オリゴヌクレオチドプライマーは、自動ＤＮ Ａ合成中に標準法により導入される５’−端のアミノ基で官能基付加させる（ｆ ｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅ）。プライマー伸長後、サンガーの配列決定用法中に 、この一次アミノ基を３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸のＮ−ヒドロキ シスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）と反応させ、そしてその後にチオール化 支持体に結合させ、そして前述の要領でピリジル−２−チオンの放出によりモニ ターする。ＤＮＡポリメラーゼの変性および配列決定用産物のエタノール沈殿の 後、上清を除去し、そしてペレットを１０μｌの１０ｍＭ ＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ ７．２中に溶かし、そして１０ｍＭ ＴＥＡＡ中の１０μｌの２ｍＭＳＰＤＰ溶 液を添加する。この反応混合物をボルテックスミキサーにより混合し、そして２ ５℃下で３０分間インキュベートする。その後に余剰のＳＰＤＰを各５０μｌの エタノールでの３回の抽出（ボルテックスミキサーによる混合、遠心）により除 去し、そして得られるペレットを１０μｌの１０ｍＭ ＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ７． ２中に溶かし、そしてチオール化支持体（上述）に結合させる。 プライマー伸長産物は、各１００μｌのＮＭＭ溶液で３回、次いで各１００μ ｌの１０ｍＭ ＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ７．２で３回の膜ディスクの洗浄により精製 する。精製したプライマー伸長産物を、１０ｍＭのＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ７．２中 の１０μｌの１０ｍＭ ２−メルカプトエタノールでの３回連続の処理により放 出させ、凍結乾燥させ、そしてＥＳ もしくはＭＡＬＤＩのいずれかのマススペクトロメトリーにより分析する。 この方法は、質量修飾核酸プライマーＵＰ^0-iについても、質量修飾用官能基 の化学特性を考慮に入れて、類似の適切な方法で使用することもできる。 実施例２ レブリニル基を介するマススペクトル分析のためサンガーのＤＮＡ配列決定用反 応のプライマー伸長産物の固定化 ５−アミノレブリン酸はその一次アミノ基を、炭酸９−フルオニルメチル−Ｎ −スクシンイミジルを用いてＦｍｏｃ基で保護し、そしてその後に標準条件下で Ｎ−ヒドロキシスクシイミドおよびジシクロヘキシルカルボジイミドを用いてＮ −ヒドロキシスクシニミドエステル（ＮＨＳエステル）へと変換させる。サンガ ーの配列決定用反応のためには核酸プライマーであるＵＰ^0-iを用いるが、これ は、最終合成段階としてアミノリンカーであるホスホアミデートを用いる自動Ｄ ＮＡ合成中に標準法により導入される５’−末端の一次アミノ基で官能基付加さ せる（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅ）。サンガーの配列決定法は標準条件下（既 述）で実施する。４つの反応混合物（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管 内で各１５０μｌ）を７０℃に１０分間加熱してＤＮＡポリメラーゼを不活化さ せ、エタノール沈殿を行い、遠心し、そして１０μｌの１０ｍＭ ＴＥＡＡ緩衝 液ｐＨ７．２中に再懸濁させる。１０ｍＭのＴＥＡＡ緩衝液中の１０μｌの２ｍ Ｍ Ｆｍｏｃ−５−アミノレブリニル−ＮＨＳエステル溶液を添加し、ボルテッ クスミキサーによる混合を行い、そして２５℃下で３０分間インキュベートする 。余剰の試薬をエ タノール沈殿および遠心により除去する。Ｆｍｏｃ基は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホル ムアミド／水（１：１ ｖ／ｖ）中の１０μｌの２０％ピペリジン溶液中にペレ ットを再懸濁させることにより開裂させて除去する。２５℃に１５分間置いた後 にピペリジンを各１００μｌのエタノールを用いる３回の沈殿／遠心により完全 に除去し、このペレットを１０μｌのＮ−メチルモルホリン、２−プロパノール 、および水（２／１０／８８ ｖ／ｖ／ｖ）の溶液中に再懸濁させ、そしてこれ をイソチオシアネート基を保持する固体支持体に結合させる。ＤＩＴＣ−セクエ ロン（Ｓｅｑｕｅｌｏｎ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．社、Ｂｅｄｆｏ ｒｄ、ＭＡ）の場合には、この膜を実施例１に記載する要領で調製し、そして結 合は既述の要領で５５℃の加熱用ブロック上で実施する。ＲＮＡ伸長産物は類似 する方法で固定化させる。この方法を、類似する様式でイソチオシアネート基を 有する他の固体支持体に適用することができる。 固定化させたプライマー伸長産物を各１００μｌのＮＭＭ溶液で３回、次いで 各１００μｌの１０ｍＭ ＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ７．２で３回、充分に洗浄する。 精製したプライマー伸長産物を、１０μｌの１００ｍＭ酢酸ヒドラジニウム緩衝 液ｐＨ６．５での３回の連続処理により放出させ、凍結乾燥し、そしてＥＳもし くはＭＡＬＤＩのいずれかのマススペクトロメトリーにより分析する。 実施例３ トリプシン感受性結合を介するマススペクトル分析のためサンガーのＤＮＡ配列 決定用反応のプライマー伸長産物の固定化 ８ｍｍ直径のセクエロン（Ｓｅｑｕｅｌｏｎ）ＤＩＴＣ膜（Ｍｉｌｌ ｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＮＭＡ）を１０μｌのＮＭＭ溶液 （Ｎ−メチルモルホリン／プロパノール−２／水；２／４９／４９ ｖ／ｖ／ｖ ）で湿らせ、そしてリンカーアームをＮＭＭ中の１０μｌの１０ｍＭ １，６− ジアミノヘキサン溶液との反応により導入する。余剰のジアミンを、１００μｌ のＮＭＭ溶液での３回の洗浄段階により除去する。標準的なペプチド合成法を用 いて２つのＬ−リシン残基を、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−ｔＢｏｃ−Ｌ−リシンのペン タフルオロフェニルエステルとの２回の連続的な縮合により結合させ、末端のＦ ｍｏｃ基をＮＭＭ中のピペリジンで除去し、そして遊離のα−アミノ基をジイソ チオシアン酸１，４−フェニレン（ＤＩＴＣ）に結合させる。余剰のＤＩＴＣを １００μｌの２−プロパノールでの３回の洗浄段階により除去し、そしてＮ−ｔ Ｂｏｃ基を標準的なペプチド合成法に従ってトリフルオロ酢酸を用いて除去する 。核酸プライマー伸長産物は、５’−末端に一次アミノ基を保持するオリゴヌク レオチドから調製する。４つのサンガーのＤＮＡ配列決定用反応混合物（エッペ ンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管内で各１５０μｌ）を１０分間７０℃に加熱 してＤＮＡポリメラーゼを不活化させ、エタノール沈殿させ、そしてペレットを １０μｌのＮ−メチルモルホリン、２−プロパノール、および水（２／１０／８ ８ ｖ／ｖ／ｖ）の溶液中に再懸濁させる。この溶液をＬｙｓ−Ｌｙｓ−ＤＩＴ Ｃ膜ディスクに移し、そして５５℃に設定してある加熱用ブロック上で結合させ る。乾燥後に、１０μｌのＮＭＭ溶液を添加し、そして乾燥過程を繰り返す。 固定化プライマー伸長産物を、各１００μｌのＮＭＭ溶液で３回、次いで各１ ００μｌの１０ｍＭ ＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ７．２で充分に洗浄 する。マススペクトル分析については、一次伸長産物と固定支持体との間の結合 を標準条件下でのトリプシンでの処理により開裂させ、そして放出された産物を 、トリプシンを内部質量標準として用いるＥＳもしくはＭＡＬＤＩのいずれかの マススペクトロメトリーにより分析する。 実施例４ ピロリン酸結合を介するマススペクトル分析のためサンガーのＤＮＡ配列決定用 反応のプライマー伸長産物の固定化 ＤＩＴＣセクエロン（Ｓｅｑｕｅｌｏｎ）膜（８ｍｍ直径のディスク）は実施 例３に記載される要領で調製し、そしてＮＭＭ溶液中の１０μｌの１０ｍＭ ３ −アミノピリジンアデニンジヌクレオチド（ＡＰＡＤ）（Ｓｉｇｍａ社）溶液を 添加する。余剰のＡＰＡＤを一回の１０μｌのＮＭＭ溶液での洗浄により除去し 、そしてこのディスクをＮＭＭ溶液中の１０μｌの１０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウ ム溶液で処理する（１５分、２５℃）。余剰の過ヨウ素酸を除去し、そして５’ 一端に一次アミノ基を有する核酸プライマーを利用する４つのサンガーのＤＮＡ 配列決定用反応（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管内で各１５０μｌ） のプライマー伸長産物をエタノール沈殿させ、１０μｌのＮ−メチルモルホリン ／２−プロパノール／水（２／１０／８８ ｖ／ｖ／ｖ）の溶液中に溶かし、そ して固定化ＮＡＤアナログの２’，３’−ジアルデヒド基に結合させる。 このプライマー伸長産物をＮＭＭ溶液（各１００μｌで３回）および１０ｍＭ のＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ７．２（各１００μｌで３回）で充分に洗浄し、そして精 製されたプライマー伸長産物を、ｐＨ７．２の１０ｍＭのＴＥＡＡ緩衝液中のＮ ＡＤアーゼもしくはピロホスファターゼのい ずれかでの３７℃下、１５分間の処理により放出させ、凍結乾燥し、そしてこれ らの酵素を内部質量標準として用いるＥＳもしくはＭＡＬＤＩのいずれかのマス スペクトロメトリーにより分析する。 実施例５ 末端ヌクレオシドの糖部分の５’−位をグリシン残基により質量修飾させた核酸 プライマーの合成 オリゴヌクレオチドはβ−シアノエチルホスホアミデートを用いる標 ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２、４５３９（１９８４））により合成し、そ して５’−アミノ基を固相ＤＮＡ合成の最後に導入する（例えば、Ａｇｒａｗａ ｌ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１４、６２２７− ４５（１９８６）、もしくはＳｐｒｏａｔｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ． １５、６１８１−９６（１９８７））。０．２５μモルのＣ ＰＧ−結合化ヌクレオシドから開始するオリゴヌクレオチド合成物の総量を濃厚 なアンモニア水溶液で脱保護化させ、ＯｌｉｇｏＰＡＫ（商標）カートリッジ（ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．社、Ｂｅｄｆｏｒｄ 、ＭＡ）を介して精製し、そして凍結乾燥する。５’−末端アミノ基を有するこ の物質を１００μｌの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶かし 、そして１０μモルのＮ−Ｆｍｏｃ−グシリンのペンタフルオロフェニルエステ ルと、６０分間２５℃で縮合させる。