CN107406874B - 用于检测CpG甲基化和诊断癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物基因组学领域，并且特别地涉及检测高甲基化DNA的存在或不存在。DNA标记中CpG甲基化的检测可用于癌症的诊断，并且本发明为此提供了改进的方法。这些改进的方法特别地允许在未甲基化DNA标记的高背景下更灵敏地检测甲基化DNA标记。

Description

用于检测CpG甲基化和诊断癌症的方法
技术领域
本发明涉及药物基因组学领域，并且特别地涉及检测高甲基化DNA的存在或不存在.DNA标记中CpG甲基化的检测可用于癌症和癌症亚型的诊断，并且本发明为此提供了改进的方法.这些改进的方法特别地允许在未甲基化DNA标记的高背景下更灵敏地检测甲基化DNA标记.
背景技术
超过65年前，Mandel和Metais首次描述了在人中存在细胞外核酸的观察结果(Mandel P，Metais P.Les acides nucleiques du plasma sanguin chez l′homme.C.R.Acad.Sci.Paris 142，241-243.1948)，并且在四十多年后，可以明确证明，在从血浆、血清和其他体液分离的无细胞核酸中可以发现肿瘤相关的遗传改变(FleischhackerM，Schmidt B.(2007)Circulating nucleic acids(CNAs)and cancer--a survey.BiochimBiophys Acta 1775：181-232；Jung K，Fleischhacker M，Rabien A.(2010)Cell-free DNAin the blood as a solid tumor biomarker-a critical appraisal of theliterature.Clin Chim Acta 411：1611-1624).这包括在不同形式的恶性肿瘤中观察到的表观遗传改变.DNA甲基化是哺乳动物染色质的标志，并且已知在CpG二核苷酸背景下的胞嘧啶甲基化在调节发育中发挥作用并且在例如胚胎发生和细胞分化的基本生物学过程具有重要意义(Smith ZD，Meissner A.(2013)DNA methylation：roles in mammaliandevelopment.Nat Rev Genet 14：204-220；Gibney ER，Nolan CM.(2010)Epigenetics andgene expression.Heredity(Edinb)105：4-13).因此，甲基化不仅调节基因转录，而且还在维持基因组稳定性、印记(imprinting)和X染色体失活中起重要作用.癌基因和肿瘤抑制基因中的表观遗传改变在癌症发生中具有关键的重要性(Suva ML，Riggi N，Bernstein BE.(2013)Epigenetic reprogramming in cancer.Science 339：1567-1570)。DNA甲基化模式在癌细胞中极大改变，因此可用于区分癌细胞与正常组织。因此，DNA甲基化模式被用于诊断所有类型的癌症。比较近的理念是使用从肿瘤释放到例如血液的游离循环肿瘤DNA进行甲基化分析，作为患者体内肿瘤负荷的指示.这种用非常灵敏且高度特异性的方法从肿瘤患者分离并表征细胞外核酸的能力导致产生术语“液体活检”.因此，医生不再仅依赖于组织活检和全身扫描的单一检查.在这样的液体活检中，在未甲基化非肿瘤DNA的高背景下检测少量的甲基化肿瘤DNA极大地挑战了该检测方法的灵敏度.而使用基于在重亚硫酸盐转化(bisulfite conversion)后选择性地扩增甲基化肿瘤DNA的技术(例如甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP)，尤其是HeavyMethylTM(HM)技术)已取得了非常好的结果(Cottrell等，A real-time PCR assay for DNA-methylation using methylation-specific blockers.Nucleic Acids Res.2004年1月13日；32(1)：e10).
癌症越早期，治疗选择和治愈患者的机会就越好.因此，非常期望尽可能早地诊断癌症.然而，较早期癌症(其意味着肿瘤尺寸较小且癌细胞较少)释放较少的游离循环肿瘤DNA.这由于以下事实而加剧：细胞外核酸的半衰期相当短，例如在血浆中短于6小时(RagoC，Huso DL，Diehl F，Karim B，Liu G等.(2007)Serial assessment of human tumorburdens in mice by the analysis of circulating DNA.Cancer Res 67：9364-9370).因此，检测方法越灵敏，则可以越早地可靠诊断或完全诊断癌症.由此，本领域需要以提高的灵敏度检测DNA甲基化的方法.
对于灵敏检测，HeavyMethylTM或HM(引物甲基化非特异性地结合，但是被甲基化特异性地阻断，并且因此当在之前的扩增循环中未能阻断时，即使不想要的模板以最小水平产生，也将重新阻断)被认为是与MSP(其特异性地引发甲基化，因此在发生错误引发(mispriming)的情况下仍引入完全匹配模板，所述模板然后以指数方式扩增)相比而言的首选.HM的优点似乎要与一个缺点进行权衡：广泛接受的理论是，针对该阻断剂的富含CpG的部分需要与没有CpG的引发位点并排。这极大地限制了待分析位点或区域的选择，因为在给定的靶DNA中只有这么多合适的位点或区域.
由于设计限制(不期望的CpG位点、SNP等)，用于HM的甲基化测定在过去使用大小长至150bp的扩增子，本发明人认为HM普遍也适于处理循环肿瘤DNA中的DNA片段化.多年的经验和结果比较向本发明人显示，这样长度的癌症标记测定在含有癌细胞的样品中非常有用(全尺寸高分子量基因组肿瘤DNA)，并且当应用于其中靶标是游离循环DNA(预期这样的DNA是至少部分片段化的)的液体活组织/体液时也有用。
发明人现在已经发现：出乎意料地，进一步减小扩增产物(amplificate)的尺寸导致远远更好的扩增(在循环肿瘤DNA中发现甚至不依赖于DNA片段化)，给出显著改善的信号：这在未甲基化非肿瘤DNA的高背景下其原始模板(即，甲基化肿瘤DNA)稀少时尤其有用.据本发明人所知，将减小扩增子尺寸作为主要设计目标而不关注其他问题(例如，不期望的CpG位点、SNP等)的研究之前尚未进行，因为小尺寸极大地限制了待分析位点或区域的选择：由于存在可能被引物覆盖的CpG位点，所述引物对于使用HeavyMethylTM的灵敏检测必须是甲基化非特异性的，因此合适的位点或区域更少.此外，SNP位点不应被引物覆盖，因为如果引物对SNP的特定核苷酸是特异性的，则会使灵敏度偏倚.
本发明人还出乎意料地发现，在HM引物中的CpG位点(或SNP位点)中引入错配(对于CpG位点中的胞嘧啶位置，通过引入例如以下错配来实现甲基化非特异性：C＝C、T＝C、C＝T或T＝T错配，其中第一碱基在引物中，第二碱基在重亚硫酸盐DNA有义模板中，或者A＝G、G＝G、A＝A或G＝A错配，其中第一碱基在引物中，第二碱基在重亚硫酸盐合成反向互补链中)并不会引入较差的阻断或非特异性引发，即使错配位置位于引物中间(并且不限于预期负面影响较小的邻近引物5’端的位置)也是如此，而不仅是在通过设计(例如延伸)调节整体引物结合焓(enthalpy)时.事实上，有证据表明这样的构建体甚至可被更好地阻断.本发明人认为，这可能是因为被阻断引物的不稳定性与仍良好退火的未阻断引物相比甚至更高.
根据这些发现调整的用于检测癌症的方法将通过提供最有希望的治疗时间窗的可能性来改善癌症患者的护理。
发明概述
在第一方面，本发明涉及一种用于在包含基因组DNA的样品中检测高甲基化(hypermethylated)靶DNA的存在或不存在的方法.
在第一方面的第一基本实施方案中，其涉及一种用于在包含基因组DNA的样品中检测高甲基化靶DNA的存在或不存在的方法，其中所述基因组DNA是至少部分片段化的，所述方法包括以下步骤：
(a)将DNA中5位未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交的另一碱基；
(b)使用甲基化非特异性引物寡核苷酸和至少一种以甲基化特异性方式阻断扩增的甲基化特异性阻断剂来扩增转化的靶DNA的区域，其中所述区域的长度小于100个碱基对(bp)，并且包含基因组DNA的至少3个CpG位点；以及
(c)检测步骤(b)中扩增的DNA的存在或不存在，
其中扩增的DNA的存在或不存在分别反映样品中高甲基化靶DNA的存在或不存在.
在第一方面的第二基本实施方案中，其涉及一种用于在包含基因组DNA的样品中检测高甲基化靶DNA的存在或不存在的方法，其包括以下步骤：
(a)将DNA中5位未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交的另一碱基；
(b)使用甲基化非特异性引物寡核苷酸和至少一种以甲基化特异性方式阻断扩增的甲基化特异性阻断剂来扩增转化的靶DNA的区域，其中至少一种引物寡核苷酸：(1)覆盖至少一个CpG位点，其具有与CpG位点的胞嘧啶碱基位置相关的甲基化非特异性错配或间隔物，和/或(2)覆盖至少一个SNP位点，其具有SNP非特异性错配或间隔物；以及
(c)检测步骤(b)中扩增的DNA的存在或不存在，
其中扩增的DNA的存在或不存在分别反映样品中高甲基化靶DNA的存在或不存在.
在第二方面，本发明涉及一种用于在对象中检测癌症的存在或不存在的方法，其包括根据第一方面用于在包含基因组DNA的样品中检测高甲基化靶DNA的存在或不存在的方法，其中：
-所述样品是来源于对象的样品，在患有所述癌症的对象中其包含癌细胞的肿瘤DNA，
-所述靶DNA在患有所述癌症的患者的癌细胞中是高甲基化的，并且
-所述样品中高甲基化靶DNA的存在或不存在分别指示所述对象中所述癌症的存在或不存在。
在第三方面，本发明涉及一种甲基化非特异性引物寡核苷酸，其适于与另一引物寡核苷酸一起用于由其中5位未甲基化的胞嘧啶已被转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交之另一碱基的基因组DNA的单链产生扩增产物，其中至少一种引物寡核苷酸覆盖至少一个CpG位点，其具有与CpG位点的胞嘧啶碱基位置相关的甲基化非特异性错配或间隔物.
在第四方面，本发明涉及一种适于进行第一方面之方法的试剂盒.
在第四方面的第一基本实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，其包含：
(i)至少一个由正向引物和反向引物组成的甲基化非特异性引物寡核苷酸对，其中所述引物对适于由其中5位未甲基化的胞嘧啶已被转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交之另一碱基的基因组DNA的单链产生扩增产物，其中所述基因组DNA是至少部分片段化的，并且其中所述扩增产物的长度小于100bp且包含所述基因组DNA的至少3个CpG位点；以及
(ii)至少一种能够以甲基化特异性方式阻断扩增的甲基化特异性阻断剂.
在第四方面的第二基本实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，其包含：
(i)至少一个由正向引物和反向引物组成的甲基化非特异性引物寡核苷酸对，其中所述引物对适于由其中5位未甲基化的胞嘧啶已被转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交之另一碱基的基因组DNA的单链产生扩增产物，其中所述扩增产物在引物结合位点之间的区域中包含基因组DNA的至少3个CpG位点，并且其中至少一种引物寡核苷酸：(1)覆盖至少一个CpG位点，其具有与CpG位点的胞嘧啶碱基位置相关的甲基化非特异性错配或间隔物，和/或(2)覆盖至少一个SNP位点，其具有SNP非特异性错配或间隔物；以及
(ii)至少一种能够以甲基化特异性方式阻断扩增的甲基化特异性阻断剂.
在第五方面，本发明涉及第三方面的甲基化非特异性引物寡核苷酸或第四方面的试剂盒用于在对象中检测癌症的存在或不存在的用途.
附图说明
图1：优选靶区域的图谱。A：SHOX2，B：PTGer4，C：FOXL2。参见表1对于SEQ ID NO的说明。
图2：一些测定示例。参考和测定DNA序列在构建的GRCh38基因组的有义取向上.测定序列及其元件与基因组参考序列(基因组，示出了两条链)在中间对齐.在此，未划掉的链提供了作为测定模板相关的经重亚硫酸盐转化的链.划掉的反向互补基因组链与测定无关，但为了完整性而示出.在基因组参考序列的顶部和底部，示出了两条衍生序列：作为用于扩增之初始模板的重亚硫酸盐链(bis.)，及其在通过扩增合成之前不可获得的反向互补链(synth).这些序列中哪一个在顶部或底部取决于构建的基因组中的序列取向.所有DNA单链序列根据其取向在两端注明3’和5’.命名法使用IUPAC碱基：Y意指C或T(取决于CpG背景中胞嘧啶的未知甲基化状态)，R意指G或A(CpG位置中甲基化状态未知的胞嘧啶的反向互补碱基).引物序列用下划线序列示出.与测定和参考序列对齐地示出了其他寡聚物如阻断剂和探针——在需要反向序列的情况下(在测定序列的反向链上匹配)，其另外以灰色文本颜色示出.CpG背景下的胞嘧啶、其在相对链上的对应物和/或探针或阻断剂中间接或直接询问(interrogate)它们的任何碱基以灰色背景的粗体字符示出(例如，
Figure BPA0000243590210000061
或
Figure BPA0000243590210000062
).在不同情况下使用大写字母：对于所有的基因组参考序列、对于与重亚硫酸盐模板反向互补的合成链的碱基(不包括引物)，以及对于重亚硫酸盐产物中的DNA甲基化测量相关的位置.引物区域中作为CpG背景中的胞嘧啶或SNP的碱基通过黑色背景的白色字体(例如
Figure BPA0000243590210000063
)突出显示，所述碱基对于所有可能的状态均通过在引物中引入错配来排除对PCR的影响.重亚硫酸盐模板链中由CpG背景以外的胞嘧啶衍生的胸苷(首先通过脱氨基成尿嘧啶，随后在PCR中用胸苷置换)以斜体示出(例如，t).
图3：引物中间没有错配的FOXL2的90bp实时PCR测定和在一个引物中间具有甲基化非特异性错配的FOXL2的68bp的比较，所述测定使用技术样品用其阻断剂和探针覆盖并且评估了完全相同的CpG.
图4：引物中间没有错配的FOXL2的90bp实时PCR测定和在一个引物中间具有甲基化非特异性错配的FOXL2的68bp的比较，所述测定使用未经掺加和掺加有50pg甲基化DNA的对标记呈阴性(不含甲基化FOXL2)和略阳性(包含约50pg水平的甲基化FOXL2)的血浆样品用其阻断剂和探针覆盖并且评估了完全相同的CpG.
图5：使用技术样品(左上)、未经掺加血浆和以不同水平掺加的血浆(右上)以及来自肺癌和健康患者之血浆样品(底部)的在一个引物中间具有甲基化非特异性错配的FOXL2的68bp的表现。技术样品和经掺加血浆的PCR以一式三份进行.底图示出了需要将曲线用于确定Ct的1.3HEX信号的循环阈值(Cycle threshold，Ct)截止值.在该截止值处，仅可评估癌症患者，来自健康患者的信号低于该阈值.
