CN101067156A - 一种基于选择性探针的多重pcr方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核酸扩增，具体涉及一种可同时扩增多个核酸片段的基于选择性探针的多重PCR方法及其应用。本发明所述的多重PCR方法包括以下步骤：(1)构建选择性探针；(2)延伸－连接反应；(3)PCR扩增；(4)检测PCR扩增产物。其关键特征是反应体系中使用了选择性探针，并且，PCR扩增产物可存在长度的差异。该方法不但使分析通量大大提高，还可节省待检样本的核酸模板用量。与传统的使用多对引物的多重PCR技术相比，本发明的方法仅使用一对通用引物，但在理论上可至少同时扩增上千个靶核酸序列，具有操作简便、通量大、检测系统兼容性高等显著优点。

Description

一种基于选择性探针的多重PCR方法及其应用

技术领域

本发明涉及核酸扩增，具体涉及一种基于选择性探针的多重PCR方法及其应用。

背景技术

多重PCR(Polymerase Chain Reaction)技术是一种在同一反应管中同时扩增多种靶核酸的技术，其中，最典型的代表是基于挂锁探针(padlock probes)发展起来的一系列基因分析技术。经典的挂锁探针由三部分组成，其中两部分序列是挂锁探针两端的寡核苷酸片段，这两部分寡核苷酸片段与靶核酸互补，第三部分寡核苷酸片段将前两部分寡核苷酸片段连接成一个整体，当挂锁探针与靶核酸形成杂交体后，挂锁探针的5’-和3’-未端无任何间隔，二者是紧紧毗连的关系。因此，在DNA连接酶的作用下，挂锁探针的5’-和3’-未端缺口被封闭，使挂锁探针成为环状单链DNA分子，当反复进行变性、杂交和连接反应，就会形成足量的环状单链DNA，然后可根据环状单链DNA与线性DNA之间电泳迁移率的差异来检测待检样本中是否存在靶核酸。经典的挂锁探针最初被用于基因组DNA点突变的确认分析，它的关键特征包括以下几点：必须针对每一种突变位点设计一种特异性的挂锁探针，也就是说，如果要检测靶核酸的某个位点是否存在两个等位基因，则必须针对每一个等位基因设计一种挂锁探针，因此，在检测DNA突变或SNP位点时，必须对同一个位点设计两种或两种以上的挂锁探针；由于每种挂锁探针-靶核酸杂交体中的挂锁探针5’-和3’-未端均无任何间隔，二者是紧紧毗连的关系，因此，挂锁探针形成环状单链DNA分子的过程仅仅需要DNA连接酶的参与，同时，不同靶核酸的PCR扩增产物之间无片段长度的差异。分子倒置探针(molecular inversion probes)是后来在经典的挂锁探针基础之上结合通用芯片检测方法发展起来的一种SNP高通量分析方法，其特征在于当其3’-和5’-端碱基与目的DNA杂交后存在1个碱基位置的间隔，该间隔在DNA聚合酶的延伸作用下补平，并随后在DNA连接酶的连接作用下封闭缺口，使分子倒置探针连接成环状单链DNA分子。为了提高SNP分析的高通量特性，分子倒置探针与经典的挂锁探针最大的区别在于它在探针中引入的适合通用引物序列扩增的碱基序列，以便于在后续的步骤中采用通用引物进行PCR扩增，此外，它还在自身序列中引入的标签序列，因此，尽管基于分子反转探针的多重PCR产物片段大小均相同，但可采用识别每种PCR扩增产物中标签序列的通用芯片达到对多重PCR产物中每种靶核酸扩增片段的特异性检测，从而极大地提高了SNP分析的高通量性，一次性最高可达到1000-重PCR的扩增效率。基于分子倒置探针的多重PCR技术的关键特征包括：由于每种分子倒置探针-靶核酸序列杂交体中的分子倒置探针的5’-和3’-未端均只存在1个碱基的间隔，因此，不同靶核酸的PCR扩增产物不存在长度的差异，不能简单地通过PCR产物长度的差异来判断待检样本中是否存在靶核酸；基于分子倒置探针的多重PCR扩增需要同时分别在四个反应中进行，每个反应管使用一种三磷酸脱氧核糖核苷酸，分别是dATP、dCTP、dTTP和dGTP，从而在一定程度上增加了多重PCR的繁琐性和检测成本。

