CN109097472A

CN109097472A - 可用于肠癌液体活检的dna甲基化标志物及其检测方法，引物对及试剂盒

Info

Publication number: CN109097472A
Application number: CN201810971220.7A
Authority: CN
Inventors: 王小平; 宁争志
Original assignee: Shenzhen Tianyuan Printing Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Tianyuan Printing Technology Co Ltd
Priority date: 2018-08-24
Filing date: 2018-08-24
Publication date: 2018-12-28

Abstract

本发明公开一种可用于肠癌液体活检的DNA甲基化标志物及其检测方法，用于检测该DNA甲基化标志物的引物对、以及应用该DNA甲基化标志物检测的试剂盒。本发明的技术方案能够利用DNA甲基化位点进行液体活检，对肠癌的发生风险进行评估，且该方法简便可行。

Description

可用于肠癌液体活检的DNA甲基化标志物及其检测方法，引物对及试剂盒

技术领域

本发明涉及疾病监测技术领域，特别涉及一种可用于肠癌液体活检的DNA甲基化标志物及其检测方法，用于检测该DNA甲基化标志物的引物对、以及应用该DNA甲基化标志物检测的试剂盒。

背景技术

2013年，世界卫生组织下属国际癌症研究机构发布报告，指认大气污染对人类致癌，并视其为普遍和主要的环境致癌物。表观遗传学是不改变DNA序列情况下，基因功能的可逆的、可遗传的变化。DNA甲基化表观遗传学的主要研究对象。DNA甲基化是DNA序列上特定序列(连续的胞嘧啶和鸟嘌呤)上的胞嘧啶有可能被甲基化。甲基化程度的变化会通过改变染色质结构及稳定性、改变转录因子结合活性等方式改变基因的表达情况。一般来说，低甲基化有利于基因的表达，高甲基化会抑制基因的表达。目前有研究证实DNA甲基化的状态与某些肿瘤的发生具有高度的相关性。可通过DNA甲基化来评价肿瘤是否发生，以及治疗措施对肿瘤的疗效。

本领域中有多种方法检测DNA的甲基化。甲基化敏感限制性内切酶-PCR/Southern法(Methylation-Sensitive Restriction Endonuclease-PCR/Southern,MSRE-PCR/Southern)是利用甲基化敏感限制性内切酶将DNA切割为大小不同的片段，并进行PCR/Southern分析的方法。该方法是基于限制性内切酶的甲基化分析方法。另还有基于经重亚硫酸盐处理的，以及在此基础上衍生出的一些甲基化分析方法，例如重亚硫酸盐测序法(Bisulphite Sequencing)、甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR,MS-PCR)、焦磷酸测序(Pyrosequencing)、结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(COmbinedBisulfiteRestriction Analysis,COBRA)等等。近年来涌现出不少基于全基因组的甲基化分析方法，也称为甲基化图谱分析(Methylation Profiling)，该方法检测样本量大，可检测多个位点。例如，基于MassARRAY技术的飞行质谱分析方法可实现多重CpG的检测；基于高通量测序的分析方法；以及基于芯片的甲基化图谱分析：安捷伦的Human CpG IslandMicroarray Kit、Illumina的Infinium Human Methylation27BeadChip芯片和InfiniumHuman Methylation450BeadChip芯片等等多种甲基化分析方法。

通过检测血液中的信息对患者肿瘤进行诊断与监测的方法称为液体活检。液体活检是目前在肿瘤精准医疗领域迅速发展的一种前沿技术，有取代传统组织活检的趋势。如果能够利用DNA甲基化位点进行液体活检，对肠癌的发生风险进行评估，无疑是一种简便可行的方法。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种可用于肠癌液体活检的DNA甲基化标志物及其检测方法，用于检测该DNA甲基化标志物的引物对、以及应用该DNA甲基化标志物检测的试剂盒，旨在能够利用DNA甲基化位点进行液体活检，对肠癌的发生风险进行评估，且该方法简便可行。

为实现上述目的，本发明提出的可用于肠癌液体活检的DNA甲基化标志物，所述DNA甲基化标志物是SHOX2基因中chr3:157821233-157821604位之间的CpG位点，所述DNA甲基化标记物的甲基化程度指示受试者肠癌发生的情况。