图6：以ACTB作为参考在二重反应中通过实时PCR评估的与来自健康个体之血浆对照相比的来自肺癌患者之血浆样品中的SHOX2甲基化.将来自肺癌患者的59份样品与92份健康对照进行比较.计算的AUC＝0.871.标记点分别是95％灵敏度和95％特异性的阈值.
图7：以另一种甲基化标记和ACTB作为参考在三重反应中通过实时PCR评估的与来自健康个体之血浆对照相比的来自肺癌患者之血浆样品中的SHOX2甲基化.将来自肺癌患者的48份样品与100份健康对照进行比较.计算的AUC＝0.893(对于独立于所使用的另一种甲基化标记进行评估的SHOX2来计算).标记点分别是95％灵敏度和95％特异性的阈值.
图8：以另一种甲基化标记和ACTB作为参考在三重反应中通过实时PCR评估的与患有不同肺病之血浆对照相比的来自肺癌患者之血浆中的SHOX2甲基化.将来自肺癌患者的50份血浆样品与来自患有良性肺病的个体的50份血浆对照进行比较.计算的AUC＝0.834(对于独立于所使用的另一甲基化标记进行评估的SHOX2来计算).标记点分别是95％灵敏度和95％特异性的阈值.
发明详述
在下面详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文所描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以变化.还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案之目的，并不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限制.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义.
优选地，本文使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms：(IUPAC Recommendations)”，Leuenberger，H.GW，Nagel，B.和
Figure BPA0000243590210000071
H.编辑.(1995)，Helvetica Chimica Acta，(CH-4010Basel，瑞士)中所述进行定义。
在本说明书的文本通篇引用了数篇文献。无论是在上文还是在下文，本文引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明等)均在此通过引用整体并入。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明由于在先的发明而不认为其早于这些公开内容.
在下文，将对本发明的要素进行说明.这些要素随着一些具体实施方案列出，然而，应当理解，其可以以任何方式和任何数量组合以产生另外的一些实施方案.多种描述的实施例和优选实施方案不应被解释为将本发明仅限于所明确描述的实施方案.该描述应被理解为支持并包括将明确描述的实施方案与任意数量的公开和/或优选要素进行组合的实施方案.此外，除非上下文另外说明，否则本申请中所有所述要素的任何排列和组合应均被视为通过本申请的描述而公开.
在本说明书和所附权利要求书通篇，除非上下文另外要求，否则词语“包括/包含”及其变化形式应理解为暗示包括所述整体或步骤或者整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或者整体或步骤的组.如本说明书和所附权利要求中所使用的，除非内容明确另外指出，否则未用数量词修饰的名词包括一个/种和/或更多个/种.
本发明的一些方面及其具体实施方案
本发明涉及上文在发明概述中示出的数个方面.这些方面包括以下描述的一些替代实施方案和优选实施方案.
在第一方面，本发明涉及一种用于在包含基因组DNA的样品中检测高甲基化靶DNA的存在或不存在的方法.
在第一方面的第一基本实施方案中，本发明涉及一种用于在包含基因组DNA的样品中检测高甲基化靶DNA的存在或不存在的方法，其中所述基因组DNA是至少部分片段化的，所述方法包括以下步骤：
(a)将DNA中5位未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交的另一碱基；
(b)使用甲基化非特异性引物寡核苷酸和至少一种以甲基化特异性方式阻断扩增的甲基化特异性阻断剂来扩增转化的靶DNA的区域，其中所述区域的长度小于100个碱基对(bp)，并且包含基因组DNA的至少3个不被引物覆盖的CpG位点；以及
(c)检测步骤(b)中扩增的DNA的存在或不存在，
其中扩增DNA的存在或不存在分别反映样品中高甲基化靶DNA的存在或不存在。
优选地，步骤(b)的至少一种引物寡核苷酸：(1)覆盖至少一个CpG位点，其具有与CpG位点的胞嘧啶碱基位置相关的甲基化非特异性错配或间隔物，和/或(2)覆盖至少一个SNP位点，其具有SNP非特异性错配或间隔物.
在第一方面的第二基本实施方案中，本发明涉及一种用于在包含基因组DNA的样品中检测高甲基化靶DNA的存在或不存在的方法，其包括以下步骤：
(a)将DNA中5位未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交的另一碱基；
(b)使用甲基化非特异性引物寡核苷酸和至少一种以甲基化特异性方式阻断扩增的甲基化特异性阻断剂来扩增转化的靶DNA的区域，其中所述区域包含基因组DNA的至少3个不被引物覆盖的CpG位点，其中至少一种引物寡核苷酸：(1)覆盖至少一个CpG位点，其具有与CpG位点的胞嘧啶碱基位置相关的甲基化非特异性错配或间隔物，和/或(2)覆盖至少一个SNP位点，其具有SNP非特异性错配或间隔物；以及
(c)检测步骤(b)中扩增的DNA的存在或不存在，
其中扩增的DNA的存在或不存在分别反映样品中高甲基化靶DNA的存在或不存在.
优选地，所述区域的长度小于100个碱基对(bp).
在下文，描述了第一方面的第一和第二两个基本实施方案的一些优选实施方案：
在一个优选实施方案中，所述区域的长度为小于100、99、98、97、96、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61或60bp，优选地长度为小于97、92、84、73、72、69或67bp.所述区域的优选范围为50至99bp，更优选60至99pb，并且最优选60或66至96bp、60或66至91、60或66至83、60或66至72、60或66至71、或者60或66至68.特别地(并且不依赖于其他标记的一般长度)，所述区域对于SHOX2而言长度为小于92bp，对于PTGER4而言长度为小于97、84或67bp，和/或对于FOXL2而言长度为小于73、72或69bp(相应适用的范围，即50、优选60或66至91(SHOX2)，至96、83或66(PTGER4)，或者至72、71或68(FOXL).在每个前述长度的情况下，所述区域包含基因组DNA的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个CpG位点，优选不被引物覆盖的CpG位点.优选地，这些CpG位点中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个(但是未必全部，特别是被间隔物或甲基化非特异性错配覆盖的CpG位点)在高甲基化靶DNA中必须是甲基化的以产生和/或可检测扩增子.
在一个优选实施方案中，每个引物的错配和间隔物(包括CpG位点和SNP位点二者相关的错配和间隔物)的总数为1、2或3，更优选1或2，并且最优选1.设想仅一个引物或两个引物都包含错配.如果两个引物都包含错配，则一个引物中错配的数目与另一个引物中错配的数目无关.
在一个优选实施方案中，至少一个错配或间隔物，优选全部错配和间隔物在引物寡核苷酸3’端的10个核苷酸内和/或不在引物寡核苷酸5’端的5个核苷酸内.而且，优选的是，至少一个错配或间隔物，优选全部错配和间隔物在引物寡核苷酸的中间三分之一或3’端的三分之一内.
在一个优选实施方案中，在步骤(b)中，至少一种以甲基化特异性方式阻断扩增的甲基化特异性阻断剂在靶DNA的区域的CpG位点阻断所述区域的扩增，优选在阻断剂覆盖的CpG位点未甲基化的情况下阻断所述区域的扩增.因此，仅高甲基化靶DNA被扩增.
在一个优选实施方案中，在步骤(c)中，使用探针，优选探针寡核苷酸来检测在步骤(b)中扩增的DNA的存在或不存在.
在一个优选实施方案中，考虑到CpG位点的胞嘧啶碱基位置(其为C或由于转化和后续扩增而为U/T)，甲基化非特异性错配为：对于由步骤(a)得到的DNA为T或C分别代替匹配的A或G，或者对于由步骤(a)得到的DNA直接在第一扩增循环中产生的链为A或G分别代替匹配的C或T。
在一个优选实施方案中，所述靶DNA是基因组人SHOX2、PTGER4或FOXL2 DNA，包括各自的启动子区以及其上游和下游5、4、3、2或1kb内的DNA.优选地，所述靶DNA是基因组人SHOX2、PTGER4或FOXL2 DNA.对于SHOX2，靶DNA优选地具有根据SEQ ID NO：101，更优选根据SEQ ID NO：106，甚至更优选根据SEQ ID NO：111，并且最优选根据SEQ ID NO：116的序列。对于PTGER4，靶DNA优选地具有根据SEQ ID NO：51，更优选根据SEQ ID NO：56，甚至更优选根据SEQ ID NO：61，甚至更优选根据SEQ ID NO：66、71、76或81之一，并且最优选根据SEQID NO 86、91或96之一的序列.对于FOXL2，靶DNA优选地具有根据SEQ ID NO：1，更优选根据SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：11，甚至更优选根据SEQ ID NO：16、21、26或31之一，并且最优选根据SEQ ID NO：36、41或46之一的序列(所有均为转化前；显示SHOX2、PTGER4和FOXL2的优选靶区域的关系的图谱示出在图X中).
在第二方面，本发明涉及一种用于在对象中检测癌症的存在或不存在的方法，其包括根据第一方面用于在包含基因组DNA的样品中检测高甲基化靶DNA的存在或不存在的方法，其中：
-所述样品是来源于对象的样品，在患有所述癌症的对象中其包含癌细胞的肿瘤DNA，
-所述靶DNA在患有所述癌症的患者的癌细胞中是高甲基化的，并且
-所述样品中高甲基化靶DNA的存在或不存在分别指示所述对象中癌症的存在或不存在.
在一个优选实施方案中，所述癌症是选自下述组的癌症(参见定义相关部分).优选地，所述癌症是包含其中SHOX2、PTGER4和/或FOXL2相关区域高甲基化的癌细胞的癌症.更优选地，所述癌症是肺癌或结肠直肠癌，最优选地，所述癌症是肺癌.更具体地，其优选为对于SHOX2、PTGER4或FOXL2的肺癌，或者对于PTGER4或FOXL2，更优选对于FOXL2的结肠直肠癌.在每种情况下，所述癌症可以是上述肺癌和结肠直肠癌的任何亚型.在一个更优选的实施方案中，肺癌或结肠直肠癌的阶段为高至任意III期.更优选地，所述癌症对于肺癌处于0、IA、IB、IIA或IIB期(优选0、IA和/或IB期中的一个或更多个)，或者对于结肠直肠癌处于0、I、IIA、IIB或IIC期(优选0和/或IA期中的一个或更多个)。
在一个优选实施方案中，用成像测试(例如PET、CT、MRI、X射线或超声)、内窥镜检查术和/或组织活检的显微术评估来确定指示的癌症存在。
与第二方面相关，本发明还涉及一种向患有癌症的对象指示(refer)癌症治疗的方法，其包括根据第二方面在对象中检测癌症的存在或不存在，并且如果检测到癌症的存在，向该对象指示癌症治疗.
与第二方面相关，本发明还涉及一种治疗患有癌症的对象的方法，其包括根据第二方面在对象中检测癌症的存在，并如上所述用一种或更多种癌症治疗来治疗该对象.
与第二方面相关，本发明还涉及一种护理怀疑患有癌症的对象的方法，其包括根据第二方面在对象中检测癌症的存在或不存在，并且如果检测到癌症的存在，分别根据上文转治或治疗该对象.
在第三方面，本发明涉及一种甲基化非特异性引物寡核苷酸，其适于与另一引物寡核苷酸一起用于由其中5位未甲基化的胞嘧啶已被转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交之另一碱基的基因组DNA的单链产生扩增子，其中至少一种引物寡核苷酸：(1)覆盖至少一个CpG位点，其具有与CpG位点的胞嘧啶碱基位置相关的甲基化非特异性错配或间隔物，和/或(2)覆盖至少一个SNP位点，其具有SNP非特异性错配或间隔物.
优选地，引物寡核苷酸的长度为15至30、更优选19至25个核苷酸.
在一个优选实施方案中，所述基因组DNA的单链是人SHOX2、PTGER4或FOXL2 DNA的，包括各自的启动子区以及其上游和下游5、4、3、2或1kb内的DNA(在本文也称为人SHOX2、PTGER4或FOXL2相关区域).优选地，其来自基因组人SHOX2、PTGER4或FOXL2 DNA.对于SHOX2，基因组DNA的单链优选地具有根据SEQ ID NO：101，更优选根据SEQ ID NO：106，甚至更优选根据SEQ ID NO：111，并且最优选根据SEQ ID NO：116的序列(转化前)；或者，各自与其反向互补的序列.对于PTGER4，靶DNA优选地具有根据SEQ ID NO：51，更优选根据SEQ IDNO：56，甚至更优选根据SEQ ID NO：61，甚至更优选根据SEQ ID NO：66、71、76或81之一，并且最优选根据SEQ ID NO 86、91或96之一的序列(转化前)；或者，各自与其反向互补的序列.对于FOXL2，靶DNA优选地具有根据SEQ ID NO：1，更优选根据SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：11，甚至更优选根据SEQ ID NO：16、21、26或31之一，并且最优选根据SEQ ID NO：36、41或46之一的序列；或者，各自与其反向互补的序列(所有均为转化前；显示SHOX2、PTGER4和FOXL2的优选靶区域的关系的图谱示出在图X中)。
在一个优选实施方案中，引物寡核苷酸具有与根据以下的序列的15至30个核苷酸长区段基本上相同的序列：
(a)SEQ ID NO：102、103、104或105；
(b)SEQ ID NO：52、53、54或55；或者
(c)SEQ ID NO：2、3、4或5；
其中相对于基因组DNA(即，各SEQ ID衍生自的未经转化DNA，参见表1)基本上相同的序列包含至少一个与CpG位点的胞嘧啶碱基位置相关的甲基化非特异性错配或间隔物.
对于(a)，引物寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：(107、108、109或110)，更优选根据SEQ ID NO：(112、113、114或115)，最优选根据SEQ ID NO：(117、118、119或120)的序列的15至30个核苷酸长区段基本上相同的序列.对于(b)，引物寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：(57、58、59或60)，更优选根据SEQ ID NO：(62、63、64或65)，甚至更优选根据SEQ ID NO：(67、68、69或70)、SEQ ID NO：(72、73、74或75)、SEQ ID NO：(77、78、79或80)或SEQ ID NO：(82、83、84或85)之一，并且最优选根据SEQ ID NO：(87、88、89或90)、SEQ ID NO：(92、93、94或95)或SEQ ID NO：(97、98、99或100)之一的序列的15至30个核苷酸长区段基本上相同的序列.对于(c)，引物寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：(7、8、9或10)或SEQ ID NO：(12、23、24或15)，更优选根据SEQ ID NO：(17、18、19、20)、SEQ ID NO：(22、23、24或25)、SEQ ID NO：(27、28、29或30)或SEQ ID NO：(32、33、24或35)之一，并且最优选根据SEQ ID NO：(37、38、39或40)、SEQ ID NO：(42、43、44或45)或SEQ ID NO：(47、48、49或50)之一的序列的15至30个核苷酸长区段基本上相同的序列(显示SHOX2、PTGER4和FOXL2的优选靶区域的关系的图谱示出在图X中).
