CN112292459A - 用于核酸检测和定量的产品和方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了使用链终止试剂和具有3'‑5'外切核酸酶活性的酶进行引物延伸反应的产品和方法，从而使未延伸的寡核苷酸被消化而延伸的寡核苷酸不被消化。本文还提供了检测靶核酸物质或多种靶核酸物质的一种或多种变体存在、不存在或量的产品和方法，其包括使用链终止试剂和具有3'‑5'外切核酸酶活性的酶的引物延伸反应，从而使未延伸的寡核苷酸被消化而延伸的寡核苷酸不被消化。
Description
相关专利申请
本专利申请要求2018年6月1日提交的题为“核酸检测和定量的产品和方法(PRODUCTS AND PROCESSES FOR NUCLEIC ACID DETECTION AND QUANTIFICATION)”，发明人为Michael Mosko且以律师案卷号AGB-7004-PV指定的美国临时申请号62/679,450的权益。
本专利申请涉及2017年10月23日提交的题为“检测和定量低量变体的并行式方法(MULTIPLEX METHODS FOR DETECTION AND QUANTIFICATION OF MINOR VARIANTS)”，发明人为Anders Nygren且以律师案卷号AGB-7002-US指定的美国专利申请号15/568,701。本申请还涉及2016年4月22日提交的题为“检测和定量低量变体的并行式方法(MULTIPLEXMETHODS FOR DETECTION AND QUANTIFICATION OF MINOR VARIANTS)”，发明人为AndersNygren且以律师案卷号AGB-7002-PC指定的国际PCT申请号PCT/US2016/028980。本申请还涉及2015年4月24日提交的题为“检测和定量低量变体的并行式方法(MULTIPLEX METHODSFOR DETECTION AND QUANTIFICATION OF MINOR VARIANTS)”，发明人为Anders Nygren且以律师案卷号AGB-6071-PV指定的美国临时申请号62/152,698。本申请涉及2012年7月17日提交的题为“多重核酸鉴定的产品和方法(PRODUCTS AND PROCESSES FOR MULTIPLEXNUCLEIC ACID IDENTIFICATION)”，发明人为Christiane Honisch、Dirk J.Van Den Boom、Michael Mosko和Anders Nygren且以律师案卷号AGB-6020-CT2t指定的美国专利申请号13/551,486，其是2012年5月18提交的题为“
核酸鉴定的产品和方法(PRODUCTS ANDPROCESSES FOR
NUCLEIC ACID IDENTIFICATION)”，发明人为ChristianeHonisch、Dirk Johannes Van Den Boom、Michael Mosko和Anders Nygren的国际专利申请号PCT/US2012/038710的继续申请。本申请还涉及2016年4月22日提交的题为“鉴定和定量低量等位基因和多态性的并行式方法(MULTIPLEXED METHOD FOR THE IDENTIFICATIONAND QUANTITATION OF MINOR ALLELES AND POLYMORPHISMS)”，发明人为Anders Nygren且以律师案卷号AGB-7001-UT指定的美国专利申请号15/136,024。本申请还涉及2016年1月20日提交的题为“鉴定和定量低量等位基因和多态性的并行式方法(MULTIPLEXED METHODFOR THE IDENTIFICATION AND QUANTITATION OF MINOR ALLELES AND POLYMORPHISMS)”，发明人为Anders Nygren且以律师案卷号AGB-7001-PV2指定的美国临时专利申请号62/280951。本申请还涉及2015年4月24日提交的题为“鉴定和定量低量等位基因和多态性的并行式方法(MULTIPLEXED METHOD FOR THE IDENTIFICATION AND QUANTITATION OF MINORALLELES AND POLYMORPHISMS)”，发明人为Anders Nygren且以律师案卷号AGB-7001-PV指定的美国临时专利申请号62/152697。本发明申请涉及2012年12月18日提交，发明人为Martin Beaulieu和Dirk Johannes van den Boom，题为“高水平多重化聚合酶链式反应和均质延伸反应的方法(METHODS FOR HIGH LEVEL MULTIPLEXED POLYMERASE CHANREACTIONS AND HOMOGENOUS MASS EXTENSION REACTIONS)”，律师案卷号为AGB-2079-CT2的美国专利申请号13/718,758，其是2011年7月28日提交的题为“高水平多重化聚合酶链式反应和均质延伸反应的方法(METHODS FOR HIGH LEVEL MULTIPLEXED POLYMERASE CHANREACTIONS AND HOMOGENOUS MASS EXTENSION REACTIONS)”，发明人为Martin Beaulieu和Dirk Johannes van den Boom，律师案卷号为AGB-2079-CT的美国专利申请号13/193,390(现为美国专利号8,349,566)的继续，其是2004年7月30日提交的题为“高水平多重化聚合酶链式反应和均质延伸反应的方法(METHODS FOR HIGH LEVEL MULTIPLEXED POLYMERASECHAN REACTIONS AND HOMOGENOUS MASS EXTENSION REACTIONS)”，发明人为MartinBeaulieu和Dirk Johannes van den Boom，律师案卷号为SEQ-2079-UT的美国专利申请号10/903,268(现为美国专利号8,003,317)的继续，其中，根据35U.S.C.§119(e)，要求2003年7月31日提交的，属于Martin Beaulieu和Dirk van den Boom，题为“高水平多重化聚合酶链式反应和均质延伸反应的方法(METHODS FOR HIGH LEVEL MULTIPLEXED POLYMERASECHAIN REACTIONS AND HOMOGENEOUS MASS EXTENSION REACTIONS)”，律师案卷号为17082-087P01(P2079)的美国临时申请序列号60/492,102的优先权。本文还涉及2012年12月18日提交的题为“水平多重化聚合酶链式反应和均质延伸反应的方法(METHODS FOR HIGHLEVEL MULTIPLEXED POLYMERASE CHAIN REACTIONS AND HOMOGENEOUS MASS EXTENSIONREACTIONS)”，发明人为Martin Beaulieu和Dirk van den Boom的国际PCT申请号PCT/US2004/024953。
前述专利申请各自的全部内容通过引用其全部内容纳入，包括所有文本、表格和附图。
序列表：
本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表并通过引用其全部内容纳入本文。创建于2019年5月23日的所述拷贝名为AGB-7004-PCT_SL.txt并且大小为18,254字节。
技术领域
本技术部分涉及鉴定和/或定量核酸变体。本技术还部分涉及利用引物延伸反应的核酸鉴定方法，并且其中可以在一个反应中检测多种靶核酸。
背景
特定核酸的检测是诊断医学和分子生物学研究的重要工具。目前，核酸测定在诸如以下方面起到重要的作用：鉴定感染性生物体如细菌和病毒，探查正常基因的表达和鉴定突变基因如癌基因，对组织移植之前的组织相容性进行分型、法医学上和为了探索不同物种的基因之间的同源性而对组织或血样进行配型。
发明内容
在某些方面中，提供了用于引物延伸的方法，其包括：(a)将靶核酸与寡核苷酸杂交，所述寡核苷酸包含对应所述靶核酸的部分的区域，由此生成杂交的寡核苷酸；(b)使所述杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，从而生成延伸的寡核苷酸，所述延伸组合物包含一种或多种链终止试剂；和(c)使(b)的产物与具有3'-5'外切核酸酶活性的酶接触，从而使未延伸的寡核苷酸被消化，而包含链终止试剂的延伸的寡核苷酸不被消化。
在某些方面中，还提供了用于检测一种或多种靶核酸存在、不存在或量的方法，其包括：(a)将一种或多种靶核酸各自与寡核苷酸杂交，所述寡核苷酸包含对应靶核酸部分的区域，由此生成杂交的寡核苷酸；(b)使所述杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，从而生成延伸的寡核苷酸，所述延伸组合物包含一种或多种链终止试剂；(c)使(b)的产物与具有3'-5'外切核酸酶活性的酶接触，从而使未延伸的寡核苷酸被消化，而包含链终止试剂的延伸的寡核苷酸不被消化；和(c)分析所述延伸的寡核苷酸，从而检测所述一种或多种靶核酸存在、不存在或量。
在某些方面中，还提供了用于检测多种靶核酸物质存在、不存在或量的方法，其包括：(a)制备衍生自多种靶核酸物质或其部分的多个扩增子，其中各靶核酸物质包括低丰度变体和高丰度变体；(b)将所述扩增子与多种寡核苷酸物质杂交，从而生成杂交的寡核苷酸，各寡核苷酸物质特异性地对应靶核酸物质的扩增子，其中(i)寡核苷酸物质与衍生自靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体的扩增子在单碱基位置的5'位置处杂交，所述单碱基位置在所述靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体之间不同；(c)使所述杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，从而生成延伸的寡核苷酸，其中所述延伸组合物包含在延伸条件下对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂，其中与所述低丰度变体杂交的所述杂交的寡核苷酸通过所述链终止试剂延伸，而与高丰度变体杂交的所述杂交的寡核苷酸不被延伸；(d)使(c)的产物与具有3'-5'外切核酸酶活性的酶接触，从而使未延伸的寡核苷酸被消化，而延伸的寡核苷酸不被消化；和(e)分析(d)的延伸的寡核苷酸，从而检测多种靶核酸物质的变体存在、不存在或量。
在某些方面中，还提供了用于检测多种靶核酸物质存在、不存在或量的方法，其包括：(a)制备衍生自多种靶核酸物质或其部分的多个扩增子，其中各靶核酸物质包括低丰度变体和高丰度变体；(b)将所述扩增子与多种寡核苷酸物质杂交，从而生成杂交的寡核苷酸，各寡核苷酸物质特异性地对应靶核酸物质的扩增子，其中(i)寡核苷酸物质与衍生自靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体的扩增子在单碱基位置的5'位置处杂交，所述单碱基位置在所述靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体之间不同，(ii)所述多种靶核酸物质各高丰度变体在所述单碱基位置处的核苷酸是相同的或不同的，(iii)所述多种靶核酸物质的各低丰度变体在所述单碱基位置处的核苷酸是相同的，和(iv)所述多种靶核酸物质的高丰度变体在所述单碱基位置处的核苷酸与所述多种靶核酸物质的低丰度变体在所述单碱基位置处的核苷酸无一相同；和(c)使所述杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，从而生成包含对所述多个靶核酸物质的低丰度变体具有特异性的链终止试剂的延伸的寡核苷酸和包含对所述多个靶核酸物质高丰度变体具有特异性的链终止试剂的延伸的寡核苷酸，所述延伸组合物包含对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂和对一种或多种所述高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂，其中：(i)所述对一种或多种高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂各自的浓度低于对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度，和(ii)所述延伸条件包括多个热循环；(d)使(c)的产物与具有3'-5'外切核酸酶活性的酶接触，从而使未延伸的寡核苷酸被消化，而包含链终止试剂的延伸的寡核苷酸不被消化；和(e)检测所述延伸的寡核苷酸；从而检测多种核酸物质的变体存在、不存在或量。
在某些方面中，还提供了用于检测多种靶核酸物质存在、不存在或量的方法，其包括：(a)制备衍生自多种靶核酸物质或其部分的多个扩增子，其中各靶核酸物质包括低丰度变体和高丰度变体；(b)将所述扩增子与多种寡核苷酸物质杂交，从而生成杂交的寡核苷酸，各寡核苷酸物质特异性地对应靶核酸物质的扩增子，其中(i)寡核苷酸物质与衍生自靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体的扩增子在单碱基位置的5'位置处杂交，所述单碱基位置在所述靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体之间不同；(c)使所述杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，从而生成分别对应所述低丰度变体和所述高丰度变体的链终止的延伸产物，所述延伸组合物包含链终止试剂，其中：(i)所述高丰度变体共有共同链终止试剂，所述共同链终止试剂对所述高丰度变体具有特异性并对所述低丰度变体不具有特异性，和(ii)所述低丰度变体各自具有链终止试剂，所述链终止试剂对所述低丰度变体具有特异性并对所述高丰度变体不具有特异性，其中对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂：(A)对扩增混合物中的特定低丰度变体是独特的并且不被扩增混合物中其他低丰度变体共有，或者(B)扩增混合物中至少一个低丰度变体与至少一个其他低丰度变体共有共同链终止试剂，由此所述寡核苷酸延伸达到或通过相对于高丰度变体而言在低丰度变体中不同的核苷酸位置，其中对所述高丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度低于对所述低丰度变体具有特异性的一种或多种链终止试剂各自的浓度；(d)使(c)的产物与具有3'-5'外切核酸酶活性的酶接触，从而使未延伸的寡核苷酸被消化，而包含链终止试剂的延伸的寡核苷酸不被消化；和(e)分析所述延伸的寡核苷酸，从而检测所述低丰度变体存在、不存在或量。
在某些方面中，还提供了用于检测多种靶核酸物质存在、不存在或量的方法，其包括：(a)制备衍生自多种靶核酸物质或其部分的多个扩增子，其中各靶核酸物质包括至少两种变体；(b)将所述多个扩增子与多种寡核苷酸物质杂交，从而生成杂交的寡核苷酸，各寡核苷酸物质特异性地对应靶核酸物质的扩增子，其中(i)寡核苷酸物质与衍生自靶核酸物质变体的扩增子在单碱基位置的5'位置处杂交，所述单碱基位置在所述靶核酸物质的变体之间不同；(c)使所述杂交的寡核苷酸与延伸组合物接触，从而生成对应变体的链终止的延伸产物，所述延伸组合物包含等摩尔浓度的2、3或4种链终止试剂，由此所述寡核苷酸延伸到达或通过在靶核酸物质的变体之间不同的核苷酸位置；(d)使(c)的产物与具有3'-5'外切核酸酶活性的酶接触，从而使未延伸的寡核苷酸被消化，而延伸的寡核苷酸不被消化；和(e)分析所述延伸的寡核苷酸；从而检测变体存在、不存在或量。
在一些方面中，还提供了试剂盒，其包括具有3'-5'外切酶活性的酶和一种或多种链终止试剂，所述链终止试剂在其处于寡核苷酸的3'末端时抑制所述酶在寡核苷酸上的活性。
下述说明、实施例、权利要求和附图中进一步描述某些实施方式。
附图简要说明
附图描述本技术的某些实施方式，但不具限制性。为了说明的清楚和方便，附图未按比例制作，并且在一些情况中，可能夸大或放大多个方面以协助对具体实施方式的理解。
图1是显示使用外切核酸酶试剂(Chop Block试剂)的单碱基延伸基因分型试验的示意图。
图2是显示使用外切核酸酶试剂(Chop Block试剂)的单碱基延伸高灵敏度试验的示意图。
图3是显示使用外切核酸酶试剂(Chop Block试剂)的单碱基延伸超高灵敏度试验的示意图。
图4显示了比较使用基于珠的化学(左栏)相对外切核酸酶试剂(Chop Block试剂)(右栏)的处理过程的超高灵敏度试验图表。
图5A和图5B显示了用无环核苷酸或双脱氧核苷酸延伸并用内切核酸酶试剂(ChopBlock试剂)调节的超高灵敏度试验的产物的标准化强度图表。
图6A和图6B显示了使用基于珠的处理(6A)和用内切核酸酶试剂(Chop Block试剂)(6B)处理的超高灵敏度试验的谱图。
图7A和图7B显示了不使用Chop Block调节(7A)和使用Chop Block调节(7B)的高灵敏度试验(
HS)的谱图。
图8显示了用Chop Block试剂处理的超高灵敏度试验(UltraSEEKTM)的谱图。
具体实施方式
本领域普通技术人员(以下称为“普通技术人员”)将发现本文所述用于确定靶核酸物质或靶核酸的变体或多种靶核酸物质或靶核酸的变体存在、不存在或量的方法的多种用途。这类方法可用于，例如：(a)快速确定样品中是否存在特定靶序列(例如，包含遗传变异的靶序列)；(b)进行混合物分析，例如鉴定混合物和/或其组合物或确定混合物中靶序列的频率(例如，混合群落，准种)；(c)检测样品中的序列变异(例如，突变，单核苷酸多态性)；(d)进行单倍型试验；(e)进行微生物(例如，病原体)分型；(f)检测样品中微生物靶序列的存在与否；(g)识别疾病标志物；(h)检测微卫星；(i)识别短串联重复；(j)识别一种或多种生物体；(k)检测等位变异；(l)确定等位基因频率；(m)确定甲基化模式；(n)进行表观遗传试验；(o)重新序列生物分子的区域；(p)在人类临床研究和医学中进行分析(例如，癌症标志物检测，序列变异检测；对特定药物给药有利或不利的序列特征的检测)，(q)进行HLA分型；(r)进行取证分析；(s)进行疫苗质量控制分析；(t)监测治疗；(u)进行矢量特征分析；(v)进行疫苗或生产菌株质量控制和(w)测试菌株特征(x)植物。例如，可以在多种领域中利用这类方法，包括但不限于，商业、教育、医疗、农业、环境、疾病监测、军事防御和法医领域。
本文提供了用于进行引物延伸反应的方法，其包括将与靶核酸杂交的寡核苷酸和延伸组合物在延伸条件下接触，用于生成延伸的寡核苷酸，所述延伸组合物包含一种或多种链终止试剂，和将引物延伸反应的产物(延伸的和未延伸的寡核苷酸)和具有3'-5'外切核酸酶活性的酶接触，从而使未延伸的寡核苷酸被消化，而延伸的寡核苷酸不被消化。因此，本文所述的方法提供了去除来自延伸反应的未延伸的寡核苷酸(引物)。去除来自延伸反应的未延伸的寡核苷酸(引物)能够用于本文所述用于检测一种或多种靶核酸存在、不存在或量的方法中以及用于检测靶核酸物质或多种靶核酸物质的一种或多种变体存在、不存在或量的方法中。
核酸
本文使用的术语“核酸”是指寡核苷酸或多核苷酸，包括但不限于天然核酸(例如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、合成核酸、非天然核酸(例如肽核酸(PNA))、未修饰的核酸、修饰的核酸(例如甲基化DNA或RNA、标记的DNA或RNA、具有一个或多个修饰的核苷酸的DNA或RNA)。以“多核苷酸”提及核酸是指通过共价键连接的两个或多个核苷酸或核苷酸类似物。核酸可以是适于本文所述的方法使用的任意类型的核酸。在某些实施方式中，核酸可以是DNA(例如互补DNA(cDNA)、基因组DNA(gDNA)、质粒和载体DNA等)、RNA(例如病毒RNA、信使RNA(mRNA)、短抑制性RNA(siRNA)、核糖体RNA(rRNA)、tRNA等)、和/或DNA或RNA类似物(例如，包含碱基类似物、糖类似物和/或非天然骨架等)。核酸可以是可用于进行本文所述方法的任何形式(例如，线性、环状、超螺旋、单链、双链等)。在某些实施方式中，核酸可以是或可以来自，质粒、噬菌体、自主复制序列(ARS)、着丝粒、人工染色体、染色体、细胞、细胞核或细胞的胞质。在一些实施方式中，核酸来自单一染色体(例如，核酸样品可以来自获自二倍体生物的样品的一个染色体)。在胎儿核酸的情况中，所述核酸可以来自父本等位基因、母本等位基因或母本和父本等位基因。
本文使用的术语“靶核酸”可以指具有这样核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列在核酸序列进行比对时与另一靶核酸序列存在一个或多个核苷酸的差异。在一些实施方式中，靶核酸序列可以具有或者可以不具有变体。
本文使用的术语“靶核酸物质”可以指样品中感兴趣的任意核酸物质。靶核酸物质包括具有这样核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列在核苷酸序列进行比对时的区别在于一个或多个核苷酸。靶核酸物质的核酸的区别可以是一个或多个核苷酸(例如，约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或超过100个核苷酸差异)。“靶核酸物质”可以包括但不限于两个或更多个等位基因。本文使用的术语“核酸物质”指区别在于一个或多个特征的核酸，并且可以称为“变体”。特征包括但不限于，一个或多个甲基基团或甲基化状态、一个或多个磷酸基团、一个或多个乙酰基基团和一个或多个核苷酸的一个和或多个缺失、添加或取代。一个或多个核苷酸的一个或多个缺失、添加或取代的示例包括但不限于特定突变的存在与否、核苷酸取代(例如，单核苷酸多态性(SNP))的存在与否、重复序列(例如，双核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸重复)的存在与否、标志物(例如，微卫星)的存在与否和区分序列(例如，区分一种生物与另一种生物的序列(例如，区分一种病毒毒株与另一种病毒毒株的序列))的存在与否。可通过任意已知的方式区分靶核酸物质的不同核酸和不同的靶核酸物质，例如，通过质量、结合、可区分标签等，如本文所述。
在一些实施方式中，靶核酸物质的变体可以大致相等(例如，SNP)的频率或拷贝数存在于样品中。在一些实施方式中，靶核酸物质的变体可以不同的频率或拷贝数存在于样品中。在一些实施方式中，一个变体可以比其他变体较大的丰度存在。在一些实施方式中，较大丰度的变体称之为野生型，而较小丰度的变体称之为突变体。在一些所述方法中，靶核酸物质包含第一和第二变体，其中第一或第二变体表现出比其他变体更大的丰度，即高丰度变体和低丰度变体或高量(major)变体和低量(minor)变体。当于另一变体进行比较时，表现出较大丰度的变体通常通常以较高的浓度存在或者通过更高数量的分子(例如，拷贝)所表示。较高的浓度可以是2倍或更多。在一些实施方式中，较高的浓度是10倍或更多。在一些实施方式中，较高的浓度是100倍、1000倍或10000倍或更多。在一些实施方式中，一个变体表示野生型序列，并且浓度比另一变体高100倍或更多。在一些实施方式中，变体(低丰度变体)的浓度显著低于另一变体(例如，野生型，高丰度变体)，并且表示样品中表示较少的靶核酸物质(靶核酸物质的重量为高丰度变体和一种或多种低丰度变体的量)。在一些实施方式中，本文提供的方法可以用于检测占靶核酸物质不到30％、20％、15％、10％、8％、5％、4％、3％、2％、1％、0.8％、0.75％、0.5％、0.1％、.05％、.01％或更少的低丰度变体的存在与否。在一些实施方式中，本文提供的方法可以用于检测占靶核酸物质约1％-约10％的低丰度变体的存在与否。在一些实施方式中，本文提供的方法可以用于检测占靶核酸物质约5％或更少的低丰度变体的存在与否。在一些实施方式中，本文提供的方法可以用于检测占靶核酸物质约5％-0.75％的低丰度变体的存在与否。在一些实施方式中，本文提供的方法可以用于检测占靶核酸物质约5％-约0.1％的低丰度变体的存在与否。在一些实施方式中，本文提供的方法可以用于检测占靶核酸物质约1％或更少的低丰度变体的存在与否。在一些实施方式中，本文提供的方法可以用于检测占靶核酸物质约0.1％-约0.001％的低丰度变体的存在与否。
在一些实施方式中，对于靶核酸物质，低丰度变体和高丰度变体的总拷贝数是至少约1000个拷贝(分子)，并且低丰度变体占0.1％的总拷贝数。在一些实施方式中，对于靶核酸物质，低丰度变体和高丰度变体的总拷贝数是至少约100个拷贝(分子)，并且低丰度变体占约0.1％的总拷贝数。在一些实施方式中，对于靶核酸物质，低丰度变体的拷贝数是约0.01％-约0.1％拷贝数的靶核酸物质。
在本文所提供的方法的一些实施方式中，样品可以包含一种或多种靶核酸物质的混合物(各靶核酸物质可以具有低丰度和高丰度变体)，或者可以通过将超过一种包含一种或多种靶核酸物质的样品组合来生成混合物(各靶核酸物质可以具有低丰度和高丰度变体)。低丰度变体可以是高丰度变体的变体并且可以包括但不限于，野生型(高丰度变体)等位基因的突变体(低丰度变体)，存在于多于一种宿主的基因的变体(例如，病毒致癌基因(低丰度基因)，其是正常健康基因(高丰度变体)的变体)，多态性，包括单核苷酸多态性(SNP)、插入、缺失或高丰度变体的其他突变形式。
本文使用的术语“多种靶核酸物质”指超过一种靶核酸物质。在某些实施方式中，多种靶核酸物质可以是约2-约10000种核酸物质，约2-约1000种核酸物质，约2-约500种核酸物质，或有时约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900,1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000种靶核酸物质。在某些实施方式中，多种靶核酸物质处于一个或多个反应容器中，并且各反应容器包含超过一种靶核酸物质。在某些实施方式中，多种靶核酸物质处于一个反应容器中。在某些实施方式中，多种靶核酸物质是约2-约100种靶核酸物质。在某些实施方式中，约2-约100种靶核酸物质处于单一反应容器中。
本文所述方法所提供的核酸检测或鉴定可以导致低丰度变体的检测并且能够指出特定突变、序列变异(突变或多态性)或遗传变异(例如，序列变异、序列差异或多态性)的存在与否。本文所述方法所提供的核酸检测或检点可以导致高丰度变体的检测或鉴定，这可以作为阳性对照。在多种靶核酸物质内，可以对相同或不同的物质进行检测和/或定量；检测和/或定量作为相同高丰度变体所有变体的低丰度变体或者作为多种高丰度变体所有变体的多种低丰度变体。
在一些实施方式中，寡核苷酸物质与靶核酸物质变体的核酸模板(例如，扩增子)杂交，从而形成双链核酸并且与模板杂交的寡核苷酸物质在本文中称为杂交的寡核苷酸物质。在一些实施方式中，杂交的寡核苷酸物质能够包括一个或多个不与模板杂交的核苷酸。例如，杂交的寡核苷酸物质能够包括一个或多个错配的核苷酸(例如，非互补核苷酸)以及有时，不杂交的核酸5’和/或3’区域。在一些实施方式中，杂交的寡核苷酸物质包含标签(例如，质量可区分标签(mass distinguishable tag)、序列标签、发光标签或放射性标签)。在一些实施方式中，杂交的寡核苷酸物质包含捕获剂(例如，生物素或结合对的任何成员)。在一些实施方式中，杂交的寡核苷酸物质包含终止核苷酸。本文述及“对应”模板的寡核苷酸物质，如靶核酸、靶核酸物质或靶核酸/靶核酸物质/靶核酸物质的变体的扩增子所使用的术语“对应”、“对应于”、“与…相对于(的)”指与模板序列完全(完整序列)或部分(部分序列)杂交的寡核苷酸物质。在一些实施方式中，寡核苷酸物质与模板“特异性地”杂交，即寡核苷酸物质的序列与特定模板或相对于模板混合物中其他序列而言模板的高丰度/低丰度变体杂交。
本文使用的术语“核苷酸”指天然和非天然核苷酸。核苷酸包括但不限于，天然存在的核苷单磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸；脱氧腺苷单磷酸、脱氧腺苷二磷酸和脱氧腺苷三磷酸；脱氧鸟苷单磷酸、脱氧鸟苷二磷酸和脱氧鸟苷三磷酸；脱氧胸苷单磷酸、脱氧胸苷二磷酸和脱氧胸苷三磷酸；脱氧胞苷单磷酸、脱氧胞苷二磷酸和脱氧胞苷三磷酸；脱氧尿苷单磷酸、脱氧尿苷二磷酸和脱氧尿苷三磷酸；以及脱氧肌苷单磷酸、脱氧肌苷二磷酸和脱氧肌苷三磷酸(本文分别称为dA、dG、dT、dC、dU和dI，或A、G、T、C、U和I)。核酸还包括但不限于，修饰的核苷酸和核苷酸类似物。修饰的核苷酸和核苷酸类似物包括但不限于，双脱氧核苷酸，无环核苷酸，脱氮嘌呤核苷酸，例如，7-脱氮-脱氧鸟苷(7-脱氮-dG)单磷酸、二磷酸和三磷酸以及7-脱氮-脱氧腺苷(7-脱氮-dA)单磷酸、二磷酸和三磷酸，氘-脱氧胸苷(氘-dT)单磷酸、二磷酸和三磷酸，甲基化核苷酸，例如，5-甲基脱氧胞苷三磷酸、13C/15N标记的核苷酸和脱氧肌苷单磷酸、二磷酸和三磷酸。能够使用多种官能团和连接位置的组合得到修饰的核苷酸、富含同位素的核苷酸、损耗的核苷酸、标签和标记的核苷酸以及核苷酸类似物。
本文中述及核酸使用的术语“组合物”指包括一种或多种靶核酸或靶核酸物质的有形物体。组合物有时是从来源提取的样品，但也是来源处所有样品的组合物，并且有时是一种或多种核酸的来源。组合物能够包括核酸。在一些实施方式中，组合物能够包括基因组DNA。在一些实施方式中，组合物可以包括合成DNA。在一些实施方式中，组合物能够包括母本DNA、胎儿DNA或母本和胎儿DNA的混合物。在一些实施方式中，组合物能够包括基因组DNA的片段。在一些实施方式中，组合物能够包括来自病毒、细菌、酵母、真菌、哺乳动物的核酸或其混合物。