エタノール沈殿および遠心の後に、このＦ ｍｏｃ基をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の１００μｌの２０％ピペリジン溶 液での１０分間の処理により開裂して除去する。余剰のペピリジン、ＤＭＦ、お よびＦｍｏｃ基か らの開裂産物をエタノール沈殿により除去し、そしてこの沈殿物を１０ｍＭのＴ ＥＡＡ緩衝液ｐＨ７．２から凍結乾燥させる。この物質を今度は、サンガーのＤ ＮＡ配列決定用反応用のプライマートして用いるか、あるいは一つもしくは複数 のグリシン残基（もしくは他の適切な保護化アミノ酸活性エステル）を添加して サンガーのＤＮＡもしくはＲＮＡ配列決定に適する一連の質量修飾プライマーオ リゴヌクレオチドを作製する。プライマー伸長後、配列決定法中にこれらの質量 修飾核酸プライマーＵＰ^0-iの固定化を、例えば実施例１−４に記載される要領 で実施することができる。 実施例６ ピリミジンヌクレオシドの複素環塩基のＣ−５をグリシン残基で質量修飾させた 核酸プライマーの合成 出発物質は、刊行物による方法（Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５、４８５７−７６（１９８７）） に従って製造した５−（３−アミノプロピニル−１）−３’，５’−ジ−ｐ−ト リルデオキシウリジンであり、そしてそれを３’，５’−ジ−Ｏ−アシル化した 。０．２８１ｇ（１．０ｍモル）の５−（３−アミノプロピニル−１）−２’− デオキシウリジンを、５ｍｌの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の０．９２ ７ｇ（２．０ｍモル）のＮ−Ｆｍｏｃ−グリシンのペンタフルオロフェニルエス テルと、０．１２９ｇ（１ｍモル；１７４μｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチ ルアミンの存在下、６０分間、室温で反応させた。溶媒をロータリー式蒸発機に より除去し、そしてこの生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｋｉｅｓｅｌ ｇｅｌ ６０、Ｍｅｒｃｋ社；カラム；２．５×５０ ｃｍ、クロロホルム／メタノール混合物による溶出）により精製した。収率は０ ．４４ｇ（０．７８ｍモル、７８％）であった。別のグリシン残基を添加する目 的で、Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中の２０％のピペリジン溶液での２０分間の処理で除 去し、吸引下で蒸発させ、そして残存する固形物質を２０ｍｌの酢酸エチルで３ 回抽出した。残存する酢酸エチルを除去させた後に、Ｎ−Ｆｍｏｃ−グリシンの ペンタフルオロフェニルエステルを既述の要領で結合させる。５−（３−（Ｎ− Ｆｍｏｃ−グリシル）−アミドプロピニル−１）−２’−デオキシウリジンを５ ’−Ｏ−ジメトキシトリチル化させたヌクレオシド−３’−Ｏ−β−シアノエチ ル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホアミデートに変換さ、そして標準 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２、２２６１（１９８４））内に取 り込ませる。化学的ＤＮＡ合成用のこのグリシン修飾チミジンアナログ構築用ブ ロックを使用して核酸プライマー配列中の一つもしくは複数のチミジン／ウリジ ンヌクレオチドを置換することができる。Ｆｍｏｃ基は、室温におけるＤＭＦ中 の２０％のピペリジン溶液での２０分間の処理を用いて固相合成の最後に除去す る。ＤＭＦはアセトニトリルでの洗浄段階により除去し、そしてこのオリゴヌク レオチドの脱保護化を行い、そして標準法での精製を行う。 実施例７ ピリミジンヌクレオシドの複素環塩基のＣ−５をβ−アラニン残基で質量修飾さ せた核酸プライマーの合成 出発物質は実施例６におけるものと同一であった。０．２８１ｇ（１．０ｍモ ル）の５−（３−アミノプロピニル−１）−２’−デオキシウリ ジンを５ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のＮ−Ｆｍｏｃ−β −アラニンのペンタフルオロフェニルエステル（０．９５５ｇ、２．０ｍモル） と、０．１２９ｇ（１７４μｌ；１．０ｍモル）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチ ルアミンの存在下、室温で６０分間反応させた。溶媒を除去し、そして生成物を 実施例６に記載される要領でシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。収 率は０．４２５ｇ（０．７４ｍモル、７４％）であった。別のβ−アラニン部分 は、Ｆｍｏｃ基の除去後に全く同じ方法で添加することができる。５−（３−（ Ｎ−Ｆｍｏｃ−β−アラニル）−アミドプロピニル−１）−２’−デオキシウリ ジンからの５’−Ｏ−ジメトキシトリチル化させたヌクレオシド−３’−Ｏ−β −シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホアミデートの製造および自動オ リゴヌクレオチド合成内への取り込みは標準条件下で実施する。この構築用ブロ ックを、核酸プライマー配列内のいずれかのチミジン／ウリジン残基と置換する ことができる。質量修飾ヌクレオチドをたった一つのみ取り込ませてある場合に は、実施例６および７に従って製造される核酸プライマー分子は１４ダルトンの 質量差を有するであろう。 実施例８ ピリミジンヌクレオシドの複素環塩基のＣ−５をエチレングリコールモノメチル エーテルで質量修飾させた核酸プライマーの合成 この実施例ではヌクレオシド構成成分として５−（３−アミノプロピニル−１ ）−２’−デオキシウリジンを用いる（実施例６および７を参照せよ）。この質 量修飾用官能基は以下に示す要領で取得した。５０ｍｌの無水ピリジン中に溶解 してある７．６１ｇ（１００．０ｍモル）の 新たに蒸留したばかりのグリコールモノメチルエーテルを、１０．０１ｇ（１０ ０．０ｍモル）の再結晶化無水コハク酸と、１．２２ｇ（１０．０ｍモル）の４ −Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンの存在下で、室温で一晩反応させた。この反 応を水（５．０ｍｌ）の添加により停止させ、この反応混合物を減圧下で蒸発さ せ、脱水トルエン（各２０ｍｌ）と共に２回共蒸発（ｃｏ−ｅｖａｐｏｒａｔｅ ｄ）させ、そしてその残渣を１００ｍｌのジクロロメタン中に再溶解した。この 溶液を、１０％のクエン酸水溶液（２×２０ｍｌ）で２回、次いで水（２０ｍｌ ）で一回連続的に抽出し、そして有機相を無水硫酸ナトリウムに通して脱水させ た。この有機相を減圧下で蒸発させ、その残渣を５０ｍｌのジクロロメタン中に 再溶解し、そして５００ｍｌのペンタン内に沈殿させ、そしてその沈殿物を減圧 下で乾燥させた。収率は１３．１２ｇ（７４．０ｍモル；７４％）であった。８ ．８６ｇ（５０．０ｍモル）のスクシニル化エチレングリコールモノメチルエー テルを、５％の脱水ピリジン（５ｍｌ）を含む１００ｍｌのジオキサン中に溶解 し、そして６．９６ｇ（５０．０ｍモル）の４−ニトロフェノールおよび１０． ３２ｇ（５０．０ｍモル）のジシクロヘキシルカルボジイミドを添加し、そして この反応を室温で４時間行わせた。ジシクロヘキシル尿素を濾過により除去し、 この濾液を減圧下で蒸発させ、そしてその残渣を５０ｍｌの無水ＤＭＦ中に再溶 解した。１２．５ｍｌ（約１２．５ｍモルの４−ニトロフェニルエステル）のこ の溶液を用いて２．８１ｇ（１０．０ｍモル）の５−（３−アミノプロピニル− １）−２’−デオキシウリジンを溶かした。この反応は、１．０１ｇ（１０．０ ｍモル；１．４ｍｌ）のトリエチルアミンの存在下、室温で一晩実施した。この 反応混合物を減圧下で蒸発させ、 トルエンと共に共蒸発させ、ジクロロメタン中に再溶解し、そしてジクロロメタ ン／メタノール混合物を用いるシリカゲル（ＳＩ６０、Ｍｅｒｃｋ社、カラム４ ×５０ｃｍ）上でのクロマトグラフにかけた。所望の化合物を含む分画を合わせ 、蒸発させ、２５ｍｌのジクロロメタン中に再溶解し、そして２５０ｍｌのペン タン中に沈殿させた。５−（３−Ｎ−（Ｏ−スクシニルエチレングリコールモノ メチルエーテル））−アミドプロピニル−１）−２’−デオキシウリジンの乾燥 化沈殿物（収率：６５％）を５’−Ｏ−ジメトキシトリチル化し、そしてヌクレ オシド−３’−Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホアミデー トに変換させ、そして構築用ブロックとして標準法に従う自動オリゴヌクレオチ ド合成内に取り込ませる。この質量修飾ヌクレオチドを、核酸プライマー配列中 の一つもしくは複数のチミジン／ウリジン残基と置換することができる。プライ マーオリゴヌクレオチドの脱保護化および精製も標準法に従う。 実施例９ ピリミジンヌクレオシドの複素環塩基のＣ−５をジエチレングリコールモノメチ ルエーテルで質量修飾させた核酸プライマーの合成 ヌクレオシド出発物質は以前の実施例におけるものと同一であり、５−（３− アミノプロピニル−１）−２’−デオキシウリジンであった。この質量修飾用官 能基は実施例８に類似する要領で取得した。５０ｍｌの無水ピリジン中に溶解さ せた１２．０２ｇ（１００．０ｍモル）の新たに蒸留したばかりのジエチレング リコールモノメチルエーテルを、１０．０１ｇ（１００．０ｍモル）の再結晶化 無水コハク酸と、１．２２ｇ（１０．０ｍモル）の４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ ピリジン（ＤＭＡ Ｐ）の存在下、室温で一晩反応させた。処理の詳細は実施例８に記載されるもの と同一であった。収率は１８．３５ｇ（８２．３ｍモル、８２．３％）。１１． ０６ｇ（５０．０ｍモル）のスクシニル化させたジエチレングリコールモノメチ ルエーテルを４−ニトロフェニルエステルに変換させ、そしてその後に１２．５ ｍモルを２．８１ｇ（１０．０ｍモル）の５−（３−アミノプロピニル−１）− ２’−デオキシウリジンと、実施例８に記載される要領で反応させた。シリカゲ ルカラムクロマトグラフィーおよびペンタン内への沈殿後の収率は３．３４ｇ（ ６．９ｍモル、６９％）であった。ジメトキシトリチル化およびヌクレオシド− β−シアノエチルホスホアミデートへの変換後、この質量修飾構築用ブロックを 標準法に従って自動の化学的ＤＮＡ合成内に取り込ませる。核酸プライマ−ＵＰ^0-i の配列内に含まれる一つもしくは複数のチミジン／ウリジン残基をこの質量 修飾ヌクレオチドで置換することができる。たった一つのみの質量修飾ヌクレオ チドが取り込まれる場合には、実施例８および９の核酸プライマーは４４．０５ ダルトンの質量差を有するであろう。 実施例１０ デオキシアデノシンの複素環塩基のＣ−８をグリシンで質量修飾させた核酸プラ イマーの合成 出発物質は、刊行物（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｓ Ｒｅｓ． １８、３３３９−４５（１９９０））に従って製造したＮ⁶−ベ ンゾイル−８−ブロモ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’− デオキシアデノシンであった。