优选地，错配是由于SEQ ID NO：2、5、7、10、12、15、17、20、22、25、27、30、32、35、37、40、42、45、47、50、52、55、57、60、62、65、67、70、72、75、77、80、82、85、87、90、92、95、97、100、102、105、107、110、112、115、117或120中一个C被A或G置换，或者是由于SEQ ID NO：3、4、8、9、13、14、18、19、23、24、28、29、33、34、38、39、43、44、48、49、53、54、58、59、63、64、68、69、73、74、78、79、83、84、88、89、93、94、98、99、103、104、108、109、113、114、118或119中一个G被T或C置换.
优选地，所述区段的长度为19至25个核苷酸.
在一个优选实施方案中，错配和间隔物(包括CpG位点和SNP二者相关的错配和间隔物)的总数为1、2或3，更优选1或2，并且最优选1.
在一个优选实施方案中，至少一个错配或间隔物，优选全部错配和间隔物在引物寡核苷酸3’端的10个核苷酸内和/或不在引物寡核苷酸5’端的5个核苷酸内.而且，优选的是，至少一个错配或间隔物，优选全部错配和间隔物在引物寡核苷酸的中间三分之一或3’端的三分之一内.
在一个特别优选的实施方案中，引物寡核苷酸具有根据SEQ ID NO：121或122或者其变体(对于(a))，SEQ ID NO：140、141、144、145、148或149或者其变体(对于(b))，或者SEQID NO：126、127、130、131、135或136或者其变体(对于(c))的序列.在这方面的变体是这样的序列：其向上游或下游移动多至10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个，优选多至5个，更优选多至3个核苷酸(相对于各自的靶序列)，和/或长或短多至10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个，优选多至5个，更优选多至3个核苷酸(相对于各自的靶序列，即同时依然与各自的靶序列退火).
在第四方面，本发明涉及一种适于进行第一方面的方法的试剂盒.
在第四方面的第一基本实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，其包含：
(i)至少一个由正向引物和反向引物组成的甲基化非特异性引物寡核苷酸对，其中所述引物对适于由其中5位未甲基化的胞嘧啶已被转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交之另一碱基的基因组DNA的单链产生扩增子，其中所述基因组DNA是至少部分片段化的，并且其中所述扩增子的长度小于100bp且包含基因组DNA的至少3个不被引物覆盖的CpG位点；以及
(ii)至少一种能够以甲基化特异性方式阻断扩增的甲基化特异性阻断剂.
优选地，至少一种引物寡核苷酸：(1)覆盖至少一个CpG位点，其具有与CpG位点的胞嘧啶碱基位置相关的甲基化非特异性错配或间隔物，和/或(2)覆盖至少一个SNP位点，其具有SNP非特异性错配或间隔物.
在第四方面的第一基本实施方案的一个优选实施方案中，所述试剂盒包含：
(i)以下(a)至(c)中的一项或更多项：
(a)引物对A，其由具有与根据SEQ ID NO：102之序列的15至30个核苷酸长区段相同或基本上相同的序列的正向引物寡核苷酸和具有与根据SEQ ID NO：103之序列的15至30个核苷酸长区段相同或基本上相同的序列的反向引物寡核苷酸组成；和/或引物对B，其由具有与根据SEQ ID NO：104之序列的15至30个核苷酸长区段相同或基本上相同的序列的正向引物寡核苷酸和具有与根据SEQ ID NO：105之序列的15至30个核苷酸长区段相同或基本上相同的序列的反向引物寡核苷酸组成；
(b)引物对A，其由具有与根据SEQ ID NO：52之序列的15至30个核苷酸长区段相同或基本上相同的序列的正向引物寡核苷酸和具有与根据SEQ ID NO：53之序列的15至30个核苷酸长区段相同或基本上相同的序列的反向引物寡核苷酸组成；和/或引物对B，其由具有与根据SEQ ID NO：54之序列的15至30个核苷酸长区段相同或基本上相同的序列的正向引物寡核苷酸和具有与根据SEQ ID NO：55之序列的15至30个核苷酸长区段相同或基本上相同的序列的反向引物寡核苷酸组成；和/或
(c)引物对A，其由具有与根据SEQ ID NO：2之序列的15至30个核苷酸长区段相同或基本上相同的序列的正向引物寡核苷酸和具有与根据SEQ ID NO：3之序列的15至30个核苷酸长区段相同或基本上相同的序列的反向引物寡核苷酸组成；和/或引物对B，其由具有与根据SEQ ID NO：4之序列的15至30个核苷酸长区段相同或基本上相同的序列的正向引物寡核苷酸和具有与根据SEQ ID NO：5之序列的15至30个核苷酸长区段相同或基本上相同的序列的反向引物寡核苷酸组成；
其中基本上相同的序列包含至少一个甲基化非特异性错配或间隔物，其中至少一个甲基化非特异性错配在正向引物A或反向引物B中是由于C被A或G置换，在正向引物B或反向引物A中其是由于G被T或C置换，甲基化非特异性间隔物在正向引物A或反向引物B中是替代C的间隔物，以及在正向引物B或反向引物A中是替代G的间隔物，
并且其中在每种情况下，使用引物对A或B用根据(a)SEQ ID NO：101、(b)SEQ IDNO：51和(c)SEQ ID NO：1的模板DNA可产生的扩增子的长度小于100个碱基对(bp)；
(ii)各自地，以下(a)至(c)中的一项或更多项：
(a)至少一种长度为20至40个核苷酸的阻断剂寡核苷酸，对于引物对A，其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：102的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有C被T置换，或者至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：103的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有G被A置换；或者对于引物对B，其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：104的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有G被A置换，或者至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：105的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有C被T置换；
(b)至少一种长度为20至40个核苷酸的阻断剂寡核苷酸，对于引物对A，其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：52的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有C被T置换，或者其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：53的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有G被A置换；或者对于引物对B，其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：54的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有G被A置换，或者其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：55的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有C被T置换；和/或
(c)至少一种长度为20至40个核苷酸的阻断剂寡核苷酸，对于引物对A，其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：2的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有C被T置换，或者其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：3的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有G被A置换；或者对于引物对B，其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：4的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有G被A置换，或者其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：5的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有C被T置换；
其中阻断剂寡核苷酸的任意所述区段至少部分地在引物对A或B的正向或反向引物5’端的5’-＞3’方向的下游，并且与或不与引物序列重叠(优选地，其与引物序列重叠)(与所述阻断剂寡核苷酸置换无关)，并且其中非重叠区段不与或基本上不与引物对中相反引物的反向互补序列重叠(与所述阻断剂寡核苷酸置换无关)(“基本上不与...重叠”意指其可以与至多5、4、3、2或1个核苷酸重叠，条件是重叠片段没有足够大到致使其用作所述相反引物的模板，即致使相反引物与阻断剂结合并且聚合酶延伸引物)；以及任选地
(iii)各自地，以下(a)至(c)中的一项或更多项：
(a)探针寡核苷酸A，其具有与根据SEQ ID NO：102或103的序列的10至25个核苷酸长区段相同的序列；和/或探针寡核苷酸B，其具有与根据SEQ ID NO：104或105的序列的10至25个核苷酸长区段相同的序列；
(b)探针寡核苷酸A，其具有与根据SEQ ID NO：52或53的序列的10至25个核苷酸长区段相同的序列；和/或探针寡核苷酸B，其具有与根据SEQ ID NO：54或55的序列的10至25个核苷酸长区段相同的序列；和/或
(c)探针寡核苷酸A，其具有与根据SEQ ID NO：2或3的序列的10至25个核苷酸长区段相同的序列；和/或探针寡核苷酸B，其具有与根据SEQ ID NO：4或5的序列的10至25个核苷酸长区段相同的序列；
其中探针寡核苷酸是甲基化特异性的并且与根据(i)可产生的扩增子的单链退火，在此所述引物寡核苷酸都不退火.
优选地，至少一种引物寡核苷酸，更优选引物对A和/或B各自的至少一种引物寡核苷酸包含至少一个甲基化非特异性错配或间隔物.
在第四方面的第二基本实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，其包含：
(i)至少一个由正向引物和反向引物组成的甲基化非特异性引物寡核苷酸对，其中所述引物对适于由其中5位未甲基化的胞嘧啶已被转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交之另一碱基的基因组DNA的单链产生扩增子，其中所述扩增子包含基因组DNA的至少3个不被引物覆盖的CpG位点，并且其中至少一种引物寡核苷酸：(1)覆盖至少一个CpG位点，其具有与CpG位点的胞嘧啶碱基位置相关的甲基化非特异性错配或间隔物，和/或(2)覆盖至少一个SNP位点，其具有SNP非特异性错配或间隔物；以及
(ii)至少一种能够以甲基化特异性方式阻断扩增的甲基化特异性阻断剂.
优选地，所述扩增子的长度小于100bp。
在第四方面的第二基本实施方案的一个优选实施方案中，所述试剂盒包含：
(i)以下(a)至(c)中的一项或更多项：
(a)引物对A，其由具有与根据SEQ ID NO：102之序列的15至30个核苷酸长区段基本上相同的序列的正向引物寡核苷酸和具有与根据SEQ ID NO：103之序列的15至30个核苷酸长区段基本上相同的序列的反向引物寡核苷酸组成；和/或引物对B，其由具有与根据SEQID NO：104之序列的15至30个核苷酸长区段基本上相同的序列的正向引物寡核苷酸和具有与根据SEQ ID NO：105之序列的15至30个核苷酸长区段基本上相同的序列的反向引物寡核苷酸组成；
(b)引物对A，其由具有与根据SEQ ID NO：52之序列的15至30个核苷酸长区段基本上相同的序列的正向引物寡核苷酸和具有与根据SEQ ID NO：53之序列的15至30个核苷酸长区段基本上相同的序列的反向引物寡核苷酸组成；和/或引物对B，其由具有与根据SEQID NO：54之序列的15至30个核苷酸长区段基本上相同的序列的正向引物寡核苷酸和具有与根据SEQ ID NO：55之序列的15至30个核苷酸长区段基本上相同的序列的反向引物寡核苷酸组成；和/或
(c)引物对A，其由具有与根据SEQ ID NO：2之序列的15至30个核苷酸长区段基本上相同的序列的正向引物寡核苷酸和具有与根据SEQ ID NO：3之序列的15至30个核苷酸长区段基本上相同的序列的反向引物寡核苷酸组成；和/或引物对B，其由具有与根据SEQ IDNO：4之序列的15至30个核苷酸长区段基本上相同的序列的正向引物寡核苷酸和具有与根据SEQ ID NO：5之序列的15至30个核苷酸长区段基本上相同的序列的反向引物寡核苷酸组成；
其中基本上相同的序列包含至少一个甲基化非特异性错配或间隔物，其中至少一个甲基化非特异性错配在正向引物A或反向引物B中是由于C被A或G置换，在正向引物B或反向引物A中其是由于G被T或C置换，甲基化非特异性间隔物在正向引物A或反向引物B中是替代C的间隔物，以及在正向引物B或反向引物A中是替代G的间隔物；
(ii)各自地，以下(a)至(c)中的一项或更多项：
(a)至少一种长度为20至40个核苷酸的阻断剂寡核苷酸，对于引物对A，其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：102的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有C被T置换，或者其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：103的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有G被A置换；或者对于引物对B，其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：104的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有G被A置换，或者其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：105的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有C被T置换；
(b)至少一种长度为20至40个核苷酸的阻断剂寡核苷酸，对于引物对A，其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：52的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有C被T置换，或者其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：53的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有G被A置换；或者对于引物对B，其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：54的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有G被A置换，或者其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：55的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有C被T置换；和/或
(c)至少一种长度为20至40个核苷酸的阻断剂寡核苷酸，对于引物对A，其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：2的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有C被T置换，或者其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：3的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有G被A置换；或者对于引物对B，其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：4的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有G被A置换，或者其中至少一种阻断剂寡核苷酸具有与根据SEQ ID NO：5的序列的区段相同的序列，其中在所述区段中，所有C被T置换；
其中阻断剂寡核苷酸的任意所述区段至少部分地在引物对A或B的正向或反向引物5’端的5’-＞3’方向的下游，并且与或不与引物序列重叠(优选地，其与引物序列重叠)(与所述阻断剂寡核苷酸置换无关)，并且其中非重叠区段不与或基本上不与引物对中相反引物的反向互补序列重叠(与所述阻断剂寡核苷酸置换无关)(“基本上不与...重叠”意指其可以与至多5、4、3、2或1个核苷酸重叠，条件是重叠片段没有足够大到致使其用作所述相反引物的模板，即致使相反引物与阻断剂结合并且聚合酶延伸引物)；以及任选地
(iii)各自地，以下(a)至(c)中的一项或更多项：
(a)探针寡核苷酸A，其具有与根据SEQ ID NO：102或103的序列的10至25个核苷酸长区段相同的序列；和/或探针寡核苷酸B，其具有与根据SEQ ID NO：104或105的序列的10至25个核苷酸长区段相同的序列；
(b)探针寡核苷酸A，其具有与根据SEQ ID NO：52或53的序列的10至25个核苷酸长区段相同的序列；和/或探针寡核苷酸B，其具有与根据SEQ ID NO：54或55的序列的10至25个核苷酸长区段相同的序列；和/或
(c)探针寡核苷酸A，其具有与根据SEQ ID NO：2或3的序列的10至25个核苷酸长区段相同的序列；和/或探针寡核苷酸B，其具有与根据SEQ ID NO：4或5的序列的10至25个核苷酸长区段相同的序列；
其中探针寡核苷酸是甲基化特异性的并且与根据(i)可产生的扩增子的单链退火，在此所述引物寡核苷酸都不退火.
优选地，在每种情况下，使用引物对A或B用根据(a)SEQ ID NO：101、(b)SEQ IDNO：51和(c)SEQ ID NO：1的模板DNA可产生的扩增子的长度小于100个碱基对(bp).
在下文，描述了第一方面的第一和第二两个基本实施方案的一些优选实施方案：
在一个优选实施方案中，所述基因组DNA的单链是人SHOX2、PTGER4或FOXL2 DNA的，包括各自的启动子区以及其上游和下游5、4、3、2或1kb内的DNA.优选地，其来自基因组人SHOX2、PTGER4或FOXL2 DNA.对于SHOX2，基因组DNA的单链优选地具有根据SEQ ID NO：101，更优选根据SEQ ID NO：106，甚至更优选根据SEQ ID NO：111，并且最优选根据SEQ IDNO：116的序列；或者，各自与其反向互补的序列.对于PTGER4，基因组DNA的单链优选地具有根据SEQ ID NO：51，更优选根据SEQ ID NO：56，甚至更优选根据SEQ ID NO：61，甚至更优选根据SEQ ID NO：66、71、76或81之一，并且最优选根据SEQ ID NO 86、91或96之一的序列；或者，各自与其反向互补的序列.对于FOXL2，基因组DNA的单链优选地具有根据SEQ ID NO：1，更优选根据SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：11，甚至更优选根据SEQ ID NO：16、21、26或31之一，并且最优选根据SEQ ID NO：36、41或46之一的序列；或者，各自与其反向互补的序列(所有均为转化前，显示SHOX2、PTGER4和FOXL2的优选靶区域的关系的图谱示出在图X中).