在人类基因组序列中，DNA甲基化总是特异性地发生于CpG二核苷酸的胞嘧啶(cytosine，C)。DNA甲基化是人类生长发育和疾病发生发展过程中调控基因表达的重要表观遗传学模式。目前，针对DNA甲基化的分析主要基于两种技术，其一是甲基化敏感限制性内切酶(methylation-sensitive restrictionendonuclease，MSRE)，如HpaII和HhaI，这一类限制性内切酶只有当其识别序列的CpG位点处于非甲基化状态时，才会切割靶序列；其二是重亚硫酸盐修饰，在重亚硫酸盐修饰作用下，未甲基化的胞嘧啶被转化成尿嘧啶(uracil，U)，后者可在随后的PCR扩增反应中被替换成胸腺嘧啶(thymine，T)，而甲基化胞嘧啶则在修饰前后保持不变。当对基因组进行MSRE酶切后，非甲基化DNA序列在酶识别位点处被切割成多个DNA片段，而甲基化DNA序列则保持了片段的完整性，因此，如果使用跨过酶切位点的引物分别扩增MSRE酶切前和酶切后的DNA，则可根据两种DNA中是否存在PCR扩增产物来判断目的序列在MSRE酶识别位点的甲基化状态。此外，对于重亚硫酸盐修饰序列，可事先假设某一个或几个CpG位点是处于甲基化或非甲基化状态，从而设计针对甲基化和非甲基化CpG位点序列的两对PCR引物，如甲基化特异性PCR。由于CpG岛是CG富含序列，当基于MSRE分析DNA甲基化时，难于同时对多个DNA序列进行扩增，即使采用基于挂锁探针或分子倒置探针的多重PCR扩增，由于CpG岛中的CpG位点众多导致了存在多个MSRE位点，因此，按照经典的挂锁探针或分子倒置探针的设计方案，难以得到符合要求的探针。此外，对于重亚硫酸盐修饰序列而言，由于非甲基化胞嘧啶均被转变成了尿嘧啶，从而导致其序列的简单性，按照经典的挂锁探针或分子倒置探针的探针同样难以得到符合要求的探针。

目前绝大多数的多重PCR方法均局限于同时扩增5～10个靶核酸片段，其主要原因是n-重PCR必须加入n对不同的引物，即2n个引物，这使得PCR扩增反应的条件难以控制，此外，引物之间的相互作用很容易产生引物二聚集体和非特异性扩增。

发明内容

为克服现有技术所存在的上述缺点和不足，本发明提供一种可同时扩增多个核酸片段的基于选择性探针的多重PCR方法及其应用。本发明所述的一种基于选择性探针的多重PCR方法包括以下步骤：

(1)构建选择性探针：

选择性探针的5’-端和3’-端分别设置一个与靶双链核酸序列的同一条核酸单链序列的5’-和3’-端或者靶单链核酸序列的5’-端和3’-端互补的互补区，两个互补区的中间部分设置为两个通用序列区；通用序列区与互补区直接相连，或者通过标签序列相连接；两个通用序列区直接相连，或者中间设置一个尿嘧啶区，通过尿嘧啶区的尿嘧啶寡核苷酸相连；

(2)延伸-连接反应：

将下列物质混合，进行延伸-连接反应：

①起始核酸模板；

②步骤(1)所构建的选择性探针；

③四种三磷酸脱氧核糖核苷酸，包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP；

④DNA连接酶和DNA聚合酶，及其相应的缓冲液体系；或者，逆转录酶和DNA聚合酶，及其相应的缓冲液体系；

(3)PCR扩增：

其中反应物包括：延伸-连接反应产物、与选择性探针的通用序列对应的一对通用引物、四种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP和dGTP)、DNA聚合酶及其相应的缓冲液体系；所述的一对通用引物，其中，一条通用引物与选择性探针的一个通用序列区的序列相同，另一条通用引物则与选择性探针另一个通用序列区的序列互补；

(4)检测PCR扩增产物，以确定待检样本中是否存在靶核酸和/或靶核酸的拷贝数。

所述步骤(1)中所述的选择性探针的部分或全部碱基含有碱基类似物或碱基修饰物；或者

选择性探针中的两个靶核酸互补区引入人工错配碱基，所述人工错配碱基是天然的A、T、C、G四种碱基或其类似物。

所述步骤(1)中所述的标签序列具有自身特异性，标签序列是长度为15～40聚体的寡核苷酸，所述标签序列的Tm值之差小于或等于5℃，相互之间以及与通用引物之间无交叉杂交，并且无发夹结构；所述标签序列与待检样本的物种基因组核酸序列无同源性或同源性较低。

所述步骤(2)中所述的起始核酸模板包括基因组DNA、甲基化酶感限制性内切酶(MSRE)酶切DNA、MSRE同裂酶酶切DNA、McrBC酶切DNA、重亚硫酸盐修饰DNA、RNA、mRNA或cDNA核酸片段。

所述步骤(3)中所述的通用引物标记有荧光分子、发光基团、生物素、地高辛分子或同位素。

或其它类似发光分子或适合分离扩增产物的标记分子；或者

通用引物全部或部分碱基含有碱基类似物或碱基修饰物；或者

四种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)的一种或多种标记有荧光分子、发光基团、生物素、地高辛分子、同位素，或其它类似发光分子或适合分离扩增产物的标记分子。

当起始核酸模板是RNA或mRNA时，选择性探针3’-端的靶核酸互补区还可以是Oligo d(T)，Oligo d(T)的长度是8～40聚体。

所述步骤(2)延伸-连接反应后，还可对延伸-连接反应产物进行如下处理：采用线性单链或双链DNA特异性核酸外切酶处理延伸-连接反应产物，使处理完毕后，延伸-连接反应产物中仅有环状单链DNA分子保持完整性；或者

采用尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)处理延伸-连接反应产物，使处理完毕后，环状单链DNA分子解体为线性单链DNA分子。

本发明还提供所述方法在检测靶核酸和/或靶核酸拷贝数方面的应用，其特征是，按照权利要求1所述步骤对靶核酸和/或靶核酸拷贝数进行检测，其中

(1)使用琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺电泳、毛细胞管电泳和其它类似电泳技术检验PCR扩增产物；