可选地，所述DNA甲基化标志物是SHOX2基因中chr3:157821303-157821353位之间的CpG位点。

可选地，所述DNA甲基化标志物的甲基化程度为检测阈值，待测受试者的CpG位点的甲基化程度高于和低于检测阈值时，分别检测待测受试者为正常和为肠癌发生风险；所述DNA甲基化标志物选自SHOX2基因中chr3:157821233-157821604中的CpG位点发生甲基化，所述甲基化程度的检测阈值M＝(a₁×X₁+a₂×X₂+……+a₁₁×X₁₁)/(X₁+X₂+……+X₁₁)，a₁为0.04-0.1；a₂为0.011-0.016；a₃为0.08-0.16；a₄为0.065-0.12；a₅为0.11-0.3；a₆为0.15-0.4；a₇为0.13-0.28；a₈为0.04-0.14；a₉为0.11-0.16；a₁₀为0.1-0.17；a₁₁为0.01-0.4；X₁、X₂、……、X₁₁为0或1；或者所述甲基化程度的检测阈值M＝(a₁×X₁+a₂×X₂+……+a₅×X₅)/(X₁+X₂+……+X₅)，a₁为0.065-0.12；a₂为0.11-0.3；a₃为0.15-0.4；a₄为0.13-0.28；a₅为0.04-0.14；X₁、X₂、……、X₅为0或1。

可选地，所述DNA甲基化标志物选自SHOX2基因中chr3:157821233-157821604中如下位置起始的CpG位点的DNA甲基化：50、60、68、86、106、116、120、126、223、227和235。

本发明还提出了一种用于检测如前所述的DNA甲基化标志物的引物对，所述引物对扩增含有所述DNA甲基化标志物的一段序列。

可选地，所述引物对选自：SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5；SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7的其中之一。

本发明还提出了一种如上所述的DNA甲基化标志物的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

S10，提取如前所述的DNA甲基化标志物的DNA样品和如如前所述的引物对；

S20，对所述DNA样品进行亚硫酸盐处理；

S30，用所述引物对扩增所述亚硫酸盐处理的样品，获得扩增产物；

S40，对所述扩增产物进行消化；

S50，对所述消化后的扩增产物进行转录和酶切，得到转录和酶切产物；

S60，采用质谱方法对所述转录和酶切产物进行检测，获得样品序列中的甲基化情况。

可选地，所述步骤S50，后还包括纯化步骤，对所述转录和酶切产物进行纯化。

可选地，所述质谱方法是飞行质谱方法。

本发明还提出了一种用于DNA甲基化标志物检测的试剂盒，所述试剂盒包括如前所述的DNA甲基化标志物的探针序列，其中所述CpG位点中的C保持不变或者被T替换。

本发明的技术方案，DNA甲基化标志物是SHOX2基因中chr3:157821233-157821604位之间的CpG位点，DNA甲基化标记物的甲基化程度指示受试者肠癌发生的情况，本发明的方法有如下优点：1)本发明选择检测的甲基化位点分布于SHOX2基因上，与肠癌发生显著相关，可对人体发生肠癌的风险进行预测。本方法具有检测方便，成本低廉、高通量的特点，适合推广。

附图说明

图1为示例甲基化位点(SEQ ID NO.1中第223位)的甲基化状态癌症人群和正常人群中的分布状态。图中左右两个箱图分别是癌症患者和正常受试者的数据值统计，左边刻度为DNA甲基化程度。N为18；癌症患者和正常受试者的数据值统计比较的p值是0.030416；

图2为血液DNA中示例性甲基化位点的甲基化平均值的ROC曲线图。横坐标是假阴性率，纵坐标是真阴性率，N为18；AUC为0.78125。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

发明人经过努力，发现了肠癌与人体液中SHOX2基因的多个DNA甲基化有关。发明人推测，SHOX2可能是通过DNA甲基化调控基因表达，而这是导致肠癌发生的重要因素之一。

本发明人发现，SHOX2基因chr3:157821233-157821604位之间的CpG位点发生甲基化，特别是其中第50、60、68、86、106、116、120、126、223、227和235位的CpG位点发生甲基化与肠癌发生有关，因此这些序列的甲基化水平可以作为预测肠癌发生的DNA甲基化标志物。

不希望拘囿于任何理论，但发明人认为，SHOX2基因上这段序列的表达活跃程度决定了肠癌的发生。通过SHOX2基因上这段序列的甲基化，恰当地降低了基因的表达，从而避免正常个体的肠癌发生；而肠癌患者SHOX2基因上这段序列的甲基化低，基因表达活跃。因此，SHOX2基因上这段序列的甲基化状态可以反应肠癌的情况。发明人通过实验数据证实了这一点，并且通过对实验数据的统计学分析找到了合适的CpG甲基化值的判定阈值。