在一个优选实施方案中，所述扩增子的长度为小于100、99、98、97、96、94、93、92、91、90、89、88、87、8685、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61或60bp，优选地长度为小于97、92、84、73、72、69或67bp.该区域的优选范围为50至99bp，更优选60至99pb，并且最优选60或66至96bp、60或66至91、60或66至83、60或66至72、60或66至71、或者60或66至68.特别地(并且不依赖于其他标记的一般长度)，该区域对于SHOX2而言长度为小于92bp，对于PTGER4而言长度为小于97、84或67bp，和/或对于FOXL2而言长度为小于73、72或69bp(相应适用的范围，即50、优选60或66至91(SHOX2)，至96、83或66(PTGER4)，或者至72、71或68(FOXL).在每个前述长度的情况下，所述扩增子包含基因组DNA的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个CpG位点，优选不被引物覆盖的CpG位点.优选地，这些CpG位点中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个(但是未必全部，特别是被间隔物或甲基化非特异性错配覆盖的CpG位点)在高甲基化靶DNA中必须是甲基化的以产生扩增子.
在一个优选实施方案中，每个引物的错配和间隔物(包括CpG位点和SNP二者相关的错配和间隔物)的总数为1、2或3，更优选1或2，并且最优选1.设想了仅一个引物或两个引物都包含错配.如果两个引物都包含错配，则一个引物中错配的数目与另一个引物中错配的数目无关.
在一个优选实施方案中，至少一个错配或间隔物，优选全部错配和间隔物在引物寡核苷酸3’端的10个核苷酸内和/或不在引物寡核苷酸5’端的5个核苷酸内.而且，优选的是，至少一个错配或间隔物，优选全部错配和间隔物在引物寡核苷酸的中间三分之一或3’三分之一内.
在一个优选实施方案中，试剂盒还包含：(iii)至少一种甲基化特异性探针，优选探针寡核苷酸.
对于(i)、(ii)和(iii)中的(a)，所述区段优选地是根据SEQ ID NO：(107、108、109或110，各自地)，更优选根据SEQ ID NO：(112、113、114或115，各自地)，并且最优选根据SEQID NO：(117、118、119或120，各自地)的序列的.
对于(i)、(ii)和(iii)中的(b)，所述区段优选地是根据SEQ ID NO：(57、58、59或60，各自地)，更优选根据SEQ ID NO：(62、63、64或65，各自地)，甚至更优选根据SEQ ID NO：(67、68、69或70，各自地)、SEQ ID NO：(72、73、74或75，各自地)、SEQ ID NO：(77、78、79或80，各自地)或SEQ ID NO：(82、83、84或85，各自地)之一，并且最优选根据SEQ ID NO：(87、88、89或90，各自地)、SEQ ID NO：(92、93、94或95，各自地)或SEQ ID NO：(97、98、99或100，各自地)之一的序列的.
对于(i)、(ii)和(iii)中的(c)，所述区段优选地是根据SEQ ID NO：(7、8、9或10，各自地)或SEQ ID NO：(12、23、24或15，各自地)，更优选根据SEQ ID NO：(17、18、19、20，各自地)、SEQ ID NO：(22、23、24或25，各自地)、SEQ ID NO：(27、28、29或30，各自地)或SEQ IDNO：(32、33、24或35，各自地)之一，并且最优选根据SEQ ID NO：(37、38、39或40，各自地)、SEQ ID NO：(42、43、44或45，各自地)或SEQ ID NO：(47、48、49或50，各自地)之一的序列的(显示SHOX2、PTGER4和FOXL2的优选靶区域的关系的图谱示出在图X中).
在一个优选实施方案中，试剂盒还包含能够将未甲基化胞嘧啶转化成尿嘧啶或在杂交性质方面与胞嘧啶可检测地不相似的另一碱基的试剂，和/或用于进行PCR反应的试剂，例如缓冲剂、核苷酸和/或聚合酶.
在一个特别优选的实施方案中，试剂盒包含：
-(对于SHOX2作为靶标)具有根据SEQ ID NO：121或其变体的序列的正向引物，具有根据SEQ ID NO：122或其变体的序列的反向引物，具有选自SEQ ID NO：123和124及其变体的序列的一种或两种阻断剂，以及任选地具有根据SEQ ID NO：122、其反向互补序列或任一者的变体的序列的探针；
-(对于FOXL2作为靶标)具有根据SEQ ID NO：126或其变体的序列的正向引物，具有根据SEQ ID NO：127或其变体的序列的反向引物，具有根据SEQ ID NO：128或其变体的序列的阻断剂，以及任选地具有根据SEQ ID NO：129、其反向互补序列或任一者的变体的序列的探针；
-(对于FOXL2作为靶标)具有根据SEQ ID NO：130或其变体的序列的正向引物，具有根据SEQ ID NO：131或其变体的序列的反向引物，具有选自SEQ ID NO：132和133及其变体的序列的一种或两种阻断剂，以及任选地具有根据SEQ ID NO：134、其反向互补序列或任一者的变体的序列的探针；
-(对于FOXL2作为靶标)具有根据SEQ ID NO：135或其变体的序列的正向引物，具有根据SEQ ID NO：136或其变体的序列的反向引物，具有选自SEQ ID NO：137和138及其变体的序列的一种或两种阻断剂，以及任选地具有根据SEQ ID NO：139、其反向互补序列或任一者的变体的序列的探针；
-(对于PTGER4作为靶标)具有根据SEQ ID NO：140或其变体的序列的正向引物，具有根据SEQ ID NO：141或其变体的序列的反向引物，具有根据SEQ ID NO：142或其变体的序列的阻断剂，以及任选地具有根据SEQ ID NO：143、其反向互补序列或任一者的变体的序列的探针；
-(对于PTGER4作为靶标)具有根据SEQ ID NO：144或其变体的序列的正向引物，具有根据SEQ ID NO：145或其变体的序列的反向引物，具有根据SEQ ID NO：146或其变体的序列的阻断剂，以及任选地具有根据SEQ ID NO：147、其反向互补序列或任一者的变体的序列的探针；和/或
-(对于PTGER4作为靶标)具有根据SEQ ID NO：148或其变体的序列的正向引物，具有根据SEQ ID NO：149或其变体的序列的反向引物，具有根据SEQ ID NO：150或其变体的序列的阻断剂，以及任选地具有根据SEQ ID NO：151、其反向互补序列或任一者的变体的序列的探针.
在这方面的变体是这样的序列：其向上游或下游移动多至10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个，优选多至5个，更优选多至3个核苷酸(相对于各自的靶序列)，和/或长或短多至10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个，优选多至5个，更优选多至3个核苷酸(相对于各自的靶序列，即同时依然与各自的靶序列退火).
在第五方面，本发明涉及第三方面的甲基化非特异性引物寡核苷酸或第四方面的试剂盒用于在对象中检测癌症的存在或不存在的用途.
所述用途特别地用于本发明第一或第二方面的方法。
本发明的定义和另一些实施方案
本说明书使用多个术语和短语，其具有如下定义的某些含义.优选的含义应解释为本文所述的本发明各方面的优选实施方案.因此，它们以及下文所述的另一些实施方案可与本发明各方面的任何实施方案，特别是上文所述的本发明各方面的任何优选实施方案组合.
本文使用的术语“检测”是指至少定性地分析高甲基化靶DNA的存在或不存在.高甲基化优选地在靶DNA的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、10个或更多个、15个或更多个或者30个或更多个CpG位点处确定.通常来说，所分析的CpG位点在癌症中是共同甲基化的，使得相邻DNA的CpG位点也被甲基化，并且可另外地或替代地进行分析.“至少定性地”意指也可进行高甲基化靶DNA(如果存在的话)的定量测定.这种“确定....的量”可以如本文所述进行.通常来说，定量可以是绝对的，例如以pg/mL或ng/mL样品、每mL样品的拷贝数、PCR循环数等计，或者定量可以是相对的，例如，是对照样品中的10倍高或作为参考对照的甲基化的百分比.确定样品中高甲基化靶DNA的量可包括对样品中总DNA的量归一化.对测试样品中总DNA的量归一化优选地包括计算高甲基化靶DNA的量与参考位点的基因组DNA的量的比率.参考位点可以是任何基因组位点，并且不一定是基因.一个实例是包含短DNA重复序列的位点.在参考基因的情况下，该基因优选为持家基因(housekeeping gene).
持家基因是参与基本细胞功能或维持基本细胞功能所需的组成型表达的基因，并且在正常和病理生理条件下在生物体的所有细胞中均表达，因此预期即使基因组部分地受到染色体不稳定和缺失的影响，持家基因也是可用的.仅在人中，有超过2000个持家基因(参见Chang等，PLoS ONE 6(7)：e22859.doi：10.1371/iournal.pone.0022859，其在此通过引用并入)，其根据本发明全部可被使用.非限制性实例是人酸性核糖体蛋白(Humanacidic ribosomal protein，HuPO)、β-肌动蛋白(β-Actin，BA)、亲环蛋白(Cyclophylin，CYC)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、磷酸甘油激酶(Phosphoglyeerokinase，PGK)、β2-微球蛋白(β2-Microglobulin，B2M)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(Hypoxanthinephosphoribosyltransferase，HPRT)、转录因子IID TATA结合蛋白(TBP)、转铁蛋白受体(Transferrin receptor，TfR)、延伸因子-1-α(Elongation factor-1-α，EF-1-α)、淋巴结转移蛋白51(Metastatic lymph node 51，MLN51)和泛素缀合酶(UbcH5B).
样品中高甲基化靶DNA的量是参考样品中高甲基化靶DNA相对于包含基本上完全甲基化的基因组DNA的高甲基化靶DNA的量的比例.优选地，确定高甲基化靶DNA的比例包括确定参考样品中相同靶标的高甲基化DNA的量，优选通过使用参考位点的甲基化非特异性测量对总甲基化DNA进行样品间归一化，并用由测试样品获得的比率除以由参考样品获得的相应比率.该比例可通过将除法的结果乘以100来表示为百分比或以下定义的PMR。
或者，特别地，如果通过实时PCR来确定高甲基化靶DNA的量，则可通过使用来自对象样品和参考(ref)样品(至少在靶基因座甲基化)的靶标和参考位点(优选在持家基因(hkg)中)的循环阈值(Ct)如下计算：量＝100*x-((Ct靶标-Cthkg)-(Ct靶标ref-Cthkgref))，其中x是假定的PCR效率，其优选为1至3，且更优选为2.
术语“参考样品”是指包含具有已知DNA浓度和已知靶标甲基化状态的对照DNA的样品.对照DNA优选但不一定是人工甲基化的、优选基本上完全甲基化的人DNA.在一个优选实施方案中，人工甲基化通过使用DNA-甲基转移酶来实现.DNA本身可以是例如细胞系DNA、质粒DNA、人工DNA、或其组合/混合物.
在靶基因座甲基化的DNA优选是来自一个或更多个细胞系的细胞系DNA，优选已经充分表征并且基因组靶标甲基化状态已知和/或已知靶标基本上完全甲基化的那些.基本上完全甲基化的基因组DNA优选是全部或基本上全部CpG位点均甲基化的DNA，特别是基因组DNA.在这方面“基本上全部”意指至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％.在一个优选实施方案中，全部或基本上全部CpG位点的甲基化通过以提供全部或基本上全部CpG位点的甲基化的方式用CpG甲基转移酶处理DNA来实现.
优选地，高甲基化靶DNA的量表示为PMR值.术语“PMR”、“甲基化参考的百分比”或“完全甲基化参考的百分比”描述了甲基化的程度，并且通常通过用基因与参考之比除以基因与完全甲基化参考之比(例如通过CpG甲基转移酶，例如正常未甲基化参考的SssI处理获得的)并乘以100来计算.PMR的测定在Ogino等(JMD 2006年5月，第8卷，第2期)中详细描述，其通过引用并入.或者，PMR可用
Figure BPA0000243590210000251
方法通过使用来自患者样品和参考(ref)样品(在靶基因座甲基化)的shox2和参考位点(例如在持家基因(hkg)中)的实时PCR循环阈值(Ct)如下计算：
Figure BPA0000243590210000252
其中x是假定的PCR效率。一般来说，PCR效率假定为1至3，优选其为2或接近2.优选地，PMR为至少3、更优选4至8、最优选6个实验重复或平行实验的中值PMR.
本文使用的术语“高甲基化”涉及“甲基化”或“DNA甲基化”，其是指涉及向胞嘧啶或腺嘌呤DNA核苷酸添加甲基的生化过程.在胞嘧啶(尤其是启动子区中的胞嘧啶)5位的DNA甲基化可具有降低基因表达的效应，并且已经在检测的每种脊椎动物中发现.在成体非配子细胞中，DNA甲基化通常发生在CpG位点.本文使用的术语“CpG位点”或“CpG二核苷酸”是指这样的DNA区域，其中在沿其长度的线性碱基序列中胞嘧啶核苷酸紧接鸟嘌呤核苷酸出现.“CpG”是“C-磷酸-G”的简写，即胞嘧啶和鸟嘌呤通过仅一个磷酸隔开；在DNA中磷酸将任意两个核苷连接在一起.使用“CpG”符号来将这种线性序列与胞嘧啶和鸟嘌呤的CG碱基配对区分开.CpG二核苷酸中的胞嘧啶可被甲基化以形成5-甲基胞嘧啶.术语“CpG位点”或“基因组DNA的CpG位点”还用于DNA中前(未甲基化的)CpG位点的其中该CpG位点的未甲基化C被转化成如本文所述的另一种(例如，通过重亚硫酸盐转化成尿嘧啶)的位点.本申请提供了每个相关DNA区域的基因组序列以及每个经转化链的重亚硫酸盐转化序列.提及的CpG位点始终是基因组序列的CpG位点，即使经转化的序列由于转化而不再包含这些CpG位点.术语“高甲基化”是指异常的甲基化模式或状态(即，一个或更多个核苷酸的甲基化的存在或不存在)，其中与来自患者之非癌细胞或者来自未患或未曾患过对该患者治疗之癌症(优选任何癌症)的对象(健康对照)的相同基因组DNA相比，一个或更多个核苷酸(优选CpG位点的C)被甲基化.特别地，高甲基化是指相对于见于健康对照DNA样品中相应CpG二核苷酸的5-mCyt的量，测试DNA样品的DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸处5-mCyt的存在提高.作为一种甲基化状态/模式的高甲基化可在一个或更多个CpG位点处确定.如果使用多于一个CpG位点，可单独地在每个位点处或一起考虑作为CpG位点的平均值来确定高甲基化.或者，所有评估的CpG位点都必须都被甲基化，使得满足高甲基化要求.