核酸样品可以衍生自一个或多个来源并且可以包含靶核酸物质的混合物，所述靶核酸物质各自可以具有不同拷贝数的一种或多种高丰度变体和低丰度变体。核酸样品可以衍生自一个或多个来源并且可以包含靶核酸物质的混合物，所述靶核酸物质各自可以具有相同拷贝数的变体。还可以将样品合并以生成包括不同靶核酸物质的混合物，所述不同靶核酸物质具有低丰度变体或高丰度变体或不同拷贝数的变体。还可以将样品合并以生成包括不同靶核酸物质的混合物，所述不同靶核酸物质各自可以具有相同拷贝数的变体。例如，样品可以收集自生物体、矿物或地质场所(例如，土壤、岩石、矿床、化石)或法医场所(例如，犯罪现场、违禁品或可疑违禁品)。因此，来源可以是环境的，例如地质、农业、战区(combattheater)或土壤来源。来源也可以来自任何类型的生物体如任意植物、真菌、原生动物、原核生物、病毒或动物，包括但不限于：人、非人、哺乳动物、爬行动物、牛、猫、狗、山羊、猪(swine)、小猪(pig)、猴、猿、猩猩、公牛、母牛、熊、马、绵羊、家禽、小鼠、大鼠、鱼、海豚、鲸鱼和鲨鱼，或具有可检测核酸的任意动物或生物体。来源也可指生物体的不同部分，如内部、外部、活细胞或死细胞、组织、液体等。因此，样品可以是“生物样品”，该术语是指获自活体或曾经为活体的来源，例如动物如人或其它哺乳动物、植物、细菌、真菌、原生生物或病毒的任何材料。来源可采用任何形式，包括但不限于，固体材料如组织、细胞、细胞团块、细胞提取物、或活检样品，或者生物液体如尿液、血液、唾液、羊水、感染或炎症区域的渗出液、或含有口腔细胞的漱口水、毛发、脑脊液和关节液，以及器官。样品还可以在与另一样品不同的时间点分离得到，其中各样品来自相同或不同来源。核酸可来自核酸库，例如cDNA或RNA库。核酸可以是样品中核酸分子的核酸纯化或分离和/或扩增的产物。本文所述提供用于测序分析的核酸可含有来自一个或来自两个或多个样品(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个或更多样品)的核酸。
可以多种方式在本文所提供的方法之中、之前或之后处理核酸。例如，核酸可以在大小上减小(例如，剪切、核酸酶或限制性酶消化、去磷酸化、去甲基化)、大小上增加(例如，磷酸化、与甲基化特异性试剂反应、与可检测标记物连接)、用核酸切割抑制剂处理等。
在某些实施方式中，可提供未处理的核酸用于进行根据本文所述的方法进行分析。在一些实施方式中，提供处理后的核酸用于进行本文所述的方法。例如，可从样品提取、分离、纯化或扩增核酸。本文所用的术语“分离”指将核酸从其原始环境中取出(例如，天然发生核酸的天然环境或外源表达核酸的宿主细胞)，因此核酸从其原始环境通过“人工”而被改变。与来源样品中的组分含量相比，分离的核酸一般带有较少的非核酸组分(例如，蛋白质、脂质)。包含分离核酸的组合物可以是基本分离的(例如，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％不含非核酸组分)。本文所用术语“纯化”是指提供的核酸与其所衍生自的样品来源相比包含更少的核酸物质。包含核酸的组合物可以是基本纯化的(例如，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％不含其它核酸物质)。
在某些实施方式中，在提供用于本文所述的方法的核酸之前，可以通过产生核酸片段的方法处理核酸。在一些实施方式中，经过片段化或切割的核酸，可具有约5到约10000个碱基对、约100到约1,00个碱基对、约100到约500个碱基对、或约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000个碱基对的标称平均长度。可通过本领域已知的任何合适方法产生片段，且核酸片段的平均、等比中数或标称长度可通过选择适当的片段生成方法而加以控制。在某些实施方式中，较短长度的核酸可用来分析含有很少序列变异和/或含有较大量的已知核苷酸序列信息的序列。在一些实施方式中，具有较长长度的核酸可用来分析含有更多序列变异和/或含有相对较少量的未知核苷酸序列信息的序列。
扩增和延伸
本文使用的术语“寡核苷酸”是指两种或多种通过共价键连接的核苷酸或核苷酸类似物。寡核苷酸是任意合适长度的，并且在一些实施方式中，寡核苷酸长约5-约200个核苷酸、约5-约150个核苷酸、约5-约100个核苷酸、约5-约75个核苷酸或约5-约50个核苷酸，并且有时长约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、80、85、90、95、100、125、150、175或200个核苷酸。寡核苷酸可以包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、天然产生的和/或非天然产生的核苷酸或其组合以及其任何化学或酶促修饰(例如，甲基化的DNA，修饰的核苷酸的DNA)。有时寡核苷酸的长度比扩增子或靶核酸短，但不必短于用于扩增的引物或聚核苷酸。寡核苷酸通常包括核苷酸亚序列(subsequence)或者与扩增子或其部分、靶核酸或其部分或其补体互补、或基本互补的杂交序列(例如，当比对时，与所述扩增子或靶核酸补体约95％、96％、97％、98％、99％或超过99％相同)。寡核苷酸可以包含与扩增子、靶核酸或其补体不互补、或基本不互补的核苷酸亚序列(例如，在与扩增子互补或基本互补的引物中的核苷酸子序列的3'或5'端)。在某些实施方式中，寡核苷酸可以包含可检测的分子(例如，标签、荧光团、放射性同位素、显色剂、颗粒、酶等)和/或结合对的成员，在某些实施方式中(例如，生物素/亲和素，生物素/链霉亲和素)。
本文使用的术语“溶液中/溶液形式”指液体，如含有例如一种或多种核酸的液体。溶液中的核酸和其他成分可以分散的，并且溶液通常包含水(例如，水溶液)。溶液可含有任意合适数量的寡核苷酸物质，并且经常存在至少与存在的待检测的扩增子物质或靶核酸物质相同数量的寡核苷酸物质。
本文所用的术语“杂交序列”指寡核苷酸中能够与扩增子或其部分、靶核酸或其部分、靶核酸物质或其部分、靶核酸物质变体或其部分或其补体特异性杂交的核苷酸序列。易于设计和选择杂交序列并且该序列能够是适于与本文所述的溶液中的扩增子、靶序列或其补体杂交的长度。在一些实施方式中，在每个寡核苷酸中的杂交序列长约5-约200个核苷酸(例如，长约5-10、约10-15、约15-20、约20-25、约25-30、约30-35、约35-40、约40-45或约45-50、约50-70、约80-90、约90-110、约100-120、约110-130、约120-140、约130-150、约140-160、约150-170、约160-180、约170-190、约180-200个核苷酸)。
本文使用的术语“杂交条件”是指在该条件下两条具有互补核苷酸序列的核酸能够彼此相互作用的条件。杂交条件能够是高严谨性、中等严谨性或低严谨性的，并且这些变化的严谨性程度的条件是已知的。根据感兴趣的应用，通常选择允许扩增和/或延伸的杂交条件。
本文使用的术语“与一种扩增子或靶核酸特异性杂交”是指基本与一种扩增子物质或靶核酸物质杂交而基本不与溶液中的其他扩增子物质或靶核酸物质杂交。特异性杂交排除了错配，使得例如可以设计寡核苷酸以与特定等位基因并且仅与该等位基因特异性杂交。与等位基因均匀匹配或互补的寡核苷酸将与该等位基因特异性地杂交，然而，如果存在一个或多个碱基错配，将不会出现杂交。
本文使用的术语“杂交位点”是指扩增子或靶核酸上的特定位点，另一个核酸与所述位点杂交。在某些实施方式中，寡核苷酸的末端相邻于或基本上相邻于扩增子或靶核酸上具有与另一个扩增子或靶核酸不同序列的位点。当位点和寡核苷酸末端之间没有核苷酸时，寡核苷酸末端与该位点“相邻”。在某些实施方式中，当位点和寡核苷酸末端之间存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸时，寡核苷酸末端与位点“基本相邻”。
在本文所提供的方法的一些实施方式中，可以扩增核酸(例如，靶核酸或靶核酸物质)。本文使用的术语“扩增”及其语法变化形式是指产生模板核酸拷贝的过程。例如，核酸模板可能经过线性或指数性产生两个或更多个核酸扩增子(拷贝)的过程，所述扩增子具有与模板或所述模板的部分的核酸序列相同或基本相同的核酸序列。在某些实施方式中，核酸扩增通常具有特异性(例如，扩增子具有相同或基本上相同的序列)，并且可以是非特异性的(例如，扩增子具有不同的序列)。在样品中的靶序列含量低时，核酸扩增有时是有益的。因为靶核酸检测测试开始时需要较少靶序列，通过扩增靶序列和检测合成的扩增子能改善测试灵敏度。在某些实施方式中，在与延伸寡核苷酸杂交之前，靶核酸或靶核酸物质优势不被扩增。
扩增条件是已知的并且能够根据要扩增的特定核酸进行选择。扩增条件包括某些试剂，其中一些可以包括但不限于，核苷酸(例如，三磷酸核苷酸)，修饰的核苷酸，寡核苷酸(例如，用于基于聚合酶的扩增的引物寡核苷酸和用于基于连接酶的扩增的寡核苷酸结构单元(building block))，一种或多种盐(例如，含镁盐)，一种或多种缓冲液，一种或多种聚合剂(例如，连接酶，聚合酶)，一种或多种切口酶(例如，切割双链核酸的一条链的酶)和一种或多种核酸酶(例如，外切核酸酶，内切核酸酶，RNA酶)。可以使用任意适于扩增的聚合酶，例如具有或没有外切核酸酶活性的聚合酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶、这些酶的突变体形式。能够使用任意适于结合一个寡核苷酸的5'端与另一个寡核苷酸的3'端的连接酶。扩增条件也能够包括某些反应条件，如等温或温度循环条件。在扩增方法中循环温度的方法是已知的，如通过热循环设备。术语“循环”指利用单引物或多引物的扩增(例如，扩增反应或延伸反应)，其中使用温度循环。在一些实施方式中，扩增条件也能够包括乳化剂(例如，油)，所述乳化剂用于形成多个反应区室，在所述区室中能够扩增单个核酸分子物质。有时扩增是指数性产物产生过程并且有时扩增是线性产物产生过程。
在一些实施方式中，扩增反应包括重复多个温度循环以扩增靶核酸的量。在一些实施方式中，扩增反应循环2次或更多次。在一些实施方式中，扩增反应循环10次或更多次。在一些实施方式中，扩增反应循环约10、15、20、50、100、200、300次或更多次。在一些实施方式中，扩增反应循环20至50次。在一些实施方式中，扩增反应循环30至45次。
能够扩增单链核酸目标的链，并且能够扩增双链核酸目标的一条或两条链。在一些实施方式中，扩增产物(扩增子)长约10-约10000个核苷酸、长约10-约1000个核苷酸、长约10-约500个核苷酸、长约10-约100个核苷酸，并且有时长约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。
根据用于扩增的特定核酸，能够选择任意合适的扩增技术和扩增条件。已知的扩增方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、延伸和连接、连接扩增(或连接酶链反应(LCR))和基于Q-β复制酶或模板依赖性聚合酶的应用的扩增方法(参见美国专利公开号US20050287592)。同样有用的是链置换扩增(SDA)、嗜热SDA、基于核酸序列的扩增(3SR或NASBA)和转录相关扩增(TAA)。用于实施扩增方法的试剂、装置和硬件是市售可得的，并且扩增条件是已知的并且能够根据手头的靶核酸选择。
在某些实施方式中，能够通过使用通用引物实现基于聚合酶的扩增。在这样的方法中，将与一个或多个通用引物杂交的杂交区域引入模板核酸中。例如，这类杂交试剂可以纳入(i)与靶核酸杂交并被延伸的引物，(ii)与靶核酸或(i)的产物接合(例如，使用连接酶连接)的寡核苷酸，和/或(iii)具有在基因特异性序列5'端制造的通用序列的引物。使用通用引物的扩增方法能够提供例如仅使用一条或两条扩增引物扩增多种靶核酸的优点。
在某些实施方式中，可以延伸表示一种或多种靶核酸物质的某些核酸和核酸的组合(例如，仅低丰度变体，低丰度变体和高丰度变体一起或者既非高丰度也非低丰度的变体)。本文使用的术语“延伸”及其语法变化形式是指核酸的一条链的延长。在一些实施方式中，与靶核酸或靶核酸物质的变体或由靶核酸或靶核酸物质的变体所生成的扩增子的寡核苷酸可以在引物延伸反应中延伸。引物延伸反应指其中核酸聚合酶以模板特异性的方法将一个或多个核苷酸添加到引物(例如，寡核苷酸)的3'末端的分子反应。本领域已知适合用于引物延伸反应的条件。通常，将引物退火(即，杂交)至靶核酸以形成引物-模板复合物。引物-模板复合物在合适条件下与DNA聚合酶和一个或多个游离的核苷酸接触，以允许添加一个或多个核苷酸至引物的3'端。在某些实施方式中，引物与在核酸物质的变体之间不同的位置不直接杂交，而是与这类位置相邻的位置杂交(例如，位置的5')。在一些实施方式中，引物与在靶核酸物质的变体之间不同的位置的相邻区域直接杂交。在一些实施方式中，将链终止试剂纳入延伸产物后，在引物延伸反应中使用链终止试剂将终止引物延伸。
延伸反应通常在延伸条件下进行，并且大量这样的条件是已知的并且根据特定应用选择。延伸条件可以包括某些试剂，包括但不限于一种或多种寡核苷酸、延伸核苷酸(例如，核苷酸三磷酸(dNTP))、终止核苷酸(例如，一种或多种双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)或无环核苷酸)、一种或多种盐(例如，含镁的盐)、一种或多种缓冲液(例如，含有β-NAD、曲通X-100)以及一种或多种聚合剂(例如，DNA聚合酶、RNA聚合酶)。
能够选择和使用任意合适的延伸反应。能够使用延伸反应，例如用于区分SNP等位基因，这通过将脱氧核苷酸和/或链终止核苷酸(例如，双脱氧核苷酸，无环核苷酸)纳入到与靶核酸物质中SNP位点相邻的区域杂交的延伸寡核苷酸。所述引物经常由聚合酶延伸。在一些实施方式中，寡核苷酸由仅仅一个与SNP位点互补的脱氧核苷酸或链终止核苷酸(例如，双脱氧核苷酸或无环核苷酸)延伸。在一些实施方式中，寡核苷酸通过纳入dNTP延伸并且通过ddNTP或无环核苷酸终止，或在某些实施方式中，寡核苷酸通过纳入ddNTP或无环核苷酸终止而没有dNTP延伸。
在一些实施方式中，寡核苷酸物质能够在杂交条件下与遗传变异或变异体相邻的模板(例如，靶核酸物质)杂交(例如，寡核苷酸物质的3’端可能位于遗传突变位点的5’端，并且可以是距离所述遗传变异位点的5’端0-10个核苷酸)。靶核酸物质中遗传变异位点可以存在多个变体。遗传变异体是单核苷酸多态性(SNP)或单核苷酸变异体。在位于杂交的寡核苷酸3’端的模板目标上的单碱基位点上可能存在几个单核苷酸变异体。通过在位于杂交的寡核苷酸物质3’端的模板目标上位点的单碱基可能区分几个单核苷酸变异体。在一些实施方式中，通过一个在变异体位点的核苷酸延伸寡核苷酸物质。在一些实施方式中，可以通过5种终止核苷酸(例如，ddATP、ddUTP、ddTTP、ddGTP、ddCTP)中的任一种延伸寡核苷酸，取决于存在的变体的数量。靶核酸物质变体，或其对应的扩增子，可以作用为模板并且可以部分确定延伸反应中哪个终止核苷酸被加入到寡核苷酸上。在某些实施方式中，可以利用其他链终止试剂或核苷酸(例如，无环核苷酸或终止子)。在一些实施方式中，靶核酸物质可以具有2、3或4个变体。
可以将任意合适类型的核苷酸引入扩增产物或延伸产物中。在一些实施方式中，核苷酸可以是天然产生的核苷酸、终止核苷酸或非天然产生的核苷酸(例如，核苷酸类似物或衍生物)。在一些实施方式中，某些核苷酸可以包括可检测标记物和/或接合对的成员(例如，结合对的其他成员可以与固相连接)或荧光标记物对，用于通过FRET进行检测(例如，该对的一个成员可以位于通过延伸纳入UEP的终止寡核苷酸上，而该对的其他成员可以位于延伸产物寡核苷酸上的它处)。
在本文中，术语“链终止试剂”可以与“链终止子(chain terminator)试剂”或“链终止子”互换使用，并指当将其添加到延伸引物时使延伸反应停止的分子。链终止子可以包括核苷酸类似物，当其存在于多核苷酸链或寡核苷酸时阻止链或寡核苷酸的进一步延伸。在某些实施方式中，链终止试剂是链终止核苷酸。在一些实施方式中，链终止核苷酸是经修饰的核苷酸，当其在延伸反应中被纳入核酸分子(例如，寡核苷酸)的3'端时将不允许核苷酸被进一步纳入寡核苷酸。在某些实施方式中，在存在具有3'-5'外切核酸酶活性的酶时，不将链终止核苷酸从寡核苷酸或多核苷酸链移除。在某些实施方式中，核苷酸戊糖的'3OH可以被这样的部分取代，所述部分产生链终止的核苷酸并且还对通过具有3'-5'外切核酸酶活性的酶的移除具有抗性。在某些实施方式中，修饰链终止核苷酸的戊糖3'位置以用另一部分替换OH，包括但不限于，磷酰基基团，乙酰基基团，3'-O-甲基，3'-O-(2-硝基苄基)，3'-O-烯丙基，3'-叠氮基和3'-氨基。在一些实施方式中，3'OH基团被氢取代。在一些实施方式中，修饰的核苷酸是双脱氧核苷酸。在一些实施方式中，修饰的核苷酸是无环核苷酸。链终止核苷酸的示例性链终止试剂包括：双脱氧核苷酸，例如ddA(双脱氧腺嘌呤)，ddT(双脱氧胸腺嘧啶)，ddC(双脱氧胞嘧啶)，ddG(双脱氧鸟嘌呤)和ddU(双脱氧尿嘧啶)和无环核苷酸，例如，acyATP、acyCTP、acyGTP、acyTTP和acy-溴-UTP。
在一些实施方式中，也还阻断酶的3'-5'外切核酸酶活性的链终止试剂可以特异性地阻断特定酶的3'-5'外切核酸酶活性或者可以阻断多种不同酶的3'-5'外切核酸酶活性。
在某些实施方式中，对于本文所述的方法，其中靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体被延伸和检测，对高丰度变体或变体具有特异性的一种或多种链终止试剂的浓度低于对低丰度变体或变体具有特异性的一种或多种链终止试剂的浓度。对一种或多种高丰度变体具有特异性的一种或多种链终止试剂的浓度比对一种或多种低丰度变体具有特异性的一种或多种链终止试剂的浓度低约30％，低约20％，约0.01％-约30％，约0.3％-约30％，约1％-约20％，约0.5％-低约20％，约0.5％-低约15％，约1％-约15％，约1％-约10％，约2％-约10％，或约1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％。在某些实施方式中，对一种或多种高丰度变体具有特异性的一种或多种链终止试剂的浓度为对一种或多种低丰度变体具有特异性的一种或多种链终止试剂的浓度的约0.1％-约10％，约0.01％-约10％或约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％。
在某些实施方式中，延伸可以在等温条件下或在非等温环境下(例如，热循环条件)进行。一种或多种靶核酸可以在延伸反应中延伸，并且可以延伸各靶核酸的一个或多个变体。核酸可以延伸一个或多个核苷酸，并且在一些实施方式中，延伸产物长度为约10个核苷酸至约10,000个核苷酸，长度为约10至约1000个核苷酸，长度为约10至约500个核苷酸，长度为约10至约100个核苷酸，并且有时长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。纳入终止核苷酸(例如，ddNTP)、杂交位置或其他因子可以确定寡核苷酸延伸的长度。在某些实施方式中，在同一检测过程中进行扩增和延伸过程。
在一些实施方式中，延伸反应包括重复多个温度循环以扩增反应中延伸产物的量。在一些实施方式中，延伸反应循环2次或更多次。在一些实施方式中，延伸反应循环10次或更多次。在一些实施方式中，扩增反应循环约10,15,20,50,100,200,300,400,500或600次或更多次。在一些实施方式中，延伸反应循环20至50次。在一些实施方式中，延伸反应循环20至100次。在一些实施方式中，延伸反应循环20至300次。在一些实施方式中，延伸反应循环200至300次。在一些实施方式中，扩增反应循环至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100次。
在一些实施方式中，与靶核酸物质的变体杂交的寡核苷酸在延伸组合物存在的情况下通过一个核苷酸延伸。延伸组合物可以包括一种或多种缓冲液、盐、酶(例如，聚合酶，Klenow等)、水、模板(例如，DNA、RNA、扩增子等)、引物(例如，寡核苷酸)、三磷酸核苷酸、甘油、大分子排除分子(macromolecular exclusion molecule)和本领域所使用的任何其他添加剂。延伸组合物可以包括终止核苷酸(例如，双脱氧核苷酸(例如，ddNTP)或五环核苷酸)，非终止或延伸核苷酸(例如，dNTP)或终止核苷酸和非终止核苷酸的混合物。延伸组合物基本上由一种或多种特定终止核苷酸组成，可以包含延伸组合物(例如，缓冲液、盐、模板等)的任何其他组分，但是除了指定的那些不包含任何其他终止核苷酸或三磷酸核苷酸(列，dNTP)。例如，基本上由ddTTP和ddCTP组成的延伸组合物不含ddATP，ddGTP或任何其他dNTP。在一些实施方式中，延伸组合物中的核苷酸仅为与靶核酸杂交的终止核苷酸和寡核苷酸，靶核酸物质或其扩增子通过一个核苷酸延伸(即，延伸组合物中有时存在非终止或延伸核苷酸)。在一些实施方式中，延伸组合物基本上由终止核苷酸(例如，ddNTP，无环核苷酸)组成。在一些实施方式中，对高丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度低于对低丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度。
在一些实施方式中，试验中存在的靶核酸物质的低丰度变体的量相对于靶核酸物质的高丰度变体(例如，野生型)的量是根据表示低丰度变体和高丰度变体的延伸的寡核苷酸检测确定的。
在一些实施方式中，在延伸组合物中存在(或在一些实施方式中不存在)的终止核苷酸确定将哪个终止核苷酸加入到寡核苷酸中。在一些实施方式中，延伸组合物包含一种或多种终止核苷酸(例如，ddNTP或无环核苷酸)。在具有超过一种终止核苷酸的某些实施方式中，2、3或4种链终止核苷酸是不同的终止核苷酸(即，不是相同的物质，例如，ddA、ddT、ddC、ddG、ddU、acyATP、acyCTP、acyGTP、acyTTP和acy-溴-UTP)。在一些实施方式中，延伸组合物包含一种或多种终止核苷酸和一种或多种非终止核苷酸(例如，dNTP)。在一些实施方式中，延伸组合物包括对应特定变体(例如，第一变体、低量变体或低丰度变体)的终止核苷酸，并因此仅能够延伸特定变体。在一些实施方式中，延伸组合物中包括能够允许延伸第二变体(例如，野生型、高量变体或高丰度变体)的终止核苷酸，从而允许延伸第二变体。在一些实施方式中，方法包括将杂交的寡核苷酸物质与包含一种或多种终止核苷酸的延伸组合物在延伸条件下接触，从而生成延伸的寡核苷酸物质，其中杂交第一变体(例如，低丰度变体、较少丰度变体、低量变体)的杂交的寡核苷酸由终止核苷酸延伸，并且杂交第二变体(例如，野生型、高丰度变体、高量变体)的杂交的寡核苷酸由终止核苷酸延伸。
扩增过程产生的扩增子或延伸过程产生的延伸产物可经进一步加工。例如，扩增子可以与试剂接触，所述试剂除去未纳入扩增子或延伸产物的游离核苷酸上的磷酸部分。这类试剂的示例是磷酸酶(例如，碱性磷酸酶)。在一些实施方式中，碱性磷酸酶虾碱性磷酸酶或重组虾碱性磷酸酶。扩增子和延伸产物还可以与固相关联，可以被洗涤，可以接触去除末端磷酸的试剂(例如，暴露于磷酸酶)，可以接触去除末端核苷酸的试剂(例如，外切核酸酶)，可以接触进行切割的试剂(例如，外切核酸酶、核糖核酸酶)等。
在某些实施方式中，延伸过程产生的产物可经进一步加工。在某些实施方式中，延伸反应的产物(延伸的或未延伸的寡核苷酸)可以与具有3'-5'外切核酸酶活性的试剂接触。具有3'-5'外切核酸酶活性的酶能够依次去除寡核苷酸3'端的一个或多个核苷酸。在一些实施方式中，具有3'-5'外切核酸酶活性的酶可以利用单链和双链DNA作为底物。在一些实施方式中，具有3'-5'外切核酸酶活性的酶对单链DNA底物具有特异性。在某些实施方式中，具有3'-5'外切核酸酶活性的酶被某些经修饰的试剂或经修饰的核苷酸抑制，如本文所述。在某些实施方式中，能够抑制3'-5'外切核酸酶活性的经修饰的核苷酸是链终止核苷酸。在某些实施方式中，能够抑制3'-5'外切核酸酶活性的链终止核苷酸是双脱氧核苷酸或无环核苷酸。其3'-5'外切核酸酶活性被某些链终止试剂或核苷酸(例如，双脱氧核苷酸或无环核苷酸)抑制的酶称之为“Chop Block试剂”或“Chop Block酶”。
在某些实施方式中，其3'-5'外切核酸酶活性被某些链终止试剂或核苷酸抑制的酶来自嗜热栖热菌(Thermus themophilus)。在一些实施方式中，酶是嗜热栖热菌外切核酸酶I或TTHB178(参加Shimada等,Nucl.Acids Res.,38(17):5692-5705(2010)，其内容通过引用其全部内容纳入本文；还参见分别以SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48所示并以GenBank登录号BAD71974.1提交的蛋白质和核酸序列)。在实施方式中，TTHB178酶有组氨酸(His)标签(参见例如，示例性His-标签标记的TTHB178，其纯化术语实施例中并且其序列示于SEQID NO:49)。
在一些实施方式中，可以在本文所述的方法中用作Chop Block酶的其他单链3'-5'外切核酸酶包括但不限于大肠杆菌外切核酸酶I，大肠杆菌外切核酸酶X，智人(Homosapiens)EXO1，智人MRE11，智人TREX1，智人TREX2，智人DNA酶III，智人细胞凋亡增强外切核酸酶，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)DnaQ-样(O05231)，抗辐射奇异球菌(D.radiodurans)DnaQ-样(NP_051628和NP_880692)和DnaQ超家族的其他单链特异性3'-5'外切核酸酶。在某些实施方式中，作为聚合酶全酶部分的3'-5'外切核酸酶活性可以与全酶的其他组分分离，特别是如果3'-5'活性结构域位于全酶的不同多肽上。本领域技术人员能够鉴定将抑制在和谐酶3'-5'外切核酸酶活性的链终止试剂(例如，双脱氧核苷酸、无环核苷酸或其他经修饰的核苷酸)。例如，磷酰基或乙酰基取代戊糖3'-OH的核苷酸抑制Exo I的3'-5'外切核酸酶活性。因此，基于上述内容，除了TTHB178以外，本领域技术人员将能够鉴定还能够用于本文所述方法中的其他Chop Block试剂。
Chop Block酶通常以-20℃储存于50％甘油中。在某些实施方式中，具有3'-5'外切核酸酶活性的酶(Chop Block酶)于具有浓度为约50％的甘油的缓冲液中。在某些实施方式中，具有3'-5'外切核酸酶活性的酶或Chop Block酶于具有甘油的缓冲液中，所述甘油的浓度为低于约50％，或约49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施方式中，具有3'-5'外切核酸酶活性的酶(Chop Block酶)于不具有甘油的缓冲液中。在一些实施方式中，缓冲液是Tris，并且甘油的浓度是约10％或不存在甘油。
本文所用的术语“信噪比”是指通过在使用检测过程(例如，质谱)时量化信号相对于噪声的强度的比例来定量测量信号质量。在一些实施方式中，一个谱图上的强度峰具有比另一谱图上相同分析物(例如，延伸的寡核苷酸物质)产生的低强度峰更高的信噪比。在一些实施方式中，高丰度变体(例如，野生型等位基因、第二变体、野生型变体)衍生的延伸的寡核苷酸物质产生噪声。在一些实施方式中，低丰度变体(例如，第一变体、低量变体、突变变体、突变等位基因，SNP)衍生的延伸的寡核苷酸物质所产生的信号被丰度更高的延伸的寡核苷酸物质(例如，第二变体、高丰度变体、高量变体、野生型变体、野生型等位基因)所产生的噪声遮蔽，例如，使用质谱时。本文所述词语“信噪比”中使用的术语“信号”指延伸的寡核苷酸物质的信号峰的强度。在一些实施方式中，本文所述词语“信噪比”中使用的术语“信号”通常指丰度较低的变体(例如，第一变体、低丰度变体、突变变体、突变等位基因，SNP)衍生的延伸的寡核苷酸物质的信号峰的强度。在一些实施方式中，延伸组合物中不包括允许高丰度变体(例如，第二变体、野生型或丰度更高的变体)延伸的终止核苷酸，从而消除高丰度延伸产物的存在，因此使其不降低低丰度变体(例如，第一变体、突变变体、突变等位基因，SNP)的信噪比。在一些实施方式中，延伸组合物中包括允许高丰度变体(例如，第二变体、野生型或丰度更高的变体)延伸的终止核苷酸，其以比允许低丰度变体延伸的终止核苷酸低很多的浓度存在(即，调整或偏斜浓度)，从而不降低低丰度变体(例如，第一变体、突变变体、突变等位基因、SNP)的信噪比。在一些实施方式中，方法包括将杂交的寡核苷酸物质与延伸组合物在延伸条件下接触，所述延伸组合物包含一种或多种终止核苷酸，其中杂交低丰度变体(例如，低量变体、丰度较低的SNP变体)的杂交的寡核苷酸物质由终止核苷酸延伸，而杂交高丰度变体(例如，野生型或高量变体)的杂交的寡核苷酸物质由以这样浓度提供的终止核苷酸延伸，所述浓度比用于低丰度变体的终止核苷酸的浓度低，从而不显著降低信噪比，相较于仅低丰度变体在不存在延伸情况下为高丰度变体的情况。
