CN102203287A

CN102203287A - 增加样本和/或靶通量的测定方法

Info

Publication number: CN102203287A
Application number: CN2009801425059A
Authority: CN
Inventors: A·摩尔; R·拉马克里山; M·恩格尔; B·G·兹莫曼
Original assignee: Fluidigm Corp
Current assignee: Standard Biotools Corp
Priority date: 2008-08-26
Filing date: 2009-08-26
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2029-08-26
Also published as: CA2734868A1; EP2326732A4; WO2010027870A2; CA2734868C; CN102203287B; US20100120038A1; US20140296090A1; US8697363B2; WO2010027870A3; EP2326732A2

Abstract

本发明提供增加可在单个测定中分析的样本和/或靶核酸的数量的测定方法。

Description

增加样本和/或靶通量的测定方法

相关申请的交叉引用

本申请特此将以下在先美国临时申请以引用的方式全文纳入：2008年8月26日提交的61/092,010、2008年9月19日提交的61/098,621和2009年1月22日提交的61/146,567。

技术领域

本发明大体上涉及用于检测具体靶核酸的高通量测定领域。具体而言，本发明涉及用于增加可在单个测定中分析的样本和/或靶的数目的方法。

背景技术

检测样本中的特异核酸序列的能力已在诊断和预测医学、环境、食品和农业监控、分子生物学研究和许多其他领域形成了新方法。

其他方法，特别是使得能检测样本中的多种靶并且/或者同时分析宽浓度范围的多个样本的方法，将会是十分有利的。

发明内容

本发明提供了一种用于检测多个样本中的多个靶核酸(即，T个靶核酸，其中T是大于1的整数)的第一测定方法。在一些实施方案中，所述方法需要提供在测定前混合在一起的S个样本，其中S是大于1的整数。使这些样本的每一个分别进行编码反应，所述编码反应产生一系列T个带标签的靶核苷酸序列，每个带标签的靶核苷酸序列包括样本特异的核苷酸标签和靶核苷酸序列。对于所述S个样本的每一个(即，待合并的样本的每一个)，可将带标签的靶核苷酸序列混合形成测定混合物。以该方式，可以成批地测定样本，因此，若例如48个样本待分析，则S可以是例如3，这意味着制备16份测定混合物。参见实施例1。可对所述测定混合物或其等分试样用S×T对独特的(unique)扩增引物进行扩增，其中每对扩增引物包括：

会与靶核苷酸序列退火的正向或反向扩增引物；和

会与样本特异性核苷酸标签退火的各自的反向或正向扩增引物。在具体实施方案中，对于每对独特的引物，确定扩增产物在扩增混合物中或其等分试样中的存在或量。扩增产物的存在或量指示具体靶核酸在具体样本中的存在或量。

在所述第一种测定方法的示例性实施方案中，所述编码反应包括使用针对每个样本的不同正向和反向预扩增引物系列分别预扩增所述S个样本的每一个来产生预扩增的样本，其中：

每个预扩增引物系列包括T对正向和反向预扩增引物，其中每对预扩增引物能够扩增一个具体的靶核酸；并且

在给定系列中的所有正向预扩增引物或所有反向预扩增引物都包括共同的样本特异性核苷酸标签。

将所述S个样本的每一个的预扩增样本混合来形成测定混合物(例如，待一起分析的每一系列样本的一份测定混合物)。然后，可通过以下方式分析所述测定混合物：将其分成最多S×T个扩增混合物，并且用独特扩增引物对来分别扩增所述每个扩增混合物，其中每对扩增引物包括：

会与靶核酸序列退火的正向或反向扩增引物；和

会与样本特异性核苷酸标签退火的各自的反向或正向扩增引物。

确定扩增产物在所述扩增混合物中的存在或量以确定具体靶核酸在具体样本中的存在或量。

本发明提供了检测多个样本中的多个靶核酸(即，T个靶核酸，其中T是大于1的整数)的第二测定方法。在一些实施方案中，所述方法需要提供在测定前混合在一起的S个样本，其中S是大于1的整数。对这些样本的每一个分别进行编码反应，所述编码反应产生一系列T个带标签的靶核苷酸序列，每个带标签的靶核苷酸序列包括连接至靶核苷酸序列的第一核苷酸标签，所述靶核苷酸序列连接至第二核苷酸标签。对于这些S个样本的每一个(即，所述待合并的样本的每一个)，将带标签的靶核苷酸序列混合形成测定混合物。用S×T对独特的扩增引物扩增所述测定混合物或其等分试样，其中每对扩增引物包括：

会与第一核苷酸标签退火的正向或反向扩增引物；和

会与第二核苷酸标签退火的反向或正向扩增引物。

对于每对独特的引物，确定扩增产物在所述扩增混合物或其等分试样中的存在或量。扩增产物的存在指示具体靶核酸在具体样本中的存在或量。

在所述第二测定方法的示例性实施方案中，所述编码反应包括使用针对每个样本的不同正向和反向预扩增引物系列分别对所述S个样本的每一个进行预扩增来产生预扩增样本，其中：

每个正向预扩增引物包括正向核苷酸标签，每个反向预扩增引物包括反向核苷酸标签；

将所述S个样本的每一个的预扩增样本混合形成测定混合物。然后，可通过以下方式分析所述测定混合物：将每个测定混合物分为最多S×T个扩增混合物，并且用独特的扩增引物对分别扩增每个所述扩增混合物，其中每对扩增引物包括：

会与正向核苷酸标签退火的正向扩增引物；和

会与反向核苷酸标签退火的反向扩增引物。

确定扩增产物在所述扩增混合物中的存在或量。扩增产物的存在指示具体靶核酸在具体样本中的存在或量。

本发明还提供了检测样本中的多个靶核酸(即，T个靶核酸)的第三测定方法。所述方法需要向样本提供T个正向预扩增引物，其中每个正向预扩增引物包括不同的靶特异性核苷酸序列和系列特异性核苷酸标签，其中使用X个不同的正向系列特异性核苷酸标签，X是大于1小于T的整数，因此T/X个引物包括相同的正向系列特异性核苷酸标签。还向所述样本提供T个反向预扩增引物，其中每个反向预扩增引物包括不同的靶特异性核苷酸序列和反向系列特异性核苷酸标签，其中使用Y个不同的反向系列特异性核苷酸标签，Y是大于1小于T的整数，因此T/Y个引物包括相同的反向系列特异性核苷酸标签。预扩增所述样本以产生测定混合物，其中针对具体靶生产的任何预扩增产物参入正向和反向系列特异性核苷酸标签的独特组合。用扩增引物扩增所述测定混合物或其等分试样，其中每对扩增引物包括：

会与所述正向系列特异性核苷酸标签退火的正向扩增引物；和

会与所述反向系列特异性核苷酸标签退火的反向扩增引物。对于每对独特的引物，确定扩增产物在所述扩增混合物或其等分试样中的存在或量。扩增产物的存在指示具体靶核酸在所述样本中的存在。

本发明的第四测定方法提供了一种检测样本中多个靶核酸的模块化方法。该方法需要将样本分为R个等分试样，其中R是大于1的整数。对R个等分试样的每一份分别进行编码反应，所述编码反应产生一系列T个带标签的核苷酸序列，其中T是每个等分试样中待检测的靶核酸的数目，T是大于1的整数。每个带标签的靶核苷酸序列包括在靶核苷酸序列5’的第一核苷酸标签、靶核苷酸序列和在所述靶核苷酸序列3’的第二核苷酸标签。所述T个带标签的靶核苷酸序列的每一个中的核苷酸标签组合对每个等分试样中的每个带标签的靶核苷酸序列来说都是独特的。然而，将相同系列的第一和第二核苷酸标签组合用于每个所述等分试样的所述编码反应中。所述方法的该方面使得能够使用针对每个等分试样的相同系列T对不同的扩增引物分别扩增每个等分试样。每对引物均包括会与每个带标签的靶核苷酸序列中的所述第一核苷酸标签退火的第一引物和会与其中的所述第二核苷酸标签退火的第二引物。对于每个等分试样中的每对独特的引物，所述方法需要确定扩增产物是否存在于所述等分试样中。扩增产物的存在指示具体靶核酸在所述样本中的存在。

在该方法的变化方法中，在所述编码反应后，将每个等分试样分为T个亚等分试样。将所述T对不同的扩增引物的一对与每个亚等分试样组合，并且将所述亚等分试样分别进行扩增反应。

在上述方法的具体实施方案中，所述样本可以是基因组DNA样本。在这些实施方案的变化方案中，可在存在一份量的阻断剂的情况下进行基因组DNA的预扩增，其中所述阻断剂的量足以提高所述靶核酸的特异性扩增。

附图说明

可通过与附图结合参考以下说明来理解本发明，所述附图示出了本发明的一些具体实施方案。

图1示出了一个示例性矩阵型微流体装置的平面图。

图2示出的曲线图描绘了本发明的方法用于在基因分型研究中分析多个样本中的多个靶核酸的结果(实施例2)。以带有3个不同标签序列的正向引物扩增样本。结果显示在标为TAG-1、2和3的单TAG对偶视图(allelogram)(上排图)中。所有的样本都清楚地区分(圈出)为纯合性XX、YY或杂合性XY基因型。来自这些对偶图的合并基因型的数据显示为“3合1合并图(Merged 3)”。

图3示出了来自实施例2的基因分型研究的数据。使用加标签和标准方法(为了比较)对16个SNP基因座进行基因分型。不带标签的样本被描述为“原样”。如实施例2所描述，将示于“原样”表格中的不带标签的相同样本与在正向引物上携带标签序列1、2或3的样本(“测试”)进行比较。带标签的样本显示出1.4至2％的检出率(call rate)增长。标签3中的所有未检出(no-called)SNP都来自于单个样本。

图4示出了一种分析多个样本中的多个靶核酸的示例性方案，例如在实施例3的基因表达研究中。该研究使用了靶向16个基因座的3个标签组(1-3)。合成用于扩增16个cDNA的3个系列的16个正向引物。如果每组对48个个体加标签，并将来自每个标签组的1个样本合并，那么可以同时分析144个样本。在芯片外加标签反应(off-chip tagging reaction)之前，将样本分到所述3个标签系列的每个系列中。每组的48个样本在正向引物的5’端带有标签序列1、2或3。加标签反应使用测定特异性加有标签的引物和外部反向引物。在芯片上，可使用嵌套反向引物。在基因表达的实例中，显示了单个水解探针。

图5显示一种分析多个样本中的多个靶核酸的示例性一般方案。例如，可使用等位基因特异性探针(基因分型)或单个探针(基因表达)。将样本合并后，在PCR步骤前使用ExoSAP-IT(USB)来除去残余的引物。

图6显示一种分析多个样本中的多个靶核酸的示例性一般方案，在该情形下，对144个样本进行16项测定。合成用于扩增16个基因座的3个系列的16个正向引物。每个标签系列在5’端还带有标签序列1、2或3。在芯片外加标签反应中，使用由带有标签序列1的16个正向测定引物和16个反向测定特异性反向引物组成的32个引物。使用带有不同5’标签序列(标签2)的测定特异性标签引物和相同序列的反向引物来对下一系列的样本加标签。还以第3种标签和另一系列的样本进行该操作。在用标签系列1对48×样本加标签、用标签系列2对48×样本加标签，用标签系列3对48×样本加标签后，将每个标签系列的一个样本合并。这产生48个混合的样本，并且当将正确的标签引物和靶特异性反向引物加入到合并的样本中时，只会出现来自于所述混合样本之一(而不是另外两个)的特异性靶的有效PCR扩增。

图7显示了源自144个系列稀释的通用参考cDNA的qPCR数据，所述通用参考cDNA以靶向16个不同基因的3个不同标签(标签10、48和89)扩增(实施例3)。数据来自单个96.96阵列。由于所有cDNA样本都是同一样本的稀释物，预期的ΔΔCT为0。96.5％的测定显示出标示出的靶区内的-1至+1个循环的ΔΔCT。144个样本中的5个(约3.5％)的ΔΔCT为1.0至1.4。箭头突出显示两个ΔΔCT为1.3和1.4的最大离群值。对于每个标签/样本稀释物/测定合并物，使用通用参考cDNA从测试ΔCT中减去对照ΔCT基因(Bax)来计算ΔΔCT。

图8显示在购自Fluidigm Corp(South San Francisco，CA)的12.765 Digital Array上的数字化PCR的结果。如实施例4中所述，在多种量的tRNA存在下预扩增人基因组DNA，然后用数字化PCR进行分析。具体而言，使用Qin J.，Jones RC，Ramakrishnan R.(2008)Studying copy number variations using a nanofluidic platform Nucleic Acids Research，Vol.36，No.18 e116中所描述的方案，在GeneAmp PCR系统9700(Applied Biosystems，CA)上将人基因组DNA在25μl反应系(reaction)中进行预扩增，所述25μl反应系包含1×PreAmp master mix(Applied Biosystems，CA)、900nM引物、约10ng的DNA样本和不同量的tRNA。如Qin等人所描述，将样本稀释并在所述数字化阵列上分析。在显示的所有子图中均使用等量的基因组DNA。上面两子图显示阴性对照——不存在tRNA下进行的预扩增，而下面的两对子图显示向预扩增反应混合物中加入2μg/μl或3μg/μl tRNA的效应。很显然，加入tRNA会增加特异性扩增信号并压抑背景。