(2)使用表面固定有与选择性探针的标签序列相同或互补寡核苷酸的通用芯片、其它类似阵列或微珠技术检测PCR扩增产物；

(3)采用以选择性探针的标签序列为靶向序列的TaqMan探针、分子信标或其它类似的实时荧光PCR或实时荧光定量PCR技术来检测延伸-连接反应产物；

(4)采用以选择性探针的标签序列为靶向序列的TaqMan探针、分子信标或其它类似的实时荧光PCR或实时荧光定量PCR技术来检测PCR扩增产物。

本发明还提供所述方法在检测DNA片段或CpG岛的甲基化状态和模式方面的应用，其特征是，按照权利要求1所述步骤对DNA片段或CpG岛进行检测，其中，

(1)起始核酸模板是MSRE酶切前或酶切后DNA，并且，选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针的5’-和3’-未端至少跨过靶核酸序列的一个MSRE酶切位点；

(2)起始核酸模板是MSRE同裂酶酶切前或酶切后DNA，并且选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针的5’-和3’-未端至少跨过靶核酸序列的一个MSRE酶切位点；

(3)起始核酸模板是McrBC酶切前或酶切后DNA，并且，选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针的5’-和3’-未端至少跨过一个McrBC酶切位点；

(4)起始核酸模板是重亚硫酸盐修饰DNA，并且，选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针5’-和3’-未端的4个碱基至少与靶核酸甲基化CpG在重亚硫酸盐修饰后仍保持不变的一个CpG位点互补，或者，至少与靶核酸非甲基化CpG在重亚硫酸盐修饰后转变成的一个TpG位点互补；

(5)起始核酸模板是重亚硫酸盐修饰DNA，并且，选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针5’-和3’-端的两个靶核酸互补区不含有与靶核酸CpG在重亚硫酸盐修饰后仍然保持不变的CpG位点或者转变成的TpG位点的互补序列；

(6)起始核酸模板是重亚硫酸盐修饰DNA，并且，选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针5’-和3’-端的两个靶核酸互补区中的一个靶核酸互补区符合上述第(4)种所述特征，并且，另一个靶核酸互补区符合上述第(5)种所述特征。

本发明还提供所述方法在检测mRNA表达谱和/或表达水平方面的应用，其特征是，按照权利要求1所述步骤对mRNA表达谱和/或表达水平进行检测，其中

起始核酸模板是mRNA，或者是含有mRNA的RNA，并且，使用表面固定有与选择性探针的标签序列相同或互补寡核苷酸的通用芯片、其它类似阵列或微珠技术，或者cDNA基因表达谱芯片、cDNA功能分类基因芯片、Oligo基因表达谱芯片、Oligo功能分类基因芯片或其它类似技术直接检测延伸-连接反应产物；或者

起始核酸模板是cDNA、mRNA，或者是含有mRNA的RNA，使用表面固定有与选择性探针的标签序列相同或互补寡核苷酸的通用芯片、其它类似阵列或微珠技术，或者cDNA基因表达谱芯片、cDNA功能分类基因芯片、Oligo基因表达谱芯片、Oligo功能分类基因芯片或其它类似技术检测PCR扩增产物。

本发明提供所述方法用于检测待检标本中是否存在靶核酸和/或靶核酸拷贝数的试剂盒。

本发明与现有的PCR方法相比，具有以下优点：

(1)本发明方法的选择性探针与靶核酸形成杂交体后，选择性探针的5’-和3’-未端的间隔至少在lbp以上，而且，每一种靶核酸对应的选择性探针的5’-和3’-未端在选择性探针-靶核酸杂交体中的间隔可以有差异，上述特征增强了选择性探针的设计灵敏性和简便性，使本发明方法适合于DNA片段、CpG岛或重亚硫酸盐修饰DNA这一类特殊DNA序列的分析，同时，还可以直接通过PCR扩增产物长度和/或丰度的差异来判断待检样本中是否存在靶核酸和/或靶核酸的丰度；

(2)本发明方法的选择性探针的两个靶核酸互补区中可以有一个是Oligod(T)，因此，可在逆转录酶的作用下分析多个基因的mRNA表达谱和/或表达水平；

(3)本发明方法中的选择性探针与经典的挂锁探针最显著的区别还包括：选择性探针形成环状单链DNA分子的过程需要DNA聚合酶和DNA连接酶，或者是逆转录酶和DNA连接酶的共同参与；在选择性探针序列中引入了通用序列，并且，该通用序列是后续多重PCR通用引物的结合位点；在选择性探针序列中引入了标签序列和/或尿嘧啶区，其中，标签序列为多重PCR产物的检测提供了简便途径(如：通用芯片)，而尿嘧啶区则为UNG酶提供了作用位点，它可使本发明方法中的延伸-连接反应过程中形成的环状单链DNA分子转变成单链DNA分子，从而避免了环状单链DNA分子在拓朴结构上对DNA聚合酶活性的抑制，提高PCR的扩增效率；

(4)本发明方法的选择性探针与分子倒置探针最显著的区别还包括：本发明的方法只需要一个PCR反应管，而且，反应体系同时含有四种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)；延伸-连接反应可以在逆转录酶和DNA连接酶的共同作用下形成环状单链DNA分子；