６３２．５ｍｇ（１．０ｍモル）のこの８−ブロ モ−デオキシアデノシン誘導体を５ ｍｌの無水エタノール中に懸濁させ、そして２５１．２ｍｇ（２．０ｍモル）の グリシンメチルエステル（塩酸塩）と、２４１．４ｍｇ（２．ｌｍモル；３６６ μｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの存在下で反応させ、そして薄層 クロマトグラフィー（ＴＣＬ）により検査する際に出発用のヌクレオシド物質が 消失するまで（４−６時間）還流させた。溶媒を蒸発させ、そしてその残渣を０ ．１％のピリジンを含むクロロホルム／メタノールの溶媒混合物を用いるシルカ ゲルクロマトグラフィー（カラム２．５×５０ｃｍ）により精製した。生成物の 分画を合わせ、そして溶媒を蒸発させ、これらの分画を５ｍｌのジクロロメタン 中に溶解し、そして１００ｍｌのペンタン中に沈殿させた。収率は４８７ｍｇ（ ０．７６ｍモル、７６％）であった。対応するヌクレオシド−β−シアノエチル ホスホアミデートへの変換および自動の化学的ＤＮＡ合成内への組込みは標準条 件下で実施する。濃厚なアンモニア水溶液での最終脱保護化の間にメチル基をグ リシン部分から除去する。この質量修飾構築用ブロックを、その核酸プライマー 配列内の一つもしくは複数のデオキシアデノシン／アデノシン残基と置換するこ とができる。 実施例１１ デオキシアデノシンの複素環塩基のＣ−８をグリシルグリシンで質量修飾させた 核酸プライマーの合成 この誘導体は、実施例１０のグリシン誘導体に類似する要領で製造した。６３ ２．５ｍｇ（１．０ｍモル）のＮ⁶−ベンゾイル−８−ブロモ−５’−Ｏ−（４ ，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシアデノシンを５ｍｌの無水エタ ノール中に懸濁させ、そして３２４．３ｍｇ（２．０ｍモル）のグリシル−グリ シンメチルエステルと、２４１．４ ｍｇ（２．１ｍモル、３６６μ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの存在 下で反応させた。この混合物を還流させ、そして反応の完了をＴＬＣにより検査 した。詳細な操作法および精製法は実施例１０に記載されるものに類似していた 。シリカゲルカラムクロマトグラフィーおよびペンタン内への沈殿後の収率は４ ６４ｍｇ（０．６５ｍモル、６５％）であった。ヌクレオシド−β−シアノエチ ルホスホスアミデートへの変換および合成オリゴヌクレオチドへの組込みは標準 法に従って実施する。核酸プライマー内中のたった一つのデオキシアデノシン／ アデノシン残基がこの質量修飾ヌクレオチドで置換される場合には、実施例１０ および１１の核酸プライマー間の質量差は５７．０３ダルトンである。 実施例１２ ２’−アミノ−２’−デオキシチミジンの糖部分のＣ−２’をエチレングリコー ルモノメチルエーテル残基で質量修飾させた核酸プライマーの合成 出発物質は、公表されている方法（例えば、Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． ３６、２５０−２５４（１９７１）；Ｓａｓａｋ ｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． ４１、３１３８−３１４（１９７ ６）；Ｉｍａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． ４４、２０３ ９−２０４１（１９７９）；Ｈｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ ． ４２、７１４−７１９（１９７６）；Ｉｋｅｈａｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｃｈ ｅｍ． Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．Ｊａｐａｎ ２６、２４０−２４４（１９７８ ）；ＰＣＴ出願国際公開第８８／００２０１号も参照せよ）に従って合成された ５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチル）−２’−アミノ−２’−デオキ シチミジンであった。５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチル）−２’−アミ ノ−２’−デオキシチミジン（５５９．６２ｍｇ；１．０ｍモル）を、１０ｍｌ の脱水ＤＭＦ中の２．０ｍモルのスクシニル化エチレングリコールモノメチルエ ーテルの４−ニトロフェニルエステル（実施例８を参照せよ）と、１．０ｍモル （１４０ｐｌ）のトリエチルアミンの存在下、室温で１８時間反応させた。この 反応混合物を減圧下で蒸発させ、トルエンと共蒸発させ、ジクロロメタン中に再 溶解させ、そしてシリカゲルクロマトグラフィー（Ｓｉ６０、Ｍｅｒｃｋ社；カ ラム：２．５×５０ｃｍ；溶出液：０．１％のトリエチルアミンを含むクロロホ ルム／メタノールの混合物）により精製した。生成物を含有する分画を合わせ、 蒸発させ、そしてペンタン中に沈殿させる。収率は５２４ｍｇ（０．７３ｍモル ；７３％）であった。ヌクレオシド−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピ ルホスホアミデートへの変換および自動の化学的ＤＮＡ合成内への組込みは標準 法により実施する。質量修飾デオキシチミジン誘導体を、核酸プライマー内の一 つもしくは複数のチミジン残基と置換することができる。 類似する方法で、スクシニル化ジエチレングリコールモノメチルエーテル（実 施例９を参照せよ）およびトリエチレングリコールモノメチルエーテルの４−ニ トロフェニルエステルを利用することにより対応する質量修飾オリゴヌクレオチ ドを調製する。たった一つのみの質量修飾ヌクレオシドがこの配列内に取り込ま れる場合には、エチレン、ジエチレン、およびトリエチレングリコール誘導体間 の質量差はそれぞれ４４．０５、８８．１、および１３２．１５ダルトンになる 。 実施例１３ ホスホロチオエート基のアルキル化を介してヌクレオチド間連結を質量修飾させ た核酸プライマーの合成 ホスホロチオエート含有性オリゴヌクレオチドは標準法（例えば、Ｇａｉｔ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９ １１８３（１９ ９１）、を参照せよ）に従って製造した。一つの、幾つかの、あるいは全てのヌ クレオチド間連結をこの方法で修飾することができる。（−）−Ｍ１３核酸プラ イマー配列（１７量体） ケールで合成し、そして最終合成周期（Ｇ−Ｔ結合）の後に一つのホスホロチオ エート基を導入させた。硫化、脱保護化、および精製は標準法に従った。収率は ３１．４ｎモル（総収率１２．６％）であり、これは３１．４ｎモルのホスホロ チオエート基に相当する。アルキル化はこの残渣を３１．４μｌのＴＥ緩衝液（ ０．０１Ｍのトリス ｐＨ８．０、０．００１ＭのＥＤＴＡ）に溶解し、そして Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の１６μｌの２０ｍＭ ２−ヨード エタノールの溶液（３２０ｎモル、すなわちホスホロチオエートジエステルに関 して１０倍過剰）を添加することにより実施した。アルキル化オリゴヌクレオチ ドを標準的な逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−１８ Ｕｌｔｒａｐｈｅｒｅ、Ｂｅｃｋｍａ ｎ社；カラム：４．５×２５０ｍｍ；１０ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム、 ｐＨ７．０および５−４０％のアセトニトリルの濃度勾配液）により精製した。 この方法の変法においては、一つもしくは複数のホスホロチオエートホスホジ エステル結合を含む核酸プライマーをサンガーの配列決定用反応に用いる。４つ の配列決定用反応のプライマー伸長産物を実施例１− ４に例示する要領で精製し、開裂により固体支持体から取り外し、凍結乾燥させ 、そして各４μｌのＴＥ緩衝液ｐＨ８．０中に溶かし、そしてＤＭＦ中の２μｌ の２０ｍＭ ２−ヨードエタノール溶液の添加によりアルキル化させる。その後 にこれをＥＳおよび／またはＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーにより分析する 。 類似する方法においては、２−ヨードメタノールの代わりに例えば３−ヨード プロパノール、４−ヨードブタノールを利用して、未修飾ホスホロチオエートホ スホジエステル含有性オリゴヌクレオチドと比較してそれぞれ質量差が１４．０ ３、２８．０６、および４２．０３ダルトンとなる質量修飾核酸プライマーを取 得する。 実施例１４ ２’−もしくは３’−アミノ官能基をグリシンもしくはβ−アラニン残基で質量 修飾させた２’−アミノ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸および３’ −アミノ−２’，３’−ジデオキシチミジン−５’−三リン酸の合成 出発物質は、刊行物（Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈ ｅｍ． ３６、２５０（１９７１））に従って調製された２’−アジド−２’− デオキシウリジンであり、これを、標準条件を用いる一つの容器で行う反応（ｏ ｎｅ−ｐｏｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ）でピリジン中の塩化４，４−ジメトキシトリ チルで５’−ＯＨを４，４−ジメトキシトリチル化し、そして無水酢酸で３’− ＯＨをアセチル化した。出発物質として１９１ｍｇ（０．７１ｍモル）の２’− アジド−２’−デオキシウリジンを用いて、３９６ｍｇ（０．６５ｍモル、９０ ．８％）の５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−アセチル− ２’−アジド−２’−デオキシウリジンを、シリカゲルクロマトグラフィーを介 する精製後に取得した。アジド基の還元は、公表されている条件（Ｂａｒｔａ ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４６、５８７−５９４（１９９０）） を用いて実施した。シリカゲルクロマトグラフィー後の５’−Ｏ−（４，４−ジ メトキシトリチル）−３’−Ｏ−アセチル−２’−アミノ−２’−デオキシウリ ジンの収率は２８８ｍｇ（０．４９ｍモル；７６％）であった。保護化してある この２’−アミノ−２’−デオキシウリジン誘導体（５８８ｍｇ）１．０ｍモル ）を、１０ｍｌの脱水ＤＭＦ中の２等量（９２７ｍｇ）２．０ｍモル）のＮ−Ｆ ｍｏｃ−グリシンペンタフルオロフェニルエステルと、室温で一晩、１．０ｍモ ル（１７４μｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの存在下で反応させた 。溶媒を減圧下での蒸発により除去し、そしてこの残渣をシリカゲルクロマトグ ラフィーにより精製した。収率は７１１ｍｇ（０．７１ｍモル、８２％）であっ た。