本文使用的术语“灵敏度”指使用检测方法(例如，质谱)时能够检测到给定信噪比的分析物的量。在一些实施方式中，能够通过减少背景噪声水平改善灵敏度。在一些实施方式中，丰度更高的变体(例如，野生型等位基因、第二变体、野生型变体)衍生的延伸的寡核苷酸产生噪声。在一些实施方式中，当检测到衍生自丰度更高的延伸的寡核苷酸(例如，第二变体、野生型变体、野生型等位基因)的延伸的寡核苷酸所产生的信号但强度降低时，灵敏度增加。在一些实施方式中，延伸组合物以降低的浓度包括将允许丰度更高的变体(例如，野生型，高丰度变体，高量变体)延伸的终止核苷酸，所述降低的浓度不降低检测低丰度变体(例如，低量变体、突变变体、突变等位基因，SNP)的灵敏度。在某些实施方式中，相对于对低丰度变体具有特异性的终止核苷酸的浓度，对高丰度变体具有特异性的终止核苷酸的浓度为约10％或更少。在某些实施方式中，对高丰度变体具有特异性的终止核苷酸的浓度是对低丰度变体具有特异性的终止核苷酸的浓度的约0.5％-少于约20％，约0.5％-少于约15％，约1％-约15％，约1％-约10％或约2％-约10％。在某些实施方式中，相对于对低丰度变体具有特异性的终止核苷酸的浓度，对高丰度变体具有特异性的终止核苷酸的浓度是约0.01％-约30％。在某些实施方式中，相对于对低丰度变体具有特异性的终止核苷酸的浓度，对高丰度变体具有特异性的终止核苷酸的浓度是约0.1％-约30％。在某些实施方式中，相对于对低丰度变体具有特异性的终止核苷酸的浓度，对高丰度变体具有特异性的终止核苷酸的浓度是约0.5％-约10％。在某些实施方式中，相对于对低丰度变体具有特异性的终止核苷酸的浓度，对高丰度变体具有特异性的终止核苷酸的浓度是约1％-约2％。
在一些实施方式中，在分析延伸的寡核苷酸之前去除未延伸的寡核苷酸可以造成信噪比(SNR)增加，并伴随着检测由低丰度变体产生的信号的灵敏度增加。延伸反应的产物可以包括延伸的寡核苷酸和未延伸的寡核苷酸。未延伸的寡核苷酸可以增加背景噪声，这可能会干扰低丰度变异体(已经产生微弱信号)的检测。在本文所述方法的一些实施方式中，未延伸的寡核苷酸通过反应中包括的酶的3'-5'外切核酸酶活性去除。在本文所述的方法的一些实施方式中，未延伸的寡核苷酸通常在谱图的某些区域中产生显著的信号，因此占据了这些区域并排除了还可以在谱图相同区域中产生信号的延伸的寡核苷酸的设计。去除未延伸的寡核苷酸还将增加能够用于检测信号的谱图区域并且增加潜在有用的寡核苷酸的数量。
可区分标记物、检测和释放
如本文所用，术语“可区分标记物”和“可区分标签”指可以彼此区分并用于鉴定标签连接的核酸的标记物或标签的类型。可以选择多种类型的标记物和标签并用于本文提供的多重方法。例如，可以使用寡核苷酸、氨基酸、小型有机分子、光发射分子、光吸收分子、光散射分子、发光分子、同位素、酶等作为可区分标记物或标签。在某些实施方式中，也能够使用寡核苷酸、氨基酸和/或各种长度、各种荷质比、各种电泳迁移率(毛细管电泳迁移率)和/或各种质量的小分子有机分子作为可区分标记物或标签。因此，可以使用荧光团、放射性同位素、发色剂、发光剂、化学发光剂、光散射剂等作为标记物。标记物的选择取决于所需灵敏度、与核酸偶联的难易、稳定性要求以及可用的设备。本文相对于可区分标记物和标签使用的“可区分特征”指能够与另一种标记物或标签区分的一种标记物或标签的任意特征(例如，质量或本文所述的其他)。在一些实施方式中，标记物与链终止试剂或链终止核苷酸连接。在一些实施方式中，可以选择和/或设计可区分标记物和标签的标记物组成，以导致质谱中最优的飞行表现并且允许标记物和标签在高的多重水平上区分。在一些实施方式中，标记物如荧光标记物与实现空间分离的方法如阵列、珠或毛细管电泳一起使用。在一些实施方式中，标记物是通过电泳或实施PCR检测的荧光标记物或染料。
可检测标记物包括但不限于，核苷酸(经标记或未经标记的)、复合体(compomer)、糖、肽、蛋白质、抗体、化学化合物、导电聚合物、结合部分如生物素、质量标签、氧化铁粒子或珠、比色剂、发光剂、化学发光剂、光射散剂、荧光标签、放射性标签、负荷标签(荷电或磁)、挥发标签和疏水标签、生物分子(例如，结合对的成员、抗体/抗原、抗体/抗体、抗体/抗体片段、抗体/抗体受体、抗体/蛋白A或蛋白G、半抗原/抗半抗原、生物素/亲和素、生物素/链霉亲和素、叶酸/叶酸结合蛋白、维生素B12/特性因子、化学反应基团/互补化学反应基团(例如，巯基/马来酰亚胺、巯基/卤化乙酰衍生物、胺/异硫氰酸酯、胺/琥珀酰亚胺酯和胺/磺酰卤化物)等，其中一些将在如下进一步描述。在一些实施方式中，探针可以包含信号生成部分，其与靶标杂交并通过纳米孔改变靶核酸的通道(passage)，并且可以当它通过纳米孔从靶核酸释放时产生信号(例如，改变通过已知大小的孔的速度或时间)。
本文所用的术语“检测”标记物指鉴定标记物质。能够使用任意合适的检测设备以区分样品中的标记物质。适于检测质量可区分标记物的检测设备包括但不限于某些质谱和凝胶电泳设备。质谱形式的示例包括但不限于：基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱(MS)、MALDI正交TOF质谱(OTOF MS；二维)、激光解吸质谱(LDMS)、电喷雾(ES)质谱、离子回旋共振(ICR)质谱和傅立叶变换质谱。本文所述的方法容易适用于质谱形式，其中分析物经挥发和离子化(“离子化MS”，例如，MALDI-TOF MS，LDMS，ESMS，线性TOF，OTOF)。正交离子提取MALDI-TOF和轴向MALDI-TOF能够产生相对高的分辨率，并且因此，相对高水平的多重化。适用于检测光发射、光吸收和/或光散射标记的检测设备包括但不限于某些光检测器和光电检测器(例如，检测荧光、化学发光、吸收和/或光散射标记物)。
对应低丰度(低量)和高丰度(高量)变体的经标记的延伸产物可以通过多种方法分析，包括但不限于，质谱，MALDI-TOF质谱，荧光检测，DNA测序凝胶，自动DNA测序机上的毛细管电泳，微通道电泳和其他测序方法，质谱，飞行时间质谱，四极杆质谱，扇形磁场质谱，电子质谱红外光谱，紫外光谱，恒电势电流测定法，电流/电化学信号测量或通过DNA杂交技术，包括Southern印迹，Slot印迹，Dot印迹和DNA微阵列，其中DNA片段可用作“探针”和“靶标”，ELISA，荧光试验，荧光共振能量转移(FRET)，SNP-IT，GeneChips，HuSNP，BeadArray，TaqMan试验，Invader试验，
或
方法。
可以通过多种方法检测通过本文提供的方法获得的对应高丰度变体(高量变体)和低丰度变体(低量变体)的延伸产物。例如，延伸引物(UEP)和/或链终止试剂可以用允许检测信号和/或定量信号的任何类型的化学基团或部分标记，包括但不限于，质量标记物、放射性分子、荧光分子、抗体、抗体片段、半抗原、碳水化合物、生物素、生物素衍生物、磷光部分、发光部分、电化学发光部分、在氧化或还原时产生电化学信号的部分，例如铁，钌或锇的复合物(参见例如，由Genmark诊断公司(Genmark Diagnostics，Inc)使用的eSensor技术，例如Peirce等，J.Clin.Micribiol.,50(11):3458-3465(2012)中所述)、色度部分和具有可检测的电子自旋共振、电容、介电常数或电导率的部分、或其标记物的任何组合。
在一些实施方式中，对于本文所述的方法，寡核苷酸物质通常与可区分的可检测标记物质配对，从而使特定标记物或标签物质的鉴定直接鉴定特定组合物中特定靶核酸物质的存在。因此，例如，可以使用标记物质的一种可区分的特征，以鉴定组合物中的一个靶核酸物质，因为特定可区分特征对应于特定靶核酸。标记物和标签可以通过任意已知的方法并且在任意位置(例如，寡核苷酸的5'端)与核酸(例如，寡核苷酸)连接。因此，如本文所用，述及各特定标记物“特异性对应”各特定靶核酸物质指一种标记物与一个靶核酸物质配对。在某些实施方式中，当检测到标记物质的存在时，从而检测到与标记物质相关联的靶核酸物质的存在。
本文使用的对应于可区分标签或标记物(统称为“标记物”)的“物质”指相对于另一种标记物可检测可区分的一种标记物。在某些实施方式中，标记物质的数量包括但不限于，约2-约10000种标记物质，约2-约500,000种标记物质，约2-约100,000，约2-约50000，约2-约10000和约2-约500种标记物质，或有时约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000或500000种标记物质。
本文所用的术语“质量可区分标记物”是指以质量作为特征区分的标记物。在一些实施方式中，所述可区分标签由核苷酸组成，并且有时所述标签长约5个核苷酸-约50个核苷酸。在某些实施方式中，所述可区分标签是核苷酸复合体，其有时长约5个核苷酸-约35个核苷酸。在一些实施方式中，所述可区分标签是肽，其有时长约5个氨基酸-约100个氨基酸。在某些实施方式中，可区分标签是有机分子单元的多联体(concatemer)。在一些实施方式中，标签是三苯甲基分子多联体。在某些实施方式中，质量可区分标记物是链终止核苷酸。
能够选择和使用多种质量可区分标记物，例如复合体、氨基酸和/或多联体。能够通过质量区分核苷酸串(例如，核酸；复合体)、氨基酸串(例如，肽；多肽；复合体)和/或多联体的不同长度和/或组成，并用作标记物。在质量可区分标记物中可以采用任意数量的单元，并且这样的单元的上限和下限部分取决于质量窗和用于检测和区分这样的标记的系统的分辨率。因此，能够部分基于用于检测和区分标记物的质量窗和检测器的分辨率选择质量可区分标记物的长度和组成。
本文使用的术语“复合体”指一组单体单元的组成而不是所述单体单元的特定序列。对于核酸，术语“复合物”指具有单体单元作为碱基的核酸的碱基组成。各类型碱基的数量可以通过Bn表示(即：AaCcGgTt，其中A0C0G0T0表示“孔”复合体或不包含碱基的复合体)。天然复合体是这样的复合物，其中所有组成单体单元(例如，核酸的碱基和多肽的氨基酸)大于或等于0。在某些实施方式中，a、c、g或t中的至少一个等于1或更大(例如，A0C0G1T0、A1C0G1T0、A2C1G1T2、A3C2G1T5)。为了比较序列以确定序列变异的目的，在本文提供的方法中，能够通过处理数据采用的算法产生含有负数数量的单体单元的“非天然”复合体。对于多肽，复合体是多肽片段的氨基酸组合物，其中每种氨基酸类型的数量具有相似表示。复合体物质能够对应于多种序列。例如，复合体A2G3对应序列AGGAG、GGGAA、AAGGG、GGAGA和其他。通常，独特的复合体对应于序列，但是超过一条序列可以对应于相同的复合体。在某些实施方式中，一种复合体物质与一种靶核酸物质、扩增子物质和/或寡核苷酸物质配对(对应)。在本文的实施方式中(例如，A0C0G5T0和A0C5G0T0是不同的和质量可区分的复合体)，不同的复合体具有不同的碱基组成，和可区分的质量。在一些实施方式中，一组复合体物质通过碱基组成区分并且具有相同的长度。在某些实施方式中，一组复合体物质通过碱基组成和长度区分。
用作质量可区分标记物的核苷酸复合体可以是任意长度的，其中所有复合体物质可以是可检测区分的，例如长度为约1-15、5-20、1-30、5-35、10-30、15-30、20-35、25-35、30-40、35-45、40-50或25-50，或有时约55、60、65、70、75、80、85、90、85或100个核苷酸。用作质量可区分标记物的肽或多肽能够是任意长度的，因此所有的复合体物质能够可检测区分，例如长度为约1-20、10-30、20-40、30-50、40-60、50-70、60-80、70-90或80-100个氨基酸。如上述，在复合体中单元数量的限制经常是受到用于区分所述复合体物质的质量窗和检测方法的分辨率的限制。
术语“多联体”和“串联体”在本文中同义(统称为“多联体”)，并且指包含彼此连接的两个或更多个单元的分子(例如，通常连续连接；在某些实施方式中有时分支)。在一些实施方式中，多联体有时是核酸和/或人工多聚物。在一些实施方式中，多联体可以包括相同类型的单元(例如，同多联体(homoconcatemer))，并且有时多联体可以包含不同类型的单元(例如，异多联体(heteroconcatemer))。多联体可以包含任何类型的单元，包括核苷酸单元、氨基酸单元、小有机分子单元(例如，三苯甲基)、特定核苷酸序列单元、特定氨基酸序列单元等。在一个实施方式中，三个特定序列单元ABC的同多联体是ABCABCABC。只要各多联体物质可以与其他物质可检测地区分，多联体可以包含任意数量的单元。例如，在一些实施方式中，三苯甲基多联体物质可以包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900或1000个三苯甲基单元。
在某些实施方式中，可以由核酸产物(例如，延伸的寡核苷酸)中释放可区分标记物。可区分标记物和核酸之间的连接可以是能被转录和切割，被切割并且允许检测释放的一种或多种标记(例如，Ehrich等题为“目标特异性复合体以及使用方法”的美国专利申请公开号US20050287533A1)的任意类型。这类连接和切割连接的方法(“切割条件”)是已知的。在某些实施方式中，可以从标记物连接的分子的其他部分分离标记物。在一些实施方式中，从核酸的较大串(例如，延伸的寡核苷酸)中切割标记物(例如，复合体)。连接的非限制性示例包括可以通过核酸酶(例如，核糖核酸酶、内切核酸酶)切割的连接；可以通过化学方法切割的连接；可以通过物理处理切割的连接；和可以通过光切割的光可切接头(例如，邻硝基苄基，6-硝基藜芦氧羰基(6-nitroveratryloxycarbonyl)，2-硝基苄基基团)。当使用发射光的检测系统(例如，涉及光的激发射的基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱)时，光可切割接头具有优势，因为切割和检测结合在一起且在一个步骤中进行。
在某些实施方式中，标记物可以是较大单元的部分，并且在检测之前可以从该单元分离。例如，在某些实施方式中，标记物是在较大核苷酸序列中的一组连续核苷酸，并且标记物切割自较大核苷酸序列。在这类实施方式中，标记物通常位于其所在核苷酸序列或核酸的一个末端。在一些实施方式中，标记物或其前体位于转录盒中，所述转录盒包括与编码所述标记物的前体序列可操作地连接的启动子序列。在后续的实施方式中，启动子有时是RNA聚合酶募集启动子，其产生包括或由标记物组成的RNA。在检测之前可以切割包括标记物的RNA以释放标记物(例如，用RNA酶)。
多重化
本文提供的方法允许高通量检测和定量多种靶核酸物质中靶核酸物质及其高丰度和低丰度变体。多重化指同时检测超过一种靶核酸物质。与质谱联合进行多重反应的常规方法是已知的(参见例如，美国专利号6,043,031、5,547,835与国际PCT申请号WO 97/37041)。相较于必须对各个靶核酸物质进行单独的质谱分析，多重化提供的优点在于多种靶核酸物质和其变体(例如，具有不同序列变异的一些)可以在仅仅单一质谱中鉴定。在一些实施方式中，本文提供的方法能用于快速且准确分析序列变化的高通量、高度自动化过程。在一些实施方式中，本文的方法可在单一反应中以高水平多重化。当位于基因座的基因型未知时，多重化是适用的，并且在一些实施方式中，位于基因座的基因型是已知的。在一些实施方式中，多重化利用所述的检测方法而不是质谱分析。
在某些实施方式中，多重化的靶核酸物质的数量包括但不限于，约2-约1,000种，约2-约500种，约2-约100种，并且有时约1-3、3-5、5-7、7-9、9-11、11-13、13-15、15-17、17-19、19-21、21-23、23-25、25-27、27-29、29-31、31-33、33-35、35-37、37-39、39-41、41-43、43-45、45-47、47-49、49-51、51-53、53-55、55-57、57-59、59-61、61-63、63-65、65-67、67-69、69-71、71-73、73-75、75-77、77-79、79-81、81-83、83-85、85-87、87-89、89-91、91-93、93-95、95-97、97-101、101-103、103-105、105-107、107-109、109-111、111-113、113-115、115-117、117-119、121-123、123-125、125-127、127-129、129-131、131-133、133-135、135-137、137-139、139-141、141-143、143-145、145-147、147-149、149-151、151-153、153-155、155-157、157-159、159-161、161-163、163-165、165-167、167-169、169-171、171-173、173-175、175-177、177-179、179-181、181-183、183-185、185-187、187-189、189-191、191-193、193-195、195-197、197-199、199-201、201-203、203-205、205-207、207-209、209-211、211-213、213-215、215-217、217-219、219-221、221-223、223-225、225-227、227-229、229-231、231-233、233-235、235-237、237-239、239-241、241-243、243-245、245-247、247-249、249-251、251-253、253-255、255-257、257-259、259-261、261-263、263-265、265-267、267-269、269-271、271-273、273-275、275-277、277-279、279-281、281-283、283-285、285-287、287-289、289-291、291-293、293-295、295-297、297-299、299-301、301-303、303-305、305-307、307-309、309-311、311-313、313-315、315-317、317-319、319-321、321-323、323-325、325-327、327-329、329-331、331-333、333-335、335-337、337-339、339-341、341-343、343-345、345-347、347-349、349-351、351-353、353-355、355-357、357-359、359-361、361-363、363-365、365-367、367-369、369-371、371-373、373-375、375-377、377-379、379-381、381-383、383-385、385-387、387-389、389-391、391-393、393-395、395-397、397-401、401-403、403-405、405-407、407-409、409-411、411-413、413-415、415-417、417-419、419-421、421-423、423-425、425-427、427-429、429-431、431-433、433-435、435-437、437-439、439-441、441-443、443-445、445-447、447-449、449-451、451-453、453-455、455-457、457-459、459-461、461-463、463-465、465-467、467-469、469-471、471-473、473-475、475-477、477-479、479-481、481-483、483-485、485-487、487-489、489-491、491-493、493-495、495-497、497-501种或更多种。
用多重分析获得解析质谱的设计方法可包括引物和寡核苷酸设计方法和反应设计方法。就多重分析中的引物与寡核苷酸设计而言，单重反应采用相同的引物设计总体方针，例如避免假引发和引物二聚体，只是多重反应涉及更多引物。此外，一个试验的质谱中的分析物峰可以从该试验与之多重化的任意试验的产物中充分解析，包括暂停峰(pausingpeak)和任意其它副产物峰。还有，分析物峰优选落入用户指定的质量窗，例如，在5,000-8,500Da范围内。在一些实施方式中，相对于给定SNP链的靶序列，可以设计延伸寡核苷酸。在这类实施方式中，例如，长度通常是可以用户指定的(例如，17-24个碱基或17-26个碱基)的范围之间，并且通常不包含靶序列中不确定的碱基。有时通过计算序列依赖性解链(或杂交/解离)温度Tm来衡量杂交强度。特定的引物选择可能被禁止，或相对于其他引物选择不利，因为其发夹潜在性、假引发潜在性、引物二聚体潜在性、低复杂性区域和问题亚序列如GGGG。用于设计延伸寡核苷酸(例如，按照这些标准)的方法和软件是已知的，并且包括，例如SpectroDESIGNER(塞昆纳姆(Sequenom))。
在一些实施方式中，本文提供的多重试验(multiplex assay)设计成检测代表约0.1％-约5％靶核酸物质的低丰度变体(超高灵敏度试验)。在一些实施方式中，本文提供的多重试验是为单碱基延伸设计的，并且包括在相同重中的多种靶核酸具有共同的低丰度变体。在一些实施方式中，试验中仅提供了特异性地延伸多种靶核酸物质的共同的低丰度变体的链终止试剂。试验中不提供特异性地延伸多种靶核酸物质的高丰度变体的链终止试剂。可以部分利用下述标准设计试验：
a.寡核苷酸物质与衍生自靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体的扩增子在单碱基位置的5’位置处杂交，所述单碱基位置在靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体之间不同。
b.重(plex)中多种靶核酸高丰度变体各自的单碱基位置处的核苷酸相同或不同。
c.重(plex)中多种靶核酸物质的低丰度变体各自的单碱基位置处的核苷酸相同(即，重中所有的试验具有相同的低丰度或共同的突变碱基)。
d.重(plex)中多种靶核酸物质的高丰度变体单碱基位置处的核苷酸与重中多种靶核酸物质的低丰度变体单碱基位置处的核苷酸不同。
在一些实施方式中，多重试验基于使用特异性地延伸单一重中包括的靶核酸物质的低丰度变体的单链终止试剂或链终止核苷酸，并且还包括特异性地延伸试验中靶核酸物质的高丰度变体的0、1、2或3种终止核苷酸。例如，设计了4个多重试验(多个重)，并且各重靶向不同的低丰度变体。具有相同低丰度变体的靶核酸被组合在单一重内。
多重C
低丰度变体-C
可能的高丰度变体–无或G、A、T
多重A
低丰度变体A
可能的高丰度变体–无或G、C、T
多重T
低丰度变体T
可能的高丰度变体–无或G、A、C
多重G
低丰度变体G
可能的高丰度变体–无或C、A、T
在一些实施方式中，相对于对低丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度，对一种或多种高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂各自的浓度为约0.01％-约30％。
在一些实施方式中，本文提供的多重试验设计成检测代表约1％-约10％靶核酸物质的低丰度变体(高灵敏度试验)。在一些实施方式中，本文提供的多重试验是为单碱基延伸设计的，并且包括在相同重中的靶核酸物质具有共同的高丰度变体。可以部分利用下述标准设计试验：
a.寡核苷酸与衍生自靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体的扩增子在对单碱基位置的5’位置处杂交，所述单碱基位置在靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体之间不同。
b.重(plex)中多种靶核酸物质的高丰度变体各自的单碱基位置处的核苷酸相同(即，重中的所有试验具有共同的相同的高丰度碱基)。
c.重(plex)中多种靶核酸低丰度变体各自的单碱基位置处的核苷酸相同或不同。
d.重(plex)中多种靶核酸物质的低丰度变体单碱基位置处的核苷酸与重中多种靶核酸物质的高丰度变体单碱基位置处的核苷酸不同。
在一些实施方式中，多重试验基于使用特异性地延伸单一重中包括的靶核酸物质的高丰度变体的单链终止试剂或链终止核苷酸。多重试验可以包括特异性地延伸试验中靶核酸物质的低丰度变体的1、2或3种终止核苷酸。例如，设计了4个多重试验(多个重)，并且各重靶向不同的高丰度变体。具有相同高丰度变体的靶核酸被组合在单一重内。
多重C
高丰度变体-C
可能的低丰度变体–G、A、T
多重A
高丰度变体A
可能的低丰度变体–G、C、T
多重T
高丰度变体T
可能的低丰度变体–G、A、C
多重G
高丰度变体G
可能的低丰度变体–C、A、T
在一些实施方式中，相对于对低丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂的浓度，对高丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度为约0.01％-约30％。
在一些实施方式中，本文提供的多重试验设计成检测代表至少10％靶核酸物质的低丰度变体(基因分型试验)。在一些实施方式中，本文提供的多重试验是为单碱基延伸设计的，并且包括在相同重中的靶核酸物质不基于变体的相对丰度来确定。可以部分利用下述标准设计试验：
a.寡核苷酸物质与衍生自靶核酸物质的扩增子在单碱基位置的5'位置处杂交，所述单碱基位置在靶核酸物质的变体之间不同。变异以大约相同的丰度存在(例如，不存在高丰度或低丰度变体)。
b.重(plex)中多种靶核酸物质的变体各自的单碱基位置处的核苷酸相同或不同。
在一些实施方式中，多重试验基于使用进行延伸的单链终止试剂或链终止核苷酸，所述延伸不受限于单一重中包括的靶核酸物质的变体。多重试验可以在试验中包括1、2、3或4种终止核苷酸。
在一些实施方式中，链终止试剂的浓度大约是等摩尔的。
本文使用的术语“检出率(call rate)”或“检测率(calling rate)”是指相对于尝试得到的检出的数量得到的检出的数量。换而言之，对于12-重反应，如果从实施本文所述的方法最终测定10个基因型，那么已经得到10个检出，检出率10/12。不同的事件能够导致特定尝试测定的失败，并且导致低于100％的检出率。有时，在dNTP和用于终止的ddNTP的混合物的情况中，在引入一个非终止核苷酸(例如，dNTP)之后由于聚合酶的暂停而出现未适当延伸的产物，得到提前终止的延伸引物。在多态性位点上的错误终止的和正确终止的引物质量延伸反应之间的质量差异有时太小无法持续分辨并且如果使用非适当终止的混合物时可导致错误检出。正确的终止和错误的终止之间(即，由暂停所引起的)以及正确的终止和盐加合物之间以及正确的终止和非特异性纳入的质量差异通常被最大化以减少错误的数量。
可以通过评价在一个或多个分析中得到的检出数(例如，正确或准确测量的)和/或假阳性和/或假阴性事件的数量来确定多重分析的准确性。也可以通过比较多重分析中评估的每个目标相应的在单重分析中的准确性来评估准确性。在某些实施方式中，可以使用一种或多种方法确定检出率。例如，人工方法可以与自动化或计算机方法联合使用以产生检出，并且在一些实施方式中，可以汇总每种方法的检出率以计算总检出率。在某些实施方式中，当多重化两种或更多种靶核酸物质(例如，50或更多种靶核酸)时，准确性或检出率可以是例如约99％或更高、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、87-88％、85-86％、83-84％、81-82％、80％、78-79％或76-77％。在一些实施方式中，在包括约2-200个靶物质的多重分析中每个靶物质的检出率大于或等于80％或更高(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)。
在某些实施方式中，可以基于检出率或准确率确定错误率。例如，错误率可以是错误产生的检出的数量。在一些实施方式中，例如，错误率可以是低于检出率或准确率100％。错误率也可以称为“失败率”。假阳性和/或假阴性的鉴定能够在此调整检出率和错误率。在某些实施方式中，进行更多的测定能够帮助鉴定假阳性和/或假阴性，从而调节检出率和/或错误率。在某些实施方式中，当多重化两种或更多种靶核酸物质(例如，50或更多种靶核酸)时，错误率能够是例如约1％或更低、2％、3％、4,％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％。
试剂盒
在一些实施方式中，提供了用于进行本文所述方法的试剂盒。试剂盒通常包含含有一种或多种本文所述组分的一个或多个容器。试剂盒包括任意数量的单独容器、包、管、小瓶、多孔板等中的一种或多种组分，或者可以在这些容器中以多种组合方式组合组分。试剂盒可以包括例如一种或多种下述组分：(i)一个或多个核苷酸(例如，终止核苷酸和/或非终止核苷酸)；其中的一个或多个可以包含检测标签；(ii)一种或多种寡核苷酸，其中的一种或多种可以包括检测标记物(例如，扩增引物，一种或多种延伸引物(UEP)，包含标签的寡核苷酸)；(iii)一种或多种酶(例如，聚合酶，内切核酸酶，限制酶，外切核酸酶等)；(v)对照组分(例如，对照基因组DNA，引物，合成模板，靶核酸等)；(vi)一种或多种缓冲液和(vii)印刷品(例如，说明书，标记物等)。在本文所述的试剂盒的一些实施方式中，终止核苷酸的相对量存在于溶液中或以相对量存在，从而在根据提供的说明书溶解后，对高丰度变体具有特异性的链终止核苷酸的浓度低于对低丰度变体具有特异性的链终止核苷酸的浓度。在一些实施方式中，对一种或多种高丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度比对一种或多种低丰度变体具有特异性的一种或多种链终止试剂的浓度低约30％，低约20％，约0.01％-约30％，约0.3％-约30％，约1％-约20％，约0.5％-低约20％，约0.5％-低约15％，约1％-约15％，约1％-约10％，约2％-约10％，或约1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％。在某些实施方式中，对高丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度为对低丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度的约0.1％-约10％，约0.01％-约10％或约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％。