图9显示了向预扩增反应混合物加入tRNA对特异性扩增曲线质量的影响。图9中显示的曲线来自实施例4中所描述的实验，并且反映了与图8所显示相同的芯片板图的实时PCR曲线。第一子图显示了预扩增混合物中不存在tRNA下的扩增图，第二和第三子图显示了当2μg/μl或3μg/μl的tRNA分别包括在所述预扩增反应混合物中时的影响。所述扩增曲线确证了图8的观察结果，即加入tRNA会增加特异性扩增信号的总量(增加采样数)，并且还显示了加入tRNA会提高扩增的质量(可能是通过提高PCR的效率)。

具体实施方式

本发明提供了用于增加可在单个测定中针对一个或多个靶进行分析的样本数目的方法，还提供了用于增加样本中可被分析的靶数目、同时使测定费用的增加最小化的方法。所述方法特别适合用于增加在矩阵型微流体装置上进行的测定的效率。

应理解，本发明不限于本文描述的具体方法、方案和试剂等，因为这些都可以由本领域技术人员改变。还应理解，本文使用的术语仅用来描述具体示例性实施方案的目的，不是意欲限制本发明的范围。还应注意，除非上下文另有说明，否则本文和所附权利要求书中使用的单数形式“a”、“an”和“所述”包括复数指代对象。因此，例如，提及“a cell”是指一个或多个池及本领域技术人员所知的其等同物。

参考附图所示出和/或以下说明书所详述的非限制性实施方案和实例可更完全地解释本发明的实施方案及其多个特征和详细优点。应注意，在附图中示出的特征不一定是按比例绘制的，并且即使未在本文明确说明，但本领域技术人员可以认识到，一个实施方案的特征可为其他实施方案使用。可以省略对熟知的组件和处理技术的描述，从而不会不必要地使本发明的实施方案令人费解。

定义

除非另有说明，权利要求和说明书中使用的术语按如下所述定义。为了清楚明确地定义这些术语，但是所有的定义都与本领域技术人员对这些术语的理解一致。

术语“邻近的”当在本文中用于指核酸中的两个核苷酸序列时，可以指由0至约20个核苷酸分隔的核苷酸序列，更具体而言，相隔约1至约10个核苷酸的核苷酸序列，或者是彼此直接毗连的序列。此外，若两个引物部分重叠则可称其为邻近的，例如邻近的引物可以重叠约1至约4个核苷酸。

术语“核酸”是指核苷酸聚合物，并且除非另有限制，否则包括可以以与天然存在的核苷酸相似的方式(例如杂交)发挥功能的天然核苷酸的已知类似物。

术语核酸包括任何形式的DNA或RNA，包括例如基因组DNA、互补DNA(cDNA，它是mRNA的DNA代表物，通常通过信使RNA(mRNA)逆转录或者通过扩增得到)、合成或通过扩增产生的DNA分子和mRNA。

术语核酸除了包括单链分子外，还涵盖双链或三链核酸。在双链或三链核酸中，核酸链不需要是共延伸的(coextensive)(即，双链核酸不需要在两条链的全长都是双链的)。

术语核酸还涵盖它的任意化学修饰，例如通过甲基化和/或加帽。核酸修饰可包括将化学基团添加至各个核酸碱基或者至核酸整体，所述化学基团会引入额外的电荷、极性、氢键、静电相互作用和功能性。这样的修饰可包括碱基修饰，例如2位糖修饰、5位嘧啶修饰、8位嘌呤修饰、胞嘧啶环外胺上的修饰和5溴尿嘧啶取代；主链修饰；异常碱基配对组合，例如异碱基(isobase)异胞嘧啶(isocytidine)和异鸟嘌呤(isoguanidine)等。

更具体而言，在一些实施方案中，核酸可包括多脱氧核糖核苷酸(包含2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(包含D-核糖)和为嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任何其他类型核酸，以及其他包含非核苷酸主链的聚合物，例如，聚酰胺(例如，肽核酸(PNA)和聚吗啉(polymorpholino)(可市购自Anti-Virals，Inc.，Corvallis，Oregon，作为Neugene))聚合物，以及满足以下条件的其他合成的序列特异性核酸聚合物，即所述聚合物含有构型使得可进行碱基配对和碱基堆积(例如DNA和RNA中出现的)的核碱基(nucleobase)。术语核酸还涵盖连接的核酸(linked nucleic acid，LNA)，连接的核酸记载于美国专利No.6,794,499、6,670,461、6,262,490和6,770,748中，这些专利就其对LNA的公开内容以引用的方式全文纳入本说明书。

所述核酸可源自完全化学合成方法，例如固相介导的化学合成；可源自生物来源，例如通过从产生核酸的任何物种中分离；或源自涉及通过分子生物学工具操作核酸的方法，例如DNA复制、PCR扩增、逆转录；或者来自以上方法的结合。

本文使用的术语“靶核酸”是指在本发明的方法中要检测的具体核酸。

本文使用的术语“靶核苷酸序列”是指包括靶核酸的核苷酸序列的分子，例如通过扩增靶核酸得到的扩增产物或者在逆转录RNA靶核酸时产生的cDNA。

本文使用的术语“互补”是指两个核苷酸之间精确配对的能力。即，若在核酸给定位置的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸以氢键结合，则认为这两个核酸在该位置是相互互补的。两个单链核酸分子之间的互补可以是“部分的”，其中仅一些核苷酸结合；或者所述互补可以是完全的，此时所述单链分子之间存在整体互补。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著影响。

“特异性杂交”是指在规定的严格条件下，核酸与靶核苷酸序列结合，但基本不与存在于杂交混合物中的其他核苷酸序列结合。本领域技术人员了解，放宽杂交条件的严格度使得会出现序列错配。

在具体的实施例中，杂交在严格杂交条件下进行。短语“严格杂交条件”通常是指比具体序列在规定离子强度和pH下的解链温度(T_m)低约5℃至约20℃或25℃的温度。本文使用的T_m是一群双链核酸分子开始出现半解离成为单链的温度。计算核酸T_m的方法是本领域已知的(参见，例如Berger and Kimmel(1987)METHODS IN ENZYMOLOGY，VOL.152：GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES，San Diego：Academic Press，Inc.和Sambrook et al.(1989)MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，2NDED.，VOLS.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，两篇参考文献都以引用方式纳入本文)。如标准参考文献所指出的，当核酸在1M NaCl的水性溶液中时，T_m值的简单估计值可通过以下等式计算：T_m＝81.5+0.41(％G+C)(参见，例如Anderson and Young，Quantitative Filter Hybridization in NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION(1985))。杂交物的解链温度(以及因此严格杂交的条件)受多种因素影响，例如引物或探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶核酸的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中还是固定的等)，以及盐和其他成分(例如存在或不存在甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇)的浓度。这些因素的影响是已知的并且在本领域标准参考文献中有详述。适于实现大部分序列特异性杂交的示例性严格条件是：至少约60℃的温度和pH7下约0.2摩尔的盐浓度。

术语“寡核苷酸”用于指相对较短的核酸，通常小于200个核苷酸，更特别小于100个核苷酸，尤其特别小于50个核苷酸。一般而言，寡核苷酸是单链DNA分子。

术语“引物”是指这样的寡核苷酸，即其能够与核酸杂交(也称为“退火”)，并且在合适缓冲物和合适温度并在合适条件(即，存在4种不同的核苷三磷酸和聚合试剂，例如DNA或RNA聚合酶或逆转录酶)下作为核苷酸(DNA或RNA)聚合的起始位点。引物的适当长度取决于所述引物的目的用途，但引物的长度一般为至少7个核苷酸，更一般为10至30个核苷酸，甚至更一般为15至30个核苷酸。其他引物可以稍微更长，例如长30至50个核苷酸。在本文中，“引物长度”是指与互补“靶”序列杂交并且引发核苷酸合成的寡核苷酸或核酸部分。短的引物分子通常需要较低的温度来与模板形成足够稳定的杂交复合体。引物不需要反映模板的精确序列，但是必须具有足够互补性以与模板杂交。术语“引物位点”或“引物结合位点”是指引物杂交的靶核酸的区段。

若引物或其部分与另一个核酸内的核苷酸序列杂交，则该引物被称为与所述核酸退火。引物与具体核苷酸序列杂交，这一陈述不是意欲指所述引物完全地或者排他性地与所述核酸序列杂交。例如，在一些实施方案中，本文使用的扩增引物被描述为“与样本特异性核苷酸标签退火”。这种描述涵盖与所述核苷酸标签完全退火的引物，以及部分地与所述核苷酸标签退火并且部分地与邻近的核苷酸序列例如靶核苷酸序列退火的引物。这样的杂合引物可增加扩增反应的特异性。

术语“引物对”是指一组引物，包括与待扩增的DNA序列的5’端的互补区杂交的5’“上游引物”或“正向引物”和与所述待扩增序列的3’端杂交的3’“下游引物”或“反向引物”。如本领技术人员了解的，术语“上游”和“下游”或者“正向”和“反向”不意欲是进行限制，而是在具体实施方案中提供示例性方向。

如果引物对可用于特异性扩增给定扩增混合物中的具体靶核苷酸序列，则将其称为“独特的”。

如果第一引物对被用于扩增第一扩增产物，然后第二引物对被用于扩增位于所述第一扩增产物中的靶核苷酸序列，则第二引物对相对于第一引物对是“嵌套的”。嵌套可用于增加扩增反应的特异性。

“探针”是能够通过一种或多种化学键(通常通过碱基互补配对，一般通过形成氢键)与互补序列的靶核酸结合并因此形成双链结构的核酸。所述探针可与“探针结合位点”结合或杂交。可用可检测标记标记所述探针，以使探针的检测容易进行，特别是当所述探针与其互补靶杂交后。然而，或者所述探针也可以不被标记，而通过与标记的配体的特异性结合直接或间接地检测。探针的大小可有很大变化。一般而言，探针长度至少为7至15个核苷酸。其他探针长可为至少20、30或40个核苷酸。又一些其他探针可略微更长，长为至少50、60、70、80或90个核苷酸。再一些其他探针还可更长，长为至少100、150、200个或更多个核苷酸。探针还可以为上述任意数值界定的范围内的任意长度(例如，长15-20个核苷酸)。

所述引物或探针可与靶核酸序列完全互补，或者可以低于完全互补。在一些实施方案中，所述引物与靶核酸序列的互补区在至少7个核苷酸的一段序列上、更一般在10-30个核苷酸的一段序列上、并且经常在至少14-25个核苷酸的一段序列上，具有至少65％的同一性，更经常具有至少75％的同一性，至少85％的同一性，至少90％的同一性，或者至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。应理解，一些碱基(例如引物的3’碱基)通常最好是与靶核酸序列的相应碱基完全互补。引物和探针一般在严格杂交条件下与所述靶序列退火。

本文使用的术语“核苷酸标签”是指加至靶核苷酸序列的预定核苷酸序列。所述核苷酸标签可编码关于所述靶核苷酸序列的信息项，例如所述靶核苷酸序列的标识、所述序列所来源的染色体或者所述靶核苷酸序列所来源的样本的标识。在一些实施方案中，这样的信息可在一个或多个核苷酸标签中编码，例如，2个核苷酸标签的结合物——靶核苷酸序列一端一个——可编码所述靶核苷酸序列的标识。

如本文使用的术语“编码反应”是指在其中至少一个核苷酸标签被加至靶核苷酸序列的反应。例如，核苷酸标签可通过“编码PCR”加入，在所述编码PCR中至少一个引物包括靶特异性部分和位于所述靶特异性部分的5’端的核苷酸标签，并且第二引物包括仅靶特异性部分或者靶特异性部分和位于所述靶特异性部分5’端的核苷酸标签。可用于编码PCR的示例性PCR方案的实例参见未决WO申请US03/37808以及美国专利No.6,605,451。还可以通过可包括连接反应的“编码连接”反应来加上核苷酸标签，在所述编码连接反应中至少一个引物包括靶特异性部分和位于所述靶特异性部分的5’端的核苷酸标签，并且第二引物包括仅靶特异性部分或者靶特异性部分和位于所述靶特异性部分5端的核苷酸标签。示例性编码连接反应记载于例如美国专利公开文本No.2005/0260640，该专利公开文本以引用的方式全文特别就连接反应纳入本文。编码反应，例如编码PCR，可进行1个循环，这足以加上单个核苷酸标签。或者，编码反应，例如编码PCR，可进行多个循环以预扩增靶核酸(例如以增加浓度)。

本文使用的“编码反应”会产生“带标签的靶核苷酸序列”，它包括连接于靶核苷酸序列的核苷酸标签。

本文使用的术语“样本特异性”核苷酸标签所指的核苷酸标签编码在编码反应中与标签连接或者与之发生连接(becomes linked)的靶核苷酸序列的样本标识。

提及引物的部分时本文使用的术语“靶特异性核苷酸序列”是指在合适的退火条件下可与靶核酸或靶核苷酸序列特异性退火的序列。

“共同的”样本特异性核苷酸标签是指具有特定核苷酸序列的标签，所述核苷酸序列与编码反应中产生的所有靶核苷酸序列连接或者与之发生连接，使得从给定样本产生的所有带标签的靶核苷酸序列每一个均被具有相同序列的标签所识别。

“系列特异性核苷酸标签”是与多个靶核苷酸序列连接或者与之发生连接的标签。在本发明的一些实施方案中，测定混合物可包括多个带标签的靶核苷酸序列，所述序列在其两端具有组合起来唯一地识别每个带标签的靶核苷酸序列的不同的组特异性核苷酸标签。