(5)本发明是一项全新的高通量选择性地同时扩增多个靶核酸的多重PCR方法。理论上通过高效聚合能力的DNA聚合酶或逆转录酶补平选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针5’-和3’-未端之间1bp以上的间隙后，再用DNA连接酶封闭缺口，并且，延伸-连接反应只进行一次，使得每个靶核苷酸的延伸-连接效率一致；同时，后继的PCR扩增是通用的，预期所有延伸-连接反应产物均能被等效扩增。

附图说明

图1是本发明的选择性探针结构示意图。

图2是图1所示的选择性探针1的PCR扩增原理示意图。

图3是图1所示的选择性探针2的PCR扩增原理示意图。

图4是图1所示的选择性探针3的PCR扩增原理示意图。

图5是图1所示的选择性探针4的PCR扩增原理示意图。

图6是实施例2的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

以下结合本发明的具体实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式的范围并不仅限于此。

实施例1

(1)构建选择性探针

图1是本发明的几个选择性探针结构示意图，由图1可见，本发明提供的选择性探针至少包括四个分区，其特征是选择性探针的中部是两个通用序列区(图1中的P1和P2区)，选择性探针的5′-和3′-端则是分别与靶双链核酸的同一条核酸单链或者靶单链核酸的5′-和3′-端互补的两个靶核酸互补区(图1中的C1、C2区)，并且，当起始核酸模板是RNA或mRNA时，选择性探针3′-端的靶核酸互补区可以是Olig d(T)(图1中的Oligo d(T)区)，Oligo d(T)的长度是8-40聚体。本发明提供的选择性探针中部的两个通用序列区之间还可以存在一个有1-10个尿嘧啶寡核苷酸的尿嘧啶区(图1中的尿嘧啶区)，或者，在选择性探针的5′-或3′-端中的任意一端的靶核酸互补区和通用序列区之间存在标签序列(图1中的标签序列区)，或者，择性探针同时具备上述两种特征。本发明提供的所有选择性探针的共有特征是：选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针的5′-和3′-末端至少相距1个碱基的间隔，并且，不同选择性探针的这种间隔可以存在差异。当使用本发明提供的选择性探针1、选择性探针2、选择性探针7或者选择性探针8等4种选择性探针中的任意一种时(图1)，在反应过程中形成的选择性探针-靶核酸杂交体中，靶向不同靶核酸的选择性探针的5′-和3′-末端之间的间隔距离至少相差1bp以上，或者，其PCR产物的长度直接存在差异，在此条件下，可直接通过PCR扩增产物的长度来判断待检样本中是否存在靶核酸；当使用本发明提供的发明方法使用选择性探针1、选择性探针2、选择性探针7或者选择性探针8等4种选择性探针之外的其它所有选择性探针中的任意一种时，在反应过程中形成的选择性探针-靶核酸杂交体中，靶向不同靶核酸的选择性探针的5′-和3′-末端之间的间隔距离可以不存在差异，在此条件下，不同靶核酸的PCR产物可通过PCR产物中标签序列来检测。

选择性探针的部分或全部碱基可以含有碱基类似物或碱基修饰物，所述碱基类似物或碱基修饰物包括肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或其它类似碱基。

选择性探针中的两个靶核酸互补区可以引入人工错配碱基，所述人工错配碱基是天然的A、T、C、G四种碱基或其类似物。

(2)延伸-连接反应：

延伸-连接反应体系包括待检样本的核酸序列作为起始核酸模板、靶向两种或两种以上靶核酸的选择性探针、四种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、DNA连接酶、DNA聚合酶和适当的缓冲体系，并且，缓冲体系至少包括DNA连接酶需要的辅助因子和DNA聚合酶需要的离子强度。整个延伸-连接反应体系经高温变性(90～99℃，2～10min)后，再进行适温复性、延伸和连接：

①变性：起始核酸模板可预先变性，或在加好一系列试剂后变性，使起始核酸模板单链化；变性温度通常是92-99℃，持续时间为1sec-10min，优选温度是94-96℃，变性时间2-5min。

②复性：将整个延伸-连接反应体系置于一定的温度中，使选择性探针5′-和3′-端的两个靶核酸互补区分别与靶双链核酸的同一条核酸单链或靶单链核酸的5′-和3′-端互补区相互退火，形成选择性探针-靶核酸杂交体(图2～5)；此温度通常是25-72℃，持续时间30sec～30min；优选温度45～65℃，持续时间5～15min。

③延伸-连接：在适当温度下，DNA聚合酶延伸选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针的3′-未端序列，按照5′→3′方向填补选择性探针3′-至5′-未端之间1bp以上的间隙。这里所述的DNA聚合酶不具备链置换和外切酶活性，因此，在链延伸至选择性探针的5′-未端后，DNA聚合酶即从靶核酸模板上脱落，此时，DNA连接酶封闭选择性探针的3′-和5′-未端之间的缺口，使选择性探针形成环状单链DNA分子。在此阶段，延伸与连接共存，所形成的环状单链DNA分子中具有与通用引物结合的通用序列，利用与通用序列对应的通用引物，可对环状单链DNA分子进行PCR扩增。当使用选择性探针2、选择性探针4、选择性探针6、选择性探针8、选择性探针10或用选择性探针12时(图1)，延伸-连接反应形成的环状单链DNA分子中就含有尿嘧啶区(图3、图5)；当使用选择性探针3至选择性探针6、选择性探针9至选择性探针12时(图1)，延伸-连接反应形成的环状单链DNA分子中就含有标签序列区(图4、图5)；当使用选择性探针4、选择性探针6、选择性探针10或选择性探针12时(图1)，延伸-连接反应形成的环状单链DNA分子中就同时含有标签序列区和尿嘧啶区(图5)。