脱トリチル化は、室温での８０％の酢酸水溶液を用いる１時間の処理により 実施した。この残渣を乾燥するまで蒸発させ、トルエンと共に２度共蒸発させ、 １ｍｌの脱水アセトニトリル中に懸濁させ、そして刊行物（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ ４２、３５０５（ １９６９）、およびＳｏｗａ ｅｔ ａｌ．、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊ ａｐａｎ ４８、２０８４（１９７５））に従いＰＯＣｌ₃で５’−リン酸化さ せ、そして刊行物（例えば、Ｓｅｅｌａ ｅｔ ａｌ．、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ． 、７４、１０４８（１９９１））に従い、ＤＭＦ中 の３ｍｌの０．５Ｍ（１．５ｍモル）テトラ（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム） ピロリン酸を用いて直接一つの容器 内での反応で５’−三リン酸へと変換させた。Ｆｍｏｃおよび３’−Ｏ−アセチ ル基を、室温における濃厚なアンモニア水溶液での１時間の処理により除去し、 そしてこの反応混合物を蒸発させ、そして凍結乾燥させた。精製法も、重炭酸ト リエチルアンモニウムの直線濃度勾配液（０．１Ｍ−１．０Ｍ）を用いるＤＥＡ Ｅ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）上での陰イオン交換クロマトグラフィ ーを用いることにより標準法に従った。 三リン酸含有性分画（ポリエチレンイミンセスロースプレート上での薄層クロ マトグラフィーにより検査する）を回収し、蒸発させ、そして凍結乾燥させた。 収率（ウラシル部分のＵＶ−吸収による）は６８％（０．４８ｍモル）であった 。 グリシル−グリシン修飾化２’−アミノ−２’−デオキシウリジン−５’−三 リン酸を、室温におけるＤＭＦ中の２０％ピペリジン溶液での１時間の処理、溶 媒の蒸発、トルエンとの２回の共蒸発、およびＮ−Ｆｍｏｃ−グリシンペンタフ ルオロフェニルエステルとの後続の縮合により５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシ トリチル）−３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｎ−（Ｎ−９−フルオレニルメトキシ カルボニルーグリシル）−２’−アミノ−２’−デオキシウリジンからＦｍｏｃ を除去することにより取得した。１．０ｍモルの２’−Ｎ−グリシル−２’−ア ミノ−２’−デオキシウリジン誘導体で出発し、そして既述の方法に従って、０ ．７２ｍモル（７２％）の対応する２’−（Ｎ−グリシル−グリシル）−２’− アミノ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸を取得した。 ５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−アセチル−２’−ア ミノ−２’−デオキシウリジンで出発し、そしてＮ−Ｆｍｏｃ −β−アラニンペンタフルオフロフェニルエステルと共有結合させて、対応する ２’−（Ｎ−β−アラニル）−２’−アミノ−２’−デオキシウリジン−５’− 三リン酸を合成することができる。これらの修飾化ヌクレオシド三リン酸を、サ ンガーのＤＮＡ配列決定法中にプライマー伸長産物内に組み込ませる。グリシン 、β−アラニン、およびグリシル−グリシン質量修飾ヌクレオチド間の質量差は 、取り込ませたヌクレオチド当たりそれぞれ５８．０６、７２．０９、および１ １５．１ダルトンである。 ５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチル）−３’−アミノ−２’，３’−ジ デオキシチミジン（公表されている方法により取得する、実施例１２を参照せよ ）で出発する場合には、対応する３’−（Ｎ−グリシル）−３’−アミノ−／３ ’−（−Ｎ−グリシル−グリシル）−３’−アミノ／および３’−（Ｎ−β−ア ラニル）−３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシチミジン−５’−三リン酸を 取得することができる。これらの質量間変化ヌクレオシド三リン酸はサンガーの ＤＮＡ配列決定用反応における停止用ヌクレオチド単位として役立ち、多重配列 決定用モードにおいて用いる際には停止化フラグメント当たり、それぞれ５８． ０６、７２．０９、および１１５．１ダルトンの質量差を生じる。その後にこの 質量修飾フラグメントをＥＳおよび／またはＭＡＬＤＩマススペクトロメトリー により分析することができる。 実施例１５ 複素環塩基のＣ−５をグリシン、グリシル−グリシン、およびβ−アラニン残基 で質量修飾させたデオキシウリジン−５’−三リン酸の合成 ０．２８１ｇ（１．０ｍモル）の５−（３−アミノプロピニル−１） −２’−デオキシウリジン（実施例６を参照せよ）を、５ｍｌの脱水ＤＭＦ中の ０．９２７ｇ（２．０ｍモル）のＮ−Ｆｍｏｃ−グリシンペンタフルオロフェニ ルエステルもしくは０．９５５ｇ（２．０ｍモル）のＮ−Ｆｍｏｃ−β−アラニ ンペンタフルオロフェニルエステルのいずれかと、０．１２９ｇのＮ，Ｎ−ジイ ソプロピルエチルアミン（１７４μｌ、１．０ｍモル）の存在下で室温で一晩反 応させた。溶媒を減圧下での蒸発により除去し、そしてこの縮合生成物をシリカ ゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（Ｓｔｉｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｏ ｒｇ．Ｃｈｅｍ． ４３、２９２３−２９２５（１９７８））により精製した。 収率は、グリシンについては４７６ｍｇ（０．８５ｍモル：８５％）、そしてβ −アラニン誘導体については４３６ｍｇ（０．７６ｍモル；７６％）であった。 グリシル−グリシン誘導体の合成については、１．０ｍモルのＦｍｏｃ−グリシ ン−デオキシウリジン誘導体のＦｍｏｃ基を、室温下、ＤＭＦ中の２０％のピペ リジンでの１時間の処理により除去した。溶媒を減圧下での蒸発により除去し、 この残渣をトルエンと２回共蒸発させ、そして０．９２７ｇ（２．０ｍモル）の Ｎ−Ｆｍｏｃ−グリシンペンタフルオロフェニルエステルと縮合させ、そして既 述の要領で精製した。収率は４４５ｍｇ（０．７２ｍモル；７２％）であった。 Ｆｍｏｃ基でＮ−保護化させてあるグリシル−、グリシル−グリシル−、および β−アラニル−２’−デオキシウリジン誘導体を、一つの容器内での反応でピリ ジン中の塩化４，４−ジメトキシトリチルでのトリチル化およびピリジン中の無 水酢酸でのアセチル化により３’−Ｏ−アセチル誘導体に変換させ、そしてその 後に標準法に従う８０％酢酸水溶液での１時間の処理により脱トリチル化させた 。溶媒を除去し、この残渣を １００ｍｌのクロロホルム中に溶かし、そして５０ｍｌの１０％重炭酸ナトリウ ムで２回、次いで５０ｍｌの水で１回抽出し、そして硫酸ナトリウムで脱水させ 、溶媒を蒸発させ、そしてこの残渣をシリカゲル上でのフラッシュクロマトグン ラフィーにより精製した。収率はそれぞれ、グリシル−については３６１ｍｇ（ ０．６０ｍモル；７１％）、β−アラニル−については３５１ｍｇ（０．５７ｍ モル；７５％）、そしてグリシル−グリシル−３−Ｏ’−アセチル−２’−デオ キシウリジン誘導体については３２３ｍｇ（０．４９ｍモル；６８％）であった 。ＰＯＣｌ₃を用いる５’−ＯＨのリン酸化、ＤＭＦ中のテトラ（トリ−ｎ−ブ チルアンモニウム）ピロリン酸でのインサイチュー反応による５’−三リン酸へ の変換、３’−脱−Ｏ−アセチル化、Ｆｍｏｃ基の開裂、およびＤＥＡＥ−セフ ァデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）上での陰イオン交換クロマトグラフィーによる 最終精製は、実施例１４に記載される要領で実施した。ウラシル部分のＵＶ−吸 収による収率は、０．４１ｍモルの５−（３−（Ｎ−グリシル）−アミドプロピ ニル−１）−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸（８４％）、０．４３ｍ モルの５−（３−（Ｎ−β−アラニル）−アミドプロピニル−１）−２’−デオ キシウリジン−５’−三リン酸（７５％）、および０．３８ｍモルの５−（３− （Ｎ−グリシル−グリシル）−アミドプロピニル−１）−２’−デオキシウリジ ン−５’−三リン酸（７８％）であった。 これらの質量修飾ヌクレオシド三リン酸を、サンガーのＤＮＡ配列決定用プラ イマー伸長反応中に取り込ませた。 出発物質として５−（３−アミノプロピニル−１）−２’，３’−ジデオキシ ウリジンを使用し、そして類似の反応配列に従う場合には、対 応するグリシル−、グリシル−グリシル−、およびβ−アラニル−２’，３’− ジデオキシウリジン−５’−三リン酸を、それぞれ６９、６３、および７１％の 収率で取得した。これらの質量修飾ヌクレオシド三リン酸は、サンガーのＤＮＡ 配列決定用反応中の鎖停止用ヌクレオチドとして役立つ。質量修飾配列決定用ラ ダーをＥＳもしくはＭＡＬＤＩのいずれかのマススペクトロメトリーにより分析 する。 実施例１６ ８−グリシル−、および８−グリシル−グリシル−２’−デオキシアデノシン− ５’−三リン酸の合成 、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３７、３６２（１９８１））に従って製造した７２ ７ｍｇ（１．０ｍモル）のＮ⁶−（４−第三級−ブチルフェノキシアセチル）− ８−グリシル−５’−（４，４−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシアデノ シンもしくは８００ｍｇ（１．０ｍモル）のＮ⁶−（４−第三級−ブチルフェノ キシアセチル）−８−グリシル−グリシル−５’−（４，４−ジメトキシトリチ ル）−２’−デオキシアデノシンを、実施例１４に記載される要領で、一つの容 器内での反応で、３’−ＯＨをピリジン中の無水酢酸でアセチル化させ、８０％ の酢酸で５’一位を脱トリチル化させ、そしてＰＯＣｌ₃を用いるリン酸化およ びテトラ（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロリン酸を用いるインサイチュー での反応を介して５’−三リン酸へと変換させた。グリシン残基におけるＮ⁶− 第三級−ブチルフェノキシアセチル、３’−Ｏ−アセチル、およびＯ−メチル基 の脱保護化は、室温下で９０分間、濃厚なアンモニア水溶液を用いて実施した。 アンモニアを凍結乾燥により除去し、 そして残渣をジクロロメタンで洗浄し、溶媒を減圧下で除去して、そして残存す る固形物質を、０．１−１．０Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウムの直線濃度勾 配液を用いるＤＥＡＥ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｅｘ）上での陰イオン交換 クロマトグラフィーにより精製した。ヌクレオシド三リン酸含有性分画（ポリエ チレンイミンセルロースプレート上でのＴＬＣにより検査する）を合わせ、そし て凍結乾燥させた。