在本发明的一实施例中，DNA甲基化标志物是选自SHOX2基因chr3:157821233-157821604位之间的CpG位点发生甲基化，其甲基化程度小于检测阈值M。M＝(a₁×X₁+a₂×X₂+……+a₁₁×X₁₁)/(X₁+X₂+……+X₁₁)，a₁为0.04-0.1，优选0.07；a₂为0.011-0.016，优选0.014；a₃为0.08-0.16，优选0.12；a₄为0.065-0.12，优选0.09；a₅为0.11-0.3，优选0.21；a₆为0.15-0.4，优选0.25；a₇为0.13-0.28，优选0.21；a₈为0.04-0.14，优选0.09；a₉为0.11-0.16，优选0.14；a₁₀为0.1-0.17，优选0.14；a₁₁为0.01-0.4，优选0.23；X₁、X₂、……、X₁₁为0或1。优选地，DNA甲基化标志物标志物选自前面所述区段的如下位置起始的CpG位点的DNA甲基化：50、60、68、86、106、116、120、126、223、227和235。

在本发明的另一实施例中，DNA甲基化标志物是选自SHOX2基因chr3:157821303-157821353位之间的CpG位点发生甲基化，其甲基化程度小于检测阈值M。M＝(a₁×X₁+a₂×X₂+……+a₅×X₅)/(X₁+X₂+……+X₅)，a₁为0.065-0.12，优选0.09；a₂为0.11-0.3，优选0.21；a₃为0.15-0.4，优选0.25；a₄为0.13-0.28，优选0.21；a₅为0.04-0.14，优选0.09；X₁、X₂、……、X₅为0或1。优选地，DNA甲基化标志物选自前面所述区段的如下位置起始的CpG位点的DNA甲基化：86、106、116、120和126。

在本发明中，甲基化值是指某一CpG位点发生甲基化的比例。例如，甲基化值0.75是该CpG位点75％发生甲基化，或者75％的几率发生甲基化。在本领域中，根据质谱峰图判断甲基化程度。

在本发明中，由于甲基化的CpG在经亚硫酸盐处理后C会变成U，所以利用其中本发明的CpG位点中的C保持不变或者被T替换的两种探针序列的杂交情况可以得出该CpG位点的甲基化情况。

本发明预测肠癌发生风险是如下判定的：CpG1甲基化值的判定阈值为0.04-0.1，优选0.07；CpG2甲基化值的判定阈值为0.011-0.016，优选0.014；CpG3甲基化值的判定阈值为0.08-0.16，优选0.12；CpG4甲基化值的判定阈值为0.065-0.12，优选0.09；CpG5甲基化值的判定阈值为0.11-0.3，优选0.21；CpG6甲基化值的判定阈值为0.15-0.4，优选0.25；CpG7甲基化值的判定阈值为0.13-0.28，优选0.21；CpG8甲基化值的判定阈值为0.04-0.14，优选0.09；CpG9甲基化值的判定阈值为0.11-0.16，优选0.14；CpG10甲基化值的判定阈值为0.1-0.17，优选0.14；CpG11甲基化值的判定阈值为0.01-0.4，优选0.23。针位点的甲基化值阈值，若该位点的DNA甲基化值高于判定阈值则为肠癌低风险人群，若低于判定阈值则为高风险人群。

对于本发明的CpG甲基化值的判定阈值，以CpG9为例，在甲基化值0.11-0.16这个范围内都可以作为判定阈值，居中的0.14是综合考虑敏感性和特异性后优选出来的值。判定阈值越低，特异性越好，但是敏感度越差(判定阈值越低，检测出来的样本的假阳性率越低，但是漏检率高)。阈值越高，敏感度越好，但是特异性越差(阈值越高，漏检率低，但是假阳性率会升高)。

对于一个个体来说，所述DNA甲基化标记物的甲基化程度小于判定阈值越多，表明其肠癌的发生风险越大，被错检的概率越小。

本发明对SHOX2基因甲基化与肠癌之间的相关性进行评估，设计了引物对，引物扩增的DNA序列中覆盖了DNA甲基化位点，利用此引物可对其中的DNA甲基化位点进行检测，评估肠癌的发生风险。