当起始核酸模板是RNA或mRNA序列时，延伸-连接反应中使用逆转录酶代替DNA聚酶。

本发明的延伸-连接反应中的逆转录酶、DNA聚合酶和DNA连接酶可以是低温的，也可以是耐热的。反应体系中除了加入一种DNA连接酶外，也可加入2种或2种以上的DNA连接酶混合物。反应体系中除了加入一种DNA聚合酶外，也可加入2种或2种以上的DNA聚合酶混合物。反应体系中除了加入一种逆转录酶外，也可加入2种或2种以上的逆转录酶混合物。

(3)通用引物PCR扩增

①延伸-连接反应产物的处理：所述的选择性探针-靶核酸杂交体中的选择性探针经延伸-连接反应形成环状单链DNA分子后，经核酸外切酶去除延伸-连接反应产物中的单链或双链线性DNA，以及残留的四种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)；当使用选择性探针2、选择性探针4、选择性探针6、选择性探针8、选择性探针10或选择性探针12时(图1)，则可在随后使用UNG酶处理核酸外切酶酶切产物，使环状单链DNA分子变成线性单链DNA分子(图3、图5)；或者使用捕捉洗脱系统收集延伸-连接反应产物；或者不经处理直接进行PCR扩增。

②PCR扩增：延伸-连接反应产物经上述处理步骤后作为PCR扩增模板，使用与选择性探针的通用序列对应的一对通用引物对延伸-连接反应产物进行PCR扩增。PCR反应体系的构成包括：延伸-连接反应产物、一对通用引物、四种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、耐热DNA聚合酶及其适当的缓冲体系。利用通用引物，保证了每个延伸-连接反应产物均能被等效扩增。

捕捉洗脱系统包括：用链亲和素或亲和素捕捉的生物素酰化引物；用抗地高辛抗体捕捉的地高辛标记的产物；与磁珠或乳胶珠附着的互补寡核苷酸。

四种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)的一种或多种可以带有荧光素、生物素、地高辛、同位素，或者其它类似发光分子或适合分离扩增产物的标记分子，其特征是可扩增出带有荧光素、生物素、地高辛或者同位素的DNA。

通用引物部分或全部可以含有碱基类似物或碱基修饰物，所述碱基类似物或碱基修饰物包括肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或其它类似碱基，其特征是该修饰或标记的碱基可被定点引入到PCR扩增产物的DNA中。

通用引物可以带有荧光素、生物素、地高辛、同位素，或者其它类似发光分子或适合分离扩增产物的标记分子，其特征是可扩增出带有荧光素、生物素、地高辛或者同位素的DNA。

当起始核酸模板是RNA或mRNA序列时，延伸-连接反应产物可不经PCR扩增而直接用于后续步骤的检测。

(4)PCR扩增产物的检测

①基于PCR扩增产物长度的检测系统：靶向每一种靶核酸的选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针的5′-和3′-端的间隔距离不一样，使每一种靶核酸序列对应的PCR扩增产物的长度不一样，使用基于PCR产物长度的检测系统可判断待检样本中是否存在靶核酸和/或靶核酸的丰度。基于PCR扩增产物长度的检测系统包括琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺电泳、毛细胞管电泳和其它类似电泳技术。

②基于PCR扩增产物标签序列的检测系统：当使用含有标签序列的选择性探针时，PCR扩增产物中均含有标签序列，并且，每一种靶核酸序列的PCR扩增产物只含有一种特定的标签序列，因此，可基于标签序列来判断待检样本中是否存在靶核酸。基于PCR扩增产物中的标签序列的检测系统包括在其表面固定有与上述标签序列相同或互补的通用芯片、其它类似阵列或微珠技术，其特征是通用芯片、其它类似阵列或微珠技术的单个检测点均固定有与每种靶核酸PCR扩增产物中的标签序列相同或互补的短寡核苷酸片段，将PCR扩增产物与其杂交后，可通过杂交点的有无及其强度值来判断待检样本中是否存在靶核酸和/或靶核酸的拷贝数。

③基于实时荧光PCR或实时荧光定量PCR的检测系统：其特征是采用与选择性探针的标签序列相同或互补的寡核苷酸序列为靶向序列，或者采用与延伸-连接反应产物或PCR扩增产物中的靶核酸序列相同或互补的寡核苷酸序列为靶向序列，以延伸-连接反应产物或PCR扩增产物为PCR模板，采用基于TaqMan探针、分子信标或其它类似的实时荧光PCR或实时荧光定量PCR技术来检测待检样本中是否存在靶核酸和/或靶核酸的拷贝数。

④DNA片段的甲基化状态和/或模式的检测：当起始核酸模板是甲基化敏感限制性内切酶(MSRE)、MSRE同裂酶或McrBC酶切DNA，或者重亚硫酸盐修饰DNA时，除使用上述PCR扩增产物的检测方法与系统外，还包括：