试剂盒有时与过程联用，并且可以包括用于进行一个或多个过程的说明和/或一种或多种组合物的描述。试剂盒可以用于执行本文所述的过程。说明和/或描述可以是有形形式(例如，纸等)或电子形式的(例如，有形介质上的计算机可读文件等(例如，光盘))，并且可以包括在试剂盒插入物中。试剂盒还可以包括提供这类说明或描述的互联网位置的书面说明。
在某些实施方式中，试剂盒包括具有3'-5'外切酶活性的酶；和一种或多种链终止试剂，所述链终止试剂在其处于寡核苷酸的3'末端时抑制所述酶在寡核苷酸上的活性。在某些实施方式中，试剂盒包括对单链DNA具有特异性的具有3'-5'外切核酸酶活性的酶。在一些实施方式中，酶来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)。在一些实施方式中，酶是TTHB178。在一些实施方式中，提供含于甘油浓度小于50％的缓冲液中的酶。在一些实施方式中，提供不含甘油的缓冲液中的酶。在一些实施方式中，酶在10％甘油Tris缓冲液中，或没有甘油的Tris缓冲液中。在某些实施方式中，一种或多种链终止试剂由1种链终止试剂组成。在某些实施方式中，一种或多种链终止试剂由2种链终止试剂组成。在某些实施方式中，一种或多种链终止试剂由3种链终止试剂组成。在某些实施方式中，一种或多种链终止试剂由4种链终止试剂组成。
在某些实施方式中，链终止试剂是链终止核苷酸。在某些所述方法中，在链终止核苷酸的戊糖部分的3'位置处修饰链终止核苷酸。在某些实施方式中，链终止试剂是双脱氧核苷酸。在某些实施方式中，双脱氧核苷酸选自：ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。在某些实施方式中，链终止试剂是无环核苷酸。在某些实施方式中，无环核苷酸选自：acyATP、acyCTP、acyGTP、acyTTP和acy-溴-UTP。在某些实施方式中，链终止试剂包括质量可区分标签。
在某些实施方式中，试剂盒包括下述一种或多种：寡核苷酸、聚合酶、碱性磷酸酶、一种或多种缓冲液和一种或多种反应对照。
在某些实施方式中，试剂盒包括对多种高丰度变体的检测具有特异性的1、2或3种链终止试剂和对多种低丰度变体的检测具有特异性的链终止试剂，并且对多种高丰度变体的检测具有特异性的1、2或3种链终止试剂各自的浓度是对多种低丰度变体的检测具有特异性的链终止试剂的浓度的约0.3％-约30％。在某些实施方式中，对多种低丰度变体的检测具有特异性的链终止试剂和对多种高丰度变体的检测具有特异性的1、2或3种链终止试剂处于单一容器内。在一些实施方式中，试剂盒包括2个或更多个容器，其各自装有对多种低丰度变体的检测具有特异性的不同的链终止试剂和对多种高丰度变体的检测具有特异性的1、2或3种链终止试剂。
在某些实施方式中，试剂盒包括对多种低丰度变体的检测具有特异性的1、2或3种链终止试剂和对多种高丰度变体的检测具有特异性的链终止试剂，并且对高丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度是对低丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂各自浓度的约0.3％-约30％。在某些实施方式中，对多种高丰度变体的检测具有特异性的链终止试剂和对多种低丰度变体的检测具有特异性的1、2或3种链终止试剂处于单一容器内。在一些实施方式中，试剂盒包括2个或更多个容器，其各自装有对多种高丰度变体的检测具有特异性的不同的链终止试剂和对多种低丰度变体的检测具有特异性的1、2或3种链终止试剂。
在某些实施方式中，试剂盒包括等同浓度的2、3或4种链终止试剂。
实施例
下述实施例说明了某些实施方式，但是并不限制技术。
实施例1：使用Chop Block试剂的外切核酸酶反应
具有3'-5'外切核酸酶的调节(Chop Block步骤)可以应用于单碱基延伸反应和单碱基延伸反应的各种实施方式，包括但不限于，多重基因分型反应、低量变体的多重高灵敏度反应，极低量变体的多重超高灵敏度反应。这三种生物化学反应利用了标准多重PCR来询问感兴趣的基因组变异。PCR后，对于所有这三种生物化学反应，扩增的产物用虾碱性磷酸酶处理，以使剩余的脱氧核苷酸去磷酸化。对于所有三种生物化学反应，然后在单碱基延伸反应中探测SAP处理的扩增产物。单碱基延伸反应中这些生物化学反应之间的区别是使用的链终止核苷酸的数量、量和类型。各化学反应的单碱基延伸反应为9ul，并且整个9ul用Chop Block试剂调节，如表1所示。
表1.Chop Block反应组分
*10x缓冲液组合是：20mM Hepes、100mM KCl和5mM MgCl2**，pH 7.5
**MnCl2是潜在的替代性辅助因子
整个反应在60℃孵育30分钟，并且后续变性/失活步骤在85℃进行10分钟。ChopBlock反应后，添加38μl的28μM吐温-20溶液，最终总体积为50μl。然后用离子交换树脂进一步调节经Chop Block调节的分析物，以去除盐并分配到排列于硅芯片上的基质上。通过以400压出体积添加20ml树脂，使用CPM(芯片制备模块(Chip Prep Module))将反应物分配到96孔SpectroCHIP(F芯片)上(与分配分析物到SpectroCHIP相关的CPM的设置，其与CPM分配移液管吸头末端出现的分析物悬垂液滴的大小有关)。然后，通过使用MassARRAY 4的Maldi-TOF质谱法对芯片进行分析。
在多种iPLEX-USK(Ultraseek)PCR/SAP/延伸反应中测试Chop Block反应检测1％发生率的EGFR外显子19缺失突变(EGFR_Exon19del_2236@1％)的能力，使用Chop Block酶，在12μl体积中最终浓度为0.034μg/μl-0.150μg/μl(0.034、0.072、0.080、0.089、0.098、0.109、0.122、0.135和0.150μg/μl)。发现所有测试的浓度的突变峰检测的灵敏度是统计学上等同的。此外，测试了样品一系列最终体积(添加吐温-20后，Chop Block反应后)的检测灵敏度。测试了25μl-50μl(25、30、35、40、45和50μl)的最终体积，并发现它们在突变检测的灵敏度方面是统计学上等同的。
实施例2：使用Chop Block试剂的超高灵敏度试验(UltraSEEKTM)
图3是超高灵敏度试验的实施方式的示意图，所述超高灵敏度试验仅使用对结合低丰度变体(参见上组图，单碱基延伸试验)的探针的延伸具有特异性的单链终止试剂(例如，终止TTP)。为了简化，附图显示了具有两种变体的单一核酸物质。在多重试验中，存在多种核酸物质，其各自具有两种变体。结合多种物质的低丰度变体的探针将由单链终止试剂(例如，终止TTP)延伸。在下组图(外切核酸酶试验)中，延伸的探针(仅代表低丰度变体)受Chop Block酶保护而免于消化，然而未延伸的探针不受保护。对于该具体实施例，材料和方案基于基纳生物科学公司(Agena Bioscience)的UtraSEEKTM试验。
本领域普通技术人员将认识到的是，通过小调方案，试验可以针对不同的目标和/或利用不同的试剂。
在替代性实施方式中(未示出)，超高灵敏度试验可以具有对低丰度变体具有特异性的单一链终止试剂和对高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂(各自处于比对低丰度变体具有特异性的链终止试剂低的浓度)。
多重PCR
制备靶向变体KRAS G12S、KRAS G12C和PIK3CA E542K和白蛋白的多重PCR反应，最终体积为25 uL[基因组DNA和各变体(白蛋白除外)混合，以33ng的背景中1％等位基因频率(突变DNA–东方诊断公司(Horizon Diagnostics)，野生型背景–科瑞尔研究所(CorriellInstitute))]。除了DNA以外，反应条件还利用1x PCR缓冲液(基纳生物科学公司)，各引物100nmol/L、4种三磷酸脱氧核苷酸(基纳生物科学公司)各125μmol/L，1.5U的Taq聚合酶(基纳生物科学公司)和1mmol/L补充MgCl2(基纳生物科学公司)。引物序列列于表2中。反应在ABI 9700 PCR系统(应用生物系统公司(Applied Biosystems))中进行。PCR方案包括：95℃下2分钟的最初变性步骤，然后45个循环的95℃变性30秒、60℃退火30秒和72℃延伸1分钟。
表2.多重PCR引物
| PCR引物 | 序列 |
| KRAS G12S正向(SEQ ID NO:1) | 5’-ACGTTGGATGAAGGCCTGCTGAAAATGACT-3’ |
| KRAS G12S正向(SEQ ID NO:2) | 5’-ACGTTGGATGTTGTTGGATCATATTCGTCCAC-3’ |
| KRAS G12C正向(SEQ ID NO:1) | 5’-ACGTTGGATGAAGGCCTGCTGAAAATGACT-3’ |
| KRAS G12C反向(SEQ ID NO:2) | 5’-ACGTTGGATGTTGTTGGATCATATTCGTCCAC-3’ |
| PIK3CA E542K正向(SEQ ID NO:3) | 5’ACGTTGGATGGCTAGAGACAATGAATTAAGGGAAA-3’ |
| PIK3CA E542K反向(SEQ ID NO:4) | 5’ACGTTGGATGAAGAAAAAGAAACAGAGAATCTCCA-3’ |
| 白蛋白_正向(PCR对照)(SEQ ID NO:5) | 5’-ACGTTGGATGCAAGCCCTGAAGCTCAACTC-3’ |
| 白蛋白_反向(PCR对象)(SEQ ID NO:6) | 5’-ACGTTGGATGGATTTGTGTGGGCATGACAG-3’ |
虾碱性磷酸酶
用虾碱性磷酸酶(SAP)处理扩增的DNA，以将来自PCR反应的未纳入的核苷酸脱磷酸化。反应条件使用1x SAP缓冲液(基纳生物科学公司)、0.5U SAP和5ul多重扩增的产物，总体积为7ul。反应在ABI 9700PCR系统(应用生物系统公司)中进行。SAP方案包括：37℃孵育40分钟，然后85℃蛋白变性步骤5分钟。
延伸反应
在单碱基延伸反应中于特定的残基处探测SAP处理的扩增产物。反应条件使用1xBuffer Plus(基纳生物科学公司)，5.56uM生物-ddUTP(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))，0.625-1.25uM探针(白蛋白探针为62.5nM)，0.14U
Pro酶(基纳生物科学公司)，和7ul SAP处理的扩增的产物，总反应体积为9ul。探针序列列于表3中。反应在ABI9700 PCR系统(应用生物系统公司)中进行。延伸方案包括：94℃最初变性步骤30秒，然后40个循环的94℃变性5秒、52℃退火5秒。在40个循环内是52℃退火和80℃变性之间的另一循环。继续40个主循环之前，各步骤为5秒并循环5次。按该原理，研究了200个循环(参见表4的循环方案)。
表3.延伸探针-/5Biosg/＝5’生物素；/3InvdT/＝3’反向dT
| 探针 | 序列 |
| KRAS_G12C_PlxT(SEQ ID NO:7) | TTGTGGTAGTTGGAGCT |
| KRAS_G12S_PlxT(SEQ ID NO:8) | CACTCTTGCCTACGCCAC |
| PIK3CA_E542K_PlxT(SEQ ID NO:9) | CCTGCTCAGTGATTT |
| 白蛋白(PCR对照)(SEQ ID NO:10) | GTTGCTGTCATCTCTTGTGGGC |
| 捕获对照1(SEQ ID NO:11) | /5Biosg/GTTGACTCGTGGT/3InvdT/ |
| 捕获对照2(SEQ ID NO:12) | /5Biosg/GTTGACTCTGTGGT/3InvdT/ |
| 捕获对照3(SEQ ID NO:13) | /5Biosg/GTTTGGGGCCAGACTCTGCCCGTTTGGT/3InvdT/ |
| 捕获对照4(SEQ ID NO:14) | /5Biosg/GTTTGGGGTCCAGACTCTGCCCGTTTGGT/3InvdT/ |
| 捕获对照5(SEQ ID NO:15) | /5Biosg/GAAGCCAGACTCTTCGTTTGG/3InvdT/ |
表4.单碱基延伸循环方案
Chop Block
在Chop Block反应中清除延伸反应产物的未反应的探针。反应条件使用：1x缓冲液(20mM Hepes、100mM KCl和5mM MgCl2，pH 7.5)，1.5μg Chop Block，和9ul延伸反应产物，总体积为12μl。Chop Block反应在ABI 9700 PCR系统(应用生物系统公司)中孵育。反应在60℃孵育30分钟，然后Chop Block蛋白在85℃热变性10分钟。
样品调节
通过添加13ul的水将Chop Block处理的样品稀释至25ul。稀释的样品与5μl阴离子交换树脂(基纳生物科学公司)浆反应，所述阴离子交换树脂浆引入约3.5mg树脂。反应在旋转血液学混合器上室温孵育30分钟。
样品分配
使用芯片准备模块(CPM–基纳生物科学公司)将树脂处理的分析物分配到排列在硅芯片上的基质元件上。分配体积范围为80-120nl。通过CPM将由三个不同的峰组成的校准分析物分配到硅芯片的单独元件上。
数据采集
将分配的芯片阵列引入基纳
仪器。该仪器是基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪。采集参数包括下述：射(n)–30；最大采集–15；最小良好谱图–15；最大良好谱图–15。通过报告软件，质谱峰被报告为标准化强度。通过标准化，可以比较谱图的峰。为了产生标准化的值，使用峰信噪比、面积或高度。通过将该值(SNR、面积或高度)除以谱图中内部标准物(捕获对照)的线性拟合上的质量处的值来进行标准化。
图8显示了多重超高灵敏度试验的产物的谱图，所述多重超高灵敏度试验使用靶向KRAS G12S、KRAS G12C和PIK3CA E542K和白蛋白的Chop block试剂。标记为“c”的峰是捕获对照峰(用作标准化)。标记为“p”的峰是过程对照峰。标记为“a”的峰是分析物峰(KRASG12S阳性突变)。因为样品中只有一种变体，所以只有一个分析物峰。样品中的其他靶标代表野生型，它们不被延伸也不在谱图中形成峰。
实施例3：使用和不使用Chop Block试剂的超高灵敏度试验
多重PCR(标准UltraSEEKTM和使用Chop Block试剂的UltraSEEKTM)
该实施例使用覆盖具有不同等位基因频率的6种变体的多重突变标准。制备靶向变体ABL1 T315I、AlK F1174L、BRAF V600E、EGFR G719S、EGFR L861Q、EGFR T790M、KRASG12D和白蛋白的多重PCR反应，最终体积为25uL[基因组DNA和各变体(白蛋白除外)混合，以33ng背景中2％等位基因频率(突变DNA–东方诊断公司，野生型背景–科瑞尔研究所)]。除了DNA以外，反应条件还利用1x PCR缓冲液(基纳生物科学公司)，各引物100nmol/L、4种三磷酸脱氧核苷酸(基纳生物科学公司)各125μmol/L，1.5U的Taq聚合酶(基纳生物科学公司)和1mmol/L补充MgCl2(基纳生物科学公司)。引物序列列于表5中。反应在ABI 9700PCR系统(应用生物系统公司)中进行。PCR方案包括：最初变性步骤95℃、2分钟，然后45个循环的95℃下30秒变性、60℃下30秒退火和72℃下1分钟延伸。
表5.多重PCR引物
虾碱性磷酸酶(标准UltraSEEKTM和Chop Block)
用虾碱性磷酸酶(SAP)处理扩增的DNA，以将来自PCR反应的未纳入的核苷酸脱磷酸化。反应条件使用1x SAP缓冲液(基纳生物科学公司)、0.5U SAP和5ul多重扩增的产物，总体积为7ul。反应在ABI 9700PCR系统(应用生物系统公司)中进行。SAP方案包括：37℃孵育40分钟，然后85℃蛋白变性步骤5分钟。
延伸翻译(标准UltraSEEKTM)
在单碱基延伸反应中特定的残基探测SAP处理的扩增产物。反应条件使用1xBuffer Plus(基纳生物科学公司)，5.56uM生物-ddUTP(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))，0.625-1.25uM探针(白蛋白探针为62.5nM)，0.14U
Pro酶(基纳生物科学公司)，和7ul SAP处理的扩增的产物，总反应体积为9ul。探针序列列于表6中。反应在ABI9700 PCR系统(应用生物系统公司)中进行。延伸方案包括：94℃最初变性步骤30秒，然后40个循环的94℃变性5秒、52℃退火5秒。在40个循环内是52℃退火和80℃变性之间的另一循环。继续40个主循环之前，各步骤为5秒并循环5次。按该原理，研究了200个循环(参见表7的循环方案)。
延伸翻译(Chop Block)
在单碱基延伸反应中特定的残基探测SAP处理的扩增产物。反应条件使用1xBuffer Plus(基纳生物科学公司)，222uM无环-溴-U(新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs))，0.625-1.25uM探针(白蛋白探针为62.5nM)，0.14U
Pro酶(基纳生物科学公司)，和7ul SAP处理的扩增的产物，总反应体积为9ul。探针序列列于表6中。反应在ABI 9700PCR系统(应用生物系统公司)中进行。延伸方案包括：94℃最初变性步骤30秒，然后40个循环的94℃变性5秒、52℃退火5秒。在40个循环内是52℃退火和80℃变性之间的另一循环。继续40个主循环之前，各步骤为5秒并循环5次。按该原理，研究了200个循环(参见表7的循环方案)。
表6.延伸探针-/5Biosg/＝5’生物素；/3InvdT/＝3’反向dT
| 探针 | 序列 |
| ABL1 T315I(SEQ ID NO:28) | GCCCCCGTTCTATATCATCA |
| ALK F1174L(SEQ ID NO:29) | CCAATGTTCTGGTGGTT |
| BRAF V600E(SEQ ID NO:30) | CCCACTCCATCGAGATTTC |
| EGFR G719S(SEQ ID NO:31) | CGAACACACCGGAGC |
| EGFR L861Q(SEQ ID NO:32) | TCTTCCGCACCCAGC |
| EGFR T790M(SEQ ID NO:33) | CCGTGCAGCTCATCA |
| KRAS G12D(SEQ ID NO:34) | CACTCTTGCCTACGCCA |
| 白蛋白(PCR对照)(SEQ ID NO:10) | GTTGCTGTCATCTCTTGTGGGC |
| 捕获对照1(SEQ ID NO:11) | /5Biosg/GTTGACTCGTGGT/3InvdT/ |
| 捕获对照2(SEQ ID NO:12) | /5Biosg/GTTGACTCTGTGGT/3InvdT/ |
| 捕获对照3(SEQ ID NO:13) | /5Biosg/GTTTGGGGCCAGACTCTGCCCGTTTGGT/3InvdT/ |
| 捕获对照4(SEQ ID NO:14) | /5Biosg/GTTTGGGGTCCAGACTCTGCCCGTTTGGT/3InvdT/ |
| 捕获对照5(SEQ ID NO:15) | /5Biosg/GAAGCCAGACTCTTCGTTTGG/3InvdT/ |
表7.单碱基延伸循环方案
标准UltraSEEKTM珠清除
用500uL结合和洗涤缓冲液(基纳生物科学公司)对4.25ul/样品的10mg/ml链霉亲和素涂覆的磁珠(基纳生物科学公司)进行两轮调节，然后以1mg/mL的浓度重悬于结合和洗涤缓冲液中。将总体积为41mL的经调节的珠添加到各9ul的延伸反应中，并且在血液学混合器中的恒定旋转下以室温进行30分钟捕获。使用磁铁对具有捕获的产物的珠进行沉淀，并且除去结合和洗涤溶液。将珠粒用100mL高效液相色谱级水洗涤一次，用13ul的洗脱溶液(基纳生物科学公司)重悬，并于95℃孵育5分钟。在ABI PCR系统9700中进行孵育。
Chop Block清除
延伸反应产物在Chop Block反应中清除未反应的探针。反应条件使用1x缓冲液(基纳生物科学公司，PCR缓冲液)，1.5μg Chop Block和9ul延长反应产物，总体积为14μl。Chop Block反应在ABI 9700PCR系统(应用生物系统公司)中孵育。反应在60℃孵育30分钟，然后Chop Block蛋白在85℃热变性10分钟。
样品调节
经标准UltraSEEKTM珠处理并经Chop Block处理的样品与5μl阴离子交换树脂(基纳生物科学公司)浆反应，所述阴离子交换树脂浆引入约3.5mg树脂。反应在旋转血液学混合器上室温孵育30分钟。
样品分配
使用rs1000纳米分配器(Nanodispenser)(基纳生物科学公司)将树脂处理的分析物分配到排列在硅芯片上的基质元件上。分配体积范围为12-20nl。通过纳米分配器将由三个不同的峰组成的校准分析物分配到硅芯片的单独元件上。
数据采集
将分配的芯片阵列引入基纳
仪器。该仪器是基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪。采集参数包括下述：射(n)–30；最大采集–15；最小良好谱图–15；最大良好谱图–15。通过报告软件，质谱峰被报告为标准化强度。通过标准化，可以比较谱图的峰。为了产生标准化的值，使用峰信噪比、面积或高度。通过得出峰比率进行标准化(将突变峰值(SNR、面积或高度)除以野生型峰值(SNR、面积或高度))。
图6A和6B分别显示了标准UltraSEEKTM(珠处理)和使用Chop Block试剂的UltraSEEKTM试验的谱图。标记为“p”的峰表示过程控制峰，标记为“a”的峰表示低丰度物质(阳性突变)的延伸寡核苷酸峰标记为“c”的峰表示捕获对照峰，标记为“p”的峰表示过程对照峰，和标记为“a”的峰表示低丰度物质(阳性突变)的延伸寡核苷酸峰。在图6B(ChopBlock反应)中，标记为a的峰比在图6A中标记为a的对应峰在背景噪声上更显著。消化未延伸的寡核苷酸(其代表试验中大多数的寡核苷酸)能够使低丰度物质在噪声上变得可见。在标准UltraSEEKTM中，通过选择性捕获延伸的寡核苷酸并洗掉其余反应组分(包括未延伸的寡核苷酸)去除反应中未延伸的寡核苷酸。此过程既耗时又需要手动移液步骤，并可能导致手动错误。Chop Block试剂的使用可以增加灵敏度，改进工作流程并且可以减少手动错误的可能。
相较于珠处理的谱图(图6A)，在Chop Block试验谱图(图6B)中观测到较低的信号(强度)。然而，相较于捕获对照的相对强度在Chop Block和标准磁珠试验之间没有变化(相等的标准化强度)。不受理论的束缚，观测到的较低信号可能是Chop Block试验中分配不佳的结果，这是由于在分配到生物阵列之前将酶添加到反应物时与Chop Block酶相关的甘油。在一些实施方式中，该问题通过降低其中存储有酶的甘油的浓度或完全消除甘油来解决。
实施例4：使用Chop Block试剂的超高灵敏度试验的参数
对于靶向一系列低量变体量(2％、1％、0.5％、0.25％和0.125％(NTC)的IDH2R172K(异柠檬酸脱氢酶变体)的UltraSEEKTM试验，将珠方案(标准)与Chop Block反应比较(参见组图)。使用的实验方案述于实施例3。实验结果在图4中以基于SNR的标准化强度(y轴)表示。使用基于珠的化学方法处理的结果示于各组图的左侧。使用外切核酸酶试剂(Chop Block试剂)处理的结果示于各组图的右侧。在两个试验中，链终止核苷酸是生物素化的ddUTP。各点是重复试验(各低量变体量16个重复)。图4显示了在一系列低丰度变体水平上，Chop Block反应的检测灵敏度水平与标准珠处理相似。
通过比较双脱氧核苷酸相对无环核苷酸的使用，对使用Chop Block反应的UltraSEEKTM试验进行评估。实验使用实施例3中所述的方案进行。对于使用经无环核苷酸(各组图左侧)或双脱氧核苷酸(各组图右侧)延伸并使用内切核酸酶试剂(Chop Block试剂)调节的NTC，WT和2％低量变体的EGFR G719S(5A)和EGFR T790M(5B)的超高灵敏度试验产物，试验结果表示为基于SNR的标准化强度(y轴)。图5A和5B显示了双脱氧核苷酸比无环核苷酸产生更多的背景噪声。
实施例5：使用或不使用Chop Block试剂的高灵敏度试验(
HS)
图2是高灵敏度试验的实施方式的示意图，所述高灵敏度试验使用特异性地延伸结合高丰度变体的探针的单链终止试剂(例如，终止TTP)以及特异性地延伸结合低丰度变体的探针的三种链终止试剂(例如，终止GTP、终止TTP终止CTP)(参见上组图，单碱基延伸试验)。为了简化，附图显示了具有两种变体的单一核酸物质。在多重试验中，存在多种物质，其各自具有两种变体。高丰度变体的链终止试剂的浓度低于低丰度变体的链终止试剂的浓度。在下组图(外切核酸酶试验)中，两种变体(高丰度和低丰度)延伸的探针受Chop Block酶保护而免于消化，然而未延伸的探针不受保护。对于该具体实施例，材料和方案基于基纳生物科学公司的
HS试验。本领域普通技术人员将认识到的是，通过小调方案，试验可以针对不同的目标和/或利用不同的试剂。
多重PCR(标准
HS和使用Chop Block试剂的
HS)
制备靶向变体BRAF V600E、EGFR L858R、EGFR L747-T751del、EGFR L746-P750del的多重PCR反应，最终体积为25uL[基因组DNA和各变体(白蛋白除外)混合，以33ng的背景中5％等位基因频率(突变DNA–东方诊断公司(Horizon Diagnostics)，野生型背景–科瑞尔研究所(Corriell Institute))]。除了DNA，反应条件利用1x PCR缓冲液(基纳生物科学公司)，各引物100nmol/L、4种三磷酸脱氧核苷酸(基纳生物科学公司)各125μmol/L，1.5U的Taq聚合酶(基纳生物科学公司)和1mmol/L补充MgCl2(基纳生物科学公司)。引物序列列于表8中。反应在ABI 9700 PCR系统(应用生物系统公司)中进行。PCR方案包括：最初变性步骤95℃、2分钟，然后45个循环的95℃下30秒变性、60℃下30秒退火和72℃下1分钟延伸。
表8.多重PCR引物
| PCR引物 | 序列 |
| BRAF V600E正向(SEQ ID NO:35) | 5’-ACGTTGGATGTTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAA-3’ |
| BRAF V600E反向(SEQ ID NO:36) | 5’-ACGTTGGATGTCAATTCTTACCATCCACAAAATG-3’ |
| EGFR L858R正向(SEQ ID NO:37) | 5’-ACGTTGGATGGCCAGGAACGTACTGGTGAAA-3’ |
| EGFR L858R反向(SEQ ID NO:38) | 5’-ACGTTGGATGCCTCCTTACTTTGCCTCCTTCT-3’ |
| EGFR外显子19正向(SEQ ID NO:39) | 5’-ACGTTGGATGTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGG-3’ |
| EGFR外显子19反向(SEQ ID NO:40) | 5’-ACGTTGGATGGTGGGCCTGAGGTTCAGA-3’ |
虾碱性磷酸酶(标准
HS和使用Chop Block的
)
用虾碱性磷酸酶(SAP)处理扩增的DNA，以将来自PCR反应的未纳入的核苷酸脱磷酸化。反应条件使用1x SAP缓冲液(基纳生物科学公司)、0.5U SAP和5ul多重扩增的产物，总体积为7ul。反应在ABI 9700PCR系统(应用生物系统公司)中进行。SAP方案包括：37℃孵育40分钟，然后85℃蛋白变性步骤5分钟。
延伸反应(标准
HS和使用Chop Block的
HS)
在单碱基延伸反应中特定的残基探测SAP处理的扩增产物。反应条件使用1xBuffer Plus(基纳生物科学公司)，222uM无环-TTP和1uM无环-ATP、无环-GTP和无环-CTP(新英格兰生物实验室公司)，0.625-1.25uM探针(白蛋白探针为62.5nM)，0.14U
Pro酶(基纳生物科学公司)，和7ul SAP处理的扩增的产物，总反应体积为9ul。探针序列列于表9中。反应在ABI 9700PCR系统(应用生物系统公司)中进行。延伸方案包括：94℃最初变性步骤30秒，然后40个循环的94℃变性5秒、52℃退火5秒。在40个循环内是52℃退火和80℃变性之间的另一循环。继续40个主循环之前，各步骤为5秒并循环5次。按该原理，研究了200个循环(参见表10的循环方案)。
表9.延伸探针-/3InvdT/＝3’反向dT
表10.单碱基延伸循环方案
Chop Block清除
延伸反应产物在Chop Block反应中清除未反应的探针。反应条件使用1x缓冲液(基纳生物科学公司，PCR缓冲液)，1.5μg Chop Block和9ul延长反应产物，总体积为14μl。Chop Block反应在ABI 9700PCR系统(应用生物系统公司)中孵育。反应在60℃孵育30分钟，然后Chop Block蛋白在85℃热变性10分钟。
样品调节(标准
HS)
标准
HS延伸产物用41ul水稀释并与5μl阴离子交换树脂(基纳生物科学公司)浆反应，所述阴离子交换树脂浆引入约3.5mg树脂。反应在旋转血液学混合器上室温孵育30分钟。
样品调节(使用Chop Block的
HS)
经使用的Chop Block的
HS处理的样品用36ul水稀释并与5μl阴离子交换树脂(基纳生物科学公司)浆反应，所述阴离子交换树脂浆引入约3.5mg树脂。反应在旋转血液学混合器上室温孵育30分钟。
样品分配(标准
HS和使用Chop Block的
HS)