本文使用的术语“靶DNA”是指在特定染色体位置处的基因组核苷酸序列.在本发明的上下文中，靶DNA通常是已知在疾病状态下(例如在癌细胞中相对于在非癌细胞中)高甲基化的遗传标记.遗传标记可以是基因组DNA的编码区或非编码区.
本文使用的术语“靶DNA的区域”是指待分析的靶DNA的一部分.一般来说，该区域的长度为至少50、60、70、80、90、100、150或200或300个碱基对(bp)和/或不长于500、600、700、800、900或1000bp(除非如本文所定义通过例如“长度小于100bp”进一步限制).特别地，其是包含基因组DNA的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个CpG位点的区域.优选地，这些位点不被用于扩增该区域的引物覆盖.优选地，这些CpG位点中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个(但未必全部，特别是被例如引物中的间隔物或甲基化非特异性错配覆盖的CpG位点)在高甲基化靶DNA中是甲基化的.
本发明的一个靶DNA是与SHOX2相关的基因组DNA.本文使用的术语“SHOX2”是指shox2(short stature homeobox 2，身材矮小症同源框2；人NCBI基因ID 6474；基因组位置3q25.32)基因，也称为同源框蛋白Og12X或配对相关同源框蛋白SHOT.其是以下基因的同源框家族的一个成员，所述基因编码含有代表DNA结合结构域的60个氨基酸残基的基序的蛋白质.同源框蛋白已被广泛地表征为参与无脊椎动物和脊椎动物物种二者中模式形成的转录调节子.本文提供了与人SHOX2(构建的GRCh38基因组中的3号染色体第158090954-158111503位)相关的基因组DNA序列(参见表1).
本发明的另一个靶DNA是与PTGER4相关的基因组DNA.本文使用的术语“PTGER4”是指ptger4(prostaglandin E receptor 4，前列腺素E受体4；人NCBI基因ID 5734；基因组位置5p13.1)基因，也称为EP4或EP4R.其是G-蛋白偶联受体家族的成员，并且是被鉴定为前列腺素E2(PGE2)的四种受体之一.该受体可激活T细胞因子信号传导，并且已经显示其介导PGE2诱导的早期生长应答1(early growth response1，EGR1)表达，调控环氧合酶-2mRNA的水平和稳定性，并导致糖原合酶激酶-3的磷酸化.小鼠的敲除研究表明该受体可参与新生儿循环系统适应(neonatal adaptation of circulatory system)、骨质疏松症以及皮肤免疫应答的引发.本文提供了与人PTGER4(构建的GRCh38基因组中的5号染色体第40674498-40698735位)相关的基因组DNA序列(SEQ ID NO：51).
本发明的另一个靶DNA是与FOXL2相关的基因组DNA.本文使用的术语“FOXL2”是指foxl2(forkhead box protein L2，叉头框蛋白L2；人NCBI基因ID 668；基因组位置3q23)基因，也称为BPES、PFRK、POF3、BPES或PINTO.其是含有叉头DNA结合结构域的叉头转录因子，并且其参与发育和性别决定。该基因中的突变导致睑裂狭小综合征和卵巢早衰3。本文提供了与人FOXL2(构建的GRCh38基因组中的3号染色体第138939224-138952140位)相关的基因组DNA序列(SEQ ID NO：1).
本文使用的术语“样品”是指从对象获得的生物材料并且包含来自全部染色体的基因组DNA，优选覆盖整个基因组的基因组DNA.如果对象患有癌症，则样品包含癌细胞或来自癌细胞的游离基因组DNA(包括靶DNA)，优选来自癌细胞的循环基因组DNA.样品可以来自于任何合适的组织或生物流体，例如血液、唾液、血浆、血清、尿液、脑脊液(CSF)、粪便、颊或颊-咽拭子、外科手术样本、从活检获得的样本、或者包埋在石蜡中的组织样品.从对象获得样品的方法是本领域技术人员公知的.优选地，所述样品是肿瘤活组织或液体样品.液体样品优选为血液、血清、血浆或尿液.在癌症是肺癌的情况下，还考虑样品包含来自支气管镜检查(包括支气管灌洗、支气管肺泡灌洗、支气管刷检或支气管磨损)或者来自痰或唾液的物质.通常来说，在包含来自癌细胞的靶DNA，尤其是细胞外靶DNA的样品中，还存在来自非癌细胞的与来自癌细胞的靶DNA相反未高甲基化的靶DNA.通常来说，来自非癌细胞的所述靶DNA超过来自患病细胞的量至少10倍、至少100倍、至少1,000倍或至少10,000倍.一般来说，样品中包含的基因组DNA是至少部分片段化的.“至少部分片段化的”意指来自癌细胞的至少细胞外DNA，特别是至少细胞外靶DNA是片段化的.术语“片段化基因组DNA”是指细胞(特别是癌细胞)的基因组DNA的碎片，其是长DNA的部分物理、化学和/或生物破碎形成较短长度的离散片段的结果.特别地，“片段化的”意指基因组DNA的至少一些(优选靶DNA)被片段化为短于1,500bp、1,300bp、1,100bp、1,000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp或100bp的片段.在该方面“至少一些”意指至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或75％.
本文使用的术语“基因组DNA”是指染色体DNA，并且用于与编码DNA区分开.因此，其包括属于基因的外显子、内含子以及调控序列，特别是启动子.
本文使用的短语“将DNA中5位未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交的另一碱基”是指以这样的方式化学处理DNA的过程：将全部或基本上全部的未甲基化胞嘧啶碱基转换成尿嘧啶碱基或在碱基配对表现方面与胞嘧啶不相似的另一碱基，而使5-甲基胞嘧啶碱基保持不变.DNA样品中未甲基化而不是甲基化的胞嘧啶碱基的转化用转化剂来进行。本文使用的术语“转化剂”涉及能够将未甲基化胞嘧啶转化成尿嘧啶或在杂交性质方面与胞嘧啶可检测地不相似的另一碱基的试剂.转化剂优选为重亚硫酸盐，例如焦亚硫酸盐(disulfite)或亚硫酸氢盐(hydrogen sulfite).根据标准程序(Frommer等，1992，ProcNatl Acad Sci USA89：1827-31；Olek，1996，Nucleic Acids Res 24：5064-6；EP 1394172)进行反应.也可酶促地，例如通过使用甲基化特异性胞苷脱氨酶来进行转化.最优选地，转化剂是重亚硫酸钠或重亚硫酸盐.
本文使用的术语“扩增”或“产生扩增子”是指靶核酸及其互补序列或者特别是它们区域的拷贝数的提高.扩增可通过使用本领域已知的任何方法来进行.核酸的扩增包括在扩增过程期间需要多个循环的方法或在单一温度下进行的方法.循环技术的实例是需要热循环的方法.需要热循环的方法包括本领域中众所周知的聚合酶链反应(polymerasechain reaction，PCR).PCR包括通过热变性将双链DNA变性为单链DNA，使引物与单链DNA退火，并由引物合成互补链.等温扩增是在单一温度下进行的或者其中扩增过程的主要方面在单一温度下进行的扩增.在PCR过程中，反应产物被加热以使两条链分离，使得另一个引物可与模板结合.相反，等温技术依赖于链置换聚合酶来使双链的两条链分离并重新拷贝模板.等温技术可分为依赖于引物替代来引发反复模板拷贝的方法，以及依赖于单引物分子的继续重复使用或新合成的那些.依赖于引物替代的方法包括解旋酶依赖性扩增(helicase dependant amplification，HDA)、核酸外切酶依赖性扩增、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)和环介导扩增(loop mediatedamplification，LAMP).依赖于单引物分子的继续重复使用或新合成的方法包括链置换扩增(strand displacement amplification，SDA)或基于核酸的扩增(NASBA和TMA).
优选使用甲基化非特异性但对经重亚硫酸盐转化的DNA具有特异性(即，通过覆盖至少一个经转化的C而仅与经转化DNA杂交)的引物通过甲基化特异性PCR(即，根据一个或更多个CpG位点是否被转化来产生扩增子)来进行扩增.甲基化特异性通过使用甲基化特异性阻断剂寡核苷酸实现，其与经转化或未经转化的CpG位点特异性杂交，并且由此终止PCR聚合.在一个最优选的实施方案中，扩增步骤包括实时PCR，特别是HeavyMethylTM或HeavyMethylTM-MethyLightTM.
本文使用的术语HeavyMethylTM是指这样的测定，其中覆盖扩增引物之间或被扩增引物覆盖的CpG位置的甲基化特异性阻断探针(在本文也称为阻断剂)使得靶DNA或其区域的甲基化特异性选择性扩增成为可能.
术语“MethyLightTM”是指利用基于荧光的实时PCR技术的高通量定量甲基化测定，其在PCR步骤后不需要进一步的操作(Eads等，Cancer Res.59：2302-2306，1999，其通过引用并入本文).简言之，MethyLightrM方法以在例如重亚硫酸钠反应中根据标准程序(该重亚硫酸盐过程将未甲基化胞嘧啶残基转化成尿嘧啶)被转化成甲基化依赖性序列差异的混合池的基因组DNA的混合样品开始.随后，在“有偏(采用与已知CpG二核苷酸重叠的PCR引物)反应中进行基于荧光的PCR.序列区分可发生在扩增过程的水平和荧光检测过程的水平.其可以用作基因组DNA样品中甲基化模式的定量测试，其中序列区分发生在探针杂交的水平.在该定量方式中，PCR反应实现在与特定的推定甲基化位点重叠的荧光探针存在下进行甲基化特异性扩增.输入DNA的量的无偏对照由其中引物和探针都不与任何CpG二核苷酸重叠的反应来提供.术语“HeavyMethylTM MethyLightTM”测定是指为MethyLightTM测定的变化形式的HeavyMethylTM MethyLightTM测定，其中MethyLightTM测定与覆盖扩增引物之间的CpG位置的甲基化特异性阻断探针结合.
当用于寡核苷酸时，术语“退火”应理解为在中等或严格杂交条件下，样品DNA中寡核苷酸沿Watson-Crick碱基配对的线路与至少基本上互补的序列结合，形成双链体结构.当用于单个核苷酸或碱基时，其是指根据Watson-Crick碱基配对的结合，例如C-G、A-T和A-U.“基本上互补的”意指寡核苷酸不需要反映模板的确切序列，并且可包含如本文定义的错配和/或间隔物.严格杂交条件包括在68℃下在5×SSC/5×Denhardt溶液/1.0％SDS中杂交，并在室温下在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤，或者包括其本领域公认的等同条件(例如这样的条件：其中在60℃下在2.5×SSC缓冲液中进行杂交，随后在37℃下在低缓冲液浓度下进行数个洗涤步骤，并保持稳定).中等条件包括在42℃下在3×SSC中洗涤，或其本领域公认的等同条件.可改变盐浓度和温度的参数以获得探针和靶核酸之间的识别的最佳水平.在本领域可获得关于这些条件的指导，例如，Sambrook等，1989，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y；和Ausubel等(编辑)，1995，CurrentProtocols in Molecular Biology，(John Wiley&Sons，N.Y.)，单元2.10.
本文使用的术语“寡核苷酸”是指5至50个核糖核苷酸或优选脱氧核糖核苷酸的线性寡聚物.优选地，其具有单链DNA片段的结构.
本文使用的术语“引物寡核苷酸”是指与试图拷贝的核酸序列(模板)基本上互补的单链寡核苷酸序列，并且用作合成引物延伸产物的起始点.“基本上互补的”意指引物寡核苷酸不需要反映模板的确切序列，并且可包含如本文定义的错配和/或间隔物，只要其在选择的(例如PCR循环的)退火和延伸条件下仍能够退火并用作延伸起始点即可.优选地，引物寡核苷酸的长度为10至40个核苷酸，更优选15至30个核苷酸，并且最优选19至25个核苷酸.
本文使用的术语“阻断剂”是指这样的分子，其以甲基化特异性方式与DNA的单链结合(即，其对经转化的甲基化DNA或优选经转化的未甲基化DNA或者由其获得的扩增DNA具有特异性)并且通过与该单链结合，例如通过在其结合处阻止引物结合或通过阻止引物延伸来阻止DNA的扩增.阻断剂的非限制性实例是序列和/或甲基化特异性抗体(阻断例如引物结合或聚合酶)，特别是阻断剂寡核苷酸.
“阻断剂寡核苷酸”可以是阻止位于阻断剂寡核苷酸上游的引物的延伸的阻断剂.其包含具有对聚合酶的5’核酸酶活性有抗性的骨架的核苷/核苷酸.这可通过例如包含以下来实现：肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)、锁核酸(locked nucleic acid，LNA)、吗啉代、二醇核酸(glycol nucleic acid，GNA)、苏糖核酸(threose nucleic acid，TNA)、桥连核酸(bridged nucleic acid，BNA)、N3’-P5’氨基磷酸酯(N3’-P5’phosphoramidate，NP)寡聚物、小沟结合剂连接的寡核苷酸(MGB-连接的寡核苷酸)、硫代磷酸酯(PS)寡聚物、CrC4烷基膦酸酯寡聚物、氨基磷酸酯、β-磷酸二酯寡核苷酸、a-磷酸二酯寡核苷酸、或其组合.或者，其可以是在DNA单链上具有与引物寡核苷酸的结合位点重叠的结合位点的不可延伸的寡核苷酸.当阻断剂结合时，引物无法结合，并且因此不产生扩增子.当阻断剂不结合时，引物结合位点是可接近的并且产生扩增子.对于这样的重叠阻断剂，优选地，阻断剂对DNA的亲和力高于引物对DNA的亲和力.阻断剂寡核苷酸的长度通常为15至50、优选20至40并且更优选25至35个核苷酸.“至少一种阻断剂”特别地是指1、2、3、4或5种阻断剂，更特别地是指1至2或1至3种阻断剂的数量.此外，由于不可延伸的3’端，阻断剂寡核苷酸本身不能作为引物(即，不能通过聚合酶延伸).
本文使用的术语“探针寡核苷酸”或“探针”是指用于通过与扩增子的一条链退火来检测扩增子的寡核苷酸，其通常不在任何引物寡核苷酸结合处(即，不与该条链中与引物寡核苷酸所退火的序列区段重叠的序列区段结合).优选地，其退火没有错配，换言之，其优选地与扩增子的一条链互补.探针寡核苷酸的长度优选为5至40个核苷酸，更优选10至25个、并且最优选25至20个核苷酸.通常来说，探针与允许检测扩增子的至少一个可检测标签连接，优选共价连接.本文使用的术语“可检测标签”不表现出任何特别的限制.可检测标签可选自放射性标签、发光标签、荧光染料、具有酶活性的化合物、磁性标签、抗原、以及对可检测标签具有高结合亲和力的化合物.例如，与探针连接的荧光染料可用作检测标签，例如在实时PCR中.合适的放射性标记是P-32、S-35、I-125和H-3；合适的发光标记是化学发光化合物，优选鲁米诺；以及合适的荧光标记优选为丹酰氯、5-异硫氰酸荧光素和4-氟-7-硝基苯-2-氮杂-1，3-二唑，特别是6-羧基荧光素(FAM)、6-六氯荧光素(HEX)、5(6)-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、5(6)-羧基-X-罗丹明(ROX)、花青-5-荧光体(Cy5)、及其衍生物；合适的酶标记是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、α-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶或生物素.