短语“不同的正向和反向引物系列”是指不同于在测定中使用的任何其他引物系列的引物系列。这样的引物系列可用于引入样本特异性核苷酸标签。

本发明的教导的扩增涵盖通过至少一个靶核酸的至少一部分被复制(一般地以模板依赖的方式)的任何方法，所述方法包括但不局限于用于线性地或指数地扩增核酸序列的大量技术。进行扩增步骤的示例性方法包括连接酶链式反应(LCR)、连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)、Q-复制酶扩增后的连接反应、PCR、引物延伸、链置换扩增(SDA)、超分支连置换扩增(hyperbranched strand displacement amplification)、多重置换扩增(multiple displacement amplification，MDA)、基于核酸链的扩增(NASBA)、2步多重扩增(two-step multiplexed amplification)、滚环扩增(RCA)等，包括其多重形式和结合，例如但不限于OLA/PCR、PCR/OLA、LDR/PCR、PCR/PCR/LDR、PCR/LDR、LCR/PCR、PCR/LCR(还被称作联合链式反应-CCR(combined chain reaction))、数字化扩增等。这类技术的描述可见于Ausbel et al.；PCR Primer：A Laboratory Manual，Diffenbach，Ed.，Cold Spring Harbor Press(1995)；The Electronic Protocol Book，Chang Bioscience(2002)；Msuih et al.，J.Clin.Micro.34：501-07(1996)；The Nucleic Acid Protocols Handbook，R.Rapley，ed.，Humana Press，Totowa，NJ.(2002)；Abramson et al.，Curr Opin Biotechnol.1993 Feb.；4(1)：41-7，美国专利No.6,027,998；美国专利No.6,605,451，Barany et al.，PCT公开文本No.WO 97/31256；Wenz et al.，PCT公开文本No.WO 01/92579；Day et al.，Genomics，29(1)：152-162(1995)，Ehrlich et al.，Science 252：1643-50(1991)；Innis et al.，PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications，Academic Press(1990)；Favis et al.，Nature Biotechnology 18：561-64(2000)；和Rabenau et al.，Infection 28：97-102(2000)；Belgrader，Barany，and Lubin，Development of a Multiplex Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay，Sixth International Symposium on Human Identification，1995(available on the world wide web at：promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html-)；LCR Kit Instruction Manual，Cat.#200520，Rev.#050002，Stratagene，2002；Barany，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：188-93(1991)；Bi and Sambrook，Nucl.Acids Res.25：2924-2951(1997)；Zirvi et al.，Nucl.Acid Res.27：e40i-viii(1999)；Dean et al.，Proc Natl Acad Sci USA 99：5261-66(2002)；Barany and Gelfand，Gene 109：1-11(1991)；Walker et al.，Nucl.Acid Res.20：1691-96(1992)；Polstra et al.，BMC Inf.Dis.2：18-(2002)；Lage et al.，Genome Res.2003 Feb.；13(2)：294-307，and Landegren et al.，Science 241：1077-80(1988)，Demidov，V.，Expert Rev MoI Diagn.2002 Nov.；2(6)：542-8.，Cook et al.，J Mierobiol Methods.2003 May；53(2)：165-74，Schweitzer et al.，Curr Opin Biotechnol.2001 Feb.；12(1)：21-7，美国专利No.5,830,711，美国专利No.6,027,889，美国专利No.5,686,243，PCT公开文本No.WO0056927A3和PCT公开文本No.WO9803673A1等其他出处。

在一些实施方案中，扩增包括以下连续过程的至少一个循环：将至少一个引物与至少一个靶核酸中的互补或基本互补序列退火；用聚合酶以模板依赖的方式合成至少一条核苷酸链；并且使新形成的核酸双链体变性以将链分开。可重复也可不重复所述循环。扩增可包括热循环或者可以在等温下进行。

本文使用的术语“qPCR”是指定量实时聚合酶链式反应(PCR)，也被称作“实时PCR”或“动力学聚合酶链式反应”。

本文使用的术语“数字化扩增”是指在其中对核酸样本例如基因组DNA进行相同的(或基本相似的)扩增反应的扩增方法。一般而言，通常选择进行数字化扩增的核酸的量，使得在将所述核酸分配至离散的反应混合物时，每个单独的扩增反应预期包括一个或少于一个可扩增核酸。任何靶扩增子的浓度(拷贝/μL)与阳性(即包含扩增产物的)反应混合物的数目有关。参见题目为“Method and Apparatus for Determining Copy Number Variation Using Digital PCR”的共同未决美国申请No.12/170,414，就其全部目的，特别是对数字化PCR结果的分析，将其以引用的方式纳入。也可参见Dube等，2008，“ Mathematical Analysis of Copy Number Variation in a DNA Sample Using Digital PCR on a Nanofluidic

“试剂”在广义上是指在反应中使用的除分析物(例如，被分析的核酸)之外的任何试剂。用于核酸扩增反应的示例性试剂包括但不局限于：缓冲物、金属离子、聚合酶、逆转录酶、引物、模板核酸、核苷酸、标记、染料、核酸酶等。用于酶反应的试剂包括例如底物、辅因子、缓冲物、金属离子、抑制剂和激活剂。

本文使用的术语“通用检测探针”是指可识别扩增产物存在的任何探针，无需考虑存在于产物中的靶核苷酸序列的标识为何。

本文使用的术语“通用qPCR探针”是指在qPCR过程中识别扩增产物存在的任何这类探针。在具体实施方案中，本发明的核苷酸标签可以包括检测探针例如通用qPCR探针可结合的核苷酸序列。如果标签被加至靶核苷酸序列的两端，则每个标签视所需均可包括被检测探针识别的序列。此类序列的结合物可编码有关带标签的靶核苷酸序列的标识、染色体来源或者样本来源的信息。在其他实施方案中，一个或多个扩增引物可以包括检测探针例如通用qPCR探针可结合的核苷酸序列。用这种方式，在本发明的方法的扩增步骤中可将1个、2个或更多个探针结合位点加入到扩增产物中。本领域技术人员了解，在预扩增(若进行)和扩增中引入多个探针结合位点的可能性有利于多重检测，其中可在给定的扩增混合物或其等分试样中检测2个或更多个不同的扩增产物。

术语“通用检测探针”还意欲涵盖被可检测标记(例如荧光标记)以及非序列特异性探针例如DNA结合染料(包括双链DNA(dsDNA)染料例如SYBR绿)标记的引物。

本文使用的术语“靶特异性qPCR探针”是指可在qPCR过程中识别扩增产物存在的qPCR探针，所述识别基于所述qPCR探针与存在于所述产物中的靶核苷酸序列的杂交。

“水解探针”一般性地记载于美国专利No.5,210,015中，该专利就其对水解探针的描述以引用的方式全文纳入本文。水解探针利用了存在于一般用在PCR反应中的热稳定Taq聚合酶(

probetechnology，Applied Biosystems，Foster City CA)的5’核酸酶活性。所述水解探针被荧光检测染料如荧光素和受体染料或猝灭物标记。一般而言，所述荧光染料共价连接至探针的5’端，所述猝灭物连接至探针的3’端，并且当探针完整时，检测染料的荧光由荧光共振能量转移(FRET)猝灭。所述探针在PCR反应中与界定所述靶核苷酸一端的引物之一的下游退火。使用Taq酶的聚合酶活性，所述靶核酸的扩增由所述探针的上游的一个引物和在所述探针下游、但与所述靶核酸相对的链退火的第二引物指导。随着上游引物延伸，所述Taq聚合酶到达所述带标签的探针退火的区域，将所述探针-模板杂合体识别为底物，并且水解所述探针的磷酸二酯键。所述水解反应不可逆地解除了猝灭物染料对报告染料的猝灭效应，因此导致检测物荧光随着每个后续PCR循环而增加。具体而言，适用于本发明的水解探针能够检测8-mer或9-mer基序，所述8-mer或9-mer基序是人和其他的基因组和/或转录组中常见的，并且可以具有由使用连接的核酸(LNA)类似物引起的约70℃的高T_m。

本文使用的术语“标记”是指可用于提供可检测和/或可定量信号的任何原子或分子。具体而言，所述标签可直接或间接地连接至核酸或蛋白质。可连接至探针的合适标记包括但不限于放射性同位素、荧光团、生色团、质量标记(mass label)、电子致密颗粒(electron dense particle)、磁性颗粒、自旋标记、发出化学发光的分子、电化学活性分子、酶、辅因子和酶底物。

本文使用的术语“染料”在广义上是指吸收波长大于或等于340nm的电磁辐射的任何有机或无机分子。

本文使用的术语“荧光染料”在广义上是指在电磁辐射源——例如灯、光敏二极管或激光——辐照时可通过荧光机制发出较长波长的电磁辐射的任何染料。

术语“弹性体”具有本领中使用的广义含义。因此，例如Allcock等人(Contemporary Polymer Chemistry，2nd Ed.)将弹性体在广义上描述为处于其玻璃化转变温度和液化温度之间的温度的聚合物。弹性材料表现出弹性特征，这是因为聚合物链容易发生扭转运动，以使主链对力做出反应而伸展，同时主链重新卷曲以在没有力时恢复先前的形状。总之，弹性体在施加力时变形，但是随后在除去力时回到其初始形状。

“多态性标记物”或“多态性位点”是出现核苷酸序列趋异的基因座。示例性标记物有至少2个等位基因，每个出现的频率均大于选择群体的1％，并且更一般大于选择群体的10％或20％。多态性位点可以小至1个碱基对。多态性标记物包括限制性片段长度多态性(RFLP)、不定数串列重复(VNTR)、超变区、小卫星、二核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、简单序列重复、缺失和插入元件例如Alu。首个鉴定出的等位基因形式被任意地指定为参考形式，其他等位基因形式被指定为可选的或变异的等位基因。在选择群体中最经常出现的等位基因形式有时被称为野生型形式。对于等位基因形式，二倍体生物可以是纯合的或杂合的。二等位基因多态性有两种形式。三等位基因多态性有三种形式。

“单核苷酸多态性”(SNP)出现在由单个核苷酸占据的多态性位点，所述多态性位点是等位基因序列之间的差异位点。所述位点通常在其前面或后面有所述等位基因的高度保守序列(例如在少于1/100或1/1000群体成员中变化的序列)。SNP通常由于在多态性位点处一个核苷酸为另一个核苷酸所代替而产生。转换是一个嘌呤被另一个嘌呤代替，或者一个嘧啶被另一个嘧啶代替。颠换是一个嘌呤被一个嘧啶代替，反之亦然。SNP还可发生自相对于参考等位基因缺失核苷酸或插入核苷酸。

在多个样本中检测多个靶核酸

总论

在多个实施方案中提供了用于检测多个样本中的多个靶核酸(即T个靶核酸，其中T是大于1的整数)的方法。在一些实施方案中，所述方法需要提供在测定前混合在一起(即合并)的S个样本，其中S是大于1的整数。对这些样本的每一个分别进行编码反应，所述编码反应产生一系列T个带标签的靶核苷酸序列，其中每个核苷酸标签编码关于具体靶核酸的标识和/或样本来源的信息。对于这些S个样本的每一个(即，待合并的样本的每一个)，将所述带标签的靶核苷酸序列混合形成测定混合物。以该方式，可成批地测定样本，因此若例如48个样本待分析，则S可以是例如3，这意味着可以制备16份测定混合物以检测16个不同的靶。所述第一份测定混合物可包括例如来自样本1-3的带标签的靶核苷酸序列，第二份测定混合物可包括例如来自样本4-6的带标签的靶核苷酸序列，以此类推。参见实施例1。然后进行扩增步骤，从而用会与所述至少一个核苷酸标签退火的至少一个引物扩增所述带标签的靶核苷酸序列。

如果需要更高的特异性，一个或两个扩增引物可包括与所述与所述核苷酸标签邻近的靶核苷酸互补的一个或多个核苷酸，即可使用除了包括标签特异性序列还包括靶特异性序列的杂合扩增引物。在一些实施方案中，所述靶特异性序列在所述引物中标签特异性序列的3’端。

基本上，本文描述的方法可用于检测与需要数量的样本中相同数量的靶。然而，测定形式通常决定了检测总数，所述检测可以例如通过使用多于1种类型的标记常规地而非多重地进行。如下文所详细讨论的，可将测定混合物等分，用于在例如微量滴定板上或者更一般在矩阵型微流体装置上分别扩增。在具体的实施方案中，S(混合的样本的数目)×T(靶的数目)限定了测定混合物等分试样的数目，该数目对于在具有相应数目的分离反应室的矩阵型微流体装置上的分析可以是例如30、48、96、120或192。在示例性实施方案中，在单个测定中测定的样本总数×T的积至少是选自2304、3600、4608和9216的数值。如本领域技术人员了解的，通过多重化，例如通过使用多个标记在给出等分试样中进行多重检测，可以实现额外的通量增加。

用一个样本特异性核苷酸标签对靶核苷酸序列加标签

在具体的实施方案中，每个带标签的靶核苷酸序列均包括样本特异性核苷酸标签和靶核苷酸序列。在这类实施方案中，使用S×T对独特的扩增引物扩增所述测定混合物或其等分试样，其中每对扩增引物包括：

会与靶核苷酸序列退火的正向或反向扩增引物；和

会与样本特异性核苷酸标签退火的各自的反向或正向扩增引物。扩增因此取决于具有具体靶核苷酸序列和具体样本特异性标签的带标签靶核苷酸序列的存在。因此，包括这些核苷酸序列的扩增产物的产生指示具体样本中的具体靶核酸的存在和量(若使用定量检测)。