当使用MSRE酶切基因组DNA时，待检样本可分为两组，本发明方法也分别在两个反应管内进行，其起始核酸模板分别是MSRE酶切前和酶切后DNA，此时，选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针的5′-和3′-未端至少跨过靶核酸的一个MSRE酶切位点，当分别对MSRE酶切前和酶切后基因组DNA进行相同的延伸-连接反应及随后的PCR扩增后，即可通过某个靶核酸扩增片段在两种扩增产物的有无来判断其甲基化状态和/或模式，例如，当A基因只存在于MSRE酶切前DNA为起始核酸模板的PCR扩增产物中时，则A基因是非甲基化DNA；当A基因只存在于MSRE酶切后DNA为起始核酸模板的PCR扩增产物中时，则A基因是甲基化DNA；当A基因同时分别存在于MSRE酶切前和酶切后DNA为起始核酸模板的PCR扩增产物中，则A基因是半甲基化DNA。

当使用MSRE及其同裂酶分别酶切DNA时，待检样本可分为两组，本发明方法也分别在两个反应管内进行，选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针的5′-和3′-未端至少跨过靶核酸的一个MSRE酶切位点，当分别对MSRE酶切后和MSRE同裂酶切后基因组DNA进行相同的延伸-连接反应及随后的通用引物PCR扩增后，即可通过某个靶核酸扩增片段在两种扩增产物的有无来判断其甲基化状态和/或模式，例如，当A基因只存在于MSRE酶切后DNA为起始核酸模板的PCR扩增产物中时，则A基因是甲基化DNA。

当使用MSRE和McrBC分别酶切基因组DNA时，待检样本分为两组，本发明方法也分别在两个反应管内进行，此时，选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针的5′-和3′-未端至少同时跨过一个MSRE酶切位点和McrBC酶切位点，当分别对MSRE酶切后和McrBC酶切后DNA进行相同的延伸-连接反应及随后的通用引物PCR扩增后，即可通过某个靶核酸扩增片段在两种扩增产物的有无来判断其甲基化状态和/或模式，例如，当A基因只存在于MSRE酶切后的DNA为起始核酸模板的PCR扩增产物中时，则A基因是甲基化DNA；当A基因只存在于McrBC酶切后的基因组DNA为起始核酸模板的PCR扩增产物中时，则A基因是非甲基化DNA；当A基因同时分别存在于MSRE酶切后和McrBC酶切后的基因组DNA为起始核酸模板的PCR扩增产物中，则A基因是半甲基化DNA。

当重亚硫酸盐修饰后的基因组DNA为起始核酸模板时，选择性探针5′-和3′-未端的最后4个碱基必须至少与靶核酸在重亚硫酸盐修饰前的一个CpG位点互补，其序列既可是CpG，也可是TpG，此时，当只有互补于CpG的选择性探针存在于PCR扩增片段时，则靶核酸序列是甲基化DNA；当只有互补于TpG的选择性探针存在于PCR扩增片段时，则靶核酸序列是非甲基化DNA；当对应于CpG和TpG的选择性同时分别存在于PCR扩增片段时，则靶核酸序列是半甲基化DNA。

当起始核酸模板是RNA、mRNA或cDNA序列时，本发明的方法可以同时高通量分析一个或多个基因的mRNA表达谱和/或表达水平：

当起始核酸模板RNA中含有mRNA，或者起始核酸模板直接是mRNA时，在延伸-连接反应中使用逆转录酶和DNA连接酶，延伸-连接反应产物可直接与表面固定有与其标签序列相同或互补的通用芯片、其它类似阵列或微珠技术，或者cDNA基因表达谱芯片、cDNA功能分类基因芯片、Oligo基因表达谱芯片、Oligo功能分类基因芯片或其它类似技术来直接检测mRNA表达谱和/或表达水平；或者，延伸-连接反应产物经过PCR扩增后再与表面固定有与其标签序列相同或互补的通用芯片、其它类似阵列或微珠技术，或者cDNA基因表达谱芯片、cDNA功能分类基因芯片、Oligo基因表达谱芯片、Oligo功能分类基因芯片或其它类似技术来检测mRNA表达谱和/或表达水平；

当起始核酸模板是cDNA时，PCR扩增产物可与表面固定有与其标签序列相同或互补的通用芯片、其它类似阵列或微珠技术，或者cDNA基因表达谱芯片、cDNA功能分类基因芯片、Oligo基因表达谱芯片、Oligo功能分类基因芯片或其它类似技术检测来mRNA表达谱和/或表达水平。

实施例2

本实例提供同时检测p16基因启动子区两个CpG岛序列的多重PCR方法。

(1)设计选择性探针

选择性探针P16-V1靶向Chr9：21，964，579-21，965，306(728bp)CpG岛序列，其序列如下：

5′P-CATTCGCTAAGTGCTCGGAGCAGAATCGTCCAGTCGCAGT GAGG CATGTACCGTCGTTGTAGTCCTCCTTCCTTGCCAAC-3′

其中，5′-和3′-端加粗序列是靶核酸互补区，5′-端靶核酸互补区与第9号染色体的21965049-21965068序列互补(图1中的C1区)，3′-端靶核酸互补区与第9号染色体的21965144-21965163的序列互补(图1中的C2区)；斜体(图1中的P1区)和下划线序列(图1中的P2区)是通用序列区。该选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针的5′-和3′-末端碱基间隔75bp；PCR产物的长度是155bp。