使用rs1000纳米分配器(Nanodispenser)(基纳生物科学公司)将树脂处理的分析物分配到排列在硅芯片上的基质元件上。分配体积范围为12-20nl。通过纳米分配器将由三个不同的峰组成的校准分析物分配到硅芯片的单独元件上。
数据采集(标准
HS和使用Chop Block的
HS)
将分配的芯片阵列引入基纳
仪器。该仪器是基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪。采集参数包括下述：射(n)–20；最大采集–9；最小良好谱图–9；最大良好谱图–9。通过报告软件，质谱峰被报告为标准化强度。通过标准化，可以比较谱图的峰。为了产生标准化的值，使用峰信噪比、面积或高度。通过得出峰比率进行标准化(将突变峰值(SNR、面积或高度)除以野生型峰值(SNR、面积或高度))。
图7A和7B分别显示了标准
HS试验和使用Chop Block试剂的
HS试验的谱图。两个反应使用根据
HS处理的相同的4重PCR和延伸反应。阳性突变是5％EGFR L858R。标记为“w”的峰表示野生型分析物峰，标记为“a”的峰表示突变分析物峰，标记为“I”的峰表示内标，用标记“u”的向下箭头标记的峰表示未延伸的探针，而标记“u”的向上箭头表示已经通过Chop Block试剂消化的未延伸探针的质量在图7A的谱图中表示未延伸的探针的峰(u标记的向下箭头)被消化(Chop Block反应)并因此不在存在于图7B的谱图中(u标记的向上箭头)。相较于图7A中对应的峰，图7B中标记为a(表示突变)和w(表示野生型)的峰的信号大于噪声，其中未延伸的寡核苷酸u表示图谱中显著的信号。清理可能会使低量变体放大成噪声的未延伸的寡核苷酸(使用Chop Block酶)可能会提高
HS试验的灵敏度。此外，去除未延伸的寡核苷酸产生的信号峰将释放未延伸的寡核苷酸所占据的谱图部分，从而允许在
HS分析中使用更多的质量方案。
实施例6：多重基因分型试验
图1是基因分型试验实施方式的示意图。以相同浓度使用所有4种链终止试剂以延伸与靶核酸物质(两种变体)结合的探针(参见上组图，单碱基延伸反应)为了简化，附图显示了具有两种变体的单一核酸物质。在多重试验中，存在多种物质，其各自具有两种变体。在下组图(外切核酸酶试验)中，核酸物质的两种变体延伸的探针受Chop Block酶保护而免于消化，然而未延伸的探针没有。对于该具体实施例，材料和方案基于基纳生物科学公司的
PRO试验。
多重PCR
制备多重PCR反应，最终体积为25ul。除了DNA，反应条件利用1x PCR缓冲液(基纳生物科学公司)，各引物100nmol/L、4种三磷酸脱氧核苷酸(基纳生物科学公司)各500μmol/L，1.5U的Taq聚合酶(基纳生物科学公司)和1mmol/L补充MgCl2(基纳生物科学公司)。PCR方案包括：最初变性步骤95℃、2分钟，然后45个循环的95℃下30秒变性、60℃下30秒退火和72℃下1分钟延伸。
虾碱性磷酸酶
用虾碱性磷酸酶(SAP)处理扩增的DNA，以将来自PCR反应的未纳入的核苷酸脱磷酸化。反应条件使用1x SAP缓冲液(基纳生物科学公司)、0.5U SAP和5ul多重扩增的产物，总体积为7ul。SAP方案包括：37℃孵育40分钟，然后85℃蛋白变性步骤5分钟。
延伸反应
在单碱基延伸反应中特定的残基探测SAP处理的扩增产物。反应条件使用1xBuffer Plus(基纳生物科学公司)，222uM无环-NTP混合物(基纳生物科学公司)，0.625-1.25uM探针，0.14U
Pro酶(基纳生物科学公司)，和7ul SAP处理的扩增的产物，总反应体积为9ul。延伸方案包括：94℃最初变性步骤30秒，然后40个循环的94℃变性5秒、52℃退火5秒。在40个循环内是52℃退火和80℃变性之间的另一循环。继续40个主循环之前，各步骤为5秒并循环5次。按该原理，研究了200个循环(参见表11的循环方案)。
表11.单碱基延伸循环方案
Chop Block
延伸反应产物在Chop Block反应中清除未反应的探针。反应条件使用：1x缓冲液(20mM Hepes、100mM KCl和5mM MgCl2，pH 7.5)，1.5μg Chop Block，和9ul延伸反应产物，总体积为12μl。Chop Block反应在ABI 9700PCR系统(应用生物系统公司)中孵育。反应在60℃孵育30分钟，然后Chop Block蛋白在85℃热变性10分钟。
样品分配
使用rs1000纳米分配器(基纳生物科学公司)或芯片制备模块(CPM-基纳生物科学公司)将树脂处理的分析物分配到排列在硅芯片上的基质元件上。对于rs1000纳米分配器，分配体积范围为12-20nl，对于CPM，分配体积范围为50-80nl。通过任一分配器将由三个不同的峰组成的校准分析物分配到硅芯片的单独元件上。
数据采集
将分配的芯片阵列引入基纳
仪器。该仪器是基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪。采集参数包括下述：射(n)–20；最大采集–9；最小良好谱图–9；最大良好谱图–9。通过报告软件，质谱峰被报告为标准化强度。通过标准化，可以比较谱图的峰。为了产生标准化的值，使用峰信噪比、面积或高度。通过得出峰比率进行标准化(将突变峰值(SNR、面积或高度)除以野生型峰值(SNR、面积或高度))。
实施例7：Chop Block蛋白的合成
His标签标记的Chop Block蛋白(His-TTHB178，具有SEQ ID NO:49所示序列)如下合成(GenScript公司，新泽西州皮斯卡塔维(Piscataway,NJ)和经验生物科学公司(Empirical Bioscience)，密歇根州大急流城(Grand Rapids,MI)：
(a).公开的氨基酸序列(例如，以GenBank登录号BAD71974.1体积并以SEQ ID NO:47示出)用于基因合成和密码子优化。
(b).基因合成和密码子优化。
(c).亚克隆到合适的表达载体-大肠杆菌，表达载体pET30a。使用表达载体pET30a在大肠杆菌中将该基因表达为N-His标签标记的蛋白质(SEQ ID NO:49)，并优化表达。进行质粒制备和DNA QC，然后将质粒转化为合适的细菌表达菌株(GenScript：大肠杆菌菌株BL21(DE3)用重组质粒转化。将单个菌落接种到包含卡那霉素的LB培养基中。培养物在37℃、200rpm下孵育，然后用IPTG诱导。使用SDS-PAGE监测表达。
(d).蛋白质表达评估和优化(使用优化条件(5L TB发酵(GenScript)；50mL LB发酵(经验(Empirical))扩大蛋白质表达)。GenScript：为了扩大规模，将甘油中存储的BL21(DE3)接种到包含卡那霉素的LB培养基并在37℃下培养。当OD600达到约4时，用IPTG在15℃下诱导细胞培养物16小时。通过离心收集细胞。
(e).纯化以达到所需蛋白质的量和纯度(GenScript：将细胞沉淀物重悬于裂解缓冲液中，然后进行超声处理。保留离心后的上清液用于后续纯化。由细胞裂物的上清液获得蛋白质，通过Ni柱和Superdex 75柱进行两步纯化。将蛋白质透析并用0.22μM过滤器灭菌，然后等分保存；经验(Empirical)：由细胞裂解物的上清液获得蛋白质。然后通过Ni2+亲和层析纯化上清液。然后进行脱盐步骤，以去除咪唑并将蛋白质交换到无甘油的存储缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl)。
(f).去除标签和分离无标签蛋白质(尚未完成，但可以根据需要进行)
(g).如果为不溶性蛋白质，那么重新折叠(尚未完成，但可以根据需要进行)
(h).使用SDS-PAGE和Western印迹(对于标签标记的蛋白质)进行N-His标签标记的蛋白质的纯度和分子量分析和检测。
(i).GenScript：通过在还原条件下对考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶进行光密度分析来估算蛋白质的纯度和分子量。还进行了蛋白质印迹分析。蛋白质的纯度在缓冲液1(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，10％甘油，pH 8.0)为为85％；缓冲液2(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0)中为为85％，而缓冲液3(1X PBS，pH 7.4)中为约90％。
(j).经验(Empirical)：通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析估算缓冲液(50mMTris-HCl，150mM NaCl)中蛋白质的纯度和分子量，并发现为约75％。
(k).使用BSA作为标准，通过GenScript进行Bradford试验用于定量。发现N-His标签标记的TTHB178蛋白质的浓度在缓冲液1中为24.5mg/ml，在缓冲液2中为23.2mg/ml，在缓冲液3中为28.2mg/ml。
(l).经验(Empirical)：使用Nanodrop 2000分光光度计，通过测量280nm处的吸光度来估算蛋白质的浓度。通过外切核酸酶检测探针的水解进行的检测发现蛋白质的活性为1.70+/-0.02pmol探针/分钟。
实施例8：实施方式的非限制性示例
以下列出技术的某些实施方式的非限制性示例。
A1.一种用于检测一种或多种靶核酸存在、不存在或量的方法，其包括：
(a)将所述一种或多种靶核酸各自与寡核苷酸杂交，所述寡核苷酸包含对应靶核酸部分的区域，由此生成杂交的寡核苷酸；
(b)使所述杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，从而生成延伸的寡核苷酸，所述延伸组合物包含一种或多种链终止试剂；
(c)使(b)的产物与具有3'-5'外切核酸酶活性的酶接触，从而使未延伸的寡核苷酸被消化，而包含链终止试剂的延伸的寡核苷酸不被消化；和
(c)分析所述延伸的寡核苷酸，从而检测所述一种或多种靶核酸存在、不存在或量。
A2.如实施方式A1所述的方法，其中，所述链终止试剂在纳入寡核苷酸时阻断所述酶的3'-5'外切核酸酶活性。
A2.1.如实施方式A2所述的方法，其中，所述链终止试剂是链终止核苷酸。
A2.2.如实施方式A2.1所述的方法，其中，所述链终止核苷酸在所述链终止核苷酸的戊糖部分的3'碳处被修饰。
A2.3.如实施方式A2.2所述的方法，其中，所述链终止试剂是双脱氧核苷酸。
A2.4.如实施方式A2.3所述的方法，其中，所述双脱氧核苷酸选自：ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。
A2.5.如实施方式A2.1所述的方法，其中，所述链终止试剂是无环核苷酸。
A2.5.1.如实施方式A2.5所述的方法，其中，所述无环核苷酸选自：acyATP、acyCTP、acyGTP、acyTTP和acy-溴-UTP。
A2.6.如实施方式A1-A2.5.1中任一项所述的方法，其中，多种靶核酸在单一多重化反应中检测。
A3.如实施方式A1-A2.6中任一项所述的方法，其中，所述酶对单链DNA具有特异性。
A4.如实施方式A1-A3中任一项所述的方法，其中，所述酶的3'-5'外切核酸酶活性被双脱氧核苷酸或无环核苷酸抑制。
A4.1.如实施方式A4所述的方法，其中，所述酶来自嗜热栖热菌。
A4.2.如实施方式A4.1所述的方法，其中，所述酶是TTHB178。
A5.如实施方式A1-A4.2中任一项所述的方法，其中，所述延伸的寡核苷酸包括可检测标记物。
A5.1.如实施方式A5所述的方法，其中，所述链终止核苷酸包括可检测标记物。
A5.2.如实施方式A5.1所述的方法，其中，所述可检测标记物是荧光标记物或染料。
A5.3.如实施方式A5.2所述的方法，其中，所述荧光标记物或染料通过电泳或实时PCR检测。
A6.如实施方式A5所述的方法，其中，所述可检测标记物是质量标记物。
A7.如实施方式A6所述的方法，其中，所述质量标记物是质量可区分标签，其位于对应所述靶核酸的部分的所述寡核苷酸的区域的5'处，或所述链终止试剂包含所述质量可区分标签。
A8.如实施方式A6或A7所述的方法，其中，所述质量标记物的检测通过质谱进行。
A9.如实施方式A8所述的方法，其中，所述质谱是基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱。
A10.如实施方式A1-A9中任一项所述的方法，其中，所述酶在甘油浓度为约50％的缓冲液中。
A10.1.如实施方式A1-A9中任一项所述的方法，其中，所述酶在甘油浓度为小于约50％的缓冲液中。
A11如所述方法A1-A9中任一项所述的方法，其中，所述酶在不含甘油的缓冲液中。
A12.如实施方式A1-A9中任一项所述的方法，其中，所述酶在10％甘油Tris缓冲液或不含甘油的Tris缓冲液中。
A13.如实施方式A1-A12中任一项所述的方法，其中，在(a)之前，所述靶核酸被扩增以产生扩增子。
A14.如实施方式A13所述的方法，其中，所述扩增子与去除末端磷酸的试剂接触，所述去除末端磷酸的试剂去除未纳入所述扩增子的任何核苷酸的末端磷酸。
A15.如实施方式A14所述的方法，其中，所述去除末端磷酸的试剂是磷酸酶。
A16.如实施方式A15所述的方法，其中，所述磷酸酶是碱性磷酸酶。
A17.如实施方式A16所述的方法，其中，所述碱性磷酸酶是虾碱性磷酸酶或重组虾碱性磷酸酶。
A18.如实施方式A1-A17中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种链终止试剂由1种链终止试剂组成。
A19.如实施方式A1-A17中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种链终止试剂由2种链终止试剂组成。
A20.如实施方式A1-A17中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种链终止试剂由3种链终止试剂组成。
A21.如实施方式A1-A17中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种链终止试剂由4种链终止试剂组成。
B1.一种检测多种靶核酸物质的变体存在、不存在或量的方法，其包括：
(a)制备衍生自多种靶核酸物质或其部分的多个扩增子，其中各靶核酸物质包括低丰度变体和高丰度变体；
(b)将所述扩增子与多种寡核苷酸物质杂交，从而生成杂交的寡核苷酸，各寡核苷酸物质特异性地对应靶核酸物质的扩增子，其中(i)寡核苷酸物质与衍生自靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体的扩增子在单碱基位置的5'位置处杂交，所述单碱基位置在所述靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体之间不同；
(c)使所述杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，从而生成延伸的寡核苷酸，其中所述延伸组合物包含在延伸条件下对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂，其中与所述低丰度变体杂交的所述杂交的寡核苷酸通过所述链终止试剂延伸，而与高丰度变体杂交的所述杂交的寡核苷酸不被延伸；
(d)使(c)的产物与具有3'-5'外切核酸酶活性的酶接触，从而使未延伸的寡核苷酸被消化，而延伸的寡核苷酸不被消化；和
(e)分析(d)的延伸的寡核苷酸，从而检测多种靶核酸物质的变体存在、不存在或量。
B2.如实施方式B1所述的方法，其中，所述酶来自嗜热栖热菌。
B2.1.如实施方式B2所述的方法，其中，所述酶是TTHB178。
B2.2.如实施方式B1-B2.1中任一项所述的方法，其中，多种靶核酸的变体在单一多重化反应中检测。
B3.如实施方式B1-B2.2中任一项所述的方法，其中，低丰度变体是突变等位基因并且所述高丰度变体是所述等位基因的野生型。
B4.如实施方式B1-B3中任一项所述的方法，其中，低丰度变体是体细胞突变。
B5.如实施方式B1-B4中任一项所述的方法，其中，低丰度变体具有一个或多个插入或缺失并且高丰度变体不具有一个或多个插入和缺失。
B6.如实施方式B1-B5中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸物质的低丰度变体以所述靶核酸物质拷贝数的约0.1％-约5％的拷贝数存在。
B7.如实施方式B1-B6中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸物质的低丰度变体以所述靶核酸物质拷贝数的约1％或更少的拷贝数存在。
B7.1.如实施方式B1-B5中任一项所述的方法，其中各种核酸的低丰度变体和高丰度变体的总拷贝数是至少约1000个拷贝，并且所述低丰度变体占所述总拷贝数的约0.1％。
B7.2.如实施方式B1-B5中任一项所述的方法，其中各种核酸的低丰度变体和高丰度变体的总拷贝数是至少约100个拷贝，并且所述低丰度变体占所述总拷贝数的约0.1％。
B7.3.如实施方式B1-B5中任一项所述的方法，其中，对于核酸物质，所述低丰度变体的拷贝数是所述靶核酸物质总拷贝数的约0.01％-约0.1％。
B8.如实施方式B1-B7.3中任一项所述的方法，其中，所述链终止试剂在纳入寡核苷酸时阻断所述酶的3'-5'外切核酸酶活性。
B8.1.如实施方式B2所述的方法，其中，所述链终止试剂是链终止核苷酸。
B8.2.如实施方式B8.1所述的方法，其中，所述链终止核苷酸在所述链终止核苷酸的戊糖部分的3'碳处被修饰。
B9.如实施方式B8.2所述的方法，其中，所述链终止试剂是双脱氧核苷酸。
B9.1.如实施方式B9所述的方法，其中，所述双脱氧核苷酸选自：ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。
B10.如实施方式B8.1所述的方法，其中，所述链终止核苷酸是无环核苷酸。
B10.1.如实施方式B10所述的方法，其中，所述无环核苷酸选自：acyATP、acyCTP、acyGTP、acyTTP和acy-溴-UTP。
B10.2.如实施方式B1-B10.1中任一项所述的方法，其中，所述酶对单链DNA具有特异性。
B10.3.如实施方式B1-B10.2中任一项所述的方法，其中，所述酶的3'-5'外切核酸酶活性被双脱氧核苷酸或无环核苷酸抑制。
B11.如实施方式B1-B10.3中任一项所述的方法，其中，所述多种靶核酸物质是约2-约100种靶核酸物质且在单一反应中。
B12.如实施方式B1-B11中任一项所述的方法，其中，各延伸的寡核苷酸包括可检测标记物。
B12.1.如实施方式B12所述的方法，其中，所述链终止核苷酸包括可检测标记物。
B12.2.如实施方式B12.1所述的方法，其中，所述可检测标记物是荧光标记物或染料。
B12.3.如实施方式B12.2所述的方法，其中，所述荧光标记物或染料通过电泳或实时PCR检测。
B13.如实施方式B12所述的方法，其中，所述可检测标记物是质量标记物。
B14.如实施方式B13所述的方法，其中，所述质量标记物是质量可区分标签，其位于与扩增子杂交的所述寡核苷酸的区域的5'处，或所述链终止试剂含有所述质量可区分标签。
B15.如实施方式B13或B14所述的方法，其中，检测所述延伸的寡核苷酸的质量通过质谱进行。
B16.如实施方式B15所述的方法，其中，所述质谱是基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱。
B17.如实施方式B1-B16中任一项所述的方法，其中，所述酶在甘油浓度为约50％的缓冲液中。
B18.如实施方式B1-B16中任一项所述的方法，其中，所述酶在甘油浓度小于约50％的缓冲液中。
B19.如所述方法B1-B16中任一项所述的方法，其中，所述酶在不含甘油的缓冲液中。
B20.如实施方式B1-B16中任一项所述的方法，其中，所述酶在10％甘油Tris缓冲液或不含甘油的Tris缓冲液中。
B21.如实施方式B1-B20中任一项所述的方法，其中(a)中产生的所述扩增子与去除末端磷酸的试剂接触，所述去除末端磷酸的试剂去除未纳入所述扩增子的任何核苷酸的末端磷酸。
B22.如实施方式B21所述的方法，其中，所述去除末端磷酸的试剂是磷酸酶。
B23.如实施方式B22所述的方法，其中，所述磷酸酶是碱性磷酸酶。
B24.如实施方式B23所述的方法，其中，所述碱性磷酸酶是虾碱性磷酸酶或重组虾碱性磷酸酶。
B25.如实施方式B1-B24中任一项所述的方法，其中，当未延伸的寡核苷酸被所述酶消化时，检测多种靶核酸物质的变体存在、不存在或量的信噪比大于未延伸的寡核苷酸不被所述酶消化时的信噪比。
C1.一种检测多种靶核酸物质的变体存在、不存在或量的方法，其包括：
(a)制备衍生自多种靶核酸物质或其部分的多个扩增子，其中各靶核酸物质包括低丰度变体和高丰度变体；
(b)将所述扩增子与多种寡核苷酸物质杂交，从而生成杂交的寡核苷酸，各寡核苷酸物质特异性地对应靶核酸物质的扩增子，其中(i)寡核苷酸物质与衍生自靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体的扩增子在单碱基位置的5'位置处杂交，所述单碱基位置在所述靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体之间不同，(ii)所述多种靶核酸物质各高丰度变体在所述单碱基位置处的核苷酸是相同的或不同的，(iii)所述多种靶核酸物质的各低丰度变体在所述单碱基位置处的核苷酸是相同的，和(iv)所述多种靶核酸物质的高丰度变体在所述单碱基位置处的核苷酸与所述多种靶核酸物质的低丰度变体在所述单碱基位置处的核苷酸无一相同。
(c)使所述杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，从而生成包含对所述多个靶核酸物质的低丰度变体具有特异性的链终止试剂的延伸的寡核苷酸和包含对所述多个靶核酸物质高丰度变体具有特异性的链终止试剂的延伸的寡核苷酸，所述延伸组合物包含对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂和对一种或多种所述高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂，其中；(i)对一种或多种高丰度变体具有特异性的所述1、2或3种链终止试剂各自的浓度低于对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度，和(ii)所述延伸条件包括多个热循环；
(d)使(c)的产物与具有3'-5'外切核酸酶活性的酶接触，从而使未延伸的寡核苷酸被消化，而包含链终止试剂的延伸的寡核苷酸不被消化；和
(e)检测所述延伸的寡核苷酸，从而检测多种核酸物质的变体存在、不存在或量。
C2.如实施方式C1所述的方法，其中，所述酶来自嗜热栖热菌。
C2.1.如实施方式C2所述的方法，其中，所述酶是TTHB178。
C2.2.如实施方式C1-C2.1中任一项所述的方法，其中，多种靶核酸物质的变体在单一多重化反应中检测。
C3.如实施方式C1-C2.2中任一项所述的方法，其中，低丰度变体是突变等位基因并且所述高丰度变体是所述等位基因的野生型。
C4.如实施方式C1-C3中任一项所述的方法，其中，低丰度变体是体细胞突变。
C5.如实施方式C1-C4中任一项所述的方法，其中，低丰度变体具有一个或多个插入或缺失并且高丰度变体不具有一个或多个插入和缺失。
C6.如实施方式C1-C5中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸物质的低丰度变体以所述靶核酸物质拷贝数的约0.1％-约5％的拷贝数存在。
C7.如实施方式C1-C5中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸物质的低丰度变体以所述靶核酸物质拷贝数的约1％或更少的拷贝数存在。
C8.如实施方式C1-C5中任一项所述的方法，其中各种核酸的低丰度变体和高丰度变体的总拷贝数是至少约1000个拷贝，并且所述低丰度变体占所述总拷贝数的约0.1％。
C9.如实施方式C1-C5中任一项所述的方法，其中各种核酸的低丰度变体和高丰度变体的总拷贝数是至少约100个拷贝，并且所述低丰度变体占所述总拷贝数的约0.1％。
C10.如实施方式C1-C8中任一项所述的方法，其中，对于核酸物质，所述低丰度变体的拷贝数是所述靶核酸物质总拷贝数的约0.01％-约0.1％。
C11.如实施方式C1-C10中任一项所述的方法，其中，相对于所述低丰度变体的特异性链终止试剂的浓度，对所述高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂各自的浓度是约0.01％-30％。
C12.如实施方式C1-C10中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂各自的浓度是对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂浓度的约0.3％-30％。
C13.如实施方式C1-C10中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂各自的浓度是对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂浓度的约1％-约20％。
C14.如实施方式C1-C10中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂各自的浓度是对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂浓度的约1％-约10％。
C15如实施方式C1-C10中任一项所述的方法，其中，相对于所述低丰度变体的特异性链终止试剂的浓度，对所述高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂各自的浓度是约1％-约2％。
C16.如实施方式C1-C15中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂由1种链终止试剂组成。
C17.如实施方式C1-C15中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂由2种链终止试剂组成。
C18.如实施方式C1-C15中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂由3种链终止试剂组成。
C18.1.如实施方式C1-C18中任一项所述的方法，其中，所述链终止试剂在纳入寡核苷酸时阻断所述酶的3'-5'外切核酸酶活性。
C18.2.如实施方式C18.1所述的方法，其中，所述链终止试剂是链终止核苷酸。
C18.3.如实施方式C18.2所述的方法，其中，所述链终止核苷酸在所述链终止核苷酸的戊糖部分的3'碳处被修饰。
C19.如实施方式C18.3所述的方法，其中，所述链终止试剂是双脱氧核苷酸。
C20.如实施方式C19所述的方法，其中，所述双脱氧核苷酸选自：ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。
C21.如实施方式C18.2所述的方法，其中，所述链终止核苷酸是无环核苷酸。
C21.1.如实施方式C21所述的方法，其中，所述无环核苷酸选自：acyATP、acyCTP、acyGTP、acyTTP和acy-溴-UTP。
C21.2.如实施方式C1-C21.1中任一项所述的方法，其中，所述酶对单链DNA具有特异性。
C21.3.如实施方式C1-C21.2中任一项所述的方法，其中，所述酶的3'-5'外切核酸酶活性被双脱氧核苷酸或无环核苷酸抑制。
C22.如实施方式C1-C21.3中任一项所述的方法，其中，所述多种靶核酸物质是约2-约100种靶核酸物质并在单一反应中。
C23.如实施方式C1-C22中任一项所述的方法，其中，各延伸的寡核苷酸包括可检测标记物。
C23.1.如实施方式C23所述的方法，其中，所述链终止核苷酸包括可检测标记物。
C23.2.如实施方式C23.1所述的方法，其中，所述可检测标记物是荧光标记物或染料。
C23.3.如实施方式C23.2所述的方法，其中，所述荧光标记物或染料通过电泳或实时PCR检测。
C24.如实施方式C23所述的方法，其中，所述可检测标记物是质量标记物。
C25.C24的实施方式，其中，所述质量标记物是质量可区分标签，其位于与扩增子杂交的所述寡核苷酸的区域的5'处，或所述链终止试剂含有所述质量可区分标签。
C26.如实施方式C24或C25所述的方法，其中，检测所述延伸的寡核苷酸的质量通过质谱进行。
C27.如实施方式C26所述的方法，其中，所述质谱是基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱。
C28.如实施方式C1-C27中任一项所述的方法，其中，所述酶在甘油浓度为约50％的缓冲液中。
C29.如实施方式C1-C27中任一项所述的方法，其中，所述酶在甘油浓度小于约50％的缓冲液中。
C30.如所述方法C1-C27中任一项所述的方法，其中，所述酶在不含甘油的缓冲液中。
C31.如实施方式C1-C27中任一项所述的方法，其中，所述酶在10％甘油Tris缓冲液或不含甘油的Tris缓冲液中。
C32.如实施方式C1-C31中任一项所述的方法，其中(a)中产生的所述扩增子与去除末端磷酸的试剂接触，所述去除末端磷酸的试剂去除未纳入所述扩增子的任何核苷酸的末端磷酸。
C33.如实施方式C32所述的方法，其中，所述去除末端磷酸的试剂是磷酸酶。
C34.如实施方式C33所述的方法，其中，所述磷酸酶是碱性磷酸酶。
C35.如实施方式C34所述的方法，其中，所述碱性磷酸酶是虾碱性磷酸酶或重组虾碱性磷酸酶。