使用能够检测与具体样本特异性标签结合的靶核苷酸序列存在的任何方法，可以检测独特的引物对的扩增产物的存在或量。为了易于检测，通过将测定混合物分为最多达S×T个扩增混合物并用独特的扩增引物对分别扩增每个扩增混合物，可以对其进行分析。在该情形下，扩增产物在具体等分试样中的存在或量指示与所述样本特异性核苷酸标签相对应的样本中所述靶特异性引物相对应的靶核酸的存在或量。

所述样本特异性核苷酸标签的核苷酸序列编码样本标识。从给定样本中产生的全部带标签的靶核苷酸序列可用共同的样本特异性核苷酸标签——即具有相同核苷酸序列的标签——加标签。或者，可用不同的样本特异性核苷酸标签对测定混合物中的每个靶核苷酸序列加标签，即，使得在所述测定混合物中的每个带标签的靶核苷酸序列携带具有不同核苷酸序列的样本特异性核苷酸标签。因此，如果在一个测定混合物中有三个将被合并用于分析16个靶的样本，那么可使用标签1-16识别来自样本1的靶核酸序列，可使用标签17-32来识别来自样本2的靶核酸序列，可使用标签32-48来识别来自样本3的靶核酸序列。如本领域技术人员了解的，可使用标签系列，使得来自给定样本的一些但不是全部靶核苷酸序列共用共同的标签。因此，例如可使用标签1来识别来自样本1的靶核酸序列1-4，可使用标签2来识别来自样本1的靶核酸序列5-8，可使用标签3来识别来自样本1的靶核酸序列9-12，可以使用标签4来识别来自样本1的靶核酸序列13-16。在这种情况下，标签1-4可识别样本1的靶核酸序列，类似的标签系列(例如标签5-8和标签9-12)可识别样本2和3的靶核酸序列。

在该方法的示例性实施方案中，所述编码反应需要使用针对每个样本的不同正向和反向预扩增引物系列分别预扩增所述S个样本的每一个来产生预扩增的样本，其中每个预扩增引物系列包括T对正向和反向预扩增引物，其中每对预扩增引物能够扩增具体的靶核酸。此外，在给定系列中的所有正向预扩增引物或所有反向预扩增引物均包括样本特异性核酸标签，所述标签可以是、但不必是共同的样本特异性核苷酸标签。所述样本特异性核苷酸标签通常在所述引物中所述靶特异性核苷酸序列的5’端。

将所述S个样本的每一个的预扩增样本混合形成测定混合物(例如，待一起分析的每个样本系列一个测定混合物)。然后，可以如上文所述分析所述测定混合物。系列中的每个正向预扩增引物除包括靶特异性核苷酸序列外还可以包括样本特异性核苷酸标签，所述系列中每个反向预扩增引物可包括靶特异性核苷酸序列。或者，系列中的每个正向预扩增引物可包括靶特异性核苷酸序列，每个系列中的每个反向预扩增引物除包括靶特异性核苷酸序列外还可包括样本特异性核苷酸标签。

用2个核苷酸标签对靶核苷酸序列加标签

在具体的实施方案中，每个带标签的靶核苷酸序列包括与靶核苷酸序列连接的第一核苷酸标签，所述靶核苷酸序列与第二核苷酸标签连接。在这类实施方案中，用S×T对独特的扩增引物对所述测定混合物或其等分试样进行扩增，其中每对扩增引物包括：

会与第一核苷酸标签退火的正向或反向扩增引物；和

会与第二核苷酸标签退火的各自的反向或正向扩增引物。扩增因此取决于具有合适标签组合的带标签的靶核苷酸序列的存在。

所述核苷酸标签的核苷酸序列可以用上文对于使用单样本特异性标签的实施方案所描述的多种方式编码样本标识。换句话说，可以用共同的样本特异性核苷酸标签对从给定样本中产生的所有带标签的靶核苷酸序列加标签。或者，可以用不同的样本特异性核苷酸标签对测定混合物中的每个靶核苷酸序列加标签，或者可以使用标签系列，使得来自给定样本的一部分但非全部靶核苷酸序列共用共同的标签。由于使用了两个标签，可组合使用任意这些策略。例如，一个标签可以是给定样本产生的所有带标签的靶核苷酸序列共同的样本特异性标签，而另一个标签对于测定混合物中的每个带标签的核苷酸序列可以是不同的。在一些高特异性的实施方案中，测定混合物中的每个标签与所述混合物中的每个其他标签均是不同的(核苷酸序列不同)。

在该加双重标签方法的示例性实施方案中，所述编码反应需要使用针对每个样本的不同正向和反向预扩增引物序列分别预扩增所述S个样本的每一个来产生预扩增的样本，其中每个预扩增引物系列包括T对正向和反向预扩增引物(即，每个靶一对)，其中每个预扩增引物对能够扩增具体的靶核酸。此外，每个正向预扩增引物包括正向核苷酸标签，并且每个反向预扩增引物包括反向核苷酸标签。这些标签通常在引物中靶特异性核苷酸序列的5’端。

将所述S个样本的每一个的预扩增样本混合形成测定混合物(例如，待一起分析的每个样本系列一个测定混合物)。然后，通过如上文总体所述的扩增分析所述测定混合物。每对扩增引物包括：

会与正向核苷酸标签退火的正向扩增引物；和

会与反向核苷酸标签退火的反向扩增引物。

通过组合加标签检测多个靶核酸

本发明还提供了可用于检测样本中的多个靶核酸的双重加标签方法。该方法需要向样本提供T个正向预扩增引物，其中T是待检测靶的数目。每个正向预扩增引物均包括不同的靶特异性核苷酸序列和系列特异性核苷酸标签。所述系列特异性核苷酸标签通常在所述靶特异性核苷酸标签的5’端。使用X个不同的正向系列特异性核苷酸标签，X是大于1小于T的整数。因此，T/X个引物包括相同的正向系列特异性核苷酸标签。

还向所述样本提供了T个反向预扩增引物。每个反向预扩增引物均包括不同的靶特异性核苷酸序列和反向系列特异性核苷酸标签。所述系列特异性核苷酸标签通常在所述靶特异性核苷酸标签的5’端。使用Y个不同的反向系列特异性核苷酸标签，Y是大于1小于T的整数。因此，T/X个引物包括相同的反向系列特异性核苷酸标签。

对所述样本进行预扩增，以生产测定混合物，其中针对具体靶产生的任何预扩增产物引入了独特的正向和反向系列特异性核苷酸标签的组合。然后进行扩增步骤，由此通过扩增引物——即可与存在于具体带标签的核苷酸序列中的核苷酸标签退火的扩增引物——的合适组合扩增所述带标签的靶核苷酸序列。

因此，当制备了X+Y个引物时，可在单个测定中分析X×Y个靶。例如，如果X和Y均是100，则仅需要合成200个引物来检测10,000个靶核酸。

在该方法的示例性实施方案中，所述扩增通过如下方式进行：将所述测定混合物分为T个扩增混合物，并使用独特的扩增引物对分别扩增所述扩增混合物的每一个。每对扩增引物包括：

会与所述反向系列特异性核苷酸标签退火的反向扩增引物。

对于每对独特的引物，确定扩增产物在所述扩增混合物或其等分试样中的存在或量。扩增产物的存在指示具体靶核酸在样本中的存在。

基本上，本发明的方法可用于检测与需要数量的样本中相同数量的靶。然而，测定形式通常决定了检测总数，所述检测可以例如通过使用多于1种类型的标记常规地而非多重地进行。在具体的实施方案中，可将测定混合物等分，用于在例如微量滴定板上或者更一般在矩阵型微流体装置上分别扩增。目前的微流体装置设计为使其成为这样的测定，即在所述测定中X或Y至少是选自12、24、48和96的数值，其中T(检测的靶的数目)至少是选自384、576、768、1152、2304、3600、4608和9216的数值。如本领域技术人员了解的，通过多重化，例如通过使用多个标记在给出等分试样中进行多重检测，可以实现额外的通量增加。

本发明还考虑上述加标签方法的组合。

检测多个靶核酸——模块化方法

本发明还提供用于检测样本中的多个靶核酸的方法，其中所述待检测的靶核酸被分为多个系列或“模块”，每个模块的靶核酸用相同系列的核苷酸标签对加标签。在每个模块内，标签对系列彼此不同，但对于每个模块使用相同的标签对系列。然后，可通过用与所述标签对系列退火的引物对系列扩增每个模块进行检测。

更具体而言，在一些实施方案中，所述方法需要将样本分为R个等分试样，其中R是大于1的整数(例如96)。可对所述R个等分试样的每一个分别进行编码反应，所述编码反应产生一系列T个带标签的靶核苷酸序列，其中T是每等分试样中待检测的靶核酸的数目，T是大于1的整数(例如96)。每个带标签的靶核苷酸序列包括在靶核苷酸序列5’端的第一核苷酸标签、靶核苷酸序列和在所述靶核苷酸序列3’端的第二核苷酸标签。所述T个带标签的靶核苷酸序列的每一个中的核苷酸标签的组合对于每个等分试样中的每个带标签的靶核苷酸序列是独特的。然而，相同系列的第一和第二核苷酸标签组合被用于所述等分试样的每一个的编码反应中。因此，在一些实施方案中，所述T个带标签的靶核苷酸序列的每一个中的核苷酸标签组合存在于其他等分试样的每一个中的带标签的靶核苷酸序列中，但每个标签组合可连接于不同的靶核苷酸序列。因此，在具体的实施方案中，所述编码反应可产生最多达R×T(例如96×96＝9216)个不同的带标签的核苷酸序列，因此允许进行R×T(如9216)个测定。

可通过以下方式对所述带标签的靶核苷酸序列进行检测：对每个等分试样使用针对每个等分试样的相同系列的T对不同扩增引物分别进行扩增，每对引物均包括会与每个带标签的靶核苷酸序列中的所述第一核苷酸标签退火的第一引物和会与其中的所述第二核苷酸标签退火的第二引物。每个等分试样中与每对独特的引物相应的扩增产物的存在指示具体靶核酸在所述样本中的存在。

在一些实施方案中，在扩增前，可将每个等分试样分为T个亚等分试样。然后，将一系列T对不同的扩增引物中的一个可与每个亚等分试样结合，并且可对所述亚等分试样分别进行扩增反应。

在示例性实施方案中，所述编码反应可以是预扩增反应，所述预扩增反应可在微流体装置上进行。为了在编码前增加靶核酸浓度，可在编码预扩增反应前进行可选的前预扩增反应。所述前预扩增反应可以多重化进行。例如，在一个混合物中可以使用针对9216个不同的靶核酸的靶特异性引物。然后，可将该混合物分为R＝96个等分试样，并且使用T＝96对不同的引物将每个等分试样在微流体装置上进行编码预扩增反应，所述引物对可将96对不同的核苷酸标签加至所述96个等分试样的每一个的靶核苷酸序列。为了增加特异性，用于预扩增的引物相对于用于前预扩增的引物可以是嵌套的。

在编码预扩增反应后，可在微流体装置的分开的室中进行扩增。例如，可将编码预扩增时产生的96个等分试样的每一个加样至矩阵型微流体装置的各个样本管线中，并且可将96个不同的标签特异性引物组合的每一个加样至各个测定柱中。所述96个引物组合的每个不同组合均可扩增所述96个等分试样的每一个中的不同靶核苷酸。然后，可以将得到的9216个反应室(亚等分试样)进行扩增，随后检测扩增产物，这可通过任何合适的方法进行，所述方法包括SYBR绿、通用探针库、每个标签组合使用一个探针(例如，其中探针序列被引入至核苷酸标签中)以及使用荧光引物来添加核苷酸标签。

在具体的实施方案中，该模块化方法是高度灵活的，并且可以很容易地由另外的靶(例如，另外96个靶)扩展。因此它适用于测定板。

样本核酸

核酸(“样本”)制品可获自生物来源，并且用本领域已知的常规方法制备。具体而言，本文所述的方法中可用的DNA或RNA可从任何来源提取和/或扩增，所述来源包括细菌、原生动物、真菌、病毒、细胞器以及高等生物，所述高等生物如植物或动物，尤其是哺乳动物，更尤其是人。合适的核酸还可获自环境来源(例如池塘水)、人造产物(例如食物)、法医样本等。核酸可通过多种标准技术的任一种从细胞、体液(例如血液、血液级分、尿液等)或组织样本中提取或扩增。示例性的样本包括血浆、血清、脊髓液、淋巴液、腹膜液、脑膜液、口腔液和皮肤外部切片的样本；来自呼吸系统、肠道、生殖道和尿道的样本；泪水、唾液、血细胞、干细胞或肿瘤的样本。例如，胎儿DNA样本可从胚胎(例如从一个或多个胚胎细胞或胎儿细胞)或从母亲血液中得到。样本可以从活的或死亡的生物体或者从体外培养物中得到。示例性的样本可包括单细胞、石蜡包埋的组织样本和针吸活检物。可用于本发明的核酸还可以来自于一个或多个核酸库，包括cDNA、黏粒、YAC、BAC、P1、PAC库等。

可使用本领域熟知的方法分离需要的核酸，具体方法的选择根据核酸的来源、性质以及类似因素。所述样本核酸可不需要是纯化形式，但是一般应足够纯以使本发明方法的扩增步骤能够进行。当靶核酸是RNA时，可通过本领域已知的标准方法和如例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，Vol.1，2，3(1989)所述将所述RNA逆转录为cDNA。然后，可通过本发明的方法分析所述cDNA。