本文关于寡核苷酸使用的术语“覆盖CpG位点”是指寡核苷酸在CpG位点的C转化之前或之后与包含该CpG位点的DNA区域退火(即，当提及经重亚硫酸盐转化的序列时，对应基因组DNA的CpG位点).对于CpG位点(如果C被转化，则为前CpG位点)，退火可以是如下文所述的甲基化特异性的或甲基化-非特异性的.
本文使用的术语“甲基化特异性的”通常是指依赖于CpG甲基化的存在或不存在.
本文关于寡核苷酸使用的术语“甲基化特异性的”意指基于至少一个CpG位点的C在转化之前是未甲基化的还是甲基化的，即基于C是否已被转化，寡核苷酸与或不与DNA单链(其中5位未甲基化的胞嘧啶已被转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交的另一碱基，并且其中其在转化之前包含至少一个CpG位点)退火，且没有与该至少一个CpG位点中C的位置相关的错配.甲基化特异性可以是阳性的(如果C未被转化，则寡核苷酸退火没有所述错配)或者是阴性的(如果C被转化，则寡核苷酸退火没有所述错配)。为了防止寡核苷酸与其特异性相反的退火，其优选地在转化前覆盖至少2、3、4、5或6，并且优选3至6个CpG位点.
本文使用的术语“甲基化非特异性的”通常是指不依赖于CpG甲基化的存在或不存在.
本文关于寡核苷酸使用的术语“甲基化非特异性的”意指不管至少一个CpG位点的C在转化之前是未甲基化的还是甲基化的，即不管C是否已经被转化，寡核苷酸均与DNA单链(其中5位未甲基化的胞嘧啶已被转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交的另一碱基，并且其中其在转化前可包含或可不包含至少一个CpG位点)退火.在一种情况下，与寡核苷酸退火的DNA单链的区域不包含任何CpG位点(在转化之前和之后)，并且仅仅为此，该寡核苷酸是甲基化非特异性的.在另一种情况下，关于转化之前和之后CpG位点的C位置，与寡核苷酸退火的DNA单链的区域包含1至3个，即1、2或3个错配和/或间隔物，优选1个错配或间隔物，使得退火不取决于至少一个CpG位点的C在转化之前是未甲基化的还是甲基化的，即不取决于C是否已经被转化.为了实现不依赖于错配和/或间隔物的退火，优选地，寡核苷酸每该寡核苷酸的10个核苷酸包含不超过1个错配(如果第一个小数位为5或更高则进位舍去，否则舍去).
本文使用的术语“错配”是指DNA中的碱基对错配，更具体地，不能形成正常碱基配对相互作用的碱基对(即，除“A”与“T”或“U”，或“G”与“C”之外).
本文使用的术语“SNP位点”是指“SNP”的位点，“SNP”即在个体群中变化的(优选人)基因组中特定位置的单核苷酸多态性.本申请涉及的基因组DNA的SNP是本领域已知的，并且可见于在线数据库，例如NCBI的dbSNP(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp).
本文使用的术语“SNP非特异性错配”是指由于以下核苷酸置换的错配，所述核苷酸置换不是用对应于见于同一群体中另一个体的基因组中相同位置的核苷酸进行置换.
本文使用的术语“间隔物”是指非核苷酸间隔物分子，其在连接两个核苷酸时将两个核苷酸之间的距离提高至约一个核苷酸的距离(即，如果两个核苷酸通过第三个核苷酸连接，这两个核苷酸相隔的距离).间隔物的非限制性实例是肌苷、d-尿嘧啶、卤代碱基、氨基-dT、C3、C12、间隔物9、间隔物18和dSpacer).
本文使用的术语“反映”应理解为意指“是...的结果”或“显示”。
本文使用的短语“用于在对象中检测癌症的存在或不存在的方法”是指对象的癌症诊断，即，确定对象是否患有癌症.如本领域技术人员理解的，这样的评估通常可能不是对100％的患者都是准确的，但其优选地是准确的.然而，该术语要求，可对对象的统计学显著部分做出准确指示.某一部分是否是统计学显著的可容易地由本领域技术人员使用几种公知的统计学评价手段来确定，所述手段例如置信区间的确定、p值的确定、Student t检验、Mann-Whitney检验等.详细信息在Dowdy和Wearden，Statistics for Research，JohnWiley&Sons，New York 1983中提供.优选的置信区间为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％.p值优选为0.05、0.01或0.005.
本文使用的术语“癌症”是指涉及异常细胞生长并具有侵入或扩散到身体其他部位的潜力的疾病的一大家族.细胞形成赘生物(neoplasm)或肿瘤的子集.赘生物或肿瘤是这样的细胞组群，其经历不受调控的生长，并且通常会形成团或块，但可扩散分布.优选地，术语“癌症”由以下一个或更多个特征来定义：
-生长信号传导的自给自足，
-对抗生长信号不敏感，
-逃避细胞凋亡，
-实现无限的复制潜力，
-血管生成的诱导和持续，和/或
-转移活化和组织侵袭.
与本发明相关的癌症优选地选自：肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑/CNS肿瘤、乳腺癌、未知的原发癌(Cancer of Unknown Primary)、卡斯特尔曼病(CastlemanDisease)、宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、尤因肿瘤家族(Ewing Family OfTumor)、眼癌、胆囊癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠间质瘤(Gastrointestinal Stromal Tumor，GIST)、妊娠滋养层病、霍奇金病(Hodgkin Disease)、卡波西肉瘤(Kaposi Sarcoma)、肾癌、喉和下咽癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤(Non-HodgkinLymphoma)、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤-成人软组织癌、皮肤癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦氏巨球蛋白血症(WaldenstromMacroglobulinemia)和肾母细胞瘤(Wilms Tumor).
术语“结肠直肠癌”以最广泛的含义使用，并且是指(1)由大肠和/或直肠的上皮细胞产生的所有阶段和所有形式的癌症，和/或(2)影响大肠和/或直肠的里层(lining)的所有阶段和所有形式的癌症.其包括各自来源于结肠(结肠癌)或直肠(直肠癌)的腺癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠间质瘤、原发性结肠直肠淋巴瘤、平滑肌肉瘤、黑素瘤或鳞状细胞癌.在用于结肠直肠癌分类的分期系统中，结肠和直肠被视为一个器官.
本文使用的术语“0期结肠直肠癌”是指癌症处于最早期.其尚未生长超过结肠或直肠的内层(黏膜).该期也称为原位癌或黏膜内癌.0期对应于TNM分类的TisN0M0.
本文使用的术语“I期结肠直肠癌”是指癌症已生长穿过黏膜肌层进入黏膜下层(T1)，或者其也可已生长入固有肌层(T2).其还没有扩散到附近的淋巴结或远端部位.I期对应于TNM分类的T1-T2N0M0.
本文使用的术语“IIA期结肠直肠癌”是指癌症已经生长入结肠或直肠的最外层但尚未穿过它们(T3).其尚未到达附近的器官.其还没有扩散到附近的淋巴结或远端部位.IIA期对应于TNM分类的T3N0M0.
本文使用的术语“IIb期结肠直肠癌”是指癌症已生长穿过结肠或直肠的壁但尚未生长入附近的其他组织或器官(T4a).其还没有扩散到附近的淋巴结或远端部位.IIb期对应于TNM分类的T4aN0M0.
本文使用的术语“IIC期结肠直肠癌”是指癌症已生长穿过结肠或直肠的壁并附着至或已经生长入附近的其他组织或器官(T4b).其还没有扩散到附近的淋巴结或远端部位.IIC期对应于TNM分类的T4bN0M0.
本文使用的术语“IIIA期结肠直肠癌”是指以下之一：(i)癌症已经生长穿过黏膜进入黏膜下层(T1)，并且其也可生长入固有肌层(T2).其已扩散到附近的1至3个淋巴结(N1a/N1b)或扩散入淋巴结附近的脂肪区域中，而不是淋巴结本身(N1c).其还没有扩散到远端部位.这对应于TNM分类的T1-T2N1M0.(ii)癌症已经生长穿过黏膜进入黏膜下层(T1).其已扩散到附近的4至6个淋巴结(N2a).其还没有扩散到远端部位.这对应于TNM分类的T1N2aM0.
本文使用的术语“IIIB期结肠直肠癌”是指以下之一：(i)癌症已经生长入结肠或直肠的最外层(T3)或穿过脏腹膜(T4a)，但尚未到达附近的器官.其已扩散到附近的1至3个淋巴结(N1a/N1b)或扩散入淋巴结附近的脂肪区域中，而不是淋巴结本身(N1c).其还没有扩散到远端部位.这对应于TNM分类的T3-T4aN1M0.(ii)癌症已经生长入固有肌层(T2)或生长入结肠或直肠的最外层(T3).其已扩散到附近的4至6个淋巴结(N2a).其还没有扩散到远端部位.这对应于TNM分类的T2-T3N2aM0.(iii)癌症已经生长穿过黏膜进入黏膜下层(T1)，或者其也可能已经生长入固有肌层(T2).其已扩散到附近的7个或更多个淋巴结(N2b).其还没有扩散到远端部位.这对应于TNM分类的T1-T2N2bM0.
本文使用的术语“IIIC期结肠直肠癌”是指以下之一：(i)癌症已经生长穿过结肠或直肠的壁(包括脏腹膜)但尚未到达附近的器官(T4a).其已扩散到4至6个附近的淋巴结(N2a).其还没有扩散到远端部位.这对应于TNM分类的T4aN2aM0.(ii)癌症已经生长入结肠或直肠的最外层(T3)或生长穿过脏腹膜(T4a)，但尚未到达附近的器官.其已扩散到7个或更多个附近的淋巴结(N2b).其还没有扩散到远端部位.这对应于TNM分类的T3-T4aN2bM0.(iii)癌症已经生长穿过结肠或直肠的壁并附着至或已经生长入附近的其他组织或器官(T4b).其已经扩散到至少一个附近的淋巴结或扩散入淋巴结附近的脂肪区域(N1或N2).其还没有扩散到远端部位.这对应于TNM分类的T4bN1-N2M0.
本文使用的术语“IVA期结肠直肠癌”是指癌症已经或尚未生长穿过结肠或直肠的壁以及已经或尚未扩散到附近的淋巴结.其已经扩散到1个远端器官(例如肝或肺)或淋巴结组(M1a).这对应于TNM分类的anyTanyNM1a.
本文使用的术语“IVA期结肠直肠癌”是指癌症已经或尚未生长穿过结肠或直肠的壁以及已经或尚未扩散到附近的淋巴结.其已扩散到多于一个远端器官(例如肝或肺)或淋巴结组，或者其已扩散到腹膜的远端部分(腹腔的内衬)(M1b).这对应于TNM分类的anyTanyNM1b.
术语“肺癌”包括小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC).
本文使用的术语“SCLC”或“小细胞肺癌”是指未分化的赘生物，优选由早期或胚胎期出现的细胞构成的未分化的赘生物.顾名思义，小细胞癌中的细胞比正常细胞更小，并且几乎没有任何细胞质的空间。
本文使用的术语“NSCLC”或“非小细胞肺癌”是指由于其预后和管理大致相同而分组在一起的一组异质性疾病，并且根据世界卫生组织/国际肺癌研究协会的组织学分类(Travis WD等，Histological typing of lung and pleural tumors.第3版.Berlin：Springer-Verlag，1999)包括以下：
(i)占NSCLC的30％至40％的鳞状细胞癌(Squamous cell carcinoma，SCC)起始于较大的呼吸管，但生长较慢，意味着这些肿瘤的大小因诊断而异.
(ii)腺癌是NSCLC中最常见的亚型，占NSCLC的50％至60％，其起始于肺的气体交换表面附近，并且其包括可对治疗有不同响应的亚型支气管肺泡癌.
(iii)大细胞癌是在肺表面附近生长的快速生长形式.其主要是排除诊断，当进行更多的研究时，通常将其重新分类为鳞状细胞癌或腺癌.
(iv)腺鳞癌(adenosquamous carcinoma)是一种包含以下两种类型的细胞的癌症：鳞状细胞(内衬于某些器官的细小的扁平细胞)和腺样细胞.
(v)具有多形性、肉瘤样或肉瘤要素的癌.这是一组罕见的肿瘤，其反映了组织学异质性以及上皮和间充质分化的连续区(continuum).
(vi)类癌肿瘤是一种缓慢生长的神经内分泌性肺肿瘤，并且起始于能够响应于神经系统提供的刺激释放激素的细胞.
(vii)唾液腺型癌起始于位于肺的大气道内的唾液腺细胞.
(viii)未分类的癌包括不适合上述任何肺癌类别的癌症.
NSCLC可以是鳞状细胞癌、腺癌、大细胞(未分化的)癌、腺鳞癌和肉瘤样癌。
SCLC或NSCLC可以是0、IA、IB、IIa、IIb、IIIa、IIIb或IV期NSCLC.
本文使用的术语“0期NSCLC”是指仅存在于内衬于气道之细胞顶层的肿瘤.其还没有更深地侵入其他肺组织，并且没有扩散到淋巴结或远端部位.0期对应于TNM分类的TisN0M0期。
本文使用的术语“I期NSCLC”或“I期SCLC”是指存在于肺中的肿瘤，但是所述癌症在胸部淋巴结或胸外的其他位置尚未发现.I期(N)SCLC细分为IA期和IB期，其通常基于肿瘤的大小或沿肺外侧内衬的胸膜的累及.在IA期，肿瘤的大小为3厘米(cm)或更小，并且最小程度地(如果有的话)侵入附近组织.癌症尚未扩散到淋巴结或任何远端部位.在IB期，肿瘤的大小大于3cm，已经侵入内衬于肺周围的胸膜，或者已导致一部分肺塌陷.癌症尚未扩散到淋巴结或任何远端部位.IA期对应于TNM分类的T1N0M0期.IB期对应于TNM分类的T2M0N0.
本文使用的术语“II期NSCLC”或“I期SCLC”是指已经开始累及胸内的淋巴结或者已经更广泛地侵入胸部结构和组织的癌症.然而，在胸部的累及侧以外可能没有发现扩散，并且仍认为该癌症是局部疾病.II期细分为IIA期和IIB期.IIA期是指3cm或更小并且已最低程度地(如果有的话)侵入附近组织的肿瘤.累及胸部同一侧的一个或更多个淋巴结，但没有扩散到远端部位.在以下两种情况下分配为IIB期：当肿瘤大于3cm时并且一定程度地侵入附近组织且累及胸部同一侧的一个或更多个淋巴结；或者对于以下癌症，其未累及淋巴结，但是已经侵入肺外部的胸部结构或者位于隆凸(气管或向肺输送空气的管分开以到达右肺和左肺的点)的2cm内.IIA期对应于TNM分类的T1N1M0或T2N1M0.根据TNM分类，IIB期对应于T3N0M0.