８−グリシル−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸 （アデニン部分のＵＶ−吸収により決定する）の収率は５７％（０．５７ｍモル ）であった。８−グリシル−グリシル−２’−デオキシアデノシン−５’−三リ ン酸の収率は５１％（０．５１ｍモル）であった。 これらの質量修飾ヌクレオシド三リン酸は、サンガーのＤＮＡ配列決定用反応 の際のプライマー伸長中に取り込ませた。 出発物質として標準法（例えば、２’，３’−官能基の導入については、Ｓｅ ｅｌａ ｅｔ ａｌ．、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ７４ 、１０４８−１０５８（１９９１）、を参照せよ）に従って製造した対応するＮ⁶ −（４−第三級−ブチルフェノキシアセチル）−８−グリシル−もしくはグリ シル−グリシル−５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチル）−２’，３’−ジ デオキシアデノシン誘導体を用い、そして既述の要領で類似する反応配列を用い る場合、鎖停止用の質量修飾ヌクレオシド三リン酸８−グリシル−および８−グ リシル−グリシル−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−三リン酸を、各 々５３および４７％の収率で取得した。この質量修飾配列決定用フラグメントラ ダーは、ＥＳもしくはＭＡＬＤＩのいずれかのマススペクトロメトーにより分析 する。 実施例１７ 鎖伸長用の２’−デオキシ−および鎖停止用の２’，３’−ジデオキシチミジン −５’−（アルファー−Ｓ−）−三リン酸の取り込み、ならびに２−ヨードエタ ノールおよび３−ヨードプロパノールでの後続のアルキル化によるサンガーのＤ ＮＡ配列決定用フラグメントラダーの質量修飾 ２’，３’−ジデオキシチミジン−５’−（アルファー−Ｓ−）−三リン酸は 、公表されている方法（例えば、アルファー−Ｓ−三リン酸部分については：Ｅ ｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５、１６８５（ １９７６）およびＡｃｃｏｕｎｔｓ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ． １２、２０４（１９ ７８）、ならびに２’，３’−ジデオキシ部分については：Ｓｅｅｌａ ｅｔ ａｌ．、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、７４、１０４８−１ ０５８（１９９１）、を参照せよ）に従って製造した。２’−デオキシチミジン −５’−（アルファー−Ｓ）−三リン酸を利用するサンガーのＤＮＡ配列決定用 反応は、標準法（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ． ５４、３６７（１９８５））に従って実施する。２’，３’−ジデオキシチ ミジン−５’−（アルファー−Ｓ）−三リン酸を用いる場合には、標準的なサン ガーのＤＮＡ配列決定法（例えば、Ｓｗｅｒｄｌｏｗ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８、１４１５−１４１９（１９９０）、を参 照せよ）における未修飾の２’，３’−ジデオキシチミジン−５’−三リン酸の 代わりにこれを用いる。鋳型（２ｐモル）および実施例１に従って修飾させたＭ １３配列決定用プライマー（４ｐモル）を、１００ｐｌの１０ｍＭトリス−ＨＣ Ｉ ｐ Ｈ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０ｍＭのＮａＣｌ、７ｍＭのジチオスレイ トール（ＤＴＴ）中で６５℃に５分間加熱し、そして１時間の期間をかけてゆっ くりと３７℃に戻すことによりアニールさせる。この配列決定用反応混合物は、 Ｔ−特異的停止反応を例にすると、１５０μｌの最終容量中に、各２００μＭの （最終濃度）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、３００ｐＭのｃ７−デアザ−ｄＧ ＴＰ、５μＭの２’，３’−ジデオキシチミジン−５’−（アルファー−Ｓ）− 三リン酸および４０単位のセクアナーゼ（Ｓｅｑｕａｎａｓｅ）（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を含む。重合を３７℃下で１０ 分間実施し、この反応混合物を７０℃に加熱してセクアナーゼ（Ｓｅｑｕａｎａ ｓｅ）を不活化させ、エタノール沈殿を行い、そして実施例１に記載する要領で チオール化セクエロン（Ｓｅｑｕｅｌｏｎ）膜ディスク（直径８ｍｍ）に結合さ せる。アルキル化は、実施例１に記載される要領で、ＮＭＭ（Ｎ−メチルモルホ リン／水／２−プロパノール、２／４９／４９ ｖ／ｖ／ｖ）中の１０μｌの１ ０ｍＭ ２−ヨードエタノールもしくは３−ヨードプロパノールのいずれかの溶 液でそのディスクを処理すること（３回）、１０μｌのＮＭＭでの洗浄（３回） 、およびＤＴＴでの処理による支持体からのアルキル化Ｔ−停止化プライマー伸 長産物を開裂させることにより実施する。質量修飾フラグメントファミリーの分 析は、ＥＳもしくはＭＡＬＤＩのいずれかのマススペクトロメトリーを用いて実 施する。 実施例１８ オリゴチミジン酸の混合物の分析 オリゴチミジン酸であるオリゴｐ（ｄＴ）_12-18は市販品として入手 することができる（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社、 Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）。一般的には、エタノール中の０．５Ｍのマトリッ クス溶液を調製する。３，５−ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸、３−ヒドロ キシピコリン酸、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノンのような様々なマ トリックスをこの実施例および実施例１９−２１用に用いる。オリゴヌクレオチ ドはＨＰＣＬによる精製後に凍結乾燥させ、そして保存溶液としての１０ｐモル ／μｌの濃度を取得するための量を用いて超純水（ＭｉｌｌｉＱ、Ｍｉｌｌｉｐ ｏｒｅ社）中に溶かす。この濃度のアリコート（１μｌ）もしくは超純水中の希 釈物を、プローブチップ（ｐｒｏｂｅ ｔｉｐ）として役立つ平らな金属表面上 で１μｌのマトリックス溶液と混合させ、そして冷空気を用いて送風機で乾燥さ せた。幾つかの実験においては、酸形態をとる陽イオン−イオン交換ビーズをマ トリックスと試料溶液との混合物に添加する。 この実施例および実施例１９−２１については、Ｖｉｓｉｏｎ ２０００（Ｆ ｉｎｎｉｇａｎ−ＭＡＴ社）、ＶＧ ＴｏｆＳｐｅｃ（Ｆｉｓｏｎｓ Ｉｎｓｔ ｒｕｍｅｎｔｓ社）、Ｌａｓｅｒ Ｔｅｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｖｅｓｔｅｃ社 ）のような様々な市販の装置でのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを取得した。こ の実施例についての条件は、２５ｋＶの加速電圧を用いる直線陰イオンモードで あった。得られるＭＡＬＤＥ−ＴＯＦスペクトルを図１４に示す。質量検量は外 部標準を用いて行うが、これは一般的には、インシュリン、グラミシジンＳ、ト リプシノゲン、ウシ血清アルブミン、およびチトクロームＣのような適切な質量 範囲の特定されたペプチドを用いることにより達成した。全てのスペクトルとも 、３３７ｎｍの波長での５ｎ秒パルスを用いる窒素レーザーを 利用して取得した。レーザーエネルギーは１０⁶および１０⁷Ｗ／ｃｍ²の間で変 化した。シグナル−対−ノイズ比を改善するためには一般的に１０−３０のレー ザーショットの強度を累積した。 実施例１９ ５０量体および９９量体のマススペクトロメトリー分析 ２つの大きなオリゴヌクレオチドをマススペクトロメトリーにより分 を用いた。これらのオリゴヌクレオチドは、β−シアノエチルホスホアミデート を使用して合成し、そして公表されている方法（例えば、Ｎ．Ｄ．Ｓｉｎｈａ、 Ｊ．Ｂｉｅｒｎａｔ、Ｊ．ＭｃＭａｎｕａｓ ａｎｄ ４５３９（１９８４））を利用し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉ ｔｙ、ＣＡ）もしくはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｍｉｌｆｏｒ ｄ、ＭＡ）のいずれかから市販品として入手することができるＤＮＡ合成機、お よびＷａｔｅｒｓ社（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）からのＲＰ１８逆相カラムを利用 して精製した。マススペクトロメトリー分析用の試料は実施例１８に記載される 要領で調製した。各オリゴヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析用に用いた条件 は、５００ｆモルの各オリゴヌクレオチド、５ｋＶの加速を用いる反射陽イオン モード、および２０ｋＶの後段加速であった。得られるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペ クトルを積層し、そして図１５に示す。 実施例２０ 図２のＤＮＡ配列決定結果のシミュレーション 実施例１９に記載される５０量体（配列番号３）についてのサンガーのＤＮＡ 配列決定法のｄＴ−停止化ネステットフラグメントを代表する１３のＤＮＡ配列 を実施例１９に記載する要領で合成した。これらの試料の処理を行い、そして５ ００ｆモルの各フラグメントを実施例１８に記載される要領でＭＡＬＤＩ−ＭＳ により分析した。得られるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを図１６Ａ−１６Ｍに 示す。条件は、５ｋＶの加速を用いる反射陽イオンモードおよび２０ｋＶの後段 加速であった。算出された分子量および実験的分子量を表１に示す。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペトルを積層し（図１７Ａおよび１７Ｂ）、個々のピー クが１０量体と１１量体（上部パネル）、ならびに３７量体と３８量体（下部パ ネル）との間でさえも解像可能であることを証明した。これらの２つのパネルは 、２つの異なるスケールおよびそれぞれのスケールで分析したスペクトルを示す 。 実施例２１ 質量修飾オリゴヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析 １７量体を一つもしくは二つのデオキシウリジン部分のＣ−５で質量修飾させ た。５−［１３−（２−メトキシエトキシ）−トリデシネ−１−イル］−５’− Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジン−３’−β−シ アノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホアミデートを使用して、実施例１９ に記載される方法を用いて修飾１７量体を合成した。 修飾１７量体は、 ［式中、Ｘ＝−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ₂）₁₁−ＯＨ である］ （未修飾１７量体：分子量：５２７３） であった。 