靶核酸

可在本发明(本文所述)的编码反应中加标签的任何靶核酸均可使用本发明的方法进行检测。在一般的实施方案中，对于靶核酸至少知道一些核苷酸序列信息。例如，如果使用的编码反应是PCR，那么对于给定靶核酸的每个末端通常应获得足够的序列信息，以使得能够设计合适的扩增引物。

所述靶可包括例如与病原体相关的核酸，所述病原体如病毒、细菌或真菌；RNA，例如过表达或表达不足指示疾病的RNA、以组织特异性或发育特异性方式表达的RNA或由具体刺激物诱导的RNA；基因组DNA，可在例如基因分型中对其分析具体的多态性(如SNP)、等位基因或单倍型的基因组DNA。特别关注的是在遗传疾病或其他病理学中改变(例如扩增、缺失和/或突变)的基因组DNA；与希望或不希望性状相关的序列；以及/或者可唯一地识别个体的序列(例如在法医或亲子关系测定中)。

引物设计

适用于核酸扩增的引物应足够长以在聚合试剂存在下引发延伸产物的合成。所述引物的确切长度和组成将取决于很多因素，包括例如退火反应的温度、引物的来源和组成以及在何处使用探针、探针退火位点与引物退火位点的邻近情况和引物：探针浓度的比例。例如，依赖于所述靶核酸序列的复杂性，寡核苷酸引物一般包含约15至约30个核苷酸，但它可包含更多或更少的核苷酸。所述引物应是足够互补的，以选择性地与其各自的链退火并形成稳定的双链体。本领域技术人员知道如何选择合适的引物对来扩增需要的靶核酸。

例如，通过使用任意市售的软件或开源软件，如Primer3(参见，例如Rozen and Skaletsky(2000)Meth.Mol.Biol.，132：365-386；www.broad.mit.edu/node/1060，等)或者通过登录Roche UPL网站，可以设计PCR引物。将所述扩增子序列输入Primer3程序，同时将UPL探针序列加括号以确保Primer3程序会在括号内的探针序列任一边设计引物。

引物可通过任何合适的方法制备，所述方法包括例如对合适序列克隆和限制性酶切或是通过例如如下的直接化学合成：Narang et al.(1979)Meth.Enzymol.68：90-99的磷酸三酯法、Brown et al.(1979)Meth.Enzymol.68：109-151的磷酸二酯法、Beaucage et al.(1981)Tetra.Lett.，22：1859-1862的二乙基亚磷酰胺法和美国专利No.4,458,066的固体支持法等；或者可由市售来源提供。

可通过使用Sephadex柱(Amersham Biosciences，Inc.，Piscataway，NJ)或本领域技术人员已知的其他方法纯化引物。引物纯化可提高本发明方法的敏感性。

微流体装置

在一些实施方案中，本发明的任一方法可使用微流体装置进行。在示例性实施方案中，矩阵型微流体装置使得能将多个底物溶液和试剂溶液在分开的分离反应室中同时结合。应了解，底物溶液可包括一个或多个底物，并且试剂溶液可包括一个或多个试剂。例如，所述微流体装置可使得多个不同的扩增引物和样本同时成对结合。在一些实施方案中，所述装置被配置为在所述不同室的每一个中包括不同组合的引物和样本。在多个实施方案中，分开的反应室的数目可以超过50个，通常超过100个，更经常超过500个，甚至更经常超过1000个，有时超过5000个，或超过10000个。

在具体的实施方案中，所述矩阵型微流体装置是动态阵列(“DA”)微流体装置。DA微流体装置是这样的矩阵型微流体装置，即该装置被设计来分离成对组合的样本和试剂(例如扩增引物、检测探针等)并且适用于进行定性和定量PCR反应，包括实时定量PCR分析。在一些实施方案中，所述DA微流体装置至少部分由弹性体制造。DA记载于PCT公开文本WO05107938A2(Thermal Reaction Device and Method For Using The Same)和美国专利公开文本US20050252773A1中，两篇文献就其对DA的描述以引用的方式全文纳入本文。DA可整合高密度矩阵设计，所述设计利用所述微流体装置的层间流体连通过孔(via)来使控制管线和流体管线穿行通过所述装置和在层间穿行。由于弹性体块多层中的流体管线，因此能够进行高密度反应池排布。或者，DA可被设计，使得所有的试剂和样本通道在相同弹性体层中，而对照通道在不同的层中。

美国专利公开文本No.2008/0223721和PCT公开文本No.WO05/107938 A2描述了可用于实施本文描述的方法的示例性矩阵型装置。PCT公开文本No.WO05/107938 A2中的图21被翻印为图1，示出了示例性矩阵设计，所述设计具有第一弹性体层2110(第一层)和第二弹性体层2120(第二层)，每层均具有在其中形成的流体通道。例如，第一层2110中的试剂流体通道与第二层2120中的试剂流体通道通过过孔2130连接，而第二层2120还在其中有样本通道，所述样本通道和所述试剂通道分别终止于样本和试剂室2180。所述样本和试剂室2180通过接口通道2150彼此流体连通，所述接口通道2150具有与其相连的接口阀2140来控制每个反应池2160的室2180之间的流体连通。在使用中，所述接口首先关闭，然后将试剂从所述试剂入口引入所述试剂通道，并且将样本通过所述样本入口引入样本通道；然后关闭控制阀2170将每个反应池2160与其他反应池2160隔离。一旦反应池2160被隔离，就打开接口阀2140以使样本室和试剂室可相互流体连通，使得所需的反应可以发生。由此(以及WO 05/107938 A2中的描述)可见，DA可用于使M数目的不同样本和N数目的不同试剂反应。

尽管上文描述的WO 05/107938中的DA非常适于进行本文描述的方法，但是本发明并不限于任何具体的装置或设计。可以使用任何隔开样本并且/或者可使试剂和样本独立地成对组合的装置。美国专利公开文本No.20080108063(其以引用的方式全文纳入本文)包括显示48.48动态阵列的图，该48.48动态阵列是可获自Fluidigm Corp(South San Francisco Calif.)的市售装置。应理解，其他构造是可能的且被考虑，例如48×96、96×96和30×120等。

在具体的实施方案中，所述微流体装置可以是数字化阵列微流体装置，该装置被改造以进行数字化扩增。这类装置可具有将样本和试剂的混合物分隔至纳升体积的反应室的连成一体的通道和阀门。在一些实施方案中，所述数字化阵列微流体装置至少部分地由弹性体制成。示例性数字化阵列微流体装置记载于Fluidigm，Inc拥有的共同未决美国申请中。一个示例性实施方案具有与通往所述装置的12个分离的样本输入对应的12个输入端口。所述装置可以有12个板，并且所述12个板中的每一个板可以包含765个6nL反应室，每板总体积为4.59μL。微流体通道可将所述板上的多个反应室与流体源连接起来。可以向存储器(accumulator)施加压力，以开放和关闭连接反应室与流体源的阀。在示例性实施方案中，可提供12个入口，用于所述样本试剂混合物的上样。可使用48个入口来提供试剂源，在向存储器施加压力时所述试剂被提供给所述微流体装置。此外，可提供2个或更多入口来向所述微流体装置提供水合作用。水合入口与所述装置流体连通，以有利于控制与反应室相关的湿度。本领域技术人员可以理解的是，可用于制造所述装置的一些弹性体材料是透气的，使得从反应室中蒸发的气体或蒸气可穿过弹性体材料进入周围大气中。在一个具体的实施方案中，位于所述装置周边部分的流体管线在围绕反应室板的微流体装置周边部分处提供了水合液体例如缓冲液或预混合物的保护物，从而减少或防止存在于所述反应室中的液体蒸发。因此，可通过向水合入口加入挥发性液体例如水来增加所述装置周边的湿度。在一个具体实施方案中，第一入口与围绕所述装置第一侧的板的水合流体管线流体连通，并且第二入口与围绕所述装置另一侧的板的所述水合流体管线流体连通。

尽管所述数字化阵列微流体装置十分适用于进行本文所述的数字化扩增方法，但本领域普通技术人员了解这些装置的许多变体和替代物。可从Fluidigm Corp.(South San Francisco，CA)购买的12.765数字化阵列的微流体装置包括12个板，每个板有765个反应室，每个反应室体积为6nL。然而，该几何形状对于数字化扩增方法不是所要求的。给定的数字化阵列微流体装置的几何形状将取决于具体的应用。与适用于本文描述的方法有关的装置的其他描述在美国专利申请公开文本No.2005/0252773中提供，所述专利申请就其数字化阵列微流体装置的公开内容以引用的方式纳入本文。

在一些实施方案中，本文描述的方法可使用提供反应产物回收的微流体装置进行。这样的装置详细记载于2009年4月2日提交的共同未决美国申请No.61/166,105中，所述申请以引用的方式全文纳入本文，特别是就其对可使反应产物回收的微流体装置和相关方法的描述。例如，可在这样的装置上在测序前进行校准DNA样本的数字化PCR方法，使得可以回收扩增产物，所述扩增产物然后可作为DNA测序的模板。

使用弹性体材料的制造方法以及用于设计装置及其组件的方法已详细记载于科学文献和专利文献中。参见，例如Unger et al.，2000，Science 288：113-16；美国专利No.US 6,960,437(利用微流体装置扩增核酸)、6,899,137(微制造的弹性体阀和泵系统)、6,767,706(一体化的活性焊剂(active flux)微流体装置和方法)、6,752,922(微流体层析)、6,408,878(微制造的弹性体阀和泵系统)、6,645,432(包含三维排列的通道网的微流体系统)；美国专利申请公开文本No.2004/0115838、20050072946、20050000900、20020127736、20020109114、20040115838、20030138829、20020164816、20020127736和20020109114；PCT公开文本No.WO 2005/084191、WO05030822A2和WO01/01025；Quake & Scherer，2000，″From micro to nanofabrication with soft materials″Science 290：1536-40；Unger et al.，2000，″Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography″Science 288：113-116；Thorsen et al.，2002，″Microfluidic large-scale integration″Science 298：580-584；Chou et al.，2000，″Microfabricated Rotary Pump″Biomedical Microdevices 3：323-330；Liu et al.，2003，″Solving the″world-to-chip″interface problem with a microfluidic matrix″Analytical Chemistry 75，4718-23，Hong et al，2004，″A nanoliter-scale nucleic acid processor with parallel architecture″Nature Biotechnology 22：435-39。

美国专利公开文本No.20080223721和PCT公开文本No.WO05107938A2描述了可用于实施本发明的示例性矩阵型装置。WO05107938A2的图21被翻印为图1。图1描述了示例性矩阵设计，所述设计具有第一弹性体层2110(第一层)和第二弹性体层2120(第二层)，每层均具有在其中形成的流体通道。例如，第一层2110中的试剂流体通道与第二层2120中的试剂流体通道通过过孔2130连接，而第二层2120还在其中有样本通道，所述样本通道和所述试剂通道分别终止于样本和试剂室2180。所述样本和试剂室2180通过接口通道2150彼此流体连通，所述接口通道2150具有与其相连的接口阀2140来控制每个反应池2160的室2180之间的流体连通。在使用中，所述接口首先关闭，然后将试剂从所述试剂入口引入所述试剂通道，并且将样本通过所述样本入口引入样本通道；然后关闭控制阀2170将每个反应池2160与其他反应池2160隔离。一旦反应池2160被隔离，就打开接口阀2140以使样本室和试剂室可相互流体连通，使得所需的反应可以发生。由此(以及WO 05/107938 A2中的描述)可见，DA可用于使M数目的不同样本和N数目的不同试剂反应。

尽管上文描述的WO 05/107938中的DA非常适于进行本发明的测定，但是本发明并不限于任何具体的装置或设计。可以使用任何隔开样本并且可使试剂和样本独立地成对组合的装置。美国专利公开文本No.20080108063(其以引用的方式全文纳入本文)包括显示48.48动态阵列的图，该48.48动态阵列是可获自Fluidigm Corp(South San Francisco Calif.)的市售装置。应理解，其他构造是可能的且被考虑，例如：48×96、96×96和30×120等。

根据本发明的一些实施方案，从一个或多个样本检测并且/或者定量一个或多个靶核酸通常可在微流体装置上通过以下方式进行：获取样本；可选预扩增所述样本；并将所述预扩增的样本的等分试样分到微流体装置的反应室中，其中包含合适的缓冲物、引物、可选的探针和酶；扩增这些混合物；并且检查所述等分试样中是否存在扩增的靶核酸。所述样本等分试样的体积可为约1皮升至约500纳升，约100皮升至约20纳升，约1纳升至约20纳升，或者为约5纳升至约15纳升。

在一些实施方案中，在单独的扩增混合物中——例如在矩阵型微流体装置的单独的反应室中——进行多重检测，所述多重检测可被用于进一步增加可在单个测定中分析的样本和/或靶的数目，或者用于进行比较方法例如多位点的比较基因组杂交(CGH)样分析。

在具体的实施方案中，所述测定通常具有至少3个数量级的动态范围，更经常是至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个数量级。

定量实时PCR以及其他检测和定量方法

任何检测和/或定量核酸的方法均可在本发明中来检测扩增产物。在一个实施方案中，PCR(聚合酶链式反应)被用于扩增和/或定量靶核酸。在该实施方案的变化方案中，可使用数字化PCR。在另一些实施方案中，可使用其他扩增系统或检测系统，包括例如记载于美国专利No.7,118,910(就其对扩增/检测系统的描述以引用的方式全文纳入本文)的系统和侵入测定(Invader assay)；PE BioSystems。在具体的实施方案中，使用了实时定量方法。例如，可使用“定量实时PCR”方法来通过测量在扩增过程本身期间形成的扩增产物的量来确定存在于样本中的靶核酸的量。