本文使用的术语“III期NSCLC”或“I期SCLC”是指与II期相比已经更广泛地侵入胸部组织的肿瘤，和/或癌症已经扩散到纵隔中的淋巴结.然而，不能检测到扩散(转移)到机体的其他部分.III期分为IIIA和IIIB期.IIIA期是指未侵入任何相邻器官而累及远离肿瘤但不在胸外的一个或更多个淋巴结的单肿瘤或团块.IIIB期是指已经扩散到胸内多于一个区域但不在胸外的癌症.根据TNM分类，IIIA期对应于T1N2M0、T2N2M0、T3N1M0、T3N2M0、T4N0M0或T4N1M0.根据TNM分类，IIIB期对应于T1N3M0、T2N3M0、T3N3M0、T4N2M0或T4N3M0.
本文使用的术语“IV期NSCLC”或“I期SCLC”是指已经扩散或转移到体内的不同部位(其可包括肝、脑或其他器官)的癌症.IV期对应于具有M1的任何T或任何N.
TNM分类是恶性癌症的分期系统.本文使用的术语“TNM分类”是指如Sobin等(International Union Against Cancer(UICC)，TNM Classification of Malignanttumors，第6版，New York；Springer，2002，第191-203页)(TNM6)和AJCC癌症分期手册第6版；第19章；肺-原始第167-177页中所定义的TNM分期的第6版，其中肿瘤通过以下几个因素如下分类：即，T为肿瘤，N为淋巴结，M为转移：
T：原发性肿瘤无法评估，或者肿瘤通过痰或支气管洗液中恶性细胞的存在得到证实，但通过成像或支气管镜检查无法可见：
-T0：无原发性肿瘤的证据；
-Tis：原位癌；
-T1：肿瘤的最大尺寸为3cm或更小，被肺或脏胸膜包围，没有支气管镜检查证据表明有比叶支气管更近的侵入(例如不在主支气管中)；
-T2：肿瘤大于3cm但为7cm或更小，或者肿瘤具有以下任何特征(如果5cm或更小，则将具有这些特征的T2肿瘤分类为T2a，)：累及主支气管、距隆凸2厘米或更远、侵入脏胸膜(PL1或PL2)、与扩展到肺门区但不累及整个肺的肺不张或阻塞性肺炎相关；
-T3：肿瘤大于7厘米或直接侵入以下任一处：壁胸膜(PL3)、胸壁(包括上沟肿瘤)、膈、膈神经、纵膈胸膜、心包壁层，或肿瘤在主支气管中距离隆凸不到2cm但不累及隆凸，或者相关的整个肺的肺不张或阻塞性肺炎，或同一肺叶中有单独肿瘤结节；以及
-T4：侵入以下任一处的任意大小的肿瘤：纵隔、心脏、大血管、气管、喉返神经、食管、椎体、隆凸，不同的同侧肺叶中有单独的肿瘤结节.N(局部淋巴结)：
-NX：局部淋巴结无法评估
-N0：无局部淋巴结转移
-N1：同侧支气管周和/或同侧肺门淋巴结和肺内淋巴结中有转移，包括通过直接扩展的累及
-N2：同侧纵隔和/或隆凸下淋巴结中有转移
-N3：对侧纵隔、对侧肺门、同侧或对侧斜角肌、或锁骨上淋巴结中有转移
M：远端转移
-M0：无远端转移
-M1：远端转移
本文使用的术语“癌细胞”是指在其发育期间获得一组特征性功能能力，特别是以下一项或更多项的细胞：逃避细胞凋亡的能力、生长信号的自给自足、对抗生长信号的不敏感、组织侵入/转移、显著的生长潜力和/或持续的血管生成.该术语意在涵盖恶性前和恶性癌细胞二者.
本文使用的术语“肿瘤DNA”或“癌细胞的肿瘤DNA”简单地是指癌细胞的DNA.其仅用于将癌细胞的DNA与本文提及的其他DNA更清楚地区分开.因此，除非引入歧义，否则可作为替代使用术语“癌细胞的DNA”.
本文所用的术语“对象”是指个体，例如人、非人灵长类(例如黑猩猩以及其他猿和猴物种)；农场动物，例如鸟、鱼、牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠.该术语不指示特定的年龄或性别.在一个具体含义中，对象是哺乳动物.在一个优选含义中，对象是人.
本文使用的术语“是......的指示”或“指示”是指识别或指定要待指示的事物的行为.如本领域技术人员理解的，这样的评估通常可能不是对100％的患者都是准确的，但其优选地是准确的.然而，该术语要求，可对对象的统计学显著部分做出准确指示.某一部分是否是统计学显著的可容易地由本领域技术人员使用几种公知的统计学评价手段来确定，所述手段例如置信区间的确定、p值的确定、Student t检验、Mann-Whitney检验等.详细信息在Dowdy和Wearden，Statistics for Research，John Wiley&Sons，New York 1983中提供.优选的置信区间为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％.p值优选为0.05、0.01或0.005.
本文使用的术语“产生扩增子”是指通常用聚合酶链反应(PCR)来扩增双链或单链DNA模板的限定区域.“扩增子”是根据所述限定区域的双链DNA片段.
本文使用的术语“引物对”是指这样的两个寡核苷酸，即正向和反向引物，其相对于双链核酸分子各自具有与一条链(至少基本上)相同的序列，使得其各自与其(至少基本上)相同链的互补链退火.术语“正向引物”是指与双链核酸分子的正向链(由基因组参考序列的方向所定义)(至少基本上)相同的引物，术语“反向引物”是指与双链核酸分子中正向链的反向互补链(至少基本上)相同的引物.正向引物和反向引物与其模板退火的位点之间的距离取决于期望引物产生的扩增子的长度.通常来说，对于本发明，其为50至1000bp.本文规定了优选的扩增子大小.在使用引物对扩增单链DNA模板的情况下，在第一扩增循环中只有一个引物与单链退火.随后，另一个引物与新产生的互补链结合，使得扩增的结果是双链DNA片段.短语“适于由其中5位未甲基化的胞嘧啶已被转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交之另一碱基的基因组DNA的单链产生扩增子的引物对”是指将从未甲基化胞嘧啶到尿嘧啶的碱基变化考虑在内的碱基对，尿嘧啶与腺嘌呤碱基配对并且因此在扩增子中被胸腺嘧啶替代.
本文关于癌症使用的术语“治疗”是指其中目的是降低癌症的进展的治疗性治疗.有益或期望的临床结果包括但不限于症状的缓解、疾病时长的缩短、稳定化的病理状态(特别是不恶化)、减慢疾病进展、改善病理状态和/或减轻(部分和全部两种情况)，其优选是可检测的.成功的治疗并不一定意味着治愈，但是与如果不施加治疗的预期生存期相比，其仍可意味着延长的生存期.在一个优选实施方案中，治疗是一线治疗，即，癌症先前未被治疗.癌症治疗涉及治疗方案.
本文使用的术语“治疗方案”是指如何根据疾病以及可利用的方法和用药来治疗患者.癌症治疗方案的非限制性实例是化学治疗、外科手术和/或照射、或其组合.本发明实现的早期癌症检测特别地允许外科手术治疗，尤其是允许治愈性切除.特别地，术语“治疗方案”是指施用如下定义的一种或更多种抗癌剂或治疗.治疗方案的改变不一定意味着药物或治疗的改变，而且也可能意味着相同药物或治疗的剂量的变化.本文使用的术语“抗癌剂或治疗”是指具有抗增殖、抗致癌和/或制癌特性的化学、物理或生物药剂或治疗、或者外科手术，包括其组合.
化学抗癌剂或治疗可选自烷化剂、抗代谢物、植物生物碱和萜类化合物以及拓扑异构酶抑制剂.优选地，烷化剂是基于铂的化合物.在一个实施方案中，基于铂的化合物选自顺铂、奥沙利铂、依铂、洛铂、奈达铂、卡铂、异丙铂、四铂、洛铂、DCP、PLD-147、JMl88、JM216、JM335和赛特铂.
物理抗癌剂或治疗可选自放射治疗(例如治愈性放射治疗、辅助性放射治疗、姑息性放射治疗、远距离放射治疗、近距离放射治疗或代谢性放射治疗)、光疗(使用例如血卟啉或光敏素II)和热疗.
外科手术可以是治愈性切除术、姑息性外科手术、预防性外科手术或细胞减灭术(cytoreductive surgery).通常来说，外科手术涉及切除，例如Baron和Valin(Rec.Med.Vet，Special Canc.1990；11(166)：999-1007)中所描述的囊内切除、边缘性切除、广泛性切除或根治性切除。
生物抗癌剂或治疗可选自抗体(例如，刺激破坏癌细胞的免疫应答的抗体，例如利妥昔单抗(retuximab)或阿仑单抗(alemtuzubab)；通过与免疫细胞的受体结合并抑制阻止免疫细胞攻击“本身”细胞的信号来刺激免疫应答的抗体，例如伊匹单抗；干扰肿瘤生长所必需的蛋白质的作用的抗体，例如贝伐单抗、西妥昔单抗或帕尼单抗；或者与药物(优选细胞杀伤物质例如毒素、化学治疗性或放射性分子)缀合的抗体，例如Y-替伊莫单抗、I-托西莫单抗或阿多曲妥珠单抗依酯(ado-trastuzumab emtansine))；细胞因子(例如，干扰素或白介素例如INF-α和IL-2)；疫苗(例如包含癌症相关抗原的疫苗，例如sipuleucel-T)；溶瘤病毒(例如，天然溶瘤病毒例如呼肠孤病毒、新城疫病毒或腮腺炎病毒；或基因工程化病毒例如麻疹病毒、腺病毒、痘苗病毒或疱疹病毒，其优先靶向携带癌症相关抗原例如EGFR或HER-2的细胞)；基因治疗剂(例如，这样的DNA或RNA，其替代改变的肿瘤抑制因子，阻断致癌基因的表达，改善患者的免疫系统，使癌细胞对化学治疗、放射治疗或其他治疗更敏感，诱导细胞自杀或赋予抗血管生成作用)；以及过继性T细胞(例如，针对抗肿瘤活性选择的患者收获的肿瘤侵入性T细胞，或经遗传修饰以识别癌症相关抗原的患者收获的T细胞).
在一个实施方案中，一种或更多种抗癌药物选自：醋酸阿比特龙、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、AC-T、ADE、阿多曲妥珠单抗依酯、双马来酸阿法替尼、阿地白介素(Aldesleukin)、阿仑单抗、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿瑞匹、三氧化二砷、菊欧文菌天冬酰胺酶(Asparaginase Erwinia chrysanthemi)、阿西替尼、阿扎胞苷、BEACOPP、贝利司他(Belinostat)、盐酸苯达莫司汀、BEP、贝伐单抗、贝沙罗汀(Bexarotene)、比卡鲁胺、博莱霉素、硼替佐米、博舒替尼(Bosutinib)、Brentuximab Vedotin、白消安、卡巴他赛(Cabazitaxel)、卡博替尼-S-苹果酸盐(Cabozantinib-S-Malate)、CAF卡培他滨、CAPOX、卡铂、卡铂-紫杉酚(CARBOPLATIN-TAXOL)、卡非佐米(Carfilzomib)、卡莫司汀、卡莫司汀植入物、色瑞替尼(Ceritinib)、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、苯丁酸氮芥-泼尼松(CHLORAMBUCIL-PREDNISONE)、CHOP、顺铂、氯法拉滨(Clofarabine)、CMF、COPP、COPP-ABV、克唑替尼(Crizotinib)、CVP、环磷酰胺、阿糖胞苷、阿糖胞苷、脂质体、达拉非尼、达卡巴嗪、放线菌素、达沙替尼、盐酸柔红霉素、地西他滨、地加瑞克、地尼白介素(Denileukin Diftitox)、地诺单抗(Denosumab)、盐酸右雷佐生(Dexrazoxane Hydrochloride)、多西他赛、盐酸多柔比星、盐酸多柔比星脂质体、艾曲波帕(Eltrombopag Olamine)、恩杂鲁胺(Enzalutamide)、盐酸表柔比星、EPOCH、甲磺酸艾日布林、盐酸埃罗替尼、盐酸依托泊苷、依维莫司、依西美坦、FEC、非格司亭、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、FU-LV、氟维司群、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、吉妥单抗奥佐米星(Gemtuzumab Ozogamicin)、谷卡匹酶(Glucarpidase)、醋酸戈舍瑞林(Goserelin Acetate)、HPV二价疫苗、重组HPV四价疫苗、Hyper-CVAD、替伊莫单抗(Ibritumomab Tiuxetan)、依鲁替尼(Ibrutinib)、ICE、艾代拉利司(Idelalisib)、异环磷酰胺(Ifosfamide)、伊马替尼(Imatinib)、甲磺酸盐、咪喹莫特(Imiquimod)、碘131托西莫单抗和托美单抗、伊匹单抗、盐酸伊立替康、伊沙匹隆、二甲苯磺酸拉帕替尼、来那度胺、来曲唑、亚叶酸钙、醋酸亮丙瑞林、脂质体阿糖胞苷、洛莫司汀、盐酸氮芥(Mechlorethamine Hydrochloride)、醋酸甲地孕酮、巯嘌呤、美司钠(Mesna)、甲氨蝶呤、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、MOPP、奈拉滨、尼洛替尼、奥比妥珠单抗、奥法木单抗(Ofatumumab)、高三尖杉酯碱(Omacetaxine Mepesuccinate)、OEPA、OFF、OPPA、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂、PAD、帕利夫明(Palifermin)、盐酸帕洛诺司琼、帕米膦酸二钠、帕尼单抗(Panitumumab)、盐酸帕唑帕尼、培门冬酶(Pegaspargase)、聚乙二醇干扰素α-2b、帕母单抗(Pembrolizumab)、培美曲塞二钠、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、普乐沙福(Plerixafor)、泊马度胺(Pomalidomide)、盐酸帕纳替尼(PonatinibHydrochloride)、普拉曲沙、泼尼松、盐酸丙卡巴肼、镭223二氯化物、盐酸雷洛昔芬、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、拉布立酶(Rasburicase)、R-CHOP、R-CVP、重组HPV二价疫苗、重组HPV四价疫苗、重组干扰素α-2b、瑞戈非尼(Regorafenib)、利妥昔单抗、罗米地辛(Romidepsin)、罗米司亭(Romiplostim)、磷酸鲁索利替尼(Ruxolitinib Phosphate)、西妥昔单抗、Sipuleucel-T、甲苯磺酸索拉非尼、STANFORD V、苹果酸舒尼替尼、TAC、滑石、枸橼酸他莫昔芬、替莫唑胺、西司他莫司、沙利度胺、盐酸托泊替康、托瑞米芬、托西莫单抗和I131碘托西莫单抗、TPF、曲美替尼(Trametinib)、曲妥珠单抗、凡德他尼、VAMP、VeIP、维罗非尼(Vemurafenib)、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞滨(Vinorelbine Tartrate)、维莫德吉(Vismodegib)、伏立诺他(Vorinostat)、XELOX、Ziv-阿柏西普(Ziv-Aflibercept)和唑来膦酸.