試料を調製し、そして５００ｆモルの各修飾１７量体を実施例１８に記載され る要領でＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて分析した。用いた条件は、５ｋＶの加速を用 いる反射陽イオンモードおよび２０ｋＶの後段加速であった。得られるＭＡＬＤ Ｉ−ＴＯＦスペクトルを積層し、そして図１８に示す。 先に引用する引用文献および刊行物は全て、引用することにより本明細書に取 り込まれる。 等価物 当業者は、本明細書に記載される具体的な方法の数々の等価物に気が付くであ ろうし、あるいは通常の実験程度のものを用いてそれらを立証することができる であろう。このような等価物は本発明の範囲内に含まれ、そして以下に示す請求 の範囲により保護されるものとみなす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ａ）配列決定を行うべき核酸に相補的な相補的核酸を、ある核酸プライ マーから出発し、そして鎖停止用および鎖伸長用ヌクレオチドの存在下において 合成し、その結果４組の塩基特異的停止化相補的核酸フラグメントを産生する段 階、 ｂ）マススペクトロメトリーによりその４組の塩基特異的停止化フラグメント の各々における各ネステットフラグメントの分子量値を決定する段階［この場合 、少なくとも２つの塩基特異的停止化フラグメントの分子量値を同時に決定する ］、および ｃ）分子量に従ってその４組の分子量値を整列させることによりヌクレオチド 配列を決定する段階、 を含む、核酸の配列決定法。 ２． ４組の塩基特異的停止化フラグメントを、マススペクトロメトリーによ り分子量値を決定する前に精製する、請求の範囲１に記載の方法。 ３．ａ）固体支持体上に相補的核酸を固定化する段階、および ｂ）残存する全ての反応物および副産物を洗浄して除去する段階、 を含む、４組の塩基特異的停止化フラグメントを精製する、請求の範囲２に記載 の方法。 ４． 固体支持体から相補的核酸を除去する段階を更に含む、請求の範囲３に 記載の方法。 ５． 相補的核酸のリン酸主鎖の対イオンを除去するか、あるいはこれを第二 対イオンで交換し、その第二対イオンによりマススペクトロメトリーによる分子 量値の決定の段階が可能になる、請求の範囲１に記載 の方法。 ６． ４組の塩基特異的停止化フラグメントの各々を別々の反応容器内で合成 する、請求の範囲１に記載の方法。 ７． ヌクレオチド配列を決定する段階が更に、その４組の塩基特異的停止化 フラグメントの各々について決定された分子量値を内挿することを含む、請求の 範囲６に記載の方法。 ８． ４組の塩基特異的停止化フラグメントの内の少なくとも２つを同じ反応 容器内で同時に合成する、請求の範囲１に記載の方法。 ９． 相補的核酸への一つの種の鎖停止用ヌクレオチドの添加を、同じ反応容 器内に存在する他の全ての種の鎖停止用ヌクレオチドの添加からマススペクトロ メトリーにより識別することができるように鎖停止用ヌクレオチドを選択する、 請求の範囲８に記載の方法。 １０． 各ネステットフラグメントの分子量値をマトリックス補助化レーザー脱 離／イオン化マススペクトロメトリー（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）により決定する、請 求の範囲１に記載の方法。 １１． 各ネステットフラグメントの分子量値を電子噴霧式マススペクトロメト リー（ＥＳ−ＭＳ）により決定する、請求の範囲１に記載の方法。 １２． 相補的核酸を、一つの核酸プライマー；デオキシアデノシン三リン酸ｄ ＡＴＰ、デオキシチミジン三リン酸ｄＴＴＰ、デオキシグアノシン三リン酸ｄＧ ＴＰ、デオキシシチジン三リン酸ｄＣＴＰ、デオキシイノシン三リン酸ｄＩＴＰ 、７−デアザデオキシヌクレオシド三リン酸ｃ⁷ｄＧＴＰ、７−デアザデオキシ ヌクレオシド三リン酸ｃ⁷ｄＡＴＰ、そして７−デアザデオキシヌクレオシド三 リン酸ｃ⁷ｄＩＴＰからなる 群から選択される少なくとも一つのデオキシヌクレオチド；ジデオキシアデノシ ン三リン酸ｄｄＡＴＰ、ジデオキシチミジン三リン酸ｄｄＴＴＰ、ジデオキシグ アノシン三リン酸ｄｄＧＴＰ、およびジデオキシシチジン三リン酸ｄｄＣＴＰか らなる群より選択される少なくとも一つの鎖停止用ジデオキシヌクレオチド；な らびに一つのＤＮＡポリメラーゼを用いて合成する、請求の範囲１に記載の方法 。 １３． 相補的核酸を、一つの核酸プライマー；アデノシン三リン酸ＡＴＰ、ウ リジン三リン酸ＵＴＰ、グアノシン三リン酸ＧＴＰ、シチジン三リン酸ＣＴＰ、 イノシン三リン酸ＩＴＰ、７−デアザヌクレオシド三リン酸ｃ⁷ＡＴＰ、７−デ アザヌクレオシド三リン酸ｃ⁷ＧＴＰ、および７−デアザヌクレオシド三リン酸 ｃ⁷ＩＴＰからなる群より選択される少なくとも一つのヌクレオチド；デオキシ アデノシン三リン酸３’−ｄＡＴＰ、デオキシウリジン三リン酸３’−ｄＵＴＰ 、デオキシグアノシン三リン酸３’−ｄＧＴＰ、およびデオキシシチジン三リン 酸３’−ｄＣＴＰからなる群より選択される少なくとも一つの鎖停止用３’−デ オキシヌクレオチド；ならびに一つのＲＮＡポリメラーゼを用いて合成する、請 求の範囲１に記載の方法。 １４． 核酸プライマーが更に、固体支持体上にそのプライマーを可逆的に固定 化するための連結用の基（Ｌ）を含む、請求の範囲１に記載の方法。 １５． 前記の組の塩基特異的停止化フラグメントを連結用の基（Ｌ）により支 持体上の官能基（Ｌ’）に結合させて、支持体への相補的核酸の一時的かつ開裂 可能な接続体（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）を作製する、請求の範囲１４に記載の方 法。 １６． 一時的かつ開裂可能な接続体を酵素的、化学的、もしくは物理的に開裂 することができる、請求の範囲１５に記載の方法。 １７． 一時的かつ開裂可能な接続体が、光開裂可能な結合、強力な静電相互作 用に基づく結合、トリチルエーテル結合、β−ベンゾイルプロピオニル基、レブ リニル基、ジスルフィド結合、アルギニン／アルギニン結合、リシン／リシン結 合、ピロリン酸結合、ワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対 により作製される結合からなる群より選択される、請求の範囲１６に記載の方法 。 １８． 支持体に結合させた塩基特異的停止化フラグメントを完全に洗浄して全 ての残存する反応物および副産物を配列決定用反応から除去する、請求の範囲１ ５に記載の方法。 １９． 塩基特異的停止化フラグメントをマススペクトロメトリーの前に固体支 持体から開裂させる、請求の範囲１８に記載の方法。 ２０． 塩基特異的停止化フラグメントをマススペクトロメトリー中に固体支持 体から開裂させる、請求の範囲１８に記載の方法。 ２１． 一つを上回る種の核酸を、標識プローブ、核酸プライマー、鎖伸長用ヌ クレオチド、および鎖停止用ヌクレオチドを利用する多重マススペクトロメトリ ーの核酸配列決定法により同時に配列決定し、この場合、前記の組の内の一つの 塩基特異的停止化フラグメントが未修飾であり、そして他の組の塩基特異的停止 化フラグメントが質量修飾してあり、そして前記の組の各々の塩基特異的停止化 フラグメントがマススペクトロメトリーにより他のものから識別されるに充分な 質量差を有する、請求の範囲１に記載の方法。 ２２． 前記の組の内の少なくとも一つの質量修飾塩基特異的停止化フ ラグメントを、少なくとも一つのヌクレオチドの複素環塩基において質量修飾用 官能基（Ｍ）で修飾させる、請求の範囲２１に記載の方法。 ２３． 複素環塩基修飾ヌクレオチドを、Ｃ−５を修飾させたシトシンヌクレオ チド、Ｃ−５を修飾させたチミンヌクレオチド、Ｃ−５メチル基を修飾させたチ ミンヌクレオチド、Ｃ−５を修飾させたウラシルヌクレオチド、Ｃ−８を修飾さ せたアデニンヌクレオチド、Ｃ−８を修飾させたｃ⁷−デアザアデニン、Ｃ−７ を修飾させたｃ⁷−デアザアデニン、Ｃ−８を修飾させたグアニン、Ｃ−８を修 飾させたｃ⁷−デアザグアニン、Ｃ−７を修飾させたｃ⁷−デアザグアニン、Ｃ− ８を修飾させたヒポキサンチン、Ｃ−７を修飾させたｃ⁷−デアザヒポキサンチ ン、およびＣ−８を修飾させたｃ⁷−デアザヒポキサンチンからなる群より選択 される、請求の範囲２２に記載の方法。 ２４． 前記の組の内の少なくとも一つの質量修飾塩基特異的停止化フラグメン トを、そのフラグメントのヌクレオチド間連結の一つもしくは複数のリン原子に 連結させた質量修飾官能基（Ｍ）で修飾させる、請求の範囲２１に記載の方法。 ２５． 前記の組の内の少なくとも一つの質量修飾塩基特異的停止化フラグメン トを、内部Ｃ−２’位、外部Ｃ−２’位、および外部Ｃ−５’位からなる群より 選択される少なくとも一つの糖の位置で、その組の質量修飾塩基特異的停止化フ ラグメント内のヌクレオチドの内の一つもしくは複数の糖部分に連結させた質量 修飾官能基（Ｍ）で修飾させる、請求の範囲２１に記載の方法。 ２６． 前記の組の内の少なくとも一つの質量修飾塩基特異的停止化フラグメン トを、５’−末端ヌクレオチドの糖部分に連結させた質量修飾 官能基（Ｍ）で修飾し、そしてこの質量修飾用官能基（Ｍ）が連結用官能基（Ｌ ）である、請求の範囲２１に記載の方法。 ２７． 質量修飾用官能基（Ｍ）を、塩基特異的停止化フラグメントの酵素的合 成の後で、そしてマススペクトロメトリーによるネステットフラグメントについ ての分子量値の決定の前に、一組の塩基特異的停止化フラグメントに連結させる 、請求の範囲２１に記載の方法。 ２８． 塩基特異的停止化フラグメントの合成を、核酸プライマー、鎖伸長用ヌ クレオチド、鎖停止用ヌクレオチド、もしくは標識プローブからなる群より選択 される少なくとも一つの試薬を用いることにより実施し［この試薬は質量修飾用 官能基Ｍの前駆体で予め修飾してある］、そして後続の段階が、質量修飾用官能 基Ｍ前駆体をマススペクトロメトリーによる分析前に修飾させて質量修飾用官能 基Ｍを作製する段階を含む、請求の範囲２７に記載の方法。 ２９． 標識プローブの質量変異を、その種の核酸内の標識プローブおよび相補 的標識配列の内の少なくとも一つのヌクレオチド組成を変化させることにより達 成する、請求の範囲２１に記載の方法。 ３０． 標識プローブをマススペクトロメトリーの分析前に対応する相補的標識 配列に共有結合により結合させる、請求の範囲２１に記載の方法。 ３１． 標識プローブと対応する相補的標識配列との間の結合を、光活性化可能 な基を介して光化学的に達成する、請求の範囲３０に記載の方法。 ３２． ａ）オリゴヌクレオチドプライマーを固体支持体に、ある連結用の基を 介して可逆的に連結させる段階、 ｂ）配列決定を行うべき核酸に相補的な相補的核酸を、核酸プライマーから出 発し、そして鎖停止用および鎖伸長用ヌクレオチドの存在下において合成し、そ の結果４組の塩基特異的停止化相補的核酸フラグメントを産生する段階、 ｃ）４組の塩基特異的停止化フラグメントの内の各々における各ネステットフ ラグメントの分子量値をマトリックス補助式レーザー脱離／イオン化マススペク トロメトリーにより決定する段階［この場合、少なくとも２つの塩基特異的停止 化フラグメントの分子量値を同時に決定し、そしてこのネステットフラグメント をマススペクトロメトリー中にレーザにより固体支持体から開裂させる］、およ び ｄ）分子量に従ってその４組の分子量値を整列させることによりヌクレオチド 配列を決定する段階、 を含む核酸の配列決定法。 ３３． ａ）核酸プライマーを固体支持体に、ある連結用の基を介して可逆的に 連結させる段階、 ｂ）配列決定を行うべき核酸に相補的な相補的核酸を、核酸プライマーから出 発し、そして鎖停止用および鎖伸長用ヌクレオチドの存在下において合成し、そ の結果４組の塩基特異的停止化相補的核酸フラグメントを産生する段階、 ｃ）４組の塩基特異的停止化フラグメントの内の各々における各ネステットフ ラグメントの分子量値をマトリックス補助式レーザー脱離／イオン化マススペク トロメトリーにより決定する段階［この場合、少なくとも２つの塩基特異的停止 化フラグメントの分子量値を同時に決定し、そしてネステットフラグメントをマ ススペクトロメトリー中にレーザに より固体支持体から開裂させる］、および ｄ）分子量に従ってその４組の分子量値を整列させることによりヌクレオチド 配列を決定する段階、 を含み、 その核酸プライマー、鎖伸長用ヌクレオチド、もしくは鎖停止用ヌクレオチドか らなる群から選択される少なくとも一つの試薬を質量修飾させてあり、そして各 組の塩基特異的停止化フラグメントが他の組の塩基特異的停止化フラグメントと は充分に異なる質量を有するため独特なものとなっており、そして２つもしくは それを上回る組の未分離の塩基特異的停止化フラグメントのネステットフラグメ ントの分子量値を同時に決定する、核酸配列の多重分析法。 ３４． ａ）連結用官能基（Ｌ’）を有する固体支持体、 ｂ）様々な種の核酸に相補的な一組の相補的核酸の合成を開始するのに適する 一組の核酸プライマー［これらのプライマーの各々は連結用官能基（Ｌ’）と相 互作用することおよび固体支持体にそのプライマーを可逆的に連結させることが 可能な連結用の基（Ｌ）を含む］、 ｃ）相補的核酸を合成するための一組の鎖伸長用ヌクレオチド、 ｄ）相補的核酸の合成を停止し、そして各組の塩基特異的停止化相補的核酸フ ラグメントを作製するための一組の鎖停止用ヌクレオチド、ならびに ｅ）核酸プライマー、鎖伸長用ヌクレオチドおよび停止用ヌクレオチドから相 補的核酸を合成するためのポリメラーゼ、 を含み、 そのプライマー、鎖伸長用ヌクレオチド、および鎖停止用ヌクレオチド からなる群から選択される少なくとも一つの試薬を質量修飾させて、各種の核酸 の各組の塩基特異的停止化ヌクレオチド間の識別化をマススペクトロメトリーに より提供する、 多重スペクトロメトリーの核酸配列決定法により一つもしくは複数の種の核酸の 配列を決定するためのキット。 ３５． 磁気ビーズ、セルロースビーズ、ポリスチレンビーズ、調製孔ガラス（ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、シリカゲルビーズ 、セファロース（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ）ビーズ、セファデックス（ＳＥＰＨＡＤ ＥＸ）ビーズ、毛細管、ポリエチレンの重合シート、ポリプロピレンの重合シー ト、ポリアミドの重合シート、ポリエステルの重合シート、二フッ化ポリビニリ デンの重合シート、ガラス製プレート、および金属表面からなる群より選択され る固体支持体［この固体支持体は連結用官能基Ｌ’を有し、この官能基はプライ マーの連結基Ｌと相互作用することが可能であり、そのプライマーを固体支持体 に可逆的に連結させ、そして酵素的、化学的、もしくは物理的に開裂可能である ］。 ３６． 連結Ｌ−Ｌ’が、光開裂結合、強力な静電相互作用に基づく結合、トリ チルエーテル結合、β−ベンゾイルプロピオニル基、レブリニル基、ジスルフィ ド結合、アルギニン／アルギニン結合、リシン／リシン結合、ピロリン酸結合、 およびワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対からなる群より 選択される、請求の範囲３５に記載の固体支持体。 ３７． あるプライマーを可逆的に結合させるために各ウエル内に請求の範囲３ ３の固体支持体を含む、官能基付加させた膜で改造してあるマ イクロタイタープレートを含む固体支持体。 ３８． ＤＮＡ合成のプライミングための質量修飾ユニバーサルプライマーのコ レクション、および転写ＲＮＡ合成を開始させるための質量修飾イニシエーター オリゴヌクレオチドのコレクションからなる群より選択される一組の質量修飾核 酸プライマー。 ３９． 少なくとも一つの質量修飾プライマーをそのプライマー内の一つもしく は複数の複素環塩基を質量修飾用官能基（Ｍ）で修飾させる、請求の範囲３８に 記載の前記の組の質量修飾核酸プライマー。 ４０． 少なくとも一つの質量修飾プライマーが、Ｃ−５を修飾させたシトシン ヌクレオチド、Ｃ−５を修飾させたチミンヌクレオチド、Ｃ−５メチル基を修飾 させたチミンヌクレオチド、Ｃ−５を修飾させたウラシルヌクレオチド、Ｃ−８ を修飾させたアデニンヌクレオチド、Ｃ−８を修飾させたｃ⁷−デアザアデニン 、Ｃ−７を修飾させたｃ⁷−デアザアデニン、Ｃ−８を修飾させたグアニンヌク レオチド、Ｃ−８を修飾させたｃ⁷−デアザグアニン、Ｃ−７を修飾させたｃ⁷− デアザグアニン、Ｃ−８を修飾させたヒポキサンチン、Ｃ−７を修飾させたｃ⁷ −デアザヒポキサンチン、およびＣ−８を修飾させたｃ⁷−デアザヒポキサンチ ンからなる群より選択される少なくとも一つの複素環塩基修飾ヌクレオチドを含 む、請求の範囲３９に記載の前記の組の質量修飾核酸プライマー。 ４１． 少なくとも一つの質量修飾プライマーを、その質量修飾プライマー内の ヌクレオチド間連結の一つもしくは複数のリン原子に連結される質量修飾用官能 基（Ｍ）で修飾させる、請求の範囲３９に記載の前記の組の質量修飾核酸プライ マー。 ４２． 少なくとも一つの質量修飾プライマーを、内部Ｃ−２’位、外 部Ｃ−２’位、および外部Ｃ−５’位からなる群より選択される少なくとも一つ の糖の位置でその質量修飾プライマー内のヌクレオチドの少なくとも一つの糖部 分に連結される質量修飾用官能基（Ｍ）で修飾させる、請求の範囲３９に記載の 前記の組の質量修飾核酸プライマー。 ４３． 少なくとも一つの質量修飾プライマーを、そのプライマーの５’−末端 ヌクレオチドの糖部分に連結される質量修飾用官能基（Ｍ）で修飾し、そしてそ の質量修飾用官能基（Ｍ）が連結用官能基（Ｌ）である、請求の範囲３９に記載 の前記の組の質量修飾核酸プライマー。 ４４． ＤＮＡ合成に適する質量修飾２’−デオキシヌクレオシド三リン酸、鎖 停止用ＤＮＡ合成に適する質量修飾２’，３’−ジデオキシヌクレオシド三リン 酸、ＲＮＡ合成に適する質量修飾ヌクレオシド三リン酸、および鎖停止用ＲＮＡ 合成に適する質量修飾３’−デオキシヌクレオシド三リン酸からなる群より選択 される一組の質量修飾ヌクレオチド。 ４５． 質量修飾用官能基（Ｍ）が、質量修飾ヌクレオチドの複素環塩基に連結 する、請求の範囲４４に記載の前記の組の質量修飾ヌクレオチド。 ４６． 質量修飾ヌクレオチドが、Ｃ−５を修飾させたシトシン部分、Ｃ−５を 修飾させたチミン部分、Ｃ−５のメチル基を修飾させたチミン部分、Ｃ−５を修 飾させたウラシル部分、Ｃ−８を修飾させたアデニン部分、Ｃ−８を修飾させた ｃ⁷−デアザアデニン部分、Ｃ−７を修飾させたｃ⁷−デアザアデニン部分、Ｃ− ８を修飾させたグアニン部分、Ｃ−８を修飾させたｃ⁷−デアザグアニン部分、 Ｃ−７を修飾させたｃ⁷−グアニン部分、Ｃ−８を修飾させたヒポキサンチン部 分、Ｃ−８を修飾させたｃ⁷−デアザヒポキサンチン部分、およびＣ−７を修飾 させたｃ⁷ −デアザヒポキサンチン部分からなる群より選択される修飾複素環塩基を含む、 請求の範囲４５に記載の一組の質量修飾ヌクレオチド。 ４７． 質量修飾用官能基（Ｍ）を、質量修飾ヌクレオチドの三リン酸部分のア ルファーリン原子に連結させる、請求の範囲４４に記載の前記の組の質量修飾ヌ クレオチド。 ４８． 質量修飾ヌクレオチドがデオキシヌクレオシド三リン酸を含み、そして 質量修飾用官能基（Ｍ）そのをデオキシヌクレオシド三リン酸の糖部分のＣ−２ ’位に連結させる、請求の範囲４４に記載の前記の組の質量修飾ヌクレオチド。 ４９． 質量修飾ヌクレオチドがジデオキシヌクレオシド三リン酸を含み、そし て質量修飾用官能基（Ｍ）をＣ−２’位およびＣ−３’位からなる群より選択さ れる少なくとも一つの糖部分の位置に連結させる、請求の範囲４４に記載の前記 の組の質量修飾ヌクレオチド。 ５０． 少なくとも一組の塩基特異的停止化フラグメント内に存在する標識配列 にワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）の塩基対形成により相補的 となる一組の質量変異標識プローブ。 ５１． 標識プローブの質量変異化を、質量修飾用官能基（Ｍ）をその標識プロ ーブに連結させることにより達成する、請求の範囲５０に記載の前記の組の質量 変異標識プローブ。 ５２． 質量修飾用官能基（Ｍ）を標識プローブヌクレオチド配列内の一つもし くは複数の複素環塩基の標識プローブに連結させる、請求の範囲５１に記載の前 記の組の質量変異標識プローブ。 ５３． 標識プローブが、Ｃ−５を修飾させたシトシン部分、Ｃ−５を修飾させ たチミン部分、Ｃ−５のメチル基を修飾させたチミン部分、Ｃ −５を修飾させたウラシル部分、Ｃ−８を修飾させたアデニン部分、Ｃ−８を修 飾させたｃ⁷−デアザアデニン部分、Ｃ−７を修飾させたｃ⁷−デアザアデニン部 分、Ｃ−８を修飾させたグアニン部分、Ｃ−８を修飾させたｃ⁷−デアザグアニ ン部分、Ｃ−７を修飾させたｃ⁷−デアザグアニン部分、Ｃ−８を修飾させたヒ ポキサンチン部分、Ｃ−８を修飾させたｃ⁷−デアザヒポキサンチン部分、およ びＣ−７を修飾させたｃ⁷−デアザヒポキサンチン部分からなる群より選択され る少なくとも一つの質量修飾複素環塩基を含む、請求の範囲５２に記載の前記の 組の質量変異標識プローブ。 ５４． 質量修飾用官能基（Ｍ）を少なくとも一つの標識プローブのヌクレオチ ド間連結の一つもしくは複数のリン原子に連結させる、請求の範囲５２に記載の 前記の組の質量変異標識プローブ。 ５５． 質量修飾用官能基（Ｍ）を少なくとも一つの糖部分で少なくとも一つの 標識プローブに連結させる、請求の範囲５２に記載の前記の組の質量変異標識プ ローブ。 ５６． 標識プローブが更に、対応する相補的標識配列への共有結合を考慮する 架橋結合用の基（ＣＬ）を含む、請求の範囲５１に記載の前記の組の質量変異標 識プローブ。 ５７． 架橋結合用の基（ＣＬ）を光化学的に活性化させ、そしてプソラレンお よびエリプティシンからなる群より選択される少なくとも一つの光活性化可能な 基から取得する、請求の範囲５５に記載の前記の組の質量変異標識プローブ。 ５８． 質量修飾用官能基（Ｍ）が、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｉ（ＣＨ₃）₃、Ｓ ｉ（ＣＨ₃）₂（Ｃ₂Ｈ₅）、Ｓｉ（ＣＨ₃）（Ｃ₂Ｈ₅）₂、Ｓｉ（Ｃ₂Ｈ₅）₃、 ＣＨ₂Ｆ、ＣＨＦ₂、およびＣＦ₃からなる群より選択される、請求の範囲３９に 記載の前記の組の質量修飾核酸プライマー。 ５９． 