C36.如实施方式C1-C35中任一项所述的方法，其中，在没有检测到包含对低丰度变体具有特异性的链终止试剂的延伸的寡核苷酸的情况下，若检测包含对高丰度变体具有特异性的链终止试剂的延伸的寡核苷酸，则提供了阳性对照以评估反应是否失败或者所述样品是否仅包含所述高丰度变体。
C37.如实施方式C1-C36中任一项所述得方法，其中，当未延伸的寡核苷酸被所述酶消化时，检测多种核酸物质的变体存在、不存在或量的信噪比大于未延伸的寡核苷酸不被所述酶消化时的信噪比。
D1.一种检测多种靶核酸物质的变体存在、不存在或量的方法，其包括：
(a)制备衍生自多种靶核酸物质或其部分的多个扩增子，其中各靶核酸物质包括低丰度变体和高丰度变体；
(b)将所述扩增子与多种寡核苷酸物质杂交，从而生成杂交的寡核苷酸，各寡核苷酸物质特异性地对应靶核酸物质的扩增子，其中(i)寡核苷酸物质与衍生自靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体的扩增子在单碱基位置的5'位置处杂交，所述单碱基位置在所述靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体之间不同；
(c)使所述杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，所述延伸组合物包含链终止试剂从而生成分别对应所述低丰度变体和所述高丰度变体的链终止的延伸产物，其中(i)所述高丰度变体共有共同链终止试剂，所述共同链终止试剂对所述高丰度变体具有特异性并对所述低丰度变体不具有特异性，和(ii)所述低丰度变体各自具有链终止试剂，所述链终止试剂对所述低丰度变体具有特异性并对所述高丰度变体不具有特异性，其中对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂：(A)对扩增混合物中的特定低丰度变体是独特的并且不被扩增混合物中其他低丰度变体共有，或者(B)扩增混合物中至少一个低丰度变体与至少一个其他低丰度变体共有共同链终止试剂，由此所述寡核苷酸延伸达到或通过相对于高丰度变体而言在低丰度变体中不同的核苷酸位置，其中对所述高丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度低于对所述低丰度变体具有特异性的一种或多种链终止试剂各自的浓度；
(d)使(c)的产物与具有3'-5'外切核酸酶活性的酶接触，从而使未延伸的寡核苷酸被消化，而包含链终止试剂的延伸的寡核苷酸不被消化；和
(e)分析所述延伸的寡核苷酸，从而检测所述低丰度变体存在、不存在或量。
D2.如实施方式D1所述的方法，其中，多种靶核酸物质的变体在单一多重化反应中检测。
D3.如实施方式D1或D2所述的方法，其中，低丰度变体的序列相对于高丰度变体的序列包含插入或缺失。
D4.如实施方式D1或D2所述的方法，其中，低丰度变体是高丰度变体的单核苷酸多态性(SNP)变体。
D5.如实施方式D1-D4中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体分别是相同基因的突变和野生型等位基因。
D6.如实施方式D1-D3中任一项所述的方法，其中，低丰度变体是体细胞突变。
D7.如实施方式D1-D6中任一项所述的方法，其中，所述酶来自嗜热栖热菌。
D7.1.如实施方式D7所述的方法，其中，所述酶是TTHB178。
D8.如实施方式D1-D7.1中任一项所述的方法，其中，高丰度变体来自宿主对象，而低丰度变体来自除了宿主以外的对象，或者低丰度变体来自宿主对象，而高丰度变体来自除了宿主以外的对象。
D9.如实施方式D1-D8中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸物质的低丰度变体以所述靶核酸物质拷贝数的约1％-约10％的拷贝数存在。
D10.如实施方式D1-D9中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸物质的低丰度变体以所述靶核酸物质拷贝数的约5％或更少的拷贝数存在。
D11.如实施方式D1-D10中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度是对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂各自浓度的约0.01％-约30％。
D12.如实施方式D1-D10中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度是对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂各自浓度的约0.3％-约30％。
D13.如实施方式D1-D10中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度是对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂各自浓度的约1％-约20％。
D14.如实施方式D1-D10中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度是对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂各自浓度的约1％-约10％。
D14.1.如实施方式D1-D10中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度是对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂各自浓度的约1％-约2％。
D15.在实施方式D1-D14中任一项所述的方法，其中，所述高丰度变体的链终止试剂的浓度根据具体的高丰度变体/低丰度变体转变而变化。
D16.如实施方式D1-D15中任一项所述的方法，其中，所述链终止试剂在纳入寡核苷酸时阻断所述酶的3'-5'外切核酸酶活性。
D16.1.如实施方式D16所述的方法，其中，所述链终止试剂是链终止核苷酸。
D16.2.如实施方式D16.1所述的方法，其中，所述链终止核苷酸在所述链终止核苷酸的戊糖部分的3'位置处被修饰。
D16.3.如实施方式D16.2所述的方法，其中，所述链终止试剂是双脱氧核苷酸。
D16.4.如实施方式D16.3所述的方法，其中，所述双脱氧核苷酸选自：ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。
D17.如实施方式D16.1所述的方法，其中，所述链终止核苷酸是无环核苷酸。
D17.1.如实施方式D17所述的方法，其中，所述无环核苷酸选自：acyATP、acyCTP、acyGTP、acyTTP和acy-溴-UTP。
D18.如实施方式D1-D17中任一项所述的方法，其中，所述酶对单链DNA具有特异性。
D18.1.如实施方式D1-D18中任一项所述的方法，其中，所述酶的3'-5'外切核酸酶活性被双脱氧核苷酸或无环核苷酸抑制。
D19.如实施方式D1-D18.1中任一项所述的方法，其中，对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂由1种链终止试剂组成。
D20.如实施方式D1-D18中任一项所述的方法，其中，对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂由2种链终止试剂组成。
D21.如实施方式D1-D18中任一项所述的方法，其中，对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂由3种链终止试剂组成。
D22.如实施方式D1-D21中任一项所述的方法，其中，所述多种靶核酸物质是约2-约100种靶核酸物质并且所述靶核酸物质在单一反应中检测。
D23.如实施方式D1-D22中任一项所述的方法，其中，各延伸的寡核苷酸包括可检测标记物。
D23.1.如实施方式D23所述的方法，其中，所述终止核苷酸包括可检测标记物。
D23.2.如实施方式D23.1所述的方法，其中，所述可检测标记物是荧光标记物或染料。
D23.3.如实施方式D23.2所述的方法，其中，所述荧光标记物或染料通过电泳或实时PCR检测。
D24.如实施方式D23所述的方法，其中，所述可检测标记物是质量标记物。
D25.D23的实施方式，其中，所述质量标记物是质量可区分标签，其位于与扩增子杂交的所述寡核苷酸的区域的5'处，或所述链终止试剂含有所述质量可区分标签。
D26.如实施方式D24或D25所述的方法，其中，检测所述延伸的寡核苷酸的质量通过质谱进行。
D27.如实施方式D26所述的方法，其中，所述质谱是基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱。
D28.如实施方式D1-D27中任一项所述的方法，其中，所述酶在甘油浓度为约50％的缓冲液中。
D29.如实施方式D1-D27中任一项所述的方法，其中，所述酶在甘油浓度为小于约50％的缓冲液中。
D30.如所述方法D1-D27中任一项所述的方法，其中，所述酶在不含甘油的缓冲液中。
D31.如实施方式D1-D27中任一项所述的方法，其中，所述酶在10％甘油Tris缓冲液或不含甘油的Tris缓冲液中。
D32.如实施方式D1-D31中任一项所述的方法，其中(a)中产生的所述扩增子与去除末端磷酸的试剂接触，所述去除末端磷酸的试剂去除未纳入所述扩增子的任何核苷酸的末端磷酸
D33.如实施方式D32所述的方法，其中，所述去除末端磷酸的试剂是磷酸酶。
D34.如实施方式D33所述的方法，其中，所述磷酸酶是碱性磷酸酶。
D35.如实施方式D34所述的方法，其中，所述碱性磷酸酶是虾碱性磷酸酶或重组虾碱性磷酸酶。
D36.如实施方式D1-D35中任一项所述的方法，其中，当未延伸的寡核苷酸被所述酶消化时，检测多种核酸物质的变体存在、不存在或量的信噪比大于未延伸的寡核苷酸不被所述酶消化时的信噪比。
E1.一种检测多种靶核酸物质的变体存在、不存在或量的方法，其包括：
(a)制备衍生自多种靶核酸物质或其部分的多个扩增子，其中各靶核酸物质包括至少两种变体；
(b)将所述扩增子与多种寡核苷酸物质杂交，从而生成杂交的寡核苷酸，各寡核苷酸物质特异性地对应靶核酸物质的扩增子，其中(i)寡核苷酸物质与衍生自靶核酸物质度变体的扩增子在单碱基位置的5'位置处杂交，所述单碱基位置在所述靶核酸物质的变体之间不同；
(c)使所述杂交的寡核苷酸与延伸组合物接触，从而生成对应变体的链终止的延伸产物，所述延伸组合物包含等摩尔浓度的2、3或4种链终止试剂，由此所述寡核苷酸延伸到达或通过在靶核酸物质的变体之间不同的核苷酸位置；
(d)使(c)的产物与具有3'-5'外切核酸酶活性的酶接触，从而使未延伸的寡核苷酸被消化，而延伸的寡核苷酸不被消化；和
(e)分析所述延伸的寡核苷酸，从而检测所述变体存在、不存在或量。
E2.如实施方式E1所述的方法，其中，多种靶核酸物质的变体在单一多重化反应中检测。
E3.如实施方式E1或E2所述的方法，其中，靶核酸物质的变体之一相对于靶核酸物质的其他变体包含插入或缺失。
E4.如实施方式E1或E2所述的方法，其中，靶核酸物质的变体是单核苷酸多态性(SNP)变体。
E5.如实施方式E1-E4中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸物质的变体分别是相同基因的突变和野生型等位基因。
E6.如实施方式E5所述的方法，其中，靶核酸物质的变体之一是体细胞突变。
E7.如实施方式E1-E6中任一项所述的方法，其中，所述酶来自嗜热栖热菌。
E7.1.如实施方式E7所述的方法，其中，所述酶是TTHB178。
E8.如实施方式E1-E7.1中任一项所述的方法，其中，靶核酸物质的变体各自以所述靶核酸物质至少约1％的拷贝数存在。
E9.如实施方式E1-E7.1中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸物质的一种变体来自宿主对象，而所述靶核酸物质的另一变体来自除了宿主以外的对象。
E9.1.如实施方式E1-E9中任一项所述的方法，其中，所述链终止试剂在纳入寡核苷酸时阻断所述酶的3'-5'外切核酸酶活性。
E10.如实施方式E9.1所述的方法，其中，所述链终止试剂是链终止核苷酸。
E10.1.如实施方式E10所述的方法，其中，所述链终止核苷酸在所述链终止核苷酸的戊糖部分的3'位置处被修饰。
E10.如实施方式E10.1所述的方法，其中，所述链终止试剂是双脱氧核苷酸。
E11.如实施方式E10所述的方法，其中，双脱氧核苷酸选自：ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。
E12.如实施方式E10所述的方法，其中，所述链终止核苷酸是无环核苷酸。
E12.1.如实施方式E12所述的方法，其中，所述无环核苷酸选自：acyATP、acyCTP、acyGTP、acyTTP和acy-溴-UTP。
E12.2.如实施方式E1-E12.1中任一项所述的方法，其中，所述酶对单链DNA具有特异性。
E12.3.如实施方式E1-E12.2中任一项所述的方法，其中，所述链终止试剂由2种链终止试剂组成。
E12.4.如实施方式E1-E12.2中任一项所述的方法，其中，所述链终止试剂由3种链终止试剂组成。
E12.5.如实施方式E1-E12.2中任一项所述的方法，其中，所述链终止试剂由4种链终止试剂组成。
E12.6.如实施方式E1-E12.5中任一项所述的方法，其中，所述酶的3'-5'外切核酸酶活性被双脱氧核苷酸或无环核苷酸抑制。
E13.如实施方式E1-E12.6中任一项所述的方法，其中，所述多种靶核酸物质是约2-约100种靶核酸物质并且所述靶核酸物质在单一反应中检测。
E14.如实施方式E1-E13中任一项所述的方法，其中，各延伸的寡核苷酸包括可检测标记物。
E14.1.如实施方式E14所述的方法，其中，所述终止核苷酸包括可检测标记物。
E14.2.如实施方式E14.1所述的方法，其中，所述可检测标记物是荧光标记物或染料。
E14.3.如实施方式E14.2所述的方法，其中，所述荧光标记物或染料通过电泳或实时PCR检测。
E15.如实施方式E14所述的方法，其中，所述可检测标记物是质量标记物。
E16.E15的实施方式，其中，所述质量标记物是质量可区分标签，其位于与扩增子杂交的所述寡核苷酸的区域的5'处，或所述链终止试剂含有所述质量可区分标签。
E17.如实施方式E15或E16所述的方法，其中，检测所述延伸的寡核苷酸的质量通过质谱进行。
E18.如实施方式E17所述的方法，其中，所述质谱是基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱。
E19.如实施方式E1-E18中任一项所述的方法，其中，所述酶在甘油浓度为约50％的缓冲液中。
E20.如实施方式E1-E18中任一项所述的方法，其中，所述酶在甘油浓度为小于约50％的缓冲液中。
E21.如所述方法E1-E18中任一项所述的方法，其中，所述酶在不含甘油的缓冲液中。
E22.如实施方式E1-E18中任一项所述的方法，其中，所述酶在10％甘油Tris缓冲液或不含甘油的Tris缓冲液中。
E23.如实施方式E1-E22中任一项所述的方法，其中(a)中产生的所述扩增子与去除末端磷酸的试剂接触，所述试剂去除所有未掺入扩增子的核苷酸的末端磷酸。
E24.如实施方式E23所述的方法，其中，所述去除末端磷酸的试剂是磷酸酶。
E25.如实施方式E24所述的方法，其中，所述磷酸酶是碱性磷酸酶。
E26.如实施方式E26所述的方法，其中，所述碱性磷酸酶是虾碱性磷酸酶或重组虾碱性磷酸酶。
E27.如实施方式E1-E26中任一项所述的方法，其中，当未延伸的寡核苷酸被所述酶消化时，检测多种核酸物质的变体存在、不存在或量的信噪比大于未延伸的寡核苷酸不被所述酶消化时的信噪比。
F1.一种用于引物延伸的方法，其包括：
(a)将靶核酸与寡核苷酸杂交，所述寡核苷酸包含对应所述靶核酸的部分的区域，由此生成杂交的寡核苷酸；
(b)使所述杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，从而生成延伸的寡核苷酸，所述延伸组合物包含一种或多种链终止试剂；和
(c)使(b)的产物与具有3'-5'外切核酸酶活性的酶接触，从而使未延伸的寡核苷酸被消化，而包含链终止试剂的延伸的寡核苷酸不被消化。
F2.如实施方式F1所述的方法，其中，链终止试剂在纳入寡核苷酸时阻断所述酶的3'-5'外切核酸酶活性。
F2.1.如实施方式F2所述的方法，其中，所述链终止试剂是链终止核苷酸。
F2.2.如实施方式F2.1所述的方法，其中，所述链终止核苷酸在所述链终止核苷酸的戊糖部分的3'位置处被修饰。
F2.3.如实施方式F2.2所述的方法，其中，所述链终止试剂是双脱氧核苷酸。
F2.4.如实施方式F2.3所述的方法，其中，所述双脱氧核苷酸选自：ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。
F2.5.如实施方式F2.1所述的方法，其中，所述链终止试剂是无环核苷酸。
F2.5.1.如实施方式F2.5所述的方法，其中，所述无环核苷酸选自：acyATP、acyCTP、acyGTP、acyTTP和acy-溴-UTP。
F3.如实施方式F1-F2.5.1中任一项所述的方法，其中，所述酶对单链DNA具有特异性。
F4.如实施方式F1-F3中任一项所述的方法，其中，所述酶的3'-5'外切核酸酶活性被双脱氧核苷酸或无环核苷酸抑制。
F5.如实施方式F4所述的方法，其中，所述酶来自嗜热栖热菌。
F5.1.如实施方式F5所述的方法，其中，所述酶是TTHB178。
F6.如实施方式F1-A5.1中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种链终止试剂由1种链终止试剂组成。
F7.如实施方式F1-F5.1中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种链终止试剂由2种链终止试剂组成。
F8.如实施方式F1-F5.1中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种链终止试剂由3种链终止试剂组成。
F9.如实施方式F1-F5.1中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种链终止试剂由4种链终止试剂组成。
G1.一种试剂盒，其包括：
具有3'-5'外切核酸酶活性的酶；和
一种或多种链终止试剂，所述链终止试剂在其处于寡核苷酸的3'末端时抑制所述酶在所述寡核苷酸上的活性。
G2.如实施方式G1所述的试剂盒，其中，所述酶来自嗜热栖热菌。
G2.1.如实施方式G2所述的试剂盒，其中，所述酶是TTHB178。
G3.如实施方式G1-G2.1中任一项所述的试剂盒，其中，提供含于甘油浓度为50％或更少的缓冲液中的所述酶。
G4.如实施方式G1-G2.1中任一项所述的试剂盒，其中，所述酶在不含甘油的缓冲液中。
G5.如实施方式G1-G2.1中任一项所述的试剂盒，其中，所述酶在10％甘油Tris缓冲液或不含甘油的Tris缓冲液中。
G6.如实施方式G1-G5中任一项所述的试剂盒，其中，链终止试剂是链终止核苷酸。
G7.如实施方式G6所述的试剂盒，其中，所述链终止核苷酸在所述链终止核苷酸的戊糖部分的3'位置处被修饰。
G8.如实施方式G7所述的试剂盒，其中，所述链终止试剂是双脱氧核苷酸。
G9.如实施方式G8所述的试剂盒，其中，所述双脱氧核苷酸选自：ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。
G10.如实施方式G6所述的试剂盒，其中，所述链终止试剂是无环核苷酸。
G10.1.如实施方式G10所述的试剂盒，其中，所述无环核苷酸选自：acyATP、acyCTP、acyGTP、acyTTP和acy-溴-UTP。
G10.2.如实施方式G1-G10.1中任一项所述的试剂盒，其中，所述链终止试剂包括质量可区分标签。
G11.如实施方式G1-G10.2中任一项所述的试剂盒，其中，所述酶对单链DNA具有特异性。
G12.如实施方式G1-G11中任一项所述的试剂盒，其还包括下述一种或多种：寡核苷酸、聚合酶、碱性磷酸酶、一种或多种缓冲液和一种或多种反应对照。
G13.如实施方式G1-G12中任一项所述的试剂盒，其中，所述一种或多种链终止试剂由1种链终止试剂组成。
G14.如实施方式G1-G12中任一项所述的试剂盒，其中，所述一种或多种链终止试剂由2种链终止试剂组成。
G15如实施方式G1-G12中任一项所述的试剂盒，其中，所述一种或多种链终止试剂由3种链终止试剂组成。
G16.如实施方式G1-G12中任一项所述的试剂盒，其中，所述一种或多种链终止试剂由4种链终止试剂组成。
G17.如实施方式G1-G12中任一项所述的试剂盒，其中，1、2或3种链终止试剂对多种高丰度变体的检测具有特异性，且1种链终止试剂对多种低丰度变体的检测具有特异性，并且对高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂各自的浓度是对低丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度的约0.3％-约30％。
G17.1.如权利要求246所述的试剂盒，其中，对多种低丰度变体的检测具有特异性的链终止试剂和对多种高丰度变体的检测具有特异性的1、2或3种链终止试剂处于单一容器中。
G17.2.如实施方式G17.1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括2个或更多个容器，其各自装有对多种低丰度变体的检测具有特异性的不同的链终止试剂和对多种高丰度变体的检测具有特异性的1、2或3种链终止试剂。
G18.如实施方式G1-G12中任一项所述的试剂盒，其中，1、2或3种链终止试剂对多种低丰度变体的检测具有特异性，且1种链终止试剂对多种高丰度变体的检测具有特异性，并且对高丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度是对低丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂各自的浓度的约0.3％-约30％。
G18.1.如实施方式G18所述的试剂盒，其中，对多种高丰度变体的检测具有特异性的链终止试剂和对多种低丰度变体的检测具有特异性的1、2或3种链终止试剂处于单一容器中。
G18.2.如实施方式G18.1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括2个或更多个容器，其各自装有对多种高丰度变体的检测具有特异性的不同的链终止试剂和对多种低丰度变体的检测具有特异性的1、2或3种链终止试剂。
G19.如实施方式G1-G12中任一项所述的试剂盒，其包括等同浓度的2、3或4种链终止试剂。
***
本文中引用的各专利、专利申请、出版物和文献的全部内容均通过引用纳入本文。对上述专利、专利申请、出版物和文献的引用并不表示承认上述任何内容是相关的现有技术，也并不表示承认这些出版物或文献的内容或日期。他们的引用不表示对于相关公开的搜索。关于文档日期或内容的所有声明都是基于可用的信息并非对其准确性或正确性的承认。
可对上述内容进行改变而不背离本技术的基本方面。尽管参考一个或多个具体实施方式充分详细描述了本技术，但是本领域普通技术人员应认识到可对本申请中具体公开的实施方式进行改良，只要这些改良和改进在本技术的范围和精神内。
本文中适当描述的技术可在没有任何本文未具体公开的元素的情况下实施。因此，例如，在本文的各个例子中，术语“包含”、“基本由……组成”和“由……组成”中的任何一个都可用其它两个中的任一个代替。已经使用的术语和表达用作说明而非限制性的术语，此类术语和表达的使用并不排除对所显示和所描述的特征或其部分的任何等价物，以及在要求权利的本技术范围内可进行各种改良。术语“一个”或“一种”表示一种或多种其修饰的元素(例如“一种试剂”可表示一种或多种试剂)，除非上下文清楚表示所描述的是元素之一或是一种以上的元素。本文所使用的术语“约”表示在基础参数的10％范围内的数值(即±10％)，在一列数值的开头处使用的术语“约”表示修饰该列数值中的每个数值(即“约1、2和3”指约1、约2和约3)。例如，“约100克”的重量能包含90克-110克的重量。此外，当本文描述数值列表(例如，约50％、60％、70％、80％、85％或86％)时，该列表包含其所有中间值和分数值(例如，54％、85.4％)。因此，应理解，尽管通过代表性实施方式和任选的特征具体公开了本技术，但是本领域技术人员能对本文所公开内容进行改良和变化，应认为此类改良和变化落在本技术的范围内。
本技术的某些实施方式在所附的权利要求中示出。
序列表
<110> 基纳生物技术有限公司（AGENA BIOSCIENCE, INC.）
<120> 用于核酸检测和定量的产品和方法
<130> AGB-7004-PCT
<140>
<141>
<150> 62/679,450
<151> 2018-06-01
<160> 49
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
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<223> /注="人工序列的描述：合成的引物"
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<212> DNA
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<220>
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<223> /注="人工序列的描述：合成的引物"
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acgttggatg aagaaaaaga aacagagaat ctcca 35
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cactcttgcc tacgccac 18
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gtttggggcc agactctgcc cgtttggtt 29
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gaagccagac tcttcgtttg gt 22
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acgttggatg agtcctcgtt gtcttgttgg 30
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acgttggatg ttggttacat ccctctctgc 30
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acgttggatg tcttcatgaa gacctcacag 30
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acgttggatg ccacaaaatg gatccagaca 30
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acgttggatg tggagcctct tacacccagt 30
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acgttggatg gtgccaggga ccttacctta 30
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acgttggatg agccaggaac gtactggtga 30
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acgttggatg cctggtgtca ggaaaatgct 30
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acgttggatg ctccaggaag cctacgtgat 30
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acgttggatg gtctttgtgt tcccggacat 30
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gcccccgttc tatatcatca 20
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<213> 人工序列
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ccaatgttct ggtggtt 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cccactccat cgagatttc 19
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<213> 人工序列
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cgaacacacc ggagc 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> /注="人工序列的描述：合成的探针"