选择性探针P16-V2靶向Chr9：21，984，102-21，985，910(1809bp)CpG岛序列，其序列如下：

5′P-GAAGAGGAAAGAGGAAGAAGCGCAGAATCGTCCAGTCGCAGT G AGGCATGTACCGTCGTTGTGGCTCCTCCGCATTCTCC-3′

其中，5′-和3′-端加粗序列是靶核酸互补区，5′-端靶核酸互补区与第9号染色体的21985327-21985348序列互补(图1中的C1区)，3′-端靶核酸互补区与第9号染色体的21985705-21985722的序列互补(图1中的C2区)；斜体(图1中的P1区)和下划线序列(图1中的CP2区)是通用序列区。该选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针的5′-和3′-末端碱基间隔356bp；PCR产物的长度是436bp。

上述两种探针的5′-末端均在合成时进行了磷酸化修饰。

(2)延伸-连接反应

制备50μl反应混合液，包括以下成份：10ng基因组DNA模板，选择性探针P16-V1和P16-V2各14pmol，10nmol dNTPs(Promega)，2.5U Pfu DNAPolymerase(NEB)，0.5×Pfu DNA Polymerase Buffer(NEB)，20U Taq DNALigase(NEB)，0.5×Taq DNA Ligase Buffer(NEB)。延伸-连接的反应条件是：95℃5min，60℃15min。

(3)酶切处理延伸-连接反应产物

将2μl第(2)步制备的延伸连接反应产物取至一支新的PCR反应管，然后再加入10U Exonuclease I(NEB)和200U Exonuclease III(NEB)；37℃2min，95℃2min。

(4)PCR扩增

采用TaKaRa ExTaq HS DNA Polymerase试剂盒，制备25μl反应混合液，包括以下成份：1×ExTaq Buffer(Mg²⁺plus)，0.25mM dNTPs，0.625U TaKaRaExTaq HS DNA Polymerase，2.0μl上述第(3)步制备的酶切产物，10pmol引物1(5’-ACTGCGACTGGACGATTCTG-3’)，10pmol引物2(5’-GAGGCATGTACCGTCGTTGT-3’)。其中，引物1与上述选择性探针中的斜体字母代表的序列互补(图1中的P1区)，引物2与上述选择性探针中的下划线字母代表的序列(图1中的P2区)相同。反应混合液于下述PCR热循环条件进行扩增：94℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，共30个循环；72℃5min。

(5)PCR扩增产物的检测

采用2％琼脂糖凝胶电泳鉴定上述所述第(3)步的PCR扩增产物，其中，P16-V1选择性探针的PCR扩增产物长度是155bp，P16-V2选择性探针的长度是436bp(图6)。图6左侧泳道是DNA Maker，其片段大小依次是2000、1000、750、500、250、100bp，右侧泳道是PCR扩增产物。

由图可见，通过使用靶向不同靶核酸片段的选择性探针经杂交、延伸-连接反应后，可在随后的PCR扩增体系中采用通用引物达到对靶核酸片段的多重扩增，在简化了PCR反应件的同时，可达到对多个靶核酸片段的同时检测。

Claims (10)

1、一种基于选择性探针的多重PCR方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)构建选择性探针：

选择性探针的5’-端和3’-端分别设置一个与靶双链核酸序列的同一条核酸单链序列的5’-和3’-端或者靶单链核酸序列的5’-端和3’-端互补的互补区，两个互补区的中间部分设置为两个通用序列区；通用序列区与互补区直接相连，或者通过标签序列相连接；两个通用序列区直接相连，或者中间设置一个尿嘧啶区，通过尿嘧啶区的尿嘧啶寡核苷酸相连；

(2)延伸-连接反应：

将下列物质混合，进行延伸-连接反应：

①起始核酸模板；

②步骤(1)所构建的选择性探针；

③四种三磷酸脱氧核糖核苷酸，包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP；

④DNA连接酶和DNA聚合酶，及其相应的缓冲液体系；或者，逆转录酶和DNA聚合酶，及其相应的缓冲液体系；

(3)PCR扩增：

其中反应物包括：延伸-连接反应产物、与选择性探针的通用序列对应的一对通用引物、四种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP和dGTP)、DNA聚合酶及其相应的缓冲液体系；所述的一对通用引物，其中，一条通用引物与选择性探针的一个通用序列区的序列相同，另一条通用引物则与选择性探针另一个通用序列区的序列互补；

(4)检测PCR扩增产物，以确定待检样本中是否存在靶核酸和/或靶核酸的拷贝数。

2、根据权利要求1所述的一种基于选择性探针的多重PCR方法，其特征是，所述步骤(1)中所述的标签序列具有自身特异性，所述标签序列是长度为15～40聚体的寡核苷酸，所述标签序列的Tm值之差小于或等于5℃，相互之间以及与通用引物之间无交叉杂交，并且无发夹结构；所述标签序列与待检样本的物种基因组核酸序列无同源性或同源性较低。

3、根据权利要求1所述的一种基于选择性探针的多重PCR方法，其特征是，所述步骤(2)中所述的起始核酸模板包括基因组DNA、甲基化酶感限制性内切酶(MSRE)酶切DNA、MSRE同裂酶酶切DNA、McrBC酶切DNA、重亚硫酸盐修饰DNA、RNA、mRNA或cDNA核酸片段。