列举以下实例，说明本发明检测甲基化的实施方式，但这些描述不限制本发明的适用范围。

1、受试者选取和取样

随机选取9名肠癌患者，9名无肠癌志愿者，采集两组志愿者的血液样品和唾液样品。

2、SEQUENOM甲基化检测实验流程与方法

主要仪器与试剂

基因扩增：ABI GeneAmp9700 384Dual；

质谱点样：MassARRAY Nanodispenser RS1000；

质谱分析：MassARRAY Compact System；

试剂：EpiTYPERRT Complete Reagent Set。

步骤阐述：

1)引物合成

利用HPLC方法合成引物对：SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

2)DNA样品提取和DNA样品质检

(1)DNA样品提取

使用武汉昌美生物技术有限公司“唾液DNA提取纯化试剂盒(一管法)”(产品货号：QT-275)提取唾液DNA；

使用QIAGEN血细胞DNA提取试剂盒(货号：51104)提取血细胞DNA；

详细操作步骤见相应试剂盒说明书。

(2)DNA质检

通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度及是否降解；

通过NANODROP检测DNA浓度及纯度。

3)亚硫酸盐处理DNA样品

使用ZYMO公司的EZ DNA Methylation-Kit试剂盒(货号：D5001)对DNA样品进行转换处理；

具体操作步骤见相应试剂盒说明书。

4)PCR反应

(1)反应体系：

反应物名称	体积(μl)
		ddH<sub>2</sub>O	1.42
10×PCR Buffer，含20Mm MgCl<sub>2</sub>	0.50
		dNTP	0.04
酶	0.04
		正向引物/反向引物	2
亚硫酸盐处理的DNA样品	1
		总计	5

(2)反应条件：

*根据引物Tm值情况调整。

5)SAP酶消化反应

(1)反应体系：

反应物名称	体积(μl)
		ddH<sub>2</sub>O	1.7
SAP Enzyme	0.3
		总计	2

(2)反应条件：

温度	时间
		37℃	20min
85℃	5min
		25℃	保温

6)转录和酶切反应

(1)反应体系：

反应条件：37℃温育3小时

7)树脂纯化

(1)将反应产物的384孔板中加入20μl三蒸水，在离心机中离心2000转/分钟离心3分钟，加入树脂，在反转摇匀仪上做树脂纯化反应15min，脱盐；反应完成后在离心机中离心2000转/分钟，离心3分钟；

(2)将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶。

8)质谱检测，收集数据

(1)MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)反应；

(2)Epityper软件检测质谱峰，根据质谱峰图判断甲基化程度。

3数据分析

经过分析，发明人发现在正常人和肠癌患者之间SHOX2基因的CpG位点的DNA甲基化水平存在显著性差异。

为了便于说明，发明人以SHOX2基因中chr3:157821233-157821604此区段的第223位CpG位点(CpG 9)的DNA甲基化为例进行分析。

图1中示例性显示了DNA甲基化位点的甲基化程度对肠癌患者和无肠癌人群的区分图。从图1可以看到，肠癌病人和正常人群在该DNA甲基化位点的甲基化状态有显著差异(P值小于0.05)，该位点均能很好地区分肠癌病人和正常人群。发明人综合考虑敏感性和特异性后确定了DNA甲基化水平的判定阈值，为0.11-0.16，优选为0.14。

以上述确定判断阈值，使用DNA甲基化位点对肠癌发生风险进行预测的分析如图2所示。从图2可以看到，此DNA甲基化位点的甲基化值对肠癌的预测可达到较高的准确性，AUC(Area Under Curve)约为0.8。

9名患者中，该CpG位点在肠癌患者中的甲基化值平均值均显著低于正常人群25-45％，平均高30％以上，而且是统计学显著的。类似地，发明人确定了SHOX2基因的正常人和肠癌患者之间DNA甲基化水平存在显著性差异的所有11个CpG位点甲基化判断阈值，如下表1所示。

表1

序列信息

SEQ ID NO.1：SHOX2基因序列片段

CGAGGATCGCGAATATTCCGCTTGAACCTGTTGATCTCTGTGGGTTAAGCGTTTAGGGTCGAGTCTGCGTTTCCACGAGGGAGGGCGAAGAGAGAACAGAAAGAGCGGTTGCTTTCGCCCGCCACCGGAGGCTGGTTTTCCGCCTCCTGCCTTCTGGCCCGGCTTGGGCGGCGAGCCCTTTGGGCAGCCAACATGGCGTGGGCGCCTGTGCTCGTGCGACCCCGGTCGGGCAGGCGGGACGGAGATTACCTGGCTGTCCAGGGGACCTTATGCAGGGTTTGGCCCGAGCCCAGGGGCAGCGAGGGGCGTCTGCGGATGCGGCTCCCTGTGCGGCACAACACCGGGGTCTGTTGCTCTCGCTGATACCTTTCG

引物对1：

F：AGGAAGAGAGATTTGTTGATTTTTGTGGGTTAAG(SEQ ID NO.2)R：CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTCCCTACATAAAATCCCCTAAACAA(SEQ ID NO.3)

引物对2：

F：GGTTAAATTTTGTATAAGGTTTTT(SEQ ID NO.4)