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tcttccgcac ccagc 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> /注="人工序列的描述：合成的探针"
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ccgtgcagct catca 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> /注="人工序列的描述：合成的探针"
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cactcttgcc tacgcca 17
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的描述：合成的引物"
<400> 35
acgttggatg tttcttcatg aagacctcac agtaa 35
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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acgttggatg tcaattctta ccatccacaa aatg 34
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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acgttggatg gccaggaacg tactggtgaa a 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的描述：合成的引物"
<400> 38
acgttggatg cctccttact ttgcctcctt ct 32
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的描述：合成的引物"
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acgttggatg tctctctgtc atagggactc tgg 33
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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acgttggatg gtgggcctga ggttcaga 28
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<213> 人工序列
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tgattttggt ctagctacag 20
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<213> 人工序列
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<223> /注="人工序列的描述：合成的探针"
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tgtcaagatc acagattttg ggc 23
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的描述：合成的探针"
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tttccttgtt ggctttcgga gatgt 25
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的描述：合成的探针"
<400> 44
cgtcgctatc aaggaat 17
<210> 45
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的描述：合成的探针"
<400> 45
gtgactcgtg gtt 13
<210> 46
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的描述：合成的探针"
<400> 46
gttggggtcc agactctgcc cgtttggtt 29
<210> 47
<211> 296
<212> PRT
<213> 嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）HB8
<400> 47
Met Ala Phe Gly Val Ser His Pro Val Ala Leu Asp Leu Glu Ala Thr
1 5 10 15
Ser Thr Asp Pro Ser Glu Ala Glu Val Leu Glu Val Ala Ala Val Asp
20 25 30
Gly Glu Gly Arg Val Phe His Arg Tyr Leu Ala Thr Gln Arg Pro Leu
35 40 45
Pro Pro Asp His Glu Val Phe Gln Leu Thr Gly Ile Pro Tyr Glu Glu
50 55 60
Tyr Glu Ala Lys Lys Val Ala Pro Lys Glu Ala Leu Glu Glu Leu Leu
65 70 75 80
Ala Phe Leu Gly Gly Arg Pro Leu Leu Gly His Asn Leu Leu Arg Tyr
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Leu Gln Arg His Leu Glu Glu Ala Gly Leu Pro Arg
100 105 110
Trp Gln Gly Glu Ala Leu Asp Thr Leu Arg Leu Ala His Leu Leu Phe
115 120 125
Pro Thr Pro Pro Gly Gly Leu Glu Gly Tyr Arg Leu Gly Asp Leu Tyr
130 135 140
Ala Phe Leu Leu Gly Arg Pro Leu Glu Gly Ala His Arg Ala Leu Asn
145 150 155 160
Asp Ala Gln Ala Thr Leu Ala Val Phe His Arg Leu Leu Asp Arg Gly
165 170 175
Arg Arg Ala Leu Ala Gln His Pro Gly Leu Val Arg Ala Trp Arg Glu
180 185 190
Leu Gly Leu Pro Glu Gly His Leu Phe Pro Glu Asp Glu Gly Leu Ile
195 200 205
Lys Asp Leu Leu Ala Arg Glu Ala Asp Val Glu Ala Phe Phe Val Glu
210 215 220
Lys Glu Gly Arg Pro Phe Pro Ala Pro Thr Asp Leu Gly Pro Asp Leu
225 230 235 240
Leu Pro Lys Pro Arg Pro Ala Gln Arg Ile Lys Glu Phe Val Gln Val
245 250 255
Ala His Gly Val Ala Gly Gln Gly Leu Val Gly Arg Glu Arg Pro Leu
260 265 270
His Glu Val Leu Glu Arg Gly Leu Arg Leu Ala Val Gly Glu Ala Glu
275 280 285
Glu Gly Ala Val Glu Lys Glu Gly
290 295
<210> 48
<211> 888
<212> DNA
<213> 嗜热栖热菌HB8
<400> 48
atggcgtttg gcgtctccca cccggtcgca ctggatctgg aagcgaccag caccgatccg 60
tctgaagctg aagtcctgga agtggcggcc gttgacggcg aaggtcgtgt ttttcatcgc 120
tatctggcaa cccagcgtcc gctgccgccg gatcacgaag tgttccaact gacgggcatt 180
ccgtatgaag aatacgaagc gaaaaaagtt gctccgaaag aagcgctgga agaactgctg 240
gcgtttctgg gcggtcgtcc gctgctgggt cataacctgc tgcgttacga tctgccgctg 300
ctgcagcgtc acctggaaga agccggtctg ccgcgttggc aaggtgaagc tctggacacc 360
ctgcgcctgg cacatctgct gtttccgacg ccgccgggcg gtctggaagg ttatcgtctg 420
ggtgatctgt acgcgttcct gctgggtcgt ccgctggaag gtgcacaccg tgctctgaat 480
gatgcacagg ctaccctggc cgtctttcat cgtctgctgg accgtggtcg tcgcgcactg 540
gcacaacacc cgggtctggt gcgtgcatgg cgtgaactgg gcctgccgga aggtcacctg 600
tttccggaag atgaaggcct gattaaagac ctgctggcgc gtgaagccga tgtcgaagcc 660
tttttcgtgg aaaaagaagg ccgtccgttt ccggcaccga cggatctggg tccggacctg 720
ctgccgaaac cgcgtccggc acagcgcatc aaagaattcg tgcaagttgc ccatggcgtt 780
gccggtcagg gtctggtcgg tcgtgaacgt ccgctgcacg aagtgctgga acgtggtctg 840
cgtctggcgg tgggtgaagc ggaagaaggt gctgtggaaa aagaaggt 888
<210> 49
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 49
Met His His His His His His Met Ala Phe Gly Val Ser His Pro Val
1 5 10 15
Ala Leu Asp Leu Glu Ala Thr Ser Thr Asp Pro Ser Glu Ala Glu Val
20 25 30
Leu Glu Val Ala Ala Val Asp Gly Glu Gly Arg Val Phe His Arg Tyr
35 40 45
Leu Ala Thr Gln Arg Pro Leu Pro Pro Asp His Glu Val Phe Gln Leu
50 55 60
Thr Gly Ile Pro Tyr Glu Glu Tyr Glu Ala Lys Lys Val Ala Pro Lys
65 70 75 80
Glu Ala Leu Glu Glu Leu Leu Ala Phe Leu Gly Gly Arg Pro Leu Leu
85 90 95
Gly His Asn Leu Leu Arg Tyr Asp Leu Pro Leu Leu Gln Arg His Leu
100 105 110
Glu Glu Ala Gly Leu Pro Arg Trp Gln Gly Glu Ala Leu Asp Thr Leu
115 120 125
Arg Leu Ala His Leu Leu Phe Pro Thr Pro Pro Gly Gly Leu Glu Gly
130 135 140
Tyr Arg Leu Gly Asp Leu Tyr Ala Phe Leu Leu Gly Arg Pro Leu Glu
145 150 155 160
Gly Ala His Arg Ala Leu Asn Asp Ala Gln Ala Thr Leu Ala Val Phe
165 170 175
His Arg Leu Leu Asp Arg Gly Arg Arg Ala Leu Ala Gln His Pro Gly
180 185 190
Leu Val Arg Ala Trp Arg Glu Leu Gly Leu Pro Glu Gly His Leu Phe
195 200 205
Pro Glu Asp Glu Gly Leu Ile Lys Asp Leu Leu Ala Arg Glu Ala Asp
210 215 220
Val Glu Ala Phe Phe Val Glu Lys Glu Gly Arg Pro Phe Pro Ala Pro
225 230 235 240
Thr Asp Leu Gly Pro Asp Leu Leu Pro Lys Pro Arg Pro Ala Gln Arg
245 250 255
Ile Lys Glu Phe Val Gln Val Ala His Gly Val Ala Gly Gln Gly Leu
260 265 270
Val Gly Arg Glu Arg Pro Leu His Glu Val Leu Glu Arg Gly Leu Arg
275 280 285
Leu Ala Val Gly Glu Ala Glu Glu Gly Ala Val Glu Lys Glu Gly
290 295 300
Claims (252)
1.一种用于检测一种或多种靶核酸存在、不存在或量的方法，其包括：
(a)将所述一种或多种靶核酸各自与寡核苷酸杂交，所述寡核苷酸包含对应靶核酸的部分的区域，由此生成杂交的寡核苷酸；
(b)使所述杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，从而生成延伸的寡核苷酸，所述延伸组合物包含一种或多种链终止试剂；
(c)使(b)的产物与具有3'-5'外切核酸酶活性的酶接触，从而使未延伸的寡核苷酸被消化，而包含链终止试剂的延伸的寡核苷酸不被消化；和
(d)分析所述延伸的寡核苷酸，从而检测所述一种或多种靶核酸存在、不存在或量。
2.如权利要求1所述的方法，其中，至少一种链终止试剂在纳入(b)中寡核苷酸时阻断所述酶的3'-5'外切核酸酶活性。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，至少一种链终止试剂是链终止核苷酸。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述链终止核苷酸在所述链终止核苷酸的戊糖部分的3'碳处被修饰。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，至少一种链终止试剂是双脱氧核苷。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述双脱氧核苷酸选自：ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。
7.如权利要求3所述的方法，其中，所述链终止试剂是无环核苷酸。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述无环核苷酸选自：acyATP、acyCTP、acyGTP、acyTTP和acy-溴-UTP。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，多种靶核酸在单一多重化反应中检测。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述酶对单链DNA具有特异性。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述酶的3'-5'外切核酸酶活性被双脱氧核苷酸或无环核苷酸抑制。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述酶来自嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述酶是TTHB178。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述延伸的寡核苷酸包含可检测标记物。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，至少一种链终止试剂是链终止核苷酸，并且所述终止核苷酸包含可检测标记物。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中，所述可检测标记物是荧光标记物或染料。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述荧光标记物或染料通过电泳或实时PCR检测。
18.如权利要求14-17中任一项所述的方法，其中，所述可检测标记物是质量标记物。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述质量标记物是质量可区分标签，其位于对应所述靶核酸的部分的所述寡核苷酸的区域的5'处，或所述链终止试剂包含所述质量可区分标签。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中，所述质量标记物的检测通过质谱进行。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述质谱是基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，所述酶在甘油浓度为约50％的缓冲液中。
23.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，所述酶在甘油浓度小于约50％的缓冲液中。
24.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，所述酶在不含甘油的缓冲液中。
25.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，所述酶在10％甘油Tris缓冲液或不含甘油的Tris缓冲液中。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中，在(a)之前，所述靶核酸被扩增以产生扩增子。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述扩增子与去除末端磷酸的试剂接触，所述去除末端磷酸的试剂去除未纳入所述扩增子的任何核苷酸的末端磷酸。
28.如权利要求27所述的方法，其中，所述去除末端磷酸的试剂是磷酸酶。
29.如权利要求28所述的方法，其中，所述磷酸酶是碱性磷酸酶。
30.如权利要求29所述的方法，其中，所述碱性磷酸酶是虾碱性磷酸酶或重组虾碱性磷酸酶。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种链终止试剂由1种链终止试剂组成。
32.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种链终止试剂由2种链终止试剂组成。
33.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种链终止试剂由3种链终止试剂组成。
34.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种链终止试剂由4种链终止试剂组成。
35.一种检测多种靶核酸物质的变体存在、不存在或量的方法，其包括：
(a)制备衍生自多种靶核酸物质或其部分的多个扩增子，其中各靶核酸物质包括低丰度变体和高丰度变体；
(b)将所述扩增子与多种寡核苷酸物质杂交，从而生成杂交的寡核苷酸，其中各寡核苷酸物质特异性地对应靶核酸物质的扩增子，其中所述寡核苷酸物质与衍生自所述靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体的扩增子在单碱基位置的5'位置处杂交，所述单碱基位置在所述靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体之间不同；
(c)使所述杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，从而生成延伸的寡核苷酸，其中所述延伸组合物包含在延伸条件下对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂，其中与所述低丰度变体杂交的所述杂交的寡核苷酸通过所述链终止试剂延伸，而与高丰度变体杂交的所述杂交的寡核苷酸不被延伸；
(d)使(c)的产物与具有3'-5'外切核酸酶活性的酶接触，从而使未延伸的寡核苷酸被消化，而延伸的寡核苷酸不被消化；和
(e)分析(d)的延伸的寡核苷酸，从而检测多种靶核酸物质的变体存在、不存在或量。
36.如权利要求35所述的方法，其中，所述酶来自嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)。
37.如权利要求36所述的方法，其中，所述酶是TTHB178。
38.如权利要求35-37中任一项所述的方法，其中，多种靶核酸的变体在单一多重化反应中检测。
39.如权利要求35-38中任一项所述的方法，其中，所述低丰度变体是突变等位基因并且所述高丰度变体是所述等位基因的野生型。
40.如权利要求35-39中任一项所述的方法，其中，所述低丰度变体是体细胞突变。
41.如权利要求35-40中任一项所述的方法，其中，所述低丰度变体具有一个或多个插入或缺失并且所述高丰度变体不具有一个或多个插入和缺失。
42.如权利要求35-41中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸物质的低丰度变体以所述靶核酸物质拷贝数的约0.1％-约5％的拷贝数存在。
43.如权利要求35-42中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸物质的低丰度变体以所述靶核酸物质拷贝数的约1％或更少的拷贝数存在。
44.如权利要求35-43中任一项所述的方法，其中，靶核酸的低丰度变体和高丰度变体的总拷贝数是至少约1000个拷贝，并且所述低丰度变体占所述总拷贝数的约0.1％。
45.如权利要求35-43中任一项所述的方法，其中，靶核酸的低丰度变体和高丰度变体的总拷贝数是至少约100个拷贝，并且所述低丰度变体占所述总拷贝数的约0.1％。
46.如权利要求35-43中任一项所述的方法，其中，所述低丰度变体的拷贝数是靶核酸物质的总拷贝数的约0.01％-约0.1％。
47.如权利要求35-46中任一项所述的方法，其中，所述链终止试剂在纳入寡核苷酸时阻断所述酶的3'-5'外切核酸酶活性。
48.如权利要求47所述的方法，其中，所述链终止试剂是链终止核苷酸。
49.如权利要求48所述的方法，其中，所述链终止核苷酸在所述链终止核苷酸的戊糖部分的3'碳处被修饰。
50.如权利要求49所述的方法，其中，所述链终止试剂是双脱氧核苷酸。
51.如权利要求50所述的方法，其中，所述双脱氧核苷酸选自：ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。
52.如权利要求49所述的方法，其中，所述链终止核苷酸是无环核苷酸。
53.如权利要求52所述的方法，其中，所述无环核苷酸选自：acyATP、acyCTP、acyGTP、acyTTP和acy-溴-UTP。
54.如权利要求35-53中任一项所述的方法，其中，所述酶对单链DNA具有特异性。
55.如权利要求35-54中任一项所述的方法，其中，所述酶的3'-5'外切核酸酶活性被双脱氧核苷酸或无环核苷酸抑制。
56.如权利要求35-55中任一项所述的方法，其中，所述多种靶核酸物质是单一反应中的约2-约100种靶核酸物质。
57.如权利要求35-56中任一项所述的方法，其中，各延伸的寡核苷酸包含可检测标记物。
58.如权利要求35-57中任一项所述的方法，其中，所述链终止试剂是链终止核苷酸，并且所述链终止核苷酸包含可检测标记物。
59.如权利要求57或58所述的方法，其中，所述可检测标记物是荧光标记物或染料。
60.如权利要求59所述的方法，其中，所述荧光标记物或染料通过电泳或实时PCR检测。
61.如权利要求57或58所述的方法，其中，所述可检测标记物是质量标记物。
62.如权利要求61所述的方法，其中，所述质量标记物是质量可区分标签，其位于与扩增子杂交的所述寡核苷酸的区域的5'处，或所述链终止试剂含有所述质量可区分标签。
63.如权利要求61或62所述的方法，其中，检测所述延伸的寡核苷酸的质量通过质谱进行。
64.如权利要求63所述的方法，其中，所述质谱是基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱。
65.如权利要求35-64中任一项所述的方法，其中，所述酶在甘油浓度为约50％的缓冲液中。
66.如权利要求35-64中任一项所述的方法，其中，所述酶在甘油浓度小于约50％的缓冲液中。
67.如权利要求35-64中任一项所述的方法，其中，所述酶在不含甘油的缓冲液中。
68.如权利要求35-64中任一项所述的方法，其中，所述酶在10％甘油Tris缓冲液或不含甘油的Tris缓冲液中。
69.如权利要求35-68中任一项所述的方法，其中，(a)中产生的所述扩增子与去除末端磷酸的试剂接触，所述去除末端磷酸的试剂去除未纳入所述扩增子的任何核苷酸的末端磷酸。
70.如权利要求69所述的方法，其中，所述去除末端磷酸的试剂是磷酸酶。
71.如权利要求70所述的方法，其中，所述磷酸酶是碱性磷酸酶。
72.如权利要求71所述的方法，其中，所述碱性磷酸酶是虾碱性磷酸酶或重组虾碱性磷酸酶。
73.如权利要求35-72中任一项所述的方法，其中，当未延伸的寡核苷酸被所述酶消化时，检测多种靶核酸物质的变体存在、不存在或量的信噪比大于未延伸的寡核苷酸不被所述酶消化时的信噪比。
74.一种检测多种靶核酸物质的变体存在、不存在或量的方法，其包括：
(a)制备衍生自多种靶核酸物质或其部分的多个扩增子，其中各靶核酸物质包括低丰度变体和高丰度变体；
(b)将所述扩增子与多种寡核苷酸物质杂交，从而生成杂交的寡核苷酸，其中各寡核苷酸物质特异性地对应靶核酸物质的扩增子，其中(i)寡核苷酸物质与衍生自靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体的扩增子在单碱基位置的5'位置处杂交，所述单碱基位置在所述靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体之间不同，(ii)所述多种靶核酸物质各高丰度变体在所述单碱基位置处的核苷酸是相同的或不同的，(iii)所述多种靶核酸物质的各低丰度变体在所述单碱基位置处的核苷酸是相同的，和(iv)所述多种靶核酸物质的高丰度变体在所述单碱基位置处的核苷酸与所述多种靶核酸物质的低丰度变体在所述单碱基位置处的核苷酸无一相同；
(c)使所述杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，从而生成包含对所述多个靶核酸物质的低丰度变体具有特异性的链终止试剂的延伸的寡核苷酸和包含对所述多个靶核酸物质的高丰度变体具有特异性的链终止试剂的延伸的寡核苷酸，所述延伸组合物包含对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂和对一种或多种所述高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂，其中：(i)对一种或多种高丰度变体具有特异性的所述1、2或3种链终止试剂各自的浓度低于对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度，和(ii)所述延伸条件包括多个热循环；
(d)使(c)的产物与具有3'-5'外切核酸酶活性的酶接触，从而使未延伸的寡核苷酸被消化，而包含链终止试剂的延伸的寡核苷酸不被消化；和
(e)检测所述延伸的寡核苷酸；从而检测多种核酸物质的变体存在、不存在或量。
75.如权利要求74所述的方法，其中，所述酶来自嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)。
76.如权利要求75所述的方法，其中，所述酶是TTHB178。
77.如权利要求74-76中任一项所述的方法，其中，多种靶核酸物质的变体在单一多重化反应中检测。
78.如权利要求74-77中任一项所述的方法，其中，低丰度变体是突变等位基因并且高丰度变体是所述等位基因的野生型。
79.如权利要求74-78中任一项所述的方法，其中，低丰度变体是体细胞突变。
80.如权利要求74-79中任一项所述的方法，其中，低丰度变体具有一个或多个插入或缺失并且高丰度变体不具有一个或多个插入和缺失。