4、根据权利要求1所述的一种基于选择性探针的多重PCR方法，其特征是，所述步骤(1)中所述的选择性探针的部分或全部碱基含有碱基类似物或碱基修饰物；或者

选择性探针中的两个靶核酸互补区引入人工错配碱基，所述人工错配碱基是天然的A、T、C、G四种碱基或其类似物；或者

当起始核酸模板是RNA或mRNA时，选择性探针3′-端的靶核酸互补区是Oligo d(T)，Oligo d(T)的长度是8～40聚体。

5、根据权利要求1所述的一种基于选择性探针的多重PCR方法，其特征是，所述步骤(3)中所述的通用引物标记有荧光分子、发光基团、生物素、地高辛分子或同位素，或其它类似发光分子或适合分离扩增产物的标记分子；或者

通用引物部分或全部碱基含有碱基类似物或碱基修饰物；或者

四种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)的一种或多种标记有荧光分子、发光基团、生物素、地高辛分子、同位素，或其它类似发光分子或适合分离扩增产物的标记分子。

6、根据权利要求1所述的一种基于选择性探针的多重PCR方法，其特征是，所述步骤(2)延伸-连接反应后，还可对延伸-连接反应产物进行如下处理：采用线性单链或双链DNA特异性核酸外切酶处理延伸-连接反应产物，使处理完毕后，延伸-连接反应产物中仅有环状单链DNA分子保持完整性；或者

采用尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)处理延伸-连接反应产物，使处理完毕后，环状单链DNA分子解体为线性单链DNA分子。

7、权利要求1至6任一所述方法在检测DNA片段或CpG岛的甲基化状态和模式方面的应用，其特征是，按照权利要求1所述步骤对DNA片段或CpG岛进行检测，其中：

(1)起始核酸模板是MSRE酶切前或酶切后DNA，并且，选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针的5’-和3’-未端至少跨过靶核酸序列的一个MSRE酶切位点；

(2)起始核酸模板是MSRE同裂酶酶切前或酶切后DNA，并且选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针的5’-和3’-未端至少跨过靶核酸序列的一个MSRE酶切位点；

(3)起始核酸模板是McrBC酶切前或酶切后DNA，并且，选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针的5’-和3’-未端至少跨过一个McrBC酶切位点；

(4)起始核酸模板是重亚硫酸盐修饰DNA，并且，选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针5’-和3’-未端的4个碱基至少与靶核酸甲基化CpG在重亚硫酸盐修饰后仍保持不变的一个CpG位点互补，或者，至少与靶核酸非甲基化CpG在重亚硫酸盐修饰后转变成的一个TpG位点互补；

(5)起始核酸模板是重亚硫酸盐修饰DNA，并且，选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针5’-和3’-端的两个靶核酸互补区不含有与靶核酸CpG在重亚硫酸盐修饰后仍然保持不变的CpG位点或者转变成的TpG位点的互补序列；

(6)起始核酸模板是重亚硫酸盐修饰DNA，并且，选择性探针-靶核酸杂交体中选择性探针5’-和3’-端的两个靶核酸互补区中的一个靶核酸互补区符合上述第(4)种所述特征，并且，另一个靶核酸互补区符合上述第(5)种所述特征。

8、权利要求1至6任一所述方法在检测mRNA表达谱和/或表达水平方面的应用，其特征是，按照权利要求1所述步骤对mRNA表达谱和/或表达水平进行检测，其中

起始核酸模板是mRNA，或者是含有mRNA的RNA，并且，使用表面固定有与选择性探针的标签序列相同或互补寡核苷酸的通用芯片、其它类似阵列或微珠技术，或者cDNA基因表达谱芯片、cDNA功能分类基因芯片、Oligo基因表达谱芯片、Oligo功能分类基因芯片或其它类似技术直接检测延伸-连接反应产物；或者

起始核酸模板是cDNA、mRNA，或者是含有mRNA的RNA，使用表面固定有与选择性探针的标签序列相同或互补寡核苷酸的通用芯片、其它类似阵列或微珠技术，或者cDNA基因表达谱芯片、cDNA功能分类基因芯片、Oligo基因表达谱芯片、Oligo功能分类基因芯片或其它类似技术检测PCR扩增产物。

9、权利要求1至6任一所述方法在检测靶核酸和/或靶核酸拷贝数方面的应用，其特征是，按照权利要求1所述步骤对靶核酸和/或靶核酸拷贝数进行检测，其中

(1)使用琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺电泳、毛细胞管电泳和其它类似电泳技术检验PCR扩增产物；

(2)使用表面固定有与选择性探针的标签序列相同或互补寡核苷酸的通用芯片、其它类似阵列或微珠技术检测PCR扩增产物；

(3)采用以选择性探针的标签序列为靶向序列的TaqMan探针、分子信标或其它类似的实时荧光PCR或实时荧光定量PCR技术来检测延伸-连接反应产物；

(4)采用以选择性探针的标签序列为靶向序列的TaqMan探针、分子信标或其它类似的实时荧光PCR或实时荧光定量PCR技术来检测PCR扩增产物。

10、权利要求1至6任一所述方法用于检测待检标本中是否存在靶核酸和/或靶核酸拷贝数的试剂盒。

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