質量修飾用官能基（Ｍ）を質量修飾プライマーに連結させた前駆体官能 基（ＰＦ）から作製し、その前駆体（ＰＦ）は、−Ｎ₃およびＸＲからなる群よ り選択され、この式中、ＲはＨであり、そしてＸは、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＮＨ Ｒ、−ＳＨ、−ＮＣＳ、−ＯＣＯ（ＣＨ₂）_rＣＯＯＨ（この場合、ｒ＝１−２０ ）、−ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）_rＣＯＯＨ（この場合、ｒ＝１−２０）、−ＯＳＯ₂Ｏ Ｈ、−ＯＣＯ（ＣＨ₂）_rＩ（この場合、ｒ＝１−２０）、および−ＯＰ（Ｏ−ア ルキル）Ｎ（アルキル）₂からなる群より選択される、請求の範囲３９に記載の 前記の組の質量修飾核酸プライマー。 ６０． 質量修飾用官能基（Ｍ）が、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｉ（ＣＨ₃）₃、Ｓ ｉ（ＣＨ₃）₂（Ｃ₂Ｈ₅）、Ｓｉ（ＣＨ₃）（Ｃ₂Ｈ₅）₂、Ｓｉ（Ｃ₂Ｈ₅）₃、ＣＨ₂ Ｆ、ＣＨＦ₂、およびＣＦ₃からなる群より選択される、請求の範囲４５に記載の 前記の組の質量修飾ヌクレオチド。 ６１． 質量修飾用官能基（Ｍ）が質量修飾ヌクレオチドに連結される前駆体官 能基（ＲＦ）から作製され、この前駆体（ＲＦ）が、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＮＨ Ｒ、−ＳＨ、−ＮＣＳ、−ＯＣＯ（ＣＨ₂）_rＣＯＯＨ（この場合、ｒ＝１−２０ ）、−ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）_rＣＯＯＨ（この場合、ｒ＝１−２０）、−ＯＳＯ₂Ｏ Ｈ、−ＯＣＯ（ＣＨ₂）_rＩ（この場合、ｒ＝１−２０）、および−ＯＰ（Ｏ−ア ルキル）Ｎ（アルキル）₂からなる群より選択される、請求の範囲４５に記載の 前記の組の質量修飾ヌクレオチド。 ６２． 標識配列が、ＸＲ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｉ（ＣＨ₃）₃、Ｓ ｉ（ＣＨ₃）₂（Ｃ₂Ｈ₅）、Ｓｉ（ＣＨ₃）（Ｃ₂Ｈ₅）₂、Ｓｉ（Ｃ₂Ｈ₅）₃、ＣＨ₂ Ｆ、ＣＨＦ₂、およびＣＦ₃からなる群より選択される質量修飾用官能基（Ｍ）で 質量修飾され、先の式中、Ｘは、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＮＨＲ、−ＳＨ、−ＮＣ Ｓ、−ＯＣＯ（ＣＨ₂）_rＣＯＯＨ（この場合、ｒ＝１−２０）、−ＮＨＣＯ（Ｃ Ｈ₂）_rＣＯＯＨ（この場合、ｒ＝１−２０）、−ＯＳＯ₂ＯＨ、−ＯＣＯ（ＣＨ₂ ）_rＩ（この場合、ｒ＝１−２０）、および−ＯＰ（Ｏ−アルキル）Ｎ（アルキ ル）₂からなる群より選択され、そしてＲは、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、 イソプロピル、ｔ−ブチル、ヘキシル、ベンジル、ベンズヒドリル、トリチル、 置換されるトリチル、アリール、置換されるアリール、ポリオキシメチレン、モ ノアルキル化されるポリオキシメチレン、ポリエチレンイミン、一般式（−ＮＨ （ＣＨ₂）_rＮＨＣＯ（ＣＨ₂）_rＣＯ−）_mのポリアミド、一般式（−ＮＨ（ＣＨ₂ ）_rＣＯ−）_mのポリアミド、一般式（−Ｏ（ＣＨ₂）_rＣＯ−）_mのポリエステル 、一般式−Ｓｉ（Ｙ）₃のアルキル化シリル化合物、一般式（−ＮＨＣＨａａＣ Ｏ−）_mのヘテロオリゴ／ポリアミノ酸、一般式−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_m−ＣＨ₂Ｃ Ｈ₂ＯＨのポリエチレングリコール、および一般式−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_m−ＣＨ₂ ＣＨ₂Ｏ−Ｙのモノアルキル化されるポリエチレングリコールからなる群より選 択され、これらの式中、ｍは０−２００の範囲に含まれ、Ｙは、メチル、エチル 、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ヘキシルからなる群より選択される低 級アルキル基であり、ｒは１−２０の範囲に含まれ、そしてａａは天然のアミノ 酸のアミノ酸側鎖を表す、請求の範囲５１に記載の前記の組の質量変異標識プロ ーブ。 ６３． 質量修飾用官能基（Ｍ）が質量変異標識プローブに連結される 前駆体官能基（ＲＦ）から作製され、この前駆体（ＲＦ）が−Ｎ₃およびＸＹか らなる群より選択され、この式中、ＲはＨであり、そしてＸは、−ＯＨ、−ＮＨ₂ 、−ＮＨＲ、−ＳＨ、−ＮＣＳ、−ＯＣＯ（ＣＨ₂）_rＣＯＯＨ（この場合、ｒ ＝１−２０）、−ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）_rＣＯＯＨ（この場合、ｒ＝１−２０）、− ＯＳＯ₂ＯＨ、−ＯＣＯ（ＣＨ₂）_rＩ（この場合、ｒ＝１−２０）、および−Ｏ Ｐ（Ｏ−アルキル）Ｎ（アルキル）₂からなる群より選択される、請求の範囲５ １に記載の前記の組の質量変異化標識プローブ。 ６４． 質量修飾用官能基（Ｍ）が一般式ＸＲにより与えられ、この式中、Ｘは 、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＮＨＲ、−ＳＨ、−ＮＣＳ、−ＯＣＯ（ＣＨ₂）_rＣＯＯ Ｈ（この場合、ｒ＝１−２０）、−ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）_rＣＯＯＨ（この場合、ｒ ＝１−２０）、−ＯＳＯ₂ＯＨ、−ＯＣＯ（ＣＨ₂）_rＩ（この場合、ｒ＝１−２ ０）、および−ＯＰ（Ｏ−アルキル）Ｎ（アルキル）₂からなる群より選択され 、そしてＲは、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ヘ キシル、ベンジル、ベンズヒドリル、トリチル、置換化されるトリチル、アリー ル、置換化されるアリール、ポリオキシメチレン、モノアルキル化されるポリオ キシメチレン、ポリエチレンイミン、一般式（−ＮＨ（ＣＨ₂）_rＮＨＣＯ（ＣＨ₂ ）_rＣＯ−）_mのポリアミド、一般式（−ＮＨ（ＣＨ₂）_rＣＯ−）_mのポリアミド 、一般式（−Ｏ（ＣＨ₂）_rＣＯ−）_mのポリエステル、一般式−Ｓｉ（Ｙ）₃のア ルキル化シリル化合物、一般式（−ＮＨＣＨａａＣＯ−）_mのヘテロオリゴ／ポ リアミノ酸、一般式−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_m−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨのポリエチレングリ コール、および一般式−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_m−ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−Ｙのモノアルキル 化ポリエチレングリコー ルからなる群より選択され、これらの式中、ｍは０−２００の範囲に含まれ、Ｙ は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ヘキシルからなる 群より選択される低級アルキル基であり、ｒは１−２０の範囲に含まれ、そして ａａは天然のアミノ酸のアミノ酸側鎖を表す、請求の範囲３９に記載の前記の組 の質量修飾核酸プライマー。 ６５． 質量修飾用官能基（Ｍ）が一般式ＸＲにより与えられ、この式中、Ｘは 、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＮＨＲ、−ＳＨ、−ＮＣＳ、−ＯＣＯ（ＣＨ₂）_rＣＯＯ Ｈ（この場合、ｒ＝１−２０）、−ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）_rＣＯＯＨ（この場合、ｒ ＝１−２０）、−ＯＳＯ₂ＯＨ、ＯＣＯ（ＣＨ₂）_rＩ（この場合、ｒ＝１−２０ ）、および−ＯＰ（Ｏ−アルキル）Ｎ（アルキル）₂からなる群より選択され、 そしてＲは、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ヘキ シル、ベンジル、ベンズヒドリル、トリチル、置換されるトリチル、アリール、 置換されるアリール、ポリオキシメチレン、モノアルキル化ポリオキシメチレン 、ポリエチレンイミン、一般式（−ＮＨ（ＣＨ₂）_rＮＨＣＯ（ＣＨ₂）_rＣＯ−）_m のポリアミド、一般式（−ＮＨ（ＣＨ₂）_rＣＯ−）_mのポリアミド、一般式（− Ｏ（ＣＨ₂）_rＣＯ−）_mのポリエステル、一般式−Ｓｉ（Ｙ）₃のアルキル化シリ ル化合物、一般式（−ＮＨＣＨａａＣＯ−）ｍのヘテロオリゴ／ポリアミノ酸、 一般式−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_m−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨのポリエチレングリコール、およ び一般式−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_m−ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−Ｙのモノアルキル化されるポリ エチレングリコールからなる群より選択され、これらの式中、ｍは０−２００の 範囲に含まれ、Ｙは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、 ヘキシルからなる群より選択される低級アルキル基であり、ｒは１−２０ の範囲に含まれ、そしてａａは天然のアミノ酸のアミノ酸側鎖を表す、請求の範 囲４５に記載の前記の組の質量修飾ヌクレオチド。 ６６． ａ）連結用官能基（Ｌ’）を有する固体支持体、 ｂ）様々な種の核酸に相補的な一組の相補的核酸の合成を開始するのに適する 一組の核酸プライマー［これらのプライマーの各々は連結用の官能基（Ｌ’）と 相互作用することおよびその固体支持体にそのプライマーを可逆的に連結させる ことが可能な連結基（Ｌ）を含む］、 ｃ）相補的核酸を合成するための一組の鎖伸長用ヌクレオチド、 ｄ）相補的核酸の合成を停止し、そして各組の塩基特異的停止化相補的核酸フ ラグメントを作製するための一組の鎖停止用ヌクレオチド、ならびに ｅ）そのプライマー、鎖伸長用ヌクレオチド、および停止用ヌクレオチドから 相補的核酸を合成するためのポリメラーゼ、 を含み、 鎖停止用ヌクレオチドを、その相補的核酸への一つの種の鎖停止用ヌクレオチド の添加が同時に分析される他のすべての種の鎖停止用ヌクレオチドの添加からマ ススペクトロメトリーにより識別可能であるように質量修飾する、 マススペクトロメトリーにより核酸の配列を決定するためのキット。 ６７． 塩基特異的停止化フラグメントをマススペクトロメトリーの前に固体支 持体から開裂させる、請求の範囲３２に記載の方法。 ６８． 塩基特異的停止化フラグメントをマススペクトロメトリー中に固体支持 体から開裂させる、請求の範囲３２に記載の方法。 ６９． 連結Ｌ−Ｌ’の光開裂結合を、電荷移動錯体もしくは安定な有 機性の基からなる群より選択される、請求の範囲３６に記載の固体支持体。 ７０． 可逆的な連結が光開裂結合である、請求の範囲３２に記載の方法。 ７１． 可逆的な連結が光開裂結合である、請求の範囲３３に記載の方法。 ７２． 塩基特異的停止化フラグメントをマススペクトロメトリーの前に固体支 持体から開裂させる、請求の範囲３３に記載の方法。 ７３． 塩基特異的停止化フラグメントをマススペクトロメトリー中に固体支持 体から開裂させる、請求の範囲３３に記載の方法。