81.如权利要求74-80中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸物质的低丰度变体以所述靶核酸物质拷贝数的约0.1％-约5％的拷贝数存在。
82.如实施方式74-80中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸物质的低丰度变体以所述靶核酸物质拷贝数的约1％或更少的拷贝数存在。
83.如权利要求74-80中任一项所述的方法，其中，靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体的总拷贝数是至少约1000个拷贝，并且所述低丰度变体占所述总拷贝数的约0.1％。
84.如权利要求74-80中任一项所述的方法，其中，靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体的总拷贝数是至少约100个拷贝，并且所述低丰度变体占所述总拷贝数的约0.1％。
85.如权利要求74-80中任一项所述的方法，其中，对于核酸物质，所述低丰度变体的拷贝数是所述靶核酸物质总拷贝数的约0.01％-约0.1％。
86.如权利要求74-85中任一项所述的方法，其中，相对于所述低丰度变体的特异性链终止试剂的浓度，对所述高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂各自的浓度是约0.01％-约30％。
87.如权利要求74-86中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂各自的浓度是对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂浓度的约0.3％-约30％。
88.如权利要求74-87中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂各自的浓度是对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂浓度的约1％-约20％。
89.如权利要求74-88中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂各自的浓度是对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂浓度的约1％-约10％。
90.如权利要求74-89中任一项所述的方法，其中，相对于所述低丰度变体的特异性链终止试剂的浓度，对所述高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂各自的浓度是约1％-约2％。
91.如权利要求74-90中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂由1种链终止试剂组成。
92.如权利要求74-90中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂由2种链终止试剂组成。
93.如权利要求74-90中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂由3种链终止试剂组成。
94.如权利要求74-93中任一项所述的方法，其中，链终止试剂在纳入寡核苷酸时阻断所述酶的3'-5'外切核酸酶活性。
95.如权利要求94所述的方法，其中，所述链终止试剂是链终止核苷酸。
96.如权利要求95所述的方法，其中，所述链终止核苷酸在所述链终止核苷酸的戊糖部分的3'碳处被修饰。
97.如权利要求96所述的方法，其中，所述链终止试剂是双脱氧核苷酸。
98.如权利要求97所述的方法，其中，所述双脱氧核苷酸选自：ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。
99.如权利要求95所述的方法，其中，所述链终止核苷酸是无环核苷酸。
100.如权利要求99所述的方法，其中，所述无环核苷酸选自：acyATP、acyCTP、acyGTP、acyTTP和acy-溴-UTP。
101.如权利要求74-100中任一项所述的方法，其中，所述酶对单链DNA具有特异性。
102.如权利要求74-101中任一项所述的方法，其中，所述酶的3'-5'外切核酸酶活性被双脱氧核苷酸或无环核苷酸抑制。
103.如权利要求74-102中任一项所述的方法，其中，所述多种靶核酸物质是约2-约100种靶核酸物质且在单一反应中。
104.如权利要求74-103中任一项所述的方法，其中，各延伸的寡核苷酸包含可检测标记物。
105.如权利要求74-104中任一项所述的方法，其中，至少一种链终止试剂包含链终止核苷酸，并且所述链终止核苷酸包含可检测标记物。
106.如权利要求104或105所述的方法，其中，所述可检测标记物是荧光标记物或染料。
107.如权利要求106所述的方法，其中，所述荧光标记物或染料通过电泳或实时PCR检测。
108.如权利要求104或105所述的方法，其中，所述可检测标记物是质量标记物。
109.如权利要求108所述的方法，其中，所述质量标记物是质量可区分标签，其位于与扩增子杂交的所述寡核苷酸的区域的5'处，或所述链终止试剂含有所述质量可区分标签。
110.如权利要求108或109所述的方法，其中，检测所述延伸的寡核苷酸的质量通过质谱进行。
111.如权利要求110所述的方法，其中，所述质谱是基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱。
112.如权利要求74-111中任一项所述的方法，其中，所述酶在甘油浓度为约50％的缓冲液中。
113.如权利要求74-111中任一项所述的方法，其中，所述酶在甘油浓度小于约50％的缓冲液中。
114.如权利要求74-111中任一项所述的方法，其中，所述酶在不含甘油的缓冲液中。
115.如权利要求74-111中任一项所述的方法，其中，所述酶在10％甘油Tris缓冲液或不含甘油的Tris缓冲液中。
116.如权利要求74-115中任一项所述的方法，其中，(a)中产生的所述扩增子与去除末端磷酸的试剂接触，所述去除末端磷酸的试剂去除未纳入所述扩增子的任何核苷酸的末端磷酸。
117.如权利要求116所述的方法，其中，所述去除末端磷酸的试剂是磷酸酶。
118.如权利要求117所述的方法，其中，所述磷酸酶是碱性磷酸酶。
119.如权利要求118所述的方法，其中，所述碱性磷酸酶是虾碱性磷酸酶或重组虾碱性磷酸酶。
120.如权利要求74-119中任一项所述的方法，其中，在没有检测到包含对低丰度变体具有特异性的链终止试剂的延伸的寡核苷酸的情况下，若检测到包含对高丰度变体具有特异性的链终止试剂的延伸的寡核苷酸，则提供了阳性对照以评估反应是否失败或者所述样品是否仅包含所述高丰度变体。
121.如权利要求74-120中任一项所述的方法，其中，当未延伸的寡核苷酸被所述酶消化时，检测多种核酸物质的变体存在、不存在或量的信噪比大于未延伸的寡核苷酸不被所述酶消化时的信噪比。
122.一种检测多种靶核酸物质的变体存在、不存在或量的方法，其包括：
(a)制备衍生自多种靶核酸物质或其部分的多个扩增子，其中各靶核酸物质包括低丰度变体和高丰度变体；
(b)将所述扩增子与多种寡核苷酸物质杂交，从而生成杂交的寡核苷酸，各寡核苷酸物质特异性地对应靶核酸物质的扩增子，其中各寡核苷酸物质与衍生自靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体的扩增子在单碱基位置的5'位置处杂交，所述单碱基位置在所述靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体之间不同；
(c)使所述杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，所述延伸组合物包含链终止试剂，从而生成分别对应所述低丰度变体和所述高丰度变体的链终止的延伸产物，其中(i)所述高丰度变体共有共同链终止试剂，所述共同链终止试剂对所述高丰度变体具有特异性并对所述低丰度变体不具有特异性，和(ii)所述低丰度变体各自具有链终止试剂，所述链终止试剂对所述低丰度变体具有特异性并对所述高丰度变体不具有特异性，其中对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂：(A)对扩增混合物中的特定低丰度变体是独特的并且不被扩增混合物中其他低丰度变体共有，或者(B)扩增混合物中至少一个低丰度变体与至少一个其他低丰度变体共有共同链终止试剂，由此所述寡核苷酸延伸达到或通过相对于高丰度变体而言在低丰度变体中不同的核苷酸位置，其中对所述高丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度低于对所述低丰度变体具有特异性的一种或多种链终止试剂各自的浓度；
(d)使(c)的产物与具有3'-5'外切核酸酶活性的酶接触，从而使未延伸的寡核苷酸被消化，而包含链终止试剂的延伸的寡核苷酸不被消化；和
(e)分析所述延伸的寡核苷酸，从而检测所述低丰度变体存在、不存在或量。
123.如权利要求122所述的方法，其中，多种核酸物质的变体在单一多重化反应中检测。
124.如权利要求122或123所述的方法，其中，低丰度变体的序列相对于高丰度变体的序列包含插入或缺失。
125.如权利要求122或123所述的方法，其中，低丰度变体是高丰度变体的单核苷酸多态性(SNP)变体。
126.如其权利要求122-125中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸物质的低丰度变体和高丰度变体分别是相同基因的突变和野生型等位基因。
127.如权利要求122-126中任一项所述的方法，其中，低丰度变体是体细胞突变。
128.如权利要求122-127中任一项所述的方法，其中，所述酶来自嗜热栖热菌。
129.如权利要求128所述的方法，其中，所述酶是TTHB178。
130.如权利要求122-129中任一项所述的方法，其中，高丰度变体来自宿主对象，而低丰度变体来自除了宿主以外的对象，或者低丰度变体来自宿主对象，而高丰度变体来自除了宿主以外的对象。
131.如权利要求122-130中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸物质的低丰度变体以所述靶核酸物质拷贝数的约1％-约10％的拷贝数存在。
132.如权利要求122-130中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸物质的低丰度变体以所述靶核酸物质拷贝数的约5％或更少的拷贝数存在。
133.如权利要求122-132中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度是对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂各自浓度的约0.01％-约30％。
134.如权利要求122-133中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度是对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂各自浓度的约0.3％-约30％。
135.如权利要求122-134中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度是对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂各自浓度的约1％-约20％。
136.如权利要求122-135中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度是对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂各自浓度的约1％-约10％。
137.如权利要求122-136中任一项所述的方法，其中，对所述高丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度是对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂各自浓度的约1％-约2％。
138.如权利要求122-137中任一项所述的方法，其中，链终止试剂在纳入寡核苷酸时阻断所述酶的3'-5'外切核酸酶活性。
139.如权利要求138所述的方法，其中，所述链终止试剂是链终止核苷酸。
140.如权利要求139所述的方法，其中，所述链终止核苷酸在所述链终止核苷酸的戊糖部分的3'位置处被修饰。
141.如权利要求140所述的方法，其中，所述链终止试剂是双脱氧核苷酸。
142.如权利要求141所述的方法，其中，所述双脱氧核苷酸选自：ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。
143.如权利要求139所述的方法，其中，所述链终止核苷酸是无环核苷酸。
144.如权利要求143所述的方法，其中，所述无环核苷酸选自：acyATP、acyCTP、acyGTP、acyTTP和acy-溴-UTP。
145.如权利要求122-144中任一项所述的方法，其中，所述酶对单链DNA具有特异性。
146.如权利要求122-145中任一项所述的方法，其中，所述酶的3'-5'外切核酸酶活性被双脱氧核苷酸或无环核苷酸抑制。
147.如权利要求122-146中任一项所述的方法，其中，对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂由1种链终止试剂组成。
148.如权利要求122-146中任一项所述的方法，其中，对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂由2种链终止试剂组成。
149.如权利要求122-146中任一项所述的方法，其中，对所述低丰度变体具有特异性的链终止试剂由3种链终止试剂组成。
150.如权利要求122-149中任一项所述的方法，其中，所述多种靶核酸物质是约2-约100种靶核酸物质并且所述靶核酸物质在单一反应中检测。
151.如权利要求122-150中任一项所述的方法，其中，各延伸的寡核苷酸包含可检测标记物。
152.如权利要求122-151中任一项所述的方法，其中，至少一种链终止试剂包含链终止核苷酸，并且所述链终止核苷酸包含可检测标记物。
153.如权利要求151或152所述的方法，其中，所述可检测标记物是荧光标记物或染料。
154.如权利要求153所述的方法，其中，所述荧光标记物或染料通过电泳或实时PCR检测。
155.如权利要求151或152所述的方法，其中，所述可检测标记物是质量标记物。
156.如权利要求155所述的方法，其中，质量标记物是质量可区分标签，其位于与扩增子杂交的所述寡核苷酸的区域的5'处，或所述链终止试剂含有所述质量可区分标签。
157.如权利要求155或156所述的方法，其中，检测所述延伸的寡核苷酸的质量通过质谱进行。
158.如权利要求157所述的方法，其中，所述质谱是基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱。
159.如权利要求122-158中任一项所述的方法，其中，所述酶在甘油浓度为约50％的缓冲液中。
160.如权利要求122-158中任一项所述的方法，其中，所述酶在甘油浓度小于约50％的缓冲液中。
161.如权利要求122-158中任一项所述的方法，其中，所述酶在不含甘油的缓冲液中。
162.如权利要求122-158中任一项所述的方法，其中，所述酶在10％甘油Tris缓冲液或不含甘油的Tris缓冲液中。
163.如权利要求122-162中任一项所述的方法，其中，(a)中产生的所述扩增子与去除末端磷酸的试剂接触，所述去除末端磷酸的试剂去除未纳入所述扩增子的任何核苷酸的末端磷酸。
164.如权利要求163所述的方法，其中，所述去除末端磷酸的试剂是磷酸酶。
165.如权利要求164所述的方法，其中，所述磷酸酶是碱性磷酸酶。
166.如权利要求165所述的方法，其中，所述碱性磷酸酶是虾碱性磷酸酶或重组虾碱性磷酸酶。
167.如权利要求122-166中任一项所述的方法，其中，当未延伸的寡核苷酸被所述酶消化时，检测多种核酸物质的变体存在、不存在或量的信噪比大于未延伸的寡核苷酸不被所述酶消化时的信噪比。
168.一种检测多种靶核酸物质的变体存在、不存在或量的方法，其包括：
(a)制备衍生自多种靶核酸物质或其部分的多个扩增子，其中各靶核酸物质包括至少两种变体；
(b)将所述扩增子与多种寡核苷酸物质杂交，从而生成杂交的寡核苷酸，其中各寡核苷酸物质特异性地对应靶核酸物质的扩增子，其中各寡核苷酸物质与衍生自靶核酸物质的变体的扩增子在单碱基位置的5'位置处杂交，所述单碱基位置在所述靶核酸物质的变体之间不同；
(c)使所述杂交的寡核苷酸与延伸组合物接触，从而生成对应变体的链终止的延伸产物，所述延伸组合物包含等摩尔浓度的2、3或4种链终止试剂，由此所述寡核苷酸延伸到达或通过在靶核酸物质的变体之间不同的核苷酸位置；
(d)使(c)的产物与具有3'-5'外切核酸酶活性的酶接触，从而使未延伸的寡核苷酸被消化，而延伸的寡核苷酸不被消化；和
(e)分析所述延伸的寡核苷酸，从而检测所述变体存在、不存在或量。
169.如权利要求168所述的方法，其中，多种靶核酸物质的变体在单一多重化反应中检测。
170.如权利要求168或169所述的方法，其中，靶核酸物质的变体之一相对于靶核酸物质的另一变体包含插入或缺失。
171.如权利要求168或169所述的方法，其中，靶核酸物质的变体是单核苷酸多态性(SNP)变体。
172.如权利要求168-171中任一项所述的方法，其中，靶核酸物质的变体分别是相同基因的突变和野生型等位基因。
173.如权利要求172所述的方法，其中，靶核酸物质的变体之一是体细胞突变。
174.如权利要求168-173中任一项所述的方法，其中，所述酶来自嗜热栖热菌。
175.如权利要求174所述的方法，其中，所述酶是TTHB178。
176.如权利要求168-175中任一项所述的方法，其中，靶核酸物质的变体各自以所述靶核酸物质拷贝数的至少约10％的拷贝数存在。
177.如权利要求168-176中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸物质的一种变体来自宿主对象，而所述靶核酸物质的至少一种其他变体来自除了宿主以外的对象。
178.如权利要求168-177中任一项所述的方法，其中，所述链终止试剂在纳入(c)中寡核苷酸时阻断所述酶的3'-5'外切核酸酶活性。
179.如权利要求178所述的方法，其中，所述链终止试剂是链终止核苷酸。
180.如权利要求179所述的方法，其中，所述链终止核苷酸在所述链终止核苷酸的戊糖部分的3'位置处被修饰。
181.如权利要求180所述的方法，其中，所述链终止试剂是双脱氧核苷酸。
182.如权利要求181所述的方法，其中，所述双脱氧核苷酸选自：ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。
183.如权利要求179所述的方法，其中，所述链终止核苷酸是无环核苷酸。
184.如权利要求183所述的方法，其中，所述无环核苷酸选自：acyATP、acyCTP、acyGTP、acyTTP和acy-溴-UTP。
185.如权利要求168-184中任一项所述的方法，其中，所述酶对单链DNA具有特异性。
186.如权利要求168-185中任一项所述的方法，其中，所述链终止试剂由2种链终止试剂组成。
187.如权利要求168-185中任一项所述的方法，其中，所述链终止试剂由3种链终止试剂组成。
188.如权利要求168-185中任一项所述的方法，其中，所述链终止试剂由4种链终止试剂组成。
189.如权利要求168-188中任一项所述的方法，其中，所述酶的3'-5'外切核酸酶活性被双脱氧核苷酸或无环核苷酸抑制。
190.如权利要求168-189中任一项所述的方法，其中，所述多种靶核酸物质是约2-约100种靶核酸物质并且所述靶核酸物质在单一反应中检测。
191.如权利要求168-190中任一项所述的方法，其中，各延伸的寡核苷酸包含可检测标记物。
192.如权利要求168-191中任一项所述的方法，其中，至少一种链终止试剂包含链终止核苷酸，并且所述链终止核苷酸包含可检测标记物。
193.如权利要求191或192所述的方法，其中，所述可检测标记物是荧光标记物或染料。
194.如权利要求193所述的方法，其中，所述荧光标记物或染料通过电泳或实时PCR检测。
195.如权利要求191或192所述的方法，其中，所述可检测标记物是质量标记物。
196.如权利要求195所述的方法，其中，质量标记物是质量可区分标签，其位于与扩增子杂交的所述寡核苷酸的区域的5'处，或所述链终止试剂含有所述质量可区分标签。
197.如权利要求195或196所述的方法，其中，检测所述延伸的寡核苷酸的质量通过质谱进行。
198.如权利要求197所述的方法，其中，所述质谱是基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱。
199.如权利要求168-198中任一项所述的方法，其中，所述酶在甘油浓度为约50％的缓冲液中。
200.如权利要求168-198中任一项所述的方法，其中，所述酶在甘油浓度小于约50％的缓冲液中。
201.如权利要求168-198中任一项所述的方法，其中，所述酶在不含甘油的缓冲液中。
202.如权利要求168-198中任一项所述的方法，其中，所述酶在10％甘油Tris缓冲液或不含甘油的Tris缓冲液中。
203.如权利要求168-202中任一项所述的方法，其中，(a)中产生的所述扩增子与去除末端磷酸的试剂接触，所述去除末端磷酸的试剂去除未纳入所述扩增子的任何核苷酸的末端磷酸。
204.如权利要求203所述的方法，其中，所述去除末端磷酸的试剂是磷酸酶。
205.如权利要求204所述的方法，其中，所述磷酸酶是碱性磷酸酶。
206.如权利要求205所述的方法，其中，所述碱性磷酸酶是虾碱性磷酸酶或重组虾碱性磷酸酶。
207.如权利要求168-206中任一项所述的方法，其中，当未延伸的寡核苷酸被所述酶消化时，检测多种核酸物质的变体存在、不存在或量的信噪比大于未延伸的寡核苷酸不被所述酶消化时的信噪比。
208.一种用于引物延伸的方法，其包括：
(a)将靶核酸与寡核苷酸杂交，所述寡核苷酸包含对应所述靶核酸的部分的区域，由此生成杂交的寡核苷酸；
(b)使所述杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，从而生成延伸的寡核苷酸，所述延伸组合物包含一种或多种链终止试剂；和
(c)使(b)的产物与具有3'-5'外切核酸酶活性的酶接触，从而使未延伸的寡核苷酸被消化，而包含链终止试剂的延伸的寡核苷酸不被消化。
209.如权利要求208所述的方法，其中，至少一种链终止试剂在纳入(b)中寡核苷酸时阻断所述酶的3'-5'外切核酸酶活性。
210.如权利要求208或209所述的方法，其中，至少一种链终止试剂是链终止核苷酸。
211.如权利要求210所述的方法，其中，所述链终止核苷酸在所述链终止核苷酸的戊糖部分的3'位置处被修饰。
212.如权利要求210所述的方法，其中，所述链终止试剂是双脱氧核苷酸。
213.如权利要求212所述的方法，其中，所述双脱氧核苷酸选自：ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。
214.如权利要求210所述的方法，其中，所述链终止试剂是无环核苷酸。
215.如权利要求214所述的方法，其中，所述无环核苷酸选自：acyATP、acyCTP、acyGTP、acyTTP和acy-溴-UTP。
216.如权利要求208-215中任一项所述的方法，其中，所述酶对单链DNA具有特异性。
217.如权利要求208-216中任一项所述的方法，其中，所述酶的3'-5'外切核酸酶活性被双脱氧核苷酸或无环核苷酸抑制。
218.如权利要求217所述的方法，其中，所述酶来自嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)。
219.如权利要求218所述的方法，其中，所述酶是TTHB178。
220.如权利要求208-219中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种链终止试剂由1种链终止试剂组成。
221.如权利要求208-219中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种链终止试剂由2种链终止试剂组成。
222.如权利要求208-219中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种链终止试剂由3种链终止试剂组成。
223.如权利要求208-219中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种链终止试剂由4种链终止试剂组成。
224.一种试剂盒，其包括：
具有3'-5'外切核酸酶活性的酶；和
一种或多种链终止试剂，所述链终止试剂在其处于寡核苷酸的3'末端时抑制所述酶在所述寡核苷酸上的活性。
225.如权利要求224所述的试剂盒，其中，所述酶来自嗜热栖热菌。
226.如权利要求225所述的试剂盒，其中，所述酶是TTHB178。
227.如权利要求224-226中任一项所述的试剂盒，其中，所述酶经标签标记。
228.如权利要求227所述的试剂盒，其中，所述标签是组氨酸(His)标签。
229.如权利要求224-228中任一项所述的试剂盒，其中，所述酶包含SEQ ID NO:47中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:49中所示氨基酸序列。
230.如权利要求224-229中任一项所述的试剂盒，其中，提供含于甘油浓度为50％或更少的缓冲液中的所述酶。
231.如权利要求224-229中任一项所述的试剂盒，其中，所述酶在不含甘油的缓冲液中。
232.如权利要求224-229中任一项所述的试剂盒，其中，所述酶在10％甘油Tris缓冲液或不含甘油的Tris缓冲液中。
233.如权利要求224-232中任一项所述的试剂盒，其中，至少一种链终止试剂是链终止核苷酸。
234.如权利要求233所述的试剂盒，其中，所述链终止核苷酸在所述链终止核苷酸的戊糖部分的3'位置处被修饰。
235.如权利要求234所述的试剂盒，其中，所述链终止试剂是双脱氧核苷酸。
236.如权利要求235所述的试剂盒，其中，所述双脱氧核苷酸选自：
ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。
237.如权利要求233所述的试剂盒，其中，所述链终止试剂是无环核苷酸。
238.如权利要求237所述的试剂盒，其中，所述无环核苷酸选自：acyATP、acyCTP、acyGTP、acyTTP和acy-溴-UTP。
239.如权利要求224-238中任一项所述的试剂盒，其中，所述一种或多种链终止试剂包含质量可区分标签。
240.如权利要求224-239中任一项所述的试剂盒，其中，所述酶对单链DNA具有特异性。
241.如权利要求224-240中任一项所述的试剂盒，其还包括下述一种或多种：寡核苷酸、聚合酶、碱性磷酸酶、一种或多种缓冲液和一种或多种反应对照。
242.如权利要求224-241中任一项所述的试剂盒，其中，所述一种或多种链终止试剂由1种链终止试剂组成。
243.如权利要求224-241中任一项所述的试剂盒，其中，所述一种或多种链终止试剂由2种链终止试剂组成。
244.如权利要求224-241中任一项所述的试剂盒，其中，所述一种或多种链终止试剂由3种链终止试剂组成。
245.如权利要求224-241中任一项所述的试剂盒，其中，所述一种或多种链终止试剂由4种链终止试剂组成。
246.如权利要求224-241和243-245中任一项所述的试剂盒，其中，1、2或3种链终止试剂对一种或多种高丰度变体的检测具有特异性，而1种链终止试剂对一种或多种低丰度变体的检测具有特异性，并且对一种或多种高丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂各自的浓度是对一种或多种低丰度变体具有特异性的链终止试剂浓度的约0.3％-约30％。
247.如权利要求246所述的试剂盒，其中，对一种或多种低丰度变体的检测具有特异性的链终止试剂和对一种或多种高丰度变体的检测具有特异性的1、2或3种链终止试剂处于单一容器内。
248.如权利要求246所述的试剂盒，其包括2个或更多个容器，其各自装有对一种或多种低丰度变体和一种或多种高丰度变体的检测具有特异性的不同的链终止试剂。
249.如权利要求224-241和243-245中任一项所述的试剂盒，其中，1、2或3种链终止试剂对一种或多种低丰度变体的检测具有特异性，而1种链终止试剂对一种或多种高丰度变体的检测具有特异性，并且对一种或多种高丰度变体具有特异性的链终止试剂的浓度是对一种或多种低丰度变体具有特异性的1、2或3种链终止试剂各自的浓度的约0.3％-约30％。
250.如权利要求249所述的试剂盒，其中，对一种或多种高丰度变体的检测具有特异性的链终止试剂和对一种或多种低丰度变体的检测具有特异性的1、2或3种链终止试剂处于单一容器内。
251.如权利要求249所述的试剂盒，其包括2个或更多个容器，其各自装有对一种或多种低丰度变体和一种或多种高丰度变体的检测具有特异性的不同的链终止试剂。
252.如权利要求224-245中任一项所述的试剂盒，其包括等同浓度的2、3或4种链终止试剂。
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