本申请中涉及的SEQ ID
本申请涉及SEQ ID NO No：1至151.对这些SED ID的概述和解释示于下表1中：
表1：本说明书的SEQ ID.r.c.意指反向互补物，C至T或G至A意指通过CpG背景以外的胞嘧啶的重亚硫酸盐转化被转化成尿嘧啶，并且在后续扩增中被胸苷替代.bis1是指经重亚硫酸盐转化的正向链(如各基因组DNA的SEQ ID中所列举的)和bis2是指正向链的经重亚硫酸盐转化的反向互补链(各基因组DNA的SEQ ID的反向互补序列)，在此链的方向由例如从构建的基因组(HCGR38)获得的基因组参考序列的方向限定.对于序列的作图，参见图2.
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通过以下实施例描述本发明，这些实施例将被解释为仅是说明性的并不限制本发明的范围.
实施例1
样品制备：
将用于评估测定的技术样品制备为经重亚硫酸盐处理的已知在测定区域中未甲基化的PBL DNA(外周血DNA)(人基因组DNA：男性，Promega GmbH)和甲基化DNA(经DNA-甲基转移酶处理的DNA-通用甲基化DNA，Merck Chemicals GmbH)的总共10ng/ml的混合物.作为未甲基化DNA的第二技术参考对照，使用全基因组随机扩增的DNA(Phi).基因组DNA对照是未处理的PBL DNA.在稀释和混合之前，按照制造商的方案，将技术对照所使用或混合的所有其他DNA用EpiTect重亚硫酸盐试剂盒(Qiagen GmbH)进行重亚硫酸盐处理.在技术样品中，与循环肿瘤DNA相反，基因组DNA未片段化/降解.
通过向来自健康(非癌症)患者的3.5ml体积血浆(血浆，正常EDTA，Cliniqa Co.)掺加甲基化DNA(经DNA甲基转移酶处理的DNA-通用甲基化DNA，Merck Chemicals GmbH)来制备血浆对照.患者血浆样品来自癌症研究中肺癌和健康(非癌症)患者的3至3.5ml剩余物.血浆中的肺癌DNA被片段化/降解.
样品/DNA处理：
直接使用技术样品/DNA混合物.以与Epi proColon 2.0试剂盒(Epigenomics AG)的使用说明书(IFU)中规定的分析前工作流程类似的方式进行血浆样品处理.
PCR反应对于技术样品在每个反应中使用10ng总DNA，或者对于血浆样品使用约1ml血浆的经处理等同物.除包含设计用于本申请中测定的相关寡聚物的PCR混合物外，均根据Epi proColon 2.0PCR试剂盒(Epigenomics AG)的PCR方案，在LightCycler 480(Roche Applied Sciences)上进行实时PCR.
该实施例比较了对FOXL2的两种测定，所述两种测定用其阻断剂和探针覆盖并评估相同的CpG：1.引物中间没有错配的已建立的90bp长HM测定(FOXL2-长)，其已经从这样的大小和特征的测定的多种替代方案中选择出，并且已经在许多实验中针对引物/阻断剂/探针序列进行优化.2.一个引物中间具有甲基化非特异性错配的新的68bp长HM测定(FOXL2-短).该测定尚未针对引物/阻断剂/探针序列进行优化.
结果：
对技术样品(图1)和经掺加血浆样品(图2)比较测定-两种比较都能提供明确的证据表明，较短的测定出乎意料地比较长的测定表现得更好，尽管其未经优化且在一个引物正中间具有错配.这是出乎意料的，不仅是因为该缩短化极大地提高了灵敏度，而且还因为该效果不依赖于作为循环肿瘤DNA之标志的DNA片段化(在技术样品中DNA未片段化).
较短测定的结果在对技术样品和经掺加血浆样品的独立实验中得到验证(图3，上图).可测量甲基化DNA的量重复地显示为每个PCR低至10pg甲基化DNA(技术样品)或每个PCR低至12pg甲基化DNA(经掺加血浆样品)，其相当于约4分子模板的当量(其中6pg DNA为约一个细胞的二倍体基因组的质量).
患者血浆材料的有限量不允许对两种测定进行头对头比较，并且只能用于技术上表现得更好的短测定以验证其检测癌症患者中血浆中的FOXL2甲基化的可用性(图3，下图).
实施例2
样品制备和处理：
如Epi proColon 2.0试剂盒(Epigenomics AG)的使用说明书(IFU)中规定的收集来自肺癌患者、患有良性肺病的患者和健康对照的血浆样品.简言之，通过两个离心步骤制备EDTA血浆.将血浆样品储存在-70℃直至进行处理.对于肺癌病例，在任何癌症特异性治疗之前进行抽血.所有对象均处于相似的年龄范围.
以与Epi proColon 2.0试剂盒(Epigenomics AG)的使用说明书(IFU)中规定的分析前工作流程类似的方式处理血浆样品.PCR反应在30μl总体积中使用约1ml血浆的经处理等同物，以技术性重复两次或重复三次进行.根据Epi proColon 2.0PCR试剂盒(Epigenomics AG)的PCR方案在Applied Biosystems 7500Fast Dx(Applied Biosystems)上进行实时PCR.除所研究标记的甲基化状态之外，还并行地测量ACTB水平作为参考.所有研究的样品均根据其ACTB值来定义为有效用于分析.对于数据和ROC分析，使用技术重复的最小Ct值.
研究1：在第一项研究中，将肺癌病例与健康对照进行比较，以ACTB作为参考在两重反应中评估SHOX2甲基化.使用来自Epi proColon洗脱的12μl经重亚硫酸盐处理的DNA作为模板在30μl总体积中以技术性重复两次进行PCR反应.研究了59份来自肺癌病例的样品.26例被诊断患有鳞状肺癌，22例患有腺癌，5例患有SCLC，3例患有非NSCLC，2例患有腺鳞癌，1例患有大细胞癌.将来自没有疾病证据的个体的92份血浆样品进行处理作为对照.
研究2：在第二项研究中，将肺癌病例与健康对照进行比较，以另一种甲基化标记和ACTB作为参考在三重反应中评估SHOX2甲基化.使用来自Epi proColon洗脱的12μl经重亚硫酸盐处理的DNA作为模板在30μl总体积中以技术性重复四次进行PCR反应.研究了来自肺癌病例的48份样品.26例被诊断患有鳞状肺癌，20例患有腺癌，1例患有非NSCLC，1例患有大细胞癌.将来自没有疾病证据的个体的100份血浆样品进行处理作为对照.
研究3：在第三项研究中，在除癌症之外的其他肺病中研究SHOX2甲基化的状态，并与肺癌患者中的SHOX2甲基化相比较.以另一种甲基化标记和ACTB作为参考在三重反应中评估SHOX2甲基化.使用来自Epi proColon洗脱的15μl经重亚硫酸盐处理的DNA作为模板在30μl总体积中以技术性重复三次进行PCR反应.在这项研究中，将研究I和研究II中使用的来自肺癌患者的50份研究血浆样品的亚组与50例对照进行比较.这些对照被诊断患有不同的肺病：18例患有慢性阻塞性肺病(COPD)，10例患有肺炎，5例患有哮喘，5例患有支气管扩张，12例患有其他肺病，例如棘球蚴(echinococcus)感染或骨软骨瘤病.
结果：
先前研究中血浆中SHOX2甲基化的检测获得比较288例肺癌患者和189例对照的ROC图中曲线下面积值为0.78的临床表现(Kneip等，Journal of Thoracic Oncology，第6卷，第8期，2011年8月)。在该研究中，使用124bp长扩增子的SHOX2测定来区分肺癌患者和健康对象。本文所述的该测定的改进形式使用允许引物中有错配的经修饰寡核苷酸，产生较短的91bp长扩增子(也参见图2，SHOX2).Kneip等的测定和本文所述的测定在相同的CpG位点检测甲基化.本发明人测定的这种改进使得出人意料地改善SHOX2的检测并且得到更好的临床表现.这通过以下三项单独的研究得以证明：
研究I以ACTB作为参考基因，在双重反应中使用本发明人的包含引物错配的新91bp SHOX2测定(图2).在此，比较来自肺癌患者的59份血浆样品和作为对照的来自健康个体的92份血浆样品，在ROC曲线分析中得到0.871的AUC提高(图6).
在第二项研究中，通过使用相同的包含引物错配的91bp SHOX2测定比较来自肺癌患者的48份血浆样品和作为对照的来自健康个体的100份血浆样品来研究SHOX2甲基化水平.与研究I相比，除ACTB之外还测量另一种甲基化标记在三重反应中测量SHOX2.尽管测定的复杂度提高，但临床表现仍然改善，如ROC图中0.893的AUC所证明的(图7).
在第三项研究中，研究了血浆中发现的SHOX2甲基化是否是肺癌的特征，或者是否可与除癌症之外的其他肺病相关.因此，再次测量了来自研究I和研究II的来自肺癌患者的50份血浆样品的亚组，并与来自患有良性肺病之患者的50份血浆样品进行比较.再次，使用相同的包含引物错配的91bp SHOX2测定.ROC分析得到0.834的AUC(图8)，其显示如本文所述用较短的经改进测定来检测SHOX2甲基化不仅可用于区分健康对照，而且还可用于区分患有良性肺病的患者.
总之，所有三项研究表明：与不具有错配的较长测定相比，如图2所示的本发明人包含引物错配的91bp SHOX2测定在临床评估方面出乎意料地优异，尽管两种测定均依赖于相同的CpG位点。
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Claims (15)

1.一种用于在包含基因组DNA的样品中检测高甲基化靶DNA的存在或不存在的方法，其中所述基因组DNA是至少部分片段化的，所述方法包括以下步骤：
(a)将DNA中5位未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交的另一碱基；
(b)使用甲基化非特异性引物寡核苷酸和至少一种以甲基化特异性方式阻断扩增的甲基化特异性阻断剂来扩增转化的靶DNA的区域，其中所述区域的长度小于100个碱基对(bp)并且包含所述基因组DNA的至少3个不被引物覆盖的CpG位点，并且
其中至少一种引物寡核苷酸：(1)覆盖至少一个CpG位点，其具有与CpG位点的胞嘧啶碱基位置相关的甲基化非特异性错配或间隔物，和/或(2)覆盖至少一个SNP位点，其具有SNP非特异性错配或间隔物；以及
(c)检测步骤(b)中扩增的DNA的存在或不存在，
其中扩增的DNA的存在或不存在分别反映所述样品中高甲基化靶DNA的存在或不存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中至少一个错配或间隔物在所述引物寡核苷酸的中间三分之一或3’端的三分之一内。
3.根据权利要求1所述的方法，其中至少一个错配或间隔物在所述引物寡核苷酸3’端的10个核苷酸内和/或不在所述引物寡核苷酸5’端的5个核苷酸内。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述靶DNA是基因组人FOXL2、SHOX2或PTGER4DNA，包括各自的启动子区以及其上游和下游5kb内的DNA。
5.甲基化非特异性引物寡核苷酸和至少一种以甲基化特异性方式阻断扩增的甲基化特异性阻断剂在制备用于在对象中检测癌症的存在或不存在的试剂盒中的用途，所述检测包括根据权利要求1至3中任一项所述的用于在包含基因组DNA的样品中检测高甲基化靶DNA的存在或不存在的方法，其中：
-所述样品是来源于对象的样品，在患有所述癌症的对象中其包含癌细胞的肿瘤DNA，
-所述靶DNA在患有所述癌症的患者的癌细胞中是高甲基化的，并且
-所述样品中高甲基化靶DNA的存在或不存在分别指示所述对象中所述癌症的存在或不存在。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述癌症是肺癌或结肠直肠癌。
7.一种试剂盒，其包含：
(i)至少一个由正向引物和反向引物组成的甲基化非特异性引物寡核苷酸对，其中所述引物对适于由基因组DNA的单链产生扩增子，在所述基因组DNA的单链中5位未甲基化的胞嘧啶已被转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交之另一碱基，其中所述基因组DNA是至少部分片段化的，其中至少一种引物寡核苷酸：(1)覆盖至少一个CpG位点，其具有与CpG位点的胞嘧啶碱基位置相关的甲基化非特异性错配或间隔物，和/或(2)覆盖至少一个SNP位点，其具有SNP非特异性错配或间隔物，并且其中所述扩增子的长度小于100bp且包含所述基因组DNA的至少3个不被引物覆盖的CpG位点；以及
(ii)至少一种能够以甲基化特异性方式阻断扩增的甲基化特异性阻断剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中至少一个错配或间隔物在所述引物寡核苷酸的中间三分之一或3’端的三分之一内。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其中至少一个错配或间隔物在所述引物寡核苷酸3’端的10个核苷酸内和/或不在所述引物寡核苷酸5’端的5个核苷酸内。
10.根据权利要求7、8或9所述的试剂盒，其中所述基因组DNA的单链是人FOXL2、SHOX2或PTGER4 DNA的，包括各自的启动子区以及其上游和下游5kb内的DNA。
11.以下在制备用于在对象中检测癌症的存在或不存在的试剂盒中的用途：
(i)至少一个由正向引物和反向引物组成的甲基化非特异性引物寡核苷酸对，其中所述引物对适于由基因组DNA的单链产生扩增子，在所述基因组DNA的单链中5位未甲基化的胞嘧啶已被转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交之另一碱基，其中所述基因组DNA是至少部分片段化的，并且其中至少一种引物寡核苷酸：(1)覆盖至少一个CpG位点，其具有与CpG位点的胞嘧啶碱基位置相关的甲基化非特异性错配或间隔物，和/或(2)覆盖至少一个SNP位点，其具有SNP非特异性错配或间隔物，并且其中所述扩增子的长度小于100bp并且包含所述基因组DNA的至少3个不被引物覆盖的CpG位点；以及
(ii)至少一种能够以甲基化特异性方式阻断扩增的甲基化特异性阻断剂。
12.根据权利要求11所述的用途，其中至少一个错配或间隔物在所述引物寡核苷酸的中间三分之一或3’端的三分之一内。
13.根据权利要求11所述的用途，其中至少一个错配或间隔物在所述引物寡核苷酸3’端的10个核苷酸内和/或不在所述引物寡核苷酸5’端的5个核苷酸内。
14.根据权利要求11所述的用途，其中所述癌症是肺癌或结肠直肠癌。
15.根据权利要求11、12、13或14所述的用途，其中所述基因组DNA的单链是人FOXL2、SHOX2或PTGER4 DNA的，包括各自的启动子区以及其上游和下游5kb内的DNA。
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