R：ATTTGTTGATTTTTGTGGGRRAAG(SEQ ID NO.5)

引物对3：

F：TAAGGTTTTTTGGATAGTTAGGTA(SEQ ID NO.6)

R：AATATTTTGTTTGAATTTGTTGA(SEQ ID NO.7)

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书内容及其附图所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市天元印科技有限公司

<120> 可用于肠癌液体活检的DNA甲基化标志物及其检测方法，引物对及试剂盒

<130> 2018.11.11

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgaggatcgc gaatattccg cttgaacctg ttgatctctg tgggttaagc gtttagggtc 60

gagtctgcgt ttccacgagg gagggcgaag agagaacaga aagagcggtt gctttcgccc 120

gccaccggag gctggttttc cgcctcctgc cttctggccc ggcttgggcg gcgagccctt 180

tgggcagcca acatggcgtg ggcgcctgtg ctcgtgcgac cccggtcggg caggcgggac 240

ggagattacc tggctgtcca ggggacctta tgcagggttt ggcccgagcc caggggcagc 300

gaggggcgtc tgcggatgcg gctccctgtg cggcacaaca ccggggtctg ttgctctcgc 360

tgataccttt cg 372

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aggaagagag atttgttgat ttttgtgggt taag 34

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cagtaatacg actcactata gggagaaggc tccctacata aaatccccta aacaa 55

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggttaaattt tgtataaggt tttt 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atttgttgat ttttgtgggr raag 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

taaggttttt tggatagtta ggta 24

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aatattttgt ttgaatttgt tga 23

Claims

1.一种可用于肠癌液体活检的DNA甲基化标志物，其特征在于，所述DNA甲基化标志物是SHOX2基因中chr3:157821233-157821604位之间的CpG位点，所述DNA甲基化标记物的甲基化程度指示受试者肠癌发生的情况。

2.如权利要求1所述的可用于肠癌液体活检的DNA甲基化标志物，其特征在于，所述DNA甲基化标志物是SHOX2基因中chr3:157821303-157821353位之间的CpG位点。

3.如权利要求1所述的可用于肠癌液体活检的DNA甲基化标志物，其特征在于，所述DNA甲基化标志物的甲基化程度为检测阈值，待测受试者的CpG位点的甲基化程度高于和低于检测阈值时，分别检测待测受试者为正常和为肠癌发生风险；

所述DNA甲基化标志物选自SHOX2基因中chr3:157821233-157821604中的CpG位点发生甲基化，所述甲基化程度的检测阈值M＝(a₁×X₁+a₂×X₂+……+a₁₁×X₁₁)/(X₁+X₂+……+X₁₁)，a₁为0.04-0.1；a₂为0.011-0.016；a₃为0.08-0.16；a₄为0.065-0.12；a₅为0.11-0.3；a₆为0.15-0.4；a₇为0.13-0.28；a₈为0.04-0.14；a₉为0.11-0.16；a₁₀为0.1-0.17；a₁₁为0.01-0.4；X₁、X₂、……、X₁₁为0或1；

或者所述甲基化程度的检测阈值M＝(a₁×X₁+a₂×X₂+……+a₅×X₅)/(X₁+X₂+……+X₅)，a₁为0.065-0.12；a₂为0.11-0.3；a₃为0.15-0.4；a₄为0.13-0.28；a₅为0.04-0.14；X₁、X₂、……、X₅为0或1。

4.如权利要求3所述的可用于肠癌液体活检的DNA甲基化标志物，其特征在于，所述DNA甲基化标志物选自SHOX2基因中chr3:157821233-157821604中如下位置起始的CpG位点的DNA甲基化：50、60、68、86、106、116、120、126、223、227和235。

5.一种用于检测权利要求1至4中任一项所述的DNA甲基化标志物的引物对，其特征在于，所述引物对扩增含有所述DNA甲基化标志物的一段序列。

6.如权利要求5所述的引物对，其特征在于，所述引物对选自：SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3；SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7的其中之一。

7.一种DNA甲基化标志物的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

S10，提取如权利要求1至4中任一项所述的DNA甲基化标志物的DNA样品和如权利要求5或6中任一项所述的引物对；

S20，对所述DNA样品进行亚硫酸盐处理；

S40，对所述扩增产物进行消化；

8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S50后还包括纯化步骤，对所述转录和酶切产物进行纯化。

9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述质谱方法是飞行质谱方法。

10.一种用于DNA甲基化标志物检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1至4中任一项所述的DNA甲基化标志物的探针序列，其中所述CpG位点中的C保持不变或者被T替换。