荧光核酸酶测定是可成功地用于本文描述的方法的实时定量方法的一个具体实例。这种监测扩增产物形成的方法包括使用双重标记的荧光寡核苷酸探针连续测量PCR产物积聚——在文献中经常被称作

法”。参见美国专利No.5,723,591；Heid et al.，1996，Real-time quantitative PCR Genome Res.6：986-94，每篇文献均就其对荧光核酸酶测定的描述通过引用的方式全文纳入本文。应理解，虽然

探针”广泛用于qPCR，但本发明并不限于使用这些探针；任何合适的探针均可使用。

可用于本发明的其他检测/定量方法包括FRET和模板延伸反应、分子信标检测、蝎检测(Scorpion detection)、侵入检测(Invader detection)和扣锁探针检测(padlock probe detection)。

FRET和模板延伸反应利用了供体/受体对的一个成员标记的引物和所述受体/供体对的另一个成员标记的核苷酸。在模板依赖的延伸反应期间在所述标记的核苷酸被参入所述引物之前，所述供体和受体之间相距足够远以使能量传递不能发生。然而，如果所述标记的核苷酸被参入所述引物中且所述距离足够近，那么能量转移发生并且可被检测。这些方法尤其可在单核苷酸多态性检测中用于进行单碱基对延伸反应，记载于美国专利No.5,945,283和PCT公开文本WO 97/22719中。

利用分子信标，所述探针与所述扩增产物的互补区杂交时的构象变化导致可检测信号的形成。所述探针本身包括两个部分：一个部分在5’末端，另一个部分在3’末端。这些部分位于与所述探针结合位点退火的探针部分的侧翼，并且是彼此互补的。一个末端部分一般连接于报告染料，另一个末端部分通常连接于猝灭染料。在溶液中，所述两个末端部分可相互杂交以形成发夹环。在这种构象中，所述报告物和猝灭染料相距足够近以至来自报告染料的荧光被猝灭染料有效地猝灭。相反，杂交探针产生了线性化的构象，在该构象中猝灭的程度降低。因此，通过对所述两个染料监测发光射光变化，有可能间接地监测扩增产物的形成。该类型的探针和它们的使用方法进一步记载于例如Piatek et al.，1998，Nat.Biotechnol.16：359-63；Tyagi，and Kramer，1996，Nat.Biotechnology 14：303-308；和Tyagi，et al.，1998，Nat.Biotechnol.16：49-53(1998)。

蝎型检测方法记载于例如Thelwell et al.2000，Nucleic Acids Research，28：3752-3761和Solinas et al.，2001，“Duplex Scorpion primers in SNP analysis and FRET applications”Nucleic Acids Research 29：20。蝎引物是荧光PCR引物，所述引物带有经PCR终止物连接在5’-末端的探针元件。它们用于均质溶液中的PCR产物的实时扩增子特异性检测。两种不同的形式是可能的：“茎-环”形式和“双螺旋”形式。在两种情况下，探测机制都是分子内的。所有样式中的蝎型的基本元件是：(i)PCR引物；(ii)防止PCR通读所述探针元件的PCR终止物；(iii)特异性探针序列；以及(iv)包含至少一个荧光团和猝灭物的荧光检测系统。在所述蝎型引物的PCR延伸后，得到的扩增子包含与所述探针互补的序列，所述序列在每个PCR循环的变性阶段成为单链。冷却时，所述探针自由结合至该互补序列，使荧光增强，这是因为猝灭物不再在所述荧光团附近。所述PCR终止物会防不需要的Taq DNA聚合酶通读所述探针。

侵入测定(Third Wave Technologies，Madison，WI)特别可用于SNP基因分型，利用了被命名为信号探针的寡核苷酸，所述寡核苷酸与所述靶核酸(DNA或RNA)或多态性位点互补。被命名为侵入寡核苷酸(Invader Oligo)的第二寡核苷酸包含相同的5’核苷酸序列，但所述3’核苷酸序列包含核苷酸多态性。所述侵入寡核苷酸会干扰所述信号探针与所述靶核酸的结合，使得所述信号探针的5’末端在包含所述多态性的核苷酸处形成“翼(flap)”。该复合物由被称为切割酶(Cleavase)的结构特异性核酸内切酶识别。切割酶切割所述核苷酸的5’翼。释放的翼与带有FRET标签的第三探针结合，从而形成被切割酶识别的另一双螺旋结构。这次，所述切割酶切开荧光团和猝灭物，并产生荧光信号。对于SNP基因分型，所述信号探针将被设计为与所述参考(野生型)等位基因或变体(突变体)等位基因杂交。与PCR不同，在没有核酸扩增的情况下有信号的线性扩增。足够指导本领域技术人员的更进一步的详细资料由例如Neri，B.P.，et al.，Advances in Nucleic Acid and Protein Analysis 3826：117-125，2000)和美国专利No.6,706,471提供。

扣锁探针(PLP)是长的(例如约100个碱基)线性寡核苷酸。所述探针3’和5’末端的序列与所述靶核酸中的邻近序列互补。在所述PLP的中部非互补区域有可用于识别所述具体PLP的“标签”序列。所述标签序列的侧翼有通用启动位点，所述通用启动位点使得能够进行所述标签的PCR扩增。当与所述靶杂交时，就使所述PLP寡核苷酸的两末端接近，并且可由酶连接反应连接。生成的产物是与所述靶DNA链串联的环状探针分子。任何未连接的探针(即，未与靶杂交的探针)都通过核酸外切酶的作用除去。PLP的杂交和连接需要两个末端片段识别所述靶序列。以该方式，PLP提供非常特异的靶识别。

然后，可以将环化PLP的标签区域扩增，并且检测生成的扩增子。例如，可进行

实时PCR来对扩增子检测并定量。可将扩增子的存在和量与所述样本中的靶序列的存在和量关联起来。对于PLP的描述，参见例如Landegren et al.，2003，Padlock and proximity probes for in situ and array-based analyses：tools for the post-genomic era，Comparative and Functional Genomics 4：525-30；Nilsson et al.，2006，Analyzing genes using closing and replicating circles Trends Biotechnol.24：83-8；Nilsson et al.，1994，Padlock probes：circularizing oligonucleotides for localized DNA detection，Science 265：2085-8。

在具体的实施方案中，可用作探针的可探测标记的荧光团包括但不限于：罗丹明、花菁3(Cy 3)、花菁5(Cy 5)、荧光素、Vic^TM、Liz^TM.、Tamra^TM、5-Fam^TM、6-Fam^TM和得克萨斯红(Molecular Probes)。(Vic^TM、Liz^TM、Tamra^TM、5-Fam^TM和6-Fam^TM都可获自Applied Biosystems，Foster City，Calif)。

已经开发的装置能够以包含荧光指示剂的组合物进行热循环反应，发出所述波长的光束，读出荧光染料的强度，并且显示每个循环后的荧光强度。包括热循环件、光束发射器和荧光信号检测器的装置已经记载于例如美国专利No.5,928,907、6,015,674和6,174,670中。

在一些实施方案中，这些功能的每一种均可由分开的装置进行。例如，如果将Q-β复制酶反应用于扩增，那么所述反应可以不在循环件中进行，但可以包括在特定波长下发射的光束、荧光信号的检测和扩增产物量的计算和显示。

在具体实施方案中，联合热循环和荧光检测的装置可用于精确定量靶核酸。在一些实施方案中，荧光信号可在一个或多个热循环期间和/或之后检测，因此使得可在反应发生时“实时”监测扩增产物。在一些实施方案中，可以使用扩增产物的量和扩增循环的数目来计算扩增前所述样品中有多少所述靶核酸序列。

根据一些实施方案，可以在足以指示所述靶核酸序列存在于样本中的预定数目的循环后简单地监测扩增产物的量。对于任何给定样本类型、引物序列和反应条件，本领域技术人员可容易地确定多少循环就足以确定给定靶核酸的存在。

根据一些实施方案，可使用内部标准来定量由荧光信号指示的扩增产物。参见，例如美国专利No.5,736,333。

通过获取不同温度下的荧光，可能跟踪杂交的程度。此外，PCR产物杂交的温度依赖性可用于鉴定和/或定量PCR产物。因此，本文描述的方法涵盖在检测和/或定量扩增子时使用解链曲线分析。解链曲线分析是公知的，记载于例如美国专利No.6,174,670、6472156和6,569,627中，所述每篇专利通过引用的方式全文纳入本文，特别是就其对使用解链曲线分析来检测和/或定量扩增产物的描述。在示例性实施方案中，解链曲线分析使用双链DNA染料——例如SYBR绿、Pico绿(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)、溴化乙啶等进行(参见Zhu et al.，1994，Anal.Chem.66：1941-48)。

在使用预扩增的多个实施方案中，预扩增循环的数目足以将一个或多个核苷酸标签加至所述靶核苷酸序列，使得所述带标签的靶核苷酸序列的相对拷贝数目可基本上代表样本中所述靶核酸的相对拷贝数目。例如，预扩增可进行2-20个循环以引入所述样本特异性或系列特异性核苷酸标签。在另一些实施方案中，检测在指数扩增结束时进行，即在“平台”期进行，或者进行终点PCR。在这种情况下，预扩增将使扩增子拷贝数对靶和对样本正态化。在多个实施方案中，预扩增和/或扩增可进行约2、4、10、15、20、25、30、35或40个循环，或者落在由任意这些数值限制的范围内的循环数。

若需要，如本文所述生成的带标签的靶核苷酸序列可通过DNA测序进行分析。很多现行的DNA测序技术依赖于“合成测序”。这些技术需要文库创建、文库分子的大规模平行PCR扩增和测序。文库创建开始于样本核酸转变为适当大小的片段、衔接体序列连接在所述片段的末端，并且选择正确地附加有所述衔接体的分子。衔接体序列存在于所述文库分子末端使得能够扩增随机序列插入物。上述对核苷酸序列加标签的方法可用连接代替以引入衔接体序列。

在具体实施方案中，在大规模平行PCR步骤中产生的文库DNA分子的数目低至足够以使两个分子与相同底物例如相同的珠子(在454 DNA测序中)或相同的表面片(在Solexa DNA测序中)结合的机会很低，但高至足够以使扩增序列的产量足够在自动测序中提供高通量。在如上文所述引入合适的衔接体序列后，可在合成测序前使用数字化PCR来校准文库DNA分子的数目。

标记策略

任何合适的标记策略都可用于本发明的方法。如果将所述测定混合物等分，并且对每个等分试样分析单一扩增产物的存在，那么可在所述扩增混合物中使用通用检测探针。在具体的实施方案中，可使用通用qPCR探针进行实时PCR检测。合适的通用qPCR探针包括双链DNA染料，如SYBR绿、Pico绿(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)、溴化乙啶等(参见Zhu et al.，1994，Anal.Chem.66：1941-48)。合适的通用qPCR探针还包括可与存在于所有扩增产物中的核苷酸序列结合的序列特异性探针。可将这类探针的结合位点在预扩增(在使用预扩增的实施方案中)过程中常规地引入至所述带标签的靶核苷酸序列中并且/或或者在扩增过程中引入至扩增产物中。

或者，将一个或多个靶特异性qPCR探针(即，对待检测的靶核苷酸序列特异)应用于所述扩增混合物中来检测扩增产物。靶特异性探针可能是有用的，例如当在大量样本中仅欲检测少数靶核酸时。例如，如果仅欲检测3个靶，可使用具有对每个靶不同的荧光标记物的靶特异性探针。通过合适的标记选择，可进行这样的分析，即其中在单个反应中不同的标记在不同的波长下被激发并且/或者被检测。参见，例如Fluorescence Spectroscopy(Pesce et al.，Eds.)Marcel Dekker，New York，(1971)；White et al.，Fluorescence Analysis：A Practical Approach，Marcel Dekker，New York，(1970)；Berlman，Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules，2nd ed.，Academic Press，New York，(1971)；Griffiths，Colour and Constitution of Organic Molecules，Academic Press，New York，(1976)；Indicators(Bishop，Ed.).Pergamon Press，Oxford，19723；和Haugland，Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，Molecular Probes，Eugene(1992)。

不需要的反应组分的除去

应了解，涉及核酸复合混合物的反应(其中使用许多反应步骤)可得到大量未参入的反应组分，通过多种清除方法的任一种除去这类未参入的反应组分或降低它们的浓度可提高随后发生的反应的效率和特异性。例如，在一些实施方案中，可能需要在进行本文所述的扩增步骤前除去预扩增引物或降低预扩增引物的浓度。

在一些实施方案中，可通过简单稀释来减少不需要的组分的浓度。例如，可在扩增前将预扩增样本稀释约2、5、10、50、100、500、1000、5000或10,000倍来提高随后的扩增步骤的特异性。本领域技术人员了解，稀释度也可落在由任何上述数值限定的范围内(例如，约100倍至约1000倍)。

在一些实施方案中，可通过多种酶方法除去不需要的组分。合适的酶方法的实例包括消化单链核酸的酶，如大肠杆菌(E.coli)外切核酸酶I。扩增反应剩下的多余dNTP可通过用虾碱性磷酸酶(SAP)处理“除去”，虾碱性磷酸酶可除去dNTP的磷酸基团。尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)(

from Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)可用于防止不需要的遗留(carry-over)引物参与初始扩增反应，所述初始扩增反应中所述引物包括dUTP而不是dTTP。UNG降解含有U的引物。

或者，可通过柱色谱除去未反应的引物和dNTP。例如，为了该目的可以使用在葡聚糖凝胶(Sephadex)上进行的凝胶过滤。

在具体的实施方案中，清除包括核酸的选择性固定。例如，可将需要的核酸优先固定在固体支持物上。在一个示例性实施方案中，将光生物素连接于需要的核酸上，并且将生成的生物素标记的核酸固定在包含亲和部分结合物例如链亲和素的固体支持物上。或者，可将不想要的核酸固定在固体支持物上，通过洗涤收获需要的核酸。

在扩增过程中使用阻断剂

在一些实施方案中，可在存在阻断剂的情况下进行扩增以增加靶核酸的特异性扩增。这类试剂可抑制扩增过程中产生的背景噪声，增加一个或多个靶核酸的特异性扩增，并且/或者提高扩增的质量(例如，可能通过提高扩增的效率)。

在任何扩增反应中都可以使用阻断剂，例如当基因组DNA样本被预扩增或扩增时。基因组DNA包含引物可以非特异性杂交的重复核苷酸序列，这样可增加背景噪声并且与靶核酸竞争引物。在扩增反应混合物中加入阻断剂会增加所述靶核酸的特异性扩增。在多个实施方案中，特异性扩增的提高可以是不存在阻断剂下观察到的扩增的约10％、约25％、约50％、约75％、约100％、约150％、约200％、约250％、约300％、约350％、约400％、约450％或约500％。不拘囿于具体的理论，本发明人认为所述阻断可通过与基因组DNA样本中的重复序列杂交起作用。

阻断剂还特别可用于使用基因组DNA或其他类型的核酸样本的多重扩增反应。在多重扩增中，在扩增反应混合物中存在多个引物可增加由所述多个引物的非特异性杂交造成的信号。加入阻断剂可抑制该信号。

在一个示例性实施方案中，将核酸阻断剂例如tRNA用作扩增反应例如PCR中的阻断剂。其他阻断剂可包括降解寡核苷酸引物、重复DNA、BSA或糖原。

所述阻断剂应以可增加所述靶核酸特异性扩增的量存在。在一些实施方案中，所述阻断剂以约0.1μg/μl至约40μg/μl的浓度存在。在具体实施方案中，所述阻断剂浓度可以是约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35或约40μg/μl的预扩增或扩增反应混合物，或者可以是任何以这些数值的任一个作为端点的范围(例如，约1μg/μl至约5μg/μl)。还可凭经验确定合适的量，如实施例4中所示。

在一个示例性实施方案中，将tRNA以约1μg/μl至约5μg/μl例如约2或3μg/μl的浓度用作阻断剂。

应用

本发明的方法可用于任何以检测核酸样本中一个或多个靶核酸的存在或量为目标的技术中。因此，例如，这些方法可用于鉴定具体多态性(如SNP)、等位基因、单倍型或染色体异常(如扩增、缺失或非整倍性)的存在。所述方法可用于基因分型，所述基因分型可在多种情况下进行，包括诊断遗传疾病或病症、药物基因组学(个性化医学)、农业质量控制(例如，用于种子或牲畜)、植物或动物种群的研究和管理(例如，在水产业或渔业管理中或者在确定种群多样性中)或者亲子鉴定或法医鉴定。本发明的方法可用于鉴定在生物或环境样本中指示具体条件或生物体的序列。例如，所述方法可用于鉴定病原体，例如病毒、细菌和真菌。所述方法还可用于表征环境或微环境，例如用于表征人肠道中的微生物种。

这些方法还可用于确定DNA或RNA(例如mRNA、miRNA)拷贝数。确定基因组DNA中的异常DNA拷贝数目可用于例如诊断和/或预后遗传缺陷和疾病例如癌症。确定RNA“拷贝数”(即表达水平)可用于表达监测所关注的基因，例如在不同条件(例如不同的外部刺激或疾病状态)和/或在不同发育阶段下的不同个体、组织或细胞中。引物还可发挥探针的功能。

此外，所述方法还可用于制备用于进一步分析例如DNA测序的核酸样本。

最后，在随后的分析之前，作为第一步可对核酸样本加标签，以降低样本的错误标记或交叉污染损害结果的风险。例如，任何医生诊所、实验室或医院可以在收集之后立即对样本加标签，所述标签可在分析时确认。类似地，对在犯罪现场收集到的含有核酸的样本可尽可能快地加标签，以确保所述样本不会被误标记或者被篡改。在样本每次从一方当事人转移给另一方时对所述标签进行检测可用于建立样本保管链。

试剂盒

本发明的试剂盒包括可用于实施本发明的一个或多个测定方法的一种或多种试剂。试剂盒通常包括带有一个或多个容纳试剂(例如引物和/或探针)的容器的包装物，所述试剂作为一个或多个分开的组合物，或者任选地，作为其中所述试剂的相容性所允许的混合物。所述试剂盒还可以包括从使用者的角度来看需要的其他材料，例如缓冲物、稀释物、标准物以及/或者可用于样本处理、洗涤或进行所述测定的任何其他步骤的任何其他材料。

本发明的试剂盒通常包括进行本发明的一种或多种方法的说明书。包含在本发明试剂盒中的说明书可贴在包装材料之上或可作为包装插页包括在其中。尽管说明书一般是书写或印刷材料，但它们并不限于此。本发明考虑任何能够储存这类说明并将其传递给终端用户的介质。这类介质包括但不限于电子储存介质(例如磁盘、磁带、录音盒带、芯片)、光学介质(例如CD ROM)、RF标签等。本文使用的术语“说明书”可包括提供所述说明书的互联网站点的地址。

应理解，本文描述的实例和实施方案仅用于示例性目的，根据它们作出的多种修饰或修改对于本领域技术人员来说是暗示性的，并且包括在本申请的主旨和考虑内以及所附权利要求书的范围内。

此外，本文引用的所有其他出版物、专利和专利申请就其全部目的通过引用的方式全文纳入本文。

实施例

实施例1

对每个引物使用独特标签的“更多样本”化学法

该实施例提供了一种用于进行本发明的测定方法的示例性方案，以使用获自Fluidigm Corporation，South San Francisco，CA的48.48动态阵列测量最多达144个样本中的16个靶的基因表达。

为了在不改变芯片设计的的情况下使用动态阵列增加用于基因表达的样本通量，发明人开发了一种新方案来使用一个M48芯片测量在超过48个样本中少于48(即16)个靶的基因表达。该方案包括加标签、合并和实时PCR步骤。为了证明观点，仅编码并分析了3个靶基因。

在加标签步骤过程中，将cDNA样本分为3个不同的组。对于所述3个组，分别合成3个靶(GAPDH、LDH1、HPRT)的正向和反向引物，独特的标签序列添加在所述引物的5’末端(共18个不同的标签)。以该方式，每对标签界定了以具体组的试剂扩增并加标签的具体靶。

将每个系列的组特异性带标签的引物与33个其他未加标签的基因表达混合物合并在一起，以模拟预扩增中的高复杂性。

在加标签步骤(用所述带标签的引物预扩增靶)中，在5μl反应系中扩增所述3组不同的cDNA样本(标准cDNA，4×稀释的8个滴度，从5ng至0.3pg)，所述反应系包含2.5μl 2×PreaAmp Master Mix(Applied Biosystems)、1μl多重加标签引物混合物(每组样本1份不同的混合物)、1μl cDNA和0.5μl无DNA水。PCR按如下进行：初始95℃15分钟，之后是14个循环2步扩增谱：95℃15秒变性、60℃4分钟退火和延伸。用DNA悬浮缓冲液(来自TEKnova的低EDTA TE)将所述PCR产物稀释100倍。然后，将来自所述3组的PCR产物合并，每个合并的样本具有来自所述带标签的3组的每一组的一个样本。作为对比，通过定量实时PCR分别地分析来自不同标签组的样本。同样，以未加标签的引物和未混合的样本平行地进行所述分析。

通过实时定量PCR在动态阵列芯片上分析所述合并的样本。在5μl反应系中以相应的TaqMan探针为每对标签制备10×测定混合物，所述反应系包含2μM Taqman探针、9μM的两种标签特异性引物和1×测定上样试剂(Fluidigm)。为每个2.5μL(合并的或独立的)样本制备5μL样本混合物，所述样本混合物包含1×TaqMan Universal Master Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA)、1×DA样本上样试剂。如上文所述在动态阵列芯片上进行标准TaqMan基因表达。

相对于参考样本(在相对浓度0.063的ABC，灰背景)确定HPRT cDNA和GAPDH cDNA的不同样本的ΔΔC_T。来自A、B和C 3组的样本不混合(“单独的”)，与相同浓度的样本混合(“ABC”)或者与不同浓度的样本混合(“A固定”)。相对浓度是指加入所述加标签反应系的cDNA量(“1.000”＝5纳克)。对于分别以组A、B和C特异性标签引物以及以未加标签的引物(即带有所述预扩增引物的靶特异性部分的序列的引物)分析的样本，列出了ΔΔC_T值。结果显示于表1中。

表1

实施例2

基因分型的“更多样本”化学法

该实施例提供了一种用于进行本发明的测定方法的示例性方案，以使用获自Fluidigm Corporation，South San Francisco，CA的48.48动态阵列对144个样本(不包括模板对照“NTC”)中的16个单核苷酸多态性(“SNP”)进行基因分型。

为了在不改变芯片设计的情况下使用动态阵列进一步增加用于基因分型的样本通量，发明人开发了一种新方案来使用一个48.48CS芯片在少于48(即16)个SNP上对超过48个样本进行基因分型。该方案包括加标签、合并和基因分型步骤(参见图4、5和6)。在加标签步骤中，将DNA样本分为3个不同的组，每组47个个体(加上给NTC的1个位置)。合成用于扩增16个SNP的3个系列16个5’正向引物。每个系列有分别添加于所述引物的5’末端的不同标签序列。将添加有相同标签的16个正向引物的每一个合并在一起并将其与16个SNP特异性3’反向引物混合，以制备多重加有标签的引物混合物，每个标签一个引物混合物。

在加标签步骤中，在5μl反应系中扩增所述3组不同的47个番茄DNA样本，所述反应系包含2.5μl的2×Multiplex PCR Master Mix(Qiagen)、1μl的所述多重加有标签的引物混合物(每组样本1个不同的标签)、1μl 60ng/uL的DNA和0.5μl无DNA水。PCR按如下进行：初始95℃15分钟，之后是14个循环2步扩增谱：95℃15秒变性、60℃4分钟退火和延伸。用DNA悬浮缓冲液(来自TEKnova的低EDTA TE)将所述PCR产物稀释100倍。然后，将来自所述3个组的47个PCR产物合并成有47个样本的一个组，每个合并的样本具有来自所述3个带标签组的的每一组的一个样本。

将所述合并的47个样本以及1个作为阴性对照(“NTC”)的含DNA悬浮缓冲液的样本在动态阵列芯片上进行基因分型。在5μl反应系中为每个SNP分别制备10×测定混合物，所述反应系包含2μMTaqman探针(FAM和VIC)、9μM相应的SNP特异性反向引物、2.5×ROX(Invitrogen)、0.25％的Tween 20和9μM的所述3个加有标签的引物(标签-1GTACGGTAGCAGAGA CTTGGTCTG、标签-2GACTTAATGCTGC TTGAGACTTGC和标签-3GACATCGT ACCTGACTCAT CGCAC)之一。为每个SNP制备3个10×测定混合物，每个标签1个混合物。为所述16个SNP制备总共48个测定混合物，分成3标签组。对每个2.5μL的1∶100稀释的合并样本和NTC制备5μL样本混合物，所述样本混合物包含1×TaqMan Universal Master Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA)、1×GT样本上样试剂(Fluidigm PN 85000741)和0.05单位/μL额外Taq-Gold聚合酶(Applied Biosystems)。如上文所述在动态阵列芯片上进行标准TaqMan基因分型。结果显示于图2和3中。

实施例3

qPCR基因表达作谱的“更多样本”化学法

该实施例提供了一种用于进行本发明的测定方法的示例性方案，以使用获自Fluidigm Corporation，South San Francisco，CA的96.96动态阵列定量36个连续稀释的样本中的16个cDNA表达。

为了在不改变芯片设计的情况下使用动态阵列增加qPCR、基因表达作谱的样本通量，发明人开发了一种新方案。所述方案(图4、5和6)使得能够检查以不同水平存在的16个基因的mRNA表达水平。图7示出了分析在用于验证“更多样本”基因表达方案的动态范围和ΔΔCt测量值的稀释系列的通用参照样本(BioChain)中的16个基因的结果。具体而言，图7显示了来自于使用96.96阵列的数据。该方案(图4、5和6)涉及加标签、合并样本和qPCR。在所述加标签步骤中(图6)，将样本分为3个不同组，有包括不同稀释系列的48个标签特异性反应系。合成用于扩增16个cDNA的3个系列的16个正向引物。每个系列带有添加在所述正向引物5’末端的不同标签序列。将具有相同5’标签的16个正向引物的每一个合并在一起，并且与16个基因特异性3’反向引物混合，以制备多重加有标签的引物混合物，每个标签1个混合物。参见图6。

在加标签步骤中，在10μl反应系中扩增所述3组不同的4倍系列(1/4、1/16和1/64倍)稀释的16个cDNA样本，所述反应系包含：5μl的2×PreAmp Master Mix(P/N 4384769；ABI)、2μl的5×(250nM)多重加有标签的引物混合物(每组样本1个不同的标签)、3μl的Universal Reference cDNA(Bio Chain)。PCR按如下进行：初始95℃15分钟，之后是17个循环2步扩增谱：95℃15秒变性、60℃4分钟退火和延伸。将样本以1比2稀释于水中，并储存在4℃。用4μlExoSAP-IT(P/N 7800，USB)处理这些PCR产物。参见图5。将所述144个样本减少至48个合并的样本。所述合并的样本仅包含标签组1、2和3的每一组的1个成员。

在动态阵列上对所述合并的样本进行PCR。如上文所述，对每个cDNA混合物制备6.5μl样本混合物，所述混合物包含：3.5uL的2×TaqMan Gene Expression Master mix(ABI)、0.35μL的20×GE样本上样试剂(Fluidigm)和2.45μL合并的样本。测定混合物(5μL)包含：2.6μM的3’嵌套反向引物和2.6μM水解探针、0.25％的Tween20和2μM的所述3个加有标签的引物(标签1或2或3)之一。在96.96芯片上进行标准Fluidigm基因表达qPCR。

实施例4

在扩增基因组DNA中使用tRNA

在GeneAmp PCR系统9700(Applied Biosystems，CA)上使用标准方法在25μl反应系中预扩增人基因组DNA，所述反应系包含1×PreAmp master mix(Applied Biosystems，CA)、900nM引物、约10ng DNA样本和不同量的tRNA(转移核糖核酸，来自面包酵母S.cerevisiae，Sigma Chemicals，cat no R5636-1ML)。将样品稀释，并且在从Fluidigm Corp.(South San Francisco，CA)购买的12.765数字化阵列上通过数字化PCR对其进行分析。随后的热循环方案类似于Qin J.，Jones RC，Ramakrishnan R.(2008)Studying copy number variations using a nanofluidic platform Nucleic Acids Research，Vol.36，No.18 el 16中报道的方案。

图8和9表明，加入tRNA会增加特异性扩增信号的强度，压抑背景并且提高特异性扩增曲线的质量。下表2示出了加入tRNA的具体计数的增加。

表2

tRNA的量	计数^*
		无	9
2μg/μl	290
		3μg/μl	275

^＊12.765数字化阵列每板的信号平均数

以上给出的实施例仅是说明性的，并不意味着穷举本发明所有可能实施例、应用或修饰。因此，在不背离本发明的范围和主旨的情况下，本发明描述的方法和系统的多种修饰和变体对于本领域技术人员来说是明显的。尽管结合具体实施方案描述了本发明，但应理解所要求的发明不应被不适当地局限于这类具体的实施方案。实际上，对于分子生物学或相关领域的技术人员来说明显的用于实施本发明的所述方式的多种修饰意欲在所附权利要求书的范围内。

Claims

1.一种用于检测多个样本中的多个靶核酸的测定方法，所述方法包括：

提供在测定前混合在一起的S个样本，其中S是大于1的整数；

使所述S个样本的每一个分别进行编码反应，所述编码反应产生一系列T个带标签的靶核苷酸序列，每个带标签的靶核苷酸序列包括样本特异的核苷酸标签和靶核苷酸序列；其中T是待检测的靶核酸的数目，T是大于1的整数；

对于所述S个样本的每一个，将带标签的靶核苷酸序列混合形成测定混合物；

对所述测定混合物或其等分试样用S×T对独特的扩增引物进行扩增，其中每对扩增引物包括：

会与靶核苷酸序列退火的正向或反向扩增引物；和

会与样本特异性核苷酸标签退火的各自的反向或正向扩增引物；并且

对于每对独特的引物，确定扩增产物是否存在于扩增混合物或其等分试样中，从而扩增产物的存在指示具体靶核酸在具体样本中的存在。

2.权利要求1的方法，其中：

所述编码反应包括使用针对每个样本的不同正向和反向预扩增引物系列分别预扩增所述S个样本的每一个来产生预扩增样本，其中

在给定系列中的所有正向预扩增引物或所有反向预扩增引物包括共同的样本特异性核苷酸标签；

所述混合包括将所述S个样本的每一个的预扩增样本混合来形成测定混合物；

所述扩增包括将所述测定混合物分成最多S×T个扩增混合物，并且用独特的扩增引物对来分别扩增所述每个扩增混合物，其中所述每对扩增引物包括：

会与靶核苷酸序列退火的正向或反向扩增引物；和

所述确定包括确定扩增产物是否存在于所述扩增混合物中，从而扩增产物在扩增混合物中的存在指示具体靶核酸在具体样本中的存在。

3.权利要求2的测定方法，其中一个系列中的每个正向预扩增引物除包括靶特异性核苷酸序列外还包括共同的样本特异性核苷酸标签，并且每个系列中的每个反向预扩增引物均包括靶特异性核苷酸序列。

4.权利要求2的测定方法，其中一个系列中的每个正向预扩增引物包括靶特异性核苷酸序列，并且每个系列中的每个反向预扩增引物除包括靶特异性核苷酸序列外还包括共同的样本特异性核苷酸标签。

5.一种检测多个样本中的多个靶核酸的测定方法，所述方法包括：

提供在测定前混合在一起的S个样本，其中S是大于1的整数；

对所述S个样本的每一个分别进行编码反应，所述编码反应产生一系列T个带标签的靶核苷酸序列，每个带标签的靶核苷酸序列包括连接至靶核苷酸序列的第一核苷酸标签，所述靶核苷酸序列连接至第二核苷酸标签；其中T是待检测的靶核酸的数目，T是大于1的整数；

使用S×T对独特的扩增引物扩增所述测定混合物或其等分试样，其中每对扩增引物包括：

会与第一核苷酸标签退火的正向或反向扩增引物；和

会与第二核苷酸标签退火的各自的反向或正向扩增引物；并且

6.权利要求5的方法，其中：

所述编码反应包括使用针对每个样本的不同正向和反向预扩增引物系列分别对所述S个样本的每一个进行预扩增来产生预扩增样本，其中

所述混合包括将所述S个样本的每一个的预扩增样本混合形成测定混合物；

所述扩增包括将每个测定混合物分为最多S×T个扩增混合物，并且用独特的扩增引物对分别扩增每个所述扩增混合物，其中每对扩增引物包括：

会与正向核苷酸标签退火的正向扩增引物；和

会与反向核苷酸标签退火的反向扩增引物；并且

7.权利要求5或6的方法，其中所述核苷酸标签的至少一个包括从给定样本产生的所有带标签的靶核苷酸序列共同的样本特异性核苷酸标签。

8.权利要求7的方法，其中所述另一个核苷酸标签对于所述测定混合物中的每个带标签的靶核苷酸序列是不同的。

9.权利要求1、2、5或6的测定方法，其中所述扩增引物的至少一个包括与所述核苷酸标签的至少一个邻近的靶核苷酸互补的至少一个核苷酸。

10.权利要求1、2、5或6的测定方法，其中通过制备多个不同的测定混合物测定一系列样本，其中每个测定混合物包括S个不同样本的混合物。

11.权利要求10的测定方法，其中S×T是选自30、48、96、120和192的至少一个数值。

12.权利要求10的测定方法，其中在单个测定中测定的样本总数×T的积是选自2304、3600、4608和9216的至少一个数值。

13.一种用于检测样本中多个靶核酸的测定方法，所述方法包括：

向样本提供T个正向预扩增引物，其中每个正向预扩增引物包括不同的靶特异性核苷酸序列和系列特异性核苷酸标签，其中使用X个不同的正向系列特异性核苷酸标签，其中T是待检测靶的数目，X是大于1小于T的整数，因此T/X个引物包括相同的正向系列特异性核苷酸标签；

向所述样本提供T个反向预扩增引物，其中每个反向预扩增引物包括不同的靶特异性核苷酸序列和反向系列特异性核苷酸标签，其中使用Y个不同的反向系列特异性核苷酸标签，Y是大于1小于T的整数，因此T/Y个引物包括相同的反向系列特异性核苷酸标签；

预扩增所述样本以产生测定混合物，其中针对具体靶生产的任何预扩增产物参入正向和反向系列特异性核苷酸标签的独特组合；

用扩增引物扩增所述测定混合物或其等分试样，其中每对扩增引物包括：

会与所述反向系列特异性核苷酸标签退火的反向扩增引物；并且

对于每对独特的引物，确定扩增产物是否存在于所述扩增混合物或其等分试样中，从而扩增产物的存在指示具体靶核酸在所述样本中的存在。

14.权利要求13的方法，其中所述扩增包括将所述测定混合物分成T个扩增混合物，并且使用独特的扩增引物对分别扩增所述扩增混合物的每一个。

15.权利要求13的方法，其中X至少是选自12、24、48和96的数值。

16.权利要求13的方法，其中所述T至少是选自384、576、768、1152、2304、3600、4608和9216的数值。

17.一种用于检测样本中的多个靶核酸的测定方法，所述方法包括：

将样本分为R个等分试样，其中R是大于1的整数；

对所述R个等分试样的每一个分别进行编码反应，所述编码反应产生一系列T个带标签的靶核苷酸序列，其中T是每个等分试样中待检测的靶核酸的数目，T是大于1的整数，并且其中：

每个带标签的靶核苷酸序列包括在靶核苷酸序列5’的第一核苷酸标签、靶核苷酸序列和在所述靶核苷酸序列3′的第二核苷酸标签；

所述T个带标签的靶核苷酸序列的每一个中的核苷酸标签组合对每个等分试样中的每个带标签的靶核苷酸序列来说都是独特的；并且

将相同系列的第一和第二核苷酸标签组合用于每个所述等分试样的所述编码反应中；

使用针对每个等分试样的相同系列T对不同的扩增引物分别扩增每个等分试样，每对引物均包括会与每个带标签的靶核苷酸序列中的所述第一核苷酸标签退火的第一引物和会与其中的所述第二核苷酸标签退火的第二引物；并且

对于每个等分试样中的每对独特的引物，确定扩增产物是否存在于所述等分试样中，从而扩增产物的存在指示具体靶核酸在所述样本中的存在。

18.权利要求17的测定方法，其中在扩增前：

将每个等分试样分为T个亚等分试样；

将所述T对不同的扩增引物的一对与每个亚等分试样组合；并且

对所述亚等分试样分别进行扩增反应。

19.权利要求17的测定方法，其中所述编码反应包括预扩增反应。

20.权利要求19的测定方法，其中对所述样本进行预扩增反应，其中预扩增T×R个靶核酸的每一个。

21.权利要求20的测定方法，其中用于预扩增的引物相对于用于前预扩增的引物是嵌套的。

22.权利要求17的测定方法，其中R和/或T至少是选自12、24、48和96的数值。

23.权利要求2、6、13或17的测定方法，其中扩增混合物在扩增前形成于或者被分配至微流体装置的不同隔间。

24.权利要求23的测定方法，其中所述微流体装置至少部分是由弹性体材料制造。

25.权利要求23的测定方法，其中所述测定具有至少4个数量级的动态范围。

26.权利要求2、6、13或19的测定方法，其中所述预扩增和/或所述扩增通过聚合酶链式反应(PCR)进行。

27.权利要求2、6、13或19的测定方法，其中所述预扩增进行2-20个循环以引入所述核苷酸标签。

28.权利要求2、6、13或19的测定方法，其中所述预扩增进行足够数目的循环以使扩增子拷贝数对靶和对样本正态化。

29.权利要求2、6、13或17的测定方法，其中通过定量实时聚合酶链式反应(PCR)确定扩增产物的存在。

30.权利要求2、6、13或17的测定方法，其中在所述扩增混合物中使用通用qPCR探针来检测扩增产物。

31.权利要求2、6、13或17的测定方法，其中在所述扩增混合物中使用一个或多个靶特异性qPCR探针来检测扩增产物。

32.权利要求2、6、13或17的测定方法，其中在所述扩增混合物中使用一个或多个标签特异性qPCR探针来检测扩增产物。

33.权利要求2、6、13或17的测定方法，其中使用荧光核酸酶测定检测扩增产物的存在。

34.权利要求33的测定方法，其中使用双重标记的荧光寡核苷酸探针检测扩增产物的存在。

35.权利要求2、6、13或17的测定方法，还包括对所述扩增混合物中的扩增产物的量进行定量。

36.权利要求35的测定方法，还包括确定在每个样本中存在的每个靶核酸的量。

37.权利要求2、6、13或17的测定方法，其中进行所述测定以确定所述靶核酸的拷贝数。

38.权利要求2、6、13或17的测定方法，其中进行所述测定以确定对应于所述靶核酸的基因座的基因型。

39.权利要求2、6、13或17的测定方法，其中进行所述测定以确定所述靶核酸的表达水平。

40.权利要求2、6、13或19的测定方法，还包括在进行所述扩增前降低预扩增引物的浓度。

41.权利要求2、6、13或19的方法，其中所述样本包括基因组DNA样本。

42.权利要求41的方法，其中在存在足以提高所述靶核酸的特异性扩增的量的阻断剂的情况下进行所述预扩增。

43.权利要求42的方法，其中所述阻断剂包括会与所述基因组DNA样本中的重复序列杂交的核酸阻断剂。

44.权利要求42的方法，其中所述阻断剂选自tRNA、降解寡核苷酸引物、重复DNA、牛血清白蛋白(BSA)和糖原。

45.权利要求42的方法，其中所述阻断剂以约0.1μg/μl至约40μg/μl的浓度存在。

46.权利要求45的方法，其中所述阻断剂包含约1μg/μl至约5μg/μl